一种新型嵌合受体组合物、重组载体、细胞及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种新型嵌合受体组合物、重组载体、细胞及其应用。


背景技术：

2.传统肿瘤治疗的方法包括手术、放疗、化疗、靶向治疗等；近些年免疫疗法的发展为肿瘤治疗领域带来深刻的改变，尤其是以ctla
‑
4、pd
‑
1/pd
‑
l1通路抑制剂为代表的免疫检查点疗法和以car
‑
t为代表的过继性细胞疗法。过继性细胞疗法包括til、nk、tcr
‑
t、等。其中靶向cd19的car
‑
t疗法在b细胞肿瘤中取得了优秀的临床疗效，并且在2017年有两款car
‑
t产品被fda批准用于b细胞白血病或者淋巴瘤的治疗。
3.虽然car
‑
t在血液瘤中取得了重大进展，但在治疗血液瘤中细胞因子风暴等副作用发生率较高，大部分患者在接受car
‑
t治疗过程中需要使用辅助手段降低细胞因子风暴带来的副作用。car
‑
t在实体瘤治疗中效果差，其中一个重要原因为肿瘤异质性，car
‑
t细胞杀伤实体瘤能力较弱并且无法完全清除肿瘤细胞，另外car
‑
t在实体瘤治疗因子风暴发生率及因子风暴水平较血液瘤更高，副作用更严重，获益与临床风险比低影响了临床实体瘤患者对car
‑
t治疗的接受度。
4.现有的解决方案一般采用双靶点等解决肿瘤异质性，在治疗过程中或提前介入，采用抗体对症治疗因子风暴或在car
‑
t上设计安全开关，当因子风暴发生或car
‑
t过度增殖时，使用抗体中和细胞因子或清除car
‑
t细胞，降低car
‑
t毒副作用。
5.nk细胞表面表达nkg2d，通过识别其配体如mica或micb等激活下游信号dap10及dap12等从而杀伤靶细胞，t细胞表面本身也表达nkg2d，胞内表达dap10而不表达dap12，正常情况下t细胞表面nkg2d识别其配体后无法有效激活胞内信号，从而不能杀伤靶细胞。本发明拟设计在常规car
‑
t细胞表达nkg2d胞外区及胞内信号区，扩大car
‑
t抗原识别谱的同时，解决肿瘤异质性。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种新型嵌合受体组合物、重组载体、细胞及其应用，扩大car
‑
t抗原识别谱的同时，解决肿瘤异质性，且降低因子风暴发生的可能，增加了car
‑
t安全性。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明的第一方面是提供一种新型嵌合受体组合物，其包括嵌合抗原受体和包括nkg2d、dap10和/或dap12的全长序列或者截短片段的nkg2d嵌合受体。
9.进一步地，该嵌合受体组合物包括嵌合抗原受体和nkg2d嵌合受体；该nkg2d嵌合受体包括nkg2d胞外区和dap12胞内区序列。
10.进一步地，上述nkg2d嵌合受体还包括一个共刺激分子；该共刺激分子选自：cd28、4
‑
1bb、dap10、icos、ox40和cd40。
11.进一步地，上述嵌合抗原受体包括：胞外识别区、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区。
12.进一步地，上述胞外识别区包括识别肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原的抗体或抗体片段。
13.进一步地，上述肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原选自：cd19、bcma、cd22、cd20、cd123、cd30、cd38、cd138、cd56、cd7、cll
‑
1、cd10、cd34、cs1、cd16、cd4、cd5、il
‑1‑
rap、itgb7、k
‑
igg、tac1、trbc1、muc1、nkg2d、pd
‑
l1、cd133、cd177、ley、cd70、ror1、afp、axl、cd80、cd86、dll3、dr5、fap、lmp1、mage
‑
a1、mage
‑
a4、mg7、muc16、pmel、ror2、vegfr2、cd171、claudin 18.2、claudin 6、epha2、erbb、fra、psca、cmet、il13ra2、epcam、egfr、psma、egfrviii、gpc3、cea、her2、gd2和mesothelin。
14.进一步地，上述铰链区的序列来源于cd8α、cd28、4
‑
1bb、icos、ox40、cd40、cd80和igg的至少一种，上述跨膜区的序列来源于cd2、cd27、lfa
‑
1(cd11a/cd18)、cd8α、cd28、4
‑
1bb、icos、ox40、cd40、cd80、cd3ζ和cd3ε的至少一种，上述胞内信号区的序列来源于toll样受体、cd2、cd27、lfa
‑
1(cd11a/cd18)、cd8α、cd28、4
‑
1bb、icos、ox40、cd40、cd80、dap10、dap12、cd3ζ和cd3ε等中的至少一种。
15.进一步地，上述嵌合抗原受体的氨基酸序列为seq id no.1。
16.进一步地，上述嵌合受体组合物还包括连接肽，连接上述嵌合抗原受体和嵌合受体；该连接肽为自切割多肽2a肽；该2a肽包括f2a、p2a、t2a和e2a；优选为p2a，其氨基酸序列为seq id no.10。
17.进一步地，上述嵌合受体的氨基酸序列选自以下序列的一条：seq idno.2～seq id no.9；优选为seq id no.4或seq id no.7。
18.本发明的第二方面是提供编码上述嵌合受体组合物的核酸序列。
19.本发明的第三方面是提供包含上述核酸序列的载体。
20.本发明的第四方面是提供表达上述嵌合受体组合物、含有上述核酸序列或者上述载体的细胞。
21.进一步地，上述细胞选自以下细胞中的一种：t细胞、nk细胞、dc细胞和巨噬细胞。
22.进一步地，上述t细胞选自αβt细胞、γδt细胞或nkt细胞。
23.本发明的第五方面是提供一种治疗肿瘤的生物制剂，包括上述细胞作为主要活性成分。
24.本发明的第六方面是提供上述细胞的制备方法，包括将上述载体转染细胞的步骤。
25.本发明的第七方面是提供上述嵌合受体组合物、核酸序列、载体或细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
26.本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
27.本发明提供的嵌合受体组合物使常规car
‑
t细胞表达nkg2d胞外区及胞内信号区，扩大car
‑
t抗原识别谱，解决肿瘤异质性，在增强car
‑
t对表达目标靶抗原肿瘤细胞的杀伤能力的同时，实现了较低水平的因子释放，降低因子风暴发生的可能，增加car
‑
t安全性。
(cd11a/cd18)、cd8α、cd28、4
‑
1bb、icos、ox40、cd40、cd80、cd3ζ和cd3ε的至少一种，上述胞内信号区的序列来源于toll样受体、cd2、cd27、lfa
‑
1(cd11a/cd18)、cd8α、cd28、4
‑
1bb、icos、ox40、cd40、cd80、dap10、dap12、cd3ζ和cd3ε等中的至少一种。
45.在本发明一优选的实施方式中，上述嵌合抗原受体的氨基酸序列为seq id no.1。
46.在本发明一优选的实施方式中，上述嵌合受体组合物还包括连接肽，连接上述嵌合抗原受体和嵌合受体；该连接肽为自切割多肽2a肽；该2a肽包括f2a、p2a、t2a和e2a；优选为p2a，其氨基酸序列为seq id no.10。
47.在本发明一优选的实施方式中，上述嵌合受体的氨基酸序列选自以下序列的一条：seq id no.2～seq id no.9；优选为seq id no.4或seq id no.7。
48.本发明一实施例提供了编码上述嵌合受体组合物的核酸序列。
49.本发明一实施例提供了包含上述核酸序列的载体。
50.本发明一实施例提供了表达上述嵌合受体组合物、含有上述核酸序列或者上述载体的细胞。
51.在本发明一优选的实施方式中，上述细胞选自以下细胞中的一种：t细胞、nk细胞、dc细胞和巨噬细胞。
52.在本发明一优选的实施方式中，上述t细胞选自αβt细胞、γδt细胞或nkt细胞。
53.本发明一实施例提供了一种治疗肿瘤的生物制剂，包括上述细胞作为主要活性成分；优选地还包括药学上可接受载体、稀释剂或赋形剂。
54.本发明一实施例提供了上述细胞的制备方法，包括将上述载体转染细胞的步骤。
55.本发明一实施例提供了上述嵌合受体组合物、核酸序列、载体或细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
56.下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
57.实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
58.实施例1
59.本实施例提供了一种新型嵌合受体组合物；该新型嵌合受体组合物(在下文中称为dual car，其对应的car
‑
t细胞称为dual car
‑
t)包括氨基酸序列为seq id no.1的anti
‑
cldn18.2
‑
car(传统二代claudin18.2 car分子，下文称为21007)，以及如seq id no.2～9所示的嵌合受体序列(结构序列如图1所示)，具体的氨基酸序列对应下表1中的序列名称为21067～21074的序列。
60.表1 anti
‑
cldn18.2
‑
car以及嵌合受体组合物的序列信息
61.62.63.[0064][0065]
如图1所示，上述嵌合受体组合物除包括氨基酸序列如seq id no.1的嵌合抗原受体，还包括的序列信息如下：
[0066]
(1)p2a，其氨基酸序列如下：
[0067]
gsgatnfsllkqagdveenpgp(seq id no.10)；
[0068]
(2)dap12icd(胞内区)，其氨基酸序列如下：
[0069]
yflgrlvprgrgaaeaatrkqritetespyqelqgqrsdvysdlntqrpyyk(seq id no.11)；
[0070]
(3)dap10icd，其氨基酸序列如下：
[0071]
lcarprrspaqedgkvyinmpgrg(seq id no.12)；
[0072]
(4)nkg2dfl(全长序列)，其氨基酸序列如下：
[0073]
mgwirgrrsrhswemsefhnynldlkksdfstrwqkqrcpvvkskcrenaspfffccfiavamgirfiimvtiwsavflnslfnqevqipltesycgpcpknwicyknncyqffdesknwyesqascmsqnasllkvyskedqdllklvksyhwmglvhiptngswqwedgsilspnlltiiemqkgdcalyassfkgyiencstpntyicmqrtv(seq id no.13)；
[0074]
(5)cd8 hinge(铰链区)，其氨基酸序列如下：
[0075]
tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd(seq id no.14)；
[0076]
(6)cd8 tm(跨膜区)，其氨基酸序列如下：
[0077]
iyiwaplagtcgvlllslvitlyc(seq id no.15)；
[0078]
(7)dap10fl，其氨基酸序列如下：
[0079]
mihlghilfllllpvaaaqttpgersslpafypgtsgscsgcgslslpllaglvaadavasllivgavflcarprrspaqedgkvyinmpgrg(seq id no.16)；
[0080]
(8)dap12fl，其氨基酸序列如下：
[0081]
mgglepcsrllllplllavsglrpvqaqaqsdcscstvspgvlagivmgdlvltvlialavyflgrlvprgrgaaeaatrkqritetespyqelqgqrsdvysdlntqrp yyk(seq id no.17)；
[0082]
(9)dap12ecd tm(胞外区及跨膜区)，其氨基酸序列如下：
[0083]
lrpvqaqaqsdcscstvspgvlagivmgdlvltvlialav(seq id no.18)；
[0084]
(10)t2a，其氨基酸序列如下：
[0085]
gsgegrgslltcgdveenpgp(seq id no.19)。
[0086]
实施例2
[0087]
本实施例提供表达上述嵌合受体的dual car
‑
t细胞，其构建方法包括如下步骤：
[0088]
1.表达载体构建：dual car分子和慢病毒载体骨架部分分别由cro公司使用全基因合成技术构建得到。通过常规分子克隆手段，将dual car片段克隆至慢病毒载体，所构建的质粒名称如上表1所示。各质粒通过对插入片段全序列测通验证证明构建成功。
[0089]
2.慢病毒包装和滴度测定
[0090]
第一天：
[0091]
1)在t75培养瓶中接种293t细胞，数量为5
×
106，培养体积为20ml；
[0092]
第二天：
[0093]
2)包病毒前确认293t细胞汇合度在70％
‑
80％左右，并进行等体积换液；
[0094]
3)转染复合物的配制和转染：
[0095]
分别配置tube a和tube b，体系如下所示，并进行颠倒或者低速振荡混匀；
[0096]
tube a：opti
‑
mem(2ml) lipo3000(55μl)；
[0097]
tube b：opti
‑
mem(2ml) p3000(46μl) 辅助质粒18μg dual car主质粒6μg；
[0098]
将tube a加入到tube b中，振荡混匀，室温孵育15分钟；
[0099]
将第3步中换过液的培养瓶翻面，使培养基处于培养瓶另一面，将tube a b混合物加入，轻摇混匀后，再将培养瓶缓慢翻回正面，后继续培养48h；
[0100]
第四天：
[0101]
4)转染完成培养2天后，收集上清，500g离心10min，用0.45μm滤器过滤上清至50ml离心管中，包好封口膜，10000g，4℃离心过夜，可见白色病毒沉淀；弃上清后倒置离心管至上清流尽后用200μl aim
‑
v培养基溶解沉淀后，取2μl按照后续步骤测定滴度，其余置于
‑
80℃保存。
[0102]
5)将2μl重悬病毒上清加至198μl 1640培养基中稀释病毒，后在24孔板中按照每孔2
×
105数量jurkat t细胞分别加入稀释后的病毒2μl、10μl和50μl一共3个孔，并加入终浓度为5μg/ml的polybrene辅助病毒感染。
[0103]
第六天：
[0104]
6)使用anti
‑
vhh
‑
fitc抗体检测病毒滴度，滴度在2.5
×
107‑
1.2
×
108之间，可满足常规体外car
‑
t构建实验要求。
[0105]
3.car
‑
t的检测
[0106]
将上述包装的慢病毒感染t细胞，检测t细胞上anti
‑
cldn18.2
‑
car及nkg2d的表达，结果如图2所示。
[0107]
由图2可知，anti
‑
cldn18.2
‑
car
‑
t细胞有较低水平的nkg2d表达，dual car
‑
t细胞相比anti
‑
cldn18.2
‑
car
‑
t细胞有较高的nkg2d表达水平，同时正常表达anti
‑
cldn18.2
‑
car。说明nkg2d嵌合受体在dual car
‑
t细胞表面成功表达。
[0108]
实施例3
[0109]
本实施例验证dual car
‑
t细胞对靶细胞的杀伤效果，具体的步骤和结果如下：
[0110]
(1)293细胞基础上构建了过表达cldn18.2抗原的细胞系293
‑
cldn18.2，该细胞系高表达cldn18.2(如图3)。
[0111]
(2)检测细胞系nkg2d配体mica/b的表达：鉴定了239t细胞系上mica/b的表达水平，293t细胞系表达较高水平的mica/b(如图4)。
[0112]
(3)car
‑
t细胞与293
‑
cldn18.2按2:1及0.5:1的效靶比混合，孵育5h，annexin v流式检测car
‑
t对靶细胞杀伤效果，anti
‑
cldn18.2
‑
car
‑
t及dual car
‑
t相对unt(未转导的t)细胞，对293
‑
cldn18.2有较强的杀伤效果，其中21069及21072在2:1效靶比时有相对传统car
‑
t(21007)更强的杀伤效果(如图5)。此外，将293
‑
cldn18.2与car
‑
t共孵育，21069及21072dual car
‑
t增殖倍数明显高于传统的car
‑
t细胞(21007)(如图6)。
[0113]
car
‑
t细胞与293t细胞按2:1及0.5:1的效靶比混合，孵育5h，annexin v流式检测car
‑
t对靶细胞杀伤效果，anti
‑
cldn18.2
‑
car
‑
t及dual car
‑
t相对unt(未转导的t)细胞，对表达mica/b的靶细胞有较强的杀伤效果，其中21069及21072在2:1效靶比时有相对传统car
‑
t更强的杀伤效果(如图7)。
[0114]
实施例4
[0115]
本实施例验证dual car
‑
t细胞在杀伤的靶细胞293
‑
cldn18.2时有更低的因子分泌水平，具体的步骤和结果如下：
[0116]
采用实施例3构建的细胞系293
‑
cldn18.2；将car
‑
t细胞与293
‑
cldn18.2按2:1的效靶比混合，孵育24h，流式检测car
‑
t细胞因子释放，使用biolegend的多因子检测试剂盒，取15μl/样品的效应细胞与靶细胞孵育的上清至新的v型96孔板中，加入混合稀释后的磁珠15μl/样品及15μl/样品的assay buffer，封板膜密封，500rpm室温震荡2h，250g离心5min，去上清，加入200μl/样品的wash buffer，250g离心5min，去上清，加入15μl/样品的检测抗体，500rpm室温震荡1h，加入15μl/样品的sa
‑
pe，500rpm室温震荡30min，250g离心5min，去上清，加入200μl/样品的wash buffer，250g离心5min，去上清，加入150μl/样品的wash buffer，上机检测。结果显示anti
‑
cldn18.2
‑
car
‑
t及dual car
‑
t细胞在杀伤293
‑
cldn18.2靶细胞时，21067、21068、21069、21070、21072等dual car
‑
t有明显更低的ifn
‑
γ、il2、il6和tnf
‑
α分泌水平(如图8)。
[0117]
实施例5
[0118]
本实施例验证dual car
‑
t细胞在杀伤表达mica/b的靶细胞时释放中等水平的细胞因子，具体的步骤和结果如下：
[0119]
将car
‑
t细胞与293t按2:1的效靶比混合，孵育24h，流式检测car
‑
t细胞因子释放，anti
‑
cldn18.2
‑
car
‑
t细胞及dual car
‑
t细胞在杀伤293t靶细胞时，21068、21069、21070、21072等dual car
‑
t有中等水平的ifn
‑
γ分泌水平，较低的tnf
‑
α、il2及il6分泌水平(如图9)。
[0120]
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。