一种嗜几丁质属菌株及其在防治香蕉枯萎病中的应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种嗜几丁质属菌株及其在防治香蕉枯萎病中的应用。


背景技术：

2.香蕉枯萎病是一种主要侵染香蕉植株维管束的毁灭性的真菌土传病害，又叫香蕉黄叶病或称巴拿马病(panama disease)，是国际植物检疫对象，由尖孢镰刀菌古巴专化型侵染引起。在中国海南、广东和广西等省份的香蕉产区都有发生。主要有尖孢镰刀菌1号和4号小种，1号小种主要为害粉蕉，4号小种为害粉蕉和香蕉。病原菌在土壤中存活时间达数年之久，一般减产20％以上，严重的田块甚至绝收。
3.现阶段治疗香蕉枯萎病主要手段为抗性育种和化学药物防治，化学杀菌药物在杀青枯菌方面其见效快，效果好，但面临主要问题是污染性较高，食用性作物存在一定危险性，且容易造成环境的污染。


技术实现要素：

4.1.要解决的技术问题
5.本发明的目的是为了解决现有技术中治疗香蕉枯萎病主要手段为抗性育种和化学药物防治，容易造成环境污染的问题，而提出的一种嗜几丁质属菌株及其在防治香蕉枯萎病中的应用。
6.2.技术方案
7.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
8.一种嗜几丁质属菌株，该菌株分离自海岛上的野生仙人掌根系土壤。
9.本发明还提出了一种嗜几丁质属菌株的筛选与鉴定方法，以下步骤：
10.步骤1：拮抗菌株分离，该菌株分离自海岛上的野生仙人掌根系土壤；
11.步骤2：观察平板拮抗效果，将步骤1中的分离菌株分别转移至1ml新鲜的lb液体培养基中，并在恒温摇床(200rmp、30℃)振荡培养48h，获得分离菌株lb培养液，用于下游拮抗试验筛选；将香蕉枯萎病菌foc4于pda固体培养基中培养，待菌丝长满平板后，用0.5cm打孔器进行打孔，将含有foc4菌丝的菌饼放置于新鲜的pda固体培养基平板中央培养2-3天，然后在距离菌丝边缘1.5cm左右，滴取0.5微升的待检测菌株的菌液，然后于30℃下培养2-3天，观察拮抗效果；
12.步骤3：16s rdna测序，提取hnu63基因组dna，使用16s rdna通用引物27f(5
’‑
agagtttgatcmtggctcag-3’，seq id no.1)和1492r(5
’‑
taccttgttacgactt-3’，seq id no.2)进行pcr反应。
13.优选地，所述拮抗菌株的分离方法包括以下步骤：
14.步骤1：采集仙人掌的根系组织及根际土；
15.步骤2：将仙人掌根系样品的根剪碎并充分研磨后转移至装有20ml 20％甘油的离
心管中充分震荡混匀，经梯度密度稀释后分别吸取100微升103cfu/ml、104cfu/ml和105cfu/ml密度梯度下的悬液涂布于lb固体培养基(以平皿中单菌落分布均匀，数目约40-60个为适宜的稀释浓度)，每个密度梯度设置3次重复；
16.步骤3：置于30℃恒温培养箱中培养48h，然后分离出单个菌落，纯化后进行超低温冷冻保存。
17.优选地，所述步骤3中将16s rdna测序后的序列置于ncbi数据库中进行序列比对。
18.本发明还提出了一种嗜几丁质属菌株及其在防治香蕉枯萎病中的应用，包括以下步骤：
19.步骤1：hnu63的培养：将hnu63单菌落分别接种于lb液体培养基(体积2l)中30℃，150rpm震荡培养48小时，离心后弃去上清然后收集菌体，使用无菌水进行稀释，得hnu63生防菌悬液，备用；
20.步骤2：香蕉枯萎病菌foc4的培养：将foc4先接种于pda固体培养基中培养，加入一定量无菌水后用涂布棒刮取菌丝收集菌丝和孢子获得悬浮液，收集足量foc4菌悬液后用于后续接种；
21.步骤3：无菌土的制备：在从未进行香蕉种植的地方收集土壤，取其地表部分以下10cm左右的土壤，然后将土壤经过2次高压蒸汽灭菌处理，以避免其它微生物干扰；
22.步骤4：生物防治实验：选取60株出苗30天的健康粉蕉苗，随机分成3组：先对粉蕉苗进行伤根处理，在根部培养土中灌注约20ml的hnu63生防菌悬液，再将20ml的foc4菌悬液灌注入粉蕉苗根系，然后于30℃温室条件下培养，空气湿度未进行严格控制，统计时间为30天，每天观察并统计粉蕉苗的发病情况。
23.优选地，所述步骤1中稀释后的菌液浓度控制在od600≈1.0。
24.优选地，所述步骤2中的培养条件为在30℃恒温培养箱中培养96h。
25.优选地，所述步骤4中表现出典型的萎蔫症状即统计为发病，即先是叶片边缘出现黄色病变，逐渐叶片和植株开始凋萎。
26.优选地，所述步骤4中在开展本实验的同时，同时以不接种香蕉枯萎病菌foc4，不灌注生防菌悬液hnu63，只添加无菌水作为对比例1；以接种香蕉枯萎病菌foc4，不灌注生防菌悬液hnu63，作为对比例2，其中实施例2中和对比例2中加入的菌悬液量一致，且粉蕉苗的健康水平和株高一致，发病率＝发病植株数/总接种植株数*100％。
27.3.有益效果
28.相比于现有技术，本发明的优点在于：
29.(1)本发明中，通过将嗜几丁质属菌株应用于防治香蕉枯萎病中，具有环境友好、污染少的特点，符合现代化生态农业发展的需求。
附图说明
30.图1为生防菌株hnu63与香蕉枯萎病菌株foc4拮抗48h后的效果图，图中黄色菌落为hnu63的菌落；
31.图2为将hnu63的16s rdna测序在ncbi数据库中序列比对结果。
具体实施方式
32.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
33.实施例1：
34.参照图1-2，一种嗜几丁质属(chitinophaga)菌株，该菌株分离自海岛上的野生仙人掌根系土壤。该菌株可有效防治由镰刀菌4号小种引起的香蕉枯萎病，施加hnu63的植株与不施加hnu63生防菌的对照相比，香蕉枯萎病发病率下降约60％。
35.本发明中，本发明还提出了一种嗜几丁质属菌株的筛选与鉴定方法，以下步骤：
36.步骤1：拮抗菌株分离，该菌株分离自海岛上的野生仙人掌根系土壤，分离方法简要描述如下：采集仙人掌的根系组织及根际土；将仙人掌根系样品的根剪碎并充分研磨后转移至装有20ml 20％甘油的离心管中充分震荡混匀，经梯度密度稀释后分别吸取100微升103cfu/ml、104cfu/ml和105cfu/ml密度梯度下的悬液涂布于lb固体培养基(以平皿中单菌落分布均匀，数目约40-60个为适宜的稀释浓度)，每个密度梯度设置3次重复，置于30℃恒温培养箱中培养48h，然后分离出单个菌落，纯化后进行超低温冷冻保存；
37.步骤2：观察平板拮抗效果，将上述分离菌株分别转移至1ml新鲜的lb液体培养基中，并在恒温摇床(200rmp、30℃)振荡培养48h，获得分离菌株lb培养液，用于下游拮抗试验筛选；将香蕉枯萎病菌foc4于pda固体培养基中培养，待菌丝长满平板后，用0.5cm打孔器进行打孔，将含有foc4菌丝的菌饼放置于新鲜的pda固体培养基平板中央培养2-3天，然后在距离菌丝边缘1.5cm左右，滴取0.5微升的待检测菌株的菌液，然后于30℃下培养2-3天，观察拮抗效果。经多次平板拮抗试验验证，hnu63拮抗香蕉枯萎病菌的能力最为稳定；
38.步骤3：16s rdna测序，提取hnu63基因组dna，使用16s rdn a通用引物27f(5
’‑
agagtttgatcmtggctcag-3’，seq id no.1)和1492r(5
’‑
taccttgttacgactt-3’，seq id no.2)进行pcr反应。
39.总体系为50μl：
[0040][0041]
pcr反应程序为(使用takara的高保真聚合酶prim star pcr体系套装)：
[0042][0043]
pcr产物经琼脂糖电泳检测后，将有清晰扩增目的条带的产物进行测序分析，测序工作由广州艾基生物公司完成。
[0044]
将序列置于ncbi数据库中进行序列比对，hnu63属于chitinophaga sp，如图2所示。
[0045]
本发明还提出了一种嗜几丁质属菌株及其在防治香蕉枯萎病中的应用，包括以下步骤：
[0046]
步骤1：hnu63的培养：将hnu63单菌落分别接种于lb液体培养基(体积2l)中30℃，150rpm震荡培养48小时，离心后弃去上清然后收集菌体，使用无菌水进行稀释，稀释后的菌液浓度控制在od
600
≈1.0，得hnu63生防菌悬液，备用；
[0047]
步骤2：香蕉枯萎病菌foc4的培养：将foc4先接种于pda固体培养基中然后30℃条件下恒温培养箱中培养96h，加入一定量无菌水后用涂布棒刮取菌丝收集菌丝和孢子获得悬浮液，收集足量foc4菌悬液后用于后续接种；
[0048]
步骤3：无菌土的制备：在从未进行香蕉种植的地方收集土壤，取其地表部分以下10cm左右的土壤，然后将土壤经过2次高压蒸汽灭菌处理，以避免其它微生物干扰；
[0049]
步骤4：生物防治实验：选取60株出苗30天的健康粉蕉苗，随机分成3组：先对粉蕉苗进行伤根处理，在根部培养土中灌注约20ml的hnu63生防菌悬液，再将20ml的foc4菌悬液灌注入粉蕉苗根系，然后于30℃温室条件下培养，空气湿度未进行严格控制，统计时间为30天，每天观察并统计粉蕉苗的发病情况，表现出典型的萎蔫症状即统计为发病，即先是叶片边缘出现黄色病变，逐渐叶片和植株开始凋萎。在开展本实验的同时，同时以不接种香蕉枯萎病菌foc4，不灌注生防菌悬液hnu63，只添加无菌水作为对比例1；以接种香蕉枯萎病菌foc4，不灌注生防菌悬液hnu63，作为对比例2，其中实施例2中和对比例2中加入的菌悬液量一致，且粉蕉苗的健康水平和株高一致。发病率＝发病植株数/总接种植株数*100％，结果如表1所示。
[0050]
表1：香蕉枯萎病发病率统计结果
[0051][0052]
综上所述，无菌水处理(对比例1)的发病率为0％，仅接种foc4菌悬液的处理(对比例2)平均发病率为91.7％，接种香蕉枯萎病菌foc4前先灌注嗜几丁质属菌株hnu63的平均发病率为30％，较对照的发病率下降61.6％。
[0053]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。