一种检测Y染色体微缺失与微重复的探针组合、试剂盒及其应用的制作方法

一种检测y染色体微缺失与微重复的探针组合、试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明涉及染色体变异检测领域，特别涉及一种检测y染色体微缺失与微重复的探针组合、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.y染色体微缺失是男性生精障碍的第二常见遗传原因。相关的染色体微小缺失集中在y染色体长臂的三个特定区域上(如图1所示)，分别为azfa(15.2-13.1mb),azfb(22.8-18.5mb)和azfc(25.5-23.3mb)，缺失可波及单个或多个亚区，导致不同的临床表型。欧洲男性科学院(eaa)和欧洲分子遗传学质量网络(emqn)推荐为无精症和严重少精症男性的常规检查项目，其中azfa亚区的sy84和sy86位点，azfb亚区的sy127和sy134位点，以及azfc亚区的sy254和sy255位点，这6个关键点位为重要检测目标。
3.最新研究发现，1.6mbgr/gr缺失是精子生成受损的重要危险因素，然而gr/gr缺失患者的临床表型差异较大，该缺失甚至在生育男性中出现的频率很高，除了种族因素之外，若合并azf区域内b2/b4重复，生精功能可与正常人无异，表明该区域基因型-表型关联的复杂性，以及针对性进一步扩展分析与对序列重复检测的必要性。
4.欧洲男科学协会(eaa)和欧洲分子遗传实验质控网(emqn)联合出版的y染色体微缺失分子诊断操作指南中,将y染色体微缺失作为无精子症和寡精子症不育患者的常规检查项目，推荐检测目标包括6个基本点位与12个扩展点位，指南附件c针对商品化试剂盒进行评估。
5.如公开号为cn106148484b，公开日期为2019年10月25日，名称为《一种诊断y染色体微缺失的试剂盒》的专利文件公开了一种试剂盒，该试剂盒使用荧光探针多重pcr法，检测azf区域6个基本点位。另外，新兴的二代测序技术与基因芯片技术也可用于诊断y染色体微缺失与微重复，但是该方法价格昂过、耗时长、所需dna样本量大，一般需要300-500ng，难以普及。
6.但是目前的试剂盒只能检测目标区域内的染色体片段缺失，无法检测目标内的染色体片段重复；同时只能检测6个基本点位，无法进行扩展分析，难以判断病变区间范围与涉及的基因。


技术实现要素：

7.为解决上述背景技术中提到的目前试剂盒只能检测染色体片段缺失，无法检测片段重复的不足，本发明提供一种检测y染色体微缺失与微重复的探针组合，包括针对y染色体上yq:azfa、yq:azfb、yq:azfc、yp、azfa/b之间、yq和yq:azfb/c区域内共25个检测点位的特异性探针，具体序列如下：
8.针对染色体上yq:azfa区域的sy746检测点位的特异性探针序列如seq id no.1～2所示；
9.针对染色体上yp区域的tspy检测点位的特异性探针序列如seq id no.3～4所示；
10.针对染色体上yq:azfa区域的uty检测点位的特异性探针序列如seq id no.5～6所示；
11.针对染色体上yq:azfb区域的xkpy检测点位的特异性探针序列如seq id no.7～8所示；
12.针对染色体上yq:azfc区域的daz1检测点位的特异性探针序列如seq id no.9～10所示；
13.针对染色体上xp区域的amelx检测点位的特异性探针序列如seq id no.11～12所示；
14.针对染色体上yq:azfb区域的rbmy检测点位的特异性探针序列如seq id no.13～14所示；
15.针对染色体上yq:azfa区域的dby检测点位的特异性探针序列如seq id no.15～16所示；
16.针对染色体上yp区域的sry检测点位的特异性探针序列如seq id no.17～18所示；
17.针对染色体上yp区域的amely检测点位的特异性探针序列如seq id no.19～20所示；
18.针对染色体上yq:azfa区域的sy84检测点位的特异性探针序列如seq id no.21～22所示；
19.针对染色体上yq:azfa区域的sy86检测点位的特异性探针序列如seq id no.23～24所示；
20.针对染色体上yq:azfb区域的sy127检测点位的特异性探针序列如seq id no.25～26所示；
21.针对染色体上yq:azfb区域的sy134检测点位的特异性探针序列如seq id no.27～28所示；
22.针对染色体上yq:azfc区域的sy255检测点位的特异性探针序列如seq id no.29～30所示；
23.针对染色体上yq:azfc区域的cdy检测点位的特异性探针序列如seq id no.31～32所示；
24.针对染色体上yq:azfc区域的sy152检测点位的特异性探针序列如seq id no.33～34所示；
25.针对染色体上yq:azfc区域的sy157检测点位的特异性探针序列如seq id no.35～36所示；
26.针对染色体上azfa/b之间区域的sy105检测点位的特异性探针序列如seq id no.37～38所示；
27.针对染色体上yq:azfb区域的sy113检测点位的特异性探针序列如seq id no.39～40所示；
28.针对染色体上yq:azfb区域的sy1197检测点位的特异性探针序列如seq id no.41～42所示；
29.针对染色体上azfa/b之间区域的sy88检测点位的特异性探针序列如seq id no.43～44所示；
30.针对染色体上yq：近着丝粒区域的sy82检测点位的特异性探针序列如seq id no.45～46所示；
31.针对染色体上yq:azfa区域的sy620检测点位的特异性探针序列如seq id no.47～48所示；
32.针对染色体上yq:azfb/c之间区域的pry检测点位的特异性探针序列如seq id no.49～50所示。
33.本发明提供如上所述的探针组合在制备检测y染色体微缺失与微重复试剂盒中的应用。
34.本发明还提供一种y染色体微缺失与微重复的试剂盒，其中，包括如上所述的探针组合。
35.基于上述方案，在一实施例中，还包含通用引物、dntp和聚合酶。
36.基于上述方案，在一实施例中，所述通用引物的序列如seq id no.51～52所示。
37.本发明还提供一种检测y染色体微缺失与微重复的方法，其中，采用如上所述的探针组合或如上任意所述的探针组合对待检dna样品进行pcr检测。该方法基于多重连接依赖探针扩增【mlpa，multiples ligation-dependent probe amplification】技术原理，可以在同一个反应管内针对待检dna样本同时检测y染色体微缺失与微重复、检测25个点位(含6个基本点位与19个扩展点位)，兼具定性与定量功能；
38.其中，如图1所示，mlpa技术原理如下：
39.捕获：针对所需检测的点位设计特异性探针对，即含特异性序列l和r的寡核苷酸片段，可与靶序列dna互补；双端加设通用引物、填充序列，利用特异性探针，识别待检样本中的目标片段dna；
40.杂交：l与r两条探针分别与靶序列dna杂交，再使用连接酶连接相邻碱基，使两条探针成为一条完整的核酸单链；如果特异性序列l和r与靶序列未能完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，则连接反应失败；
41.pcr扩增：唯有连接成功的l与r探针，才能成为后续pcr反应的模板；连接反应完成后，用一对通用引物扩增；
42.产物分析：针对特定点位的每个探针的扩增产物的长度都是唯一的，范围在130～480bp；通过毛细管电泳分离及数据收集，分析软件对收集的数据进行分析:根据扩增峰的改变(缺失、降低或增高)就可判断靶序列是否有突变存在、是否有拷贝数的异常等。
43.本发明还提供一种检测y染色体微缺失与微重复的方法，具体包括如下步骤：
44.s100、配制探针混合液：以te缓冲液制备25组探针组合；
45.制备dna模板：以te缓冲液制备待检dna样本，于95～100℃加热变性；
46.s200、杂交捕获：将上述探针混合液和dna模板混合，于90～100℃孵育，然后于50～70℃杂交；
47.s300、连接反应：在s200的基础上继续加入连接酶和缓冲液于50～60℃孵育，再于95～100℃加热使连接酶失活；
48.s400、pcr反应：在s300完成连接反应的样本中，加入pcr反应试剂混合液进行pcr
扩增；
49.s500、毛细管电泳分析：取s400的pcr扩增产物进行毛细管电泳分析，根据检测到的片段长度和峰面积，判断受检样本靶点的存在、缺失或重复。
50.基于上述方案，在一实施例中，包括如下步骤：
51.s100、配制探针混合液：以te缓冲液制备25组探针组合共3ul，每条探针终浓度为1um，并添加参考探针，终浓度为1um；
52.制备dna模板：以te缓冲液制备100ng/5ul的待检dna样本，于95～100℃加热变性2～10min，优选地，于98℃加热变性5min；
53.s200、杂交捕获：将上述探针混合液和dna模板混合，于90～100℃孵育1～3min，然后于50～70℃杂交16～20h；优选地，95℃孵育1min，60℃杂交18h；
54.s300、连接反应：在s200的基础上继续加入连接酶和缓冲液于50～60℃孵育10～20min，再于95～100℃加热2～10min使连接酶失活；优选地，于54℃孵育15min，再于98℃加热5min使连接酶失活；
55.s400、pcr反应：在s300完成连接反应的样本中，加入5～15ul pcr反应试剂混合液进行pcr扩增，所述pcr扩增的反应条件为(95℃x 30"；60℃x30"；72℃x1')x35,72℃20'；优选地，所述pcr反应试剂混合液的组分包括2ul sa primers,2ul sa聚合酶缓冲液，7.5ul ddh2o和0.5ul聚合酶；
56.s500、毛细管电泳分析：取s400的pcr扩增产物进行毛细管电泳分析，根据检测到的片段长度和峰面积，判断受检样本靶点的存在、缺失或重复。
57.基于上述方案，在一实施例中，所述te缓冲液包括10mm ph为8.0～8.5的tris-hcl和0.1mm edta。
58.基于上述方案，在一实施例中，所述参考探针为mrc-holland公司生产的p200探针。
59.基于上述，与现有技术相比，本发明提供的检测y染色体微缺失与微重复的方法，具有以下技术效果：
60.1、采用针对y染色体25个检测点位的特异性探针，其中含6个基本点位与19个扩展点位，每个点位有2条探针，具备序列特异即在全基因组里无相似，靶向特异性、杂交条件一致，实现与目标序列配对杂交。
61.2、在同一个反应管内针对待检dna同时检测y染色体微缺失与微重复、可同时检测靶点缺失、重复并估算拷贝数，重复性好，操作简单，可以同时检测多个样本，兼具定性与定量功能，并且该技术手段适用于多种类型的样本，如精液、外周血、羊水等各种标本，样本量要求只需20-50ngdna，经济简便。
62.3、通过软件分析结果峰值、与对照峰值比较，高，则重复，低，则缺失，结构判读直观且准确，易于普及。
63.4、该检测方法较为高效，检测时间短，一次反应可以同时检测25个靶序列拷贝数的改变，单管反应，减少操作步骤，降低人为失误，降低差错风险。
64.5、设计amel基因(x、y染色体上均有)内参，可鉴别假阴性；灵敏性高、dna样本量可低至20ng，且实验结果不受dna量的影响。
65.本发明的其它特征和有益效果将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书
中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他有益效果可通过在说明书、权利要求书以及附图中的内容来实现和获得。
附图说明
66.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图；在下面描述中附图所述的位置关系，若无特别指明，皆是图示中组件绘示的方向为基准。
67.图1为y染色体结构与基因排列示意图；
68.图2为多重连接依赖探针扩增(mlpa)技术原理示意图；
69.图3为正常已经婚育男性样本采用本发明提供的方法检测后得到的图谱；
70.图4为正常女性标本采用本发明提供的方法检测后得到的图谱；
71.图5为azfb区域缺失样本采用本发明提供的方法检测后得到的图谱；
72.图6为azfc区域缺失样本采用本发明提供的方法检测后得到的图谱；
73.图7为azfb c缺失样本采用本发明提供的方法检测后得到的图谱；
74.图8为azfa b c缺失样本采用本发明提供的方法检测后得到的图谱。
具体实施方式
75.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；下面所描述的本发明不同实施方式中所设计的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合；基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
76.在本发明的描述中，需要说明的是，本发明所使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义相同的含义，不能理解为对本发明的限制；应进一步理解，本发明所使用的术语应被理解为具有与这些术语在本说明书的上下文和相关领域中的含义一致的含义，并且不应以理想化或过于正式的意义来理解，除本发明中明确如此定义之外。
77.本发明提供如下实施例
78.实施例1-探针组合的设计
79.采用针对如表1所示的每个检测点位设计一组特异性探针，各个检测点位相对应的扩增产物的长度具有唯一性(88-168nt)：
80.表1
81.[0082][0083]
上述探针所采用的通用引物的左序列如seq id no.51所示，右序列如seq id no.52所示。
[0084]
实施例2、样本制备、pcr扩增程序及结果判读
[0085]
a、待检dna样本的获得
[0086]
选取已知的正常已婚育男性样本，已知的正常女性样本，已知的azfb区域缺失样本，已知的azfc区域缺失样本，已知的azfb c缺失样本，已知的azfa b c缺失样本，提取dna作为本发明的待检dna样本，无dna纯水样本作为对照；
[0087]
b、将上述实验材料采用如下检测方法进行检测，具体操作如下：
[0088]
s100、配制探针混合液：以te缓冲液制备实施例1的25组探针组合共3ul，每条探针终浓度为1um，并添加参考探针，终浓度为1um；
[0089]
制备dna模板：以te缓冲液制备100ng/5ul的待检dna样本，于98℃加热变性5min；
[0090]
s200、杂交捕获：将上述探针混合液和待检dna样本以体积比3:5混合，于95℃孵育1min，60℃杂交18h；
[0091]
s300、连接反应：在s200的基础上继续加入1ul连接酶和3ul缓冲液a和3ul缓冲液b、25ul ddh2o于54℃孵育15min，再于98℃加热5min使连接酶失活；
[0092]
s400、pcr反应：在s300完成连接反应的样本中，加入10ul pcr反应试剂混合液进行pcr扩增，所述pcr扩增的反应条件为(95℃x 30"；60℃x30"；72℃x1')x35,72℃20'；
[0093]
s500、毛细管电泳分析：取s400的pcr扩增产物进行毛细管电泳分析，具体采用abi基因分析仪3500和mrc-holland的coffalyser软件，根据检测到的片段长度和峰面积，判断受检样本靶点的存在、缺失或重复。
[0094]
其中，上述te缓冲液的组成为10mm ph为8.0～8.5的tris-hcl和0.1mm edta；
[0095]
参考探针为mrc-holland公司出品的，salsa mlpa p200探针；
[0096]
s300的连接反应加入的连接酶、缓冲液a、缓冲液b以及s400的pcr反应试剂混合液，均可选自mrc-holland公司的salsa mlpa ek1 reagent kit试剂盒成分；
[0097]
c、检测结果及判读
[0098]
图3为正常已经婚育男性样本经上述方法检测后得到的图谱，从图中可以看出25个靶点目标片段全部检测到，与实际结果相符；
[0099]
图4为正常女性标本经上述方法检测后得到的图谱，从图中可以看出除了内参amel片段外，其余24个男性特异片段，均未出现；
[0100]
图5为azfb区域缺失样本经上述方法检测后得到的图谱，从图中可以看出该男性患者a，未检出rbmy、sy127、sy134、sy113、sy1197、pry等片段，证实azfb缺失；
[0101]
图6为azfc区域缺失样本经上述方法检测后得到的图谱，从图中可以看出该男性患者b，未检出daz1、sy152、sy157等片段，证实azfc部分缺失。
[0102]
图7为azfb c缺失样本经上述方法检测后得到的图谱，从图中可以看出该男性患者c，未检出azfb与azfc区域的所有目标片段，证实合并azfb与azfc大片段缺失。
[0103]
图8为azfa b c缺失样本经上述方法检测后得到的图谱,从图中可以看出该男性患者d，未检出azfb、azfb与azfc区域的所有目标片段，证实合并azfa、azfb与azfc大片段缺失。
[0104]
另外，本领域技术人员应当理解，尽管现有技术中存在许多问题，但是，本发明的每个实施例或技术方案可以仅在一个或几个方面进行改进，而不必同时解决现有技术中或者背景技术中列出的全部技术问题。本领域技术人员应当理解，对于一个权利要求中没有提到的内容不应当作为对于该权利要求的限制。
[0105]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。