结合在神经自身免疫疾病中靶向中枢神经系统的自身抗体的嵌合自身抗体受体(CAAR)的制作方法

结合在神经自身免疫疾病中靶向中枢神经系统的自身抗体的嵌合自身抗体受体(caar)
技术领域
1.本发明涉及采用嵌合自身抗体受体的靶向细胞疗法和神经自身免疫疾病的治疗的领域。
2.本发明涉及能够将免疫细胞靶向至产生自身抗体的b细胞的嵌合自身抗体受体(caar)。该caar包含自身抗原或其片段，所述自身抗原或其片段结合与主要靶向中枢神经系统的神经自身免疫疾病相关的自身抗体。本发明涉及编码嵌合自身抗体受体(caar)的核酸分子，该核酸分子包含：编码自身抗原或其片段的序列，所述自身抗原或其片段结合与主要靶向中枢神经系统的神经自身免疫疾病相关的自身抗体；编码跨膜结构域的序列；以及编码细胞内信号传导结构域的序列。
3.在一种实施方式中，由所述核酸序列编码的自身抗原包含以下或由以下组成：n-甲基-d-天冬氨酸受体(nmdar)或一个或多个nmdar片段。本发明进一步涉及本发明的嵌合自身抗体受体(caar)蛋白质、包含编码本发明的嵌合自身抗体受体(caar)的核酸分子的载体、包含编码caar的核酸分子的基因修饰的免疫细胞以及该免疫细胞在治疗或预防主要靶向中枢神经系统的神经自身免疫疾病中的用途，所述神经自身免疫疾病诸如自身免疫性脑病或脑脊髓病，优选地为抗nmdar脑炎。


背景技术：

4.自身免疫，作为神经系统疾病的主要组成部分，是对身体自身器官的误导性免疫应答。当自身免疫(自身抗体)靶向中枢或周围神经系统内的结构时，就会发生神经自身免疫疾病。抗n-甲基-d-天冬氨酸受体脑炎(抗nmdar脑炎)最近被发现是一种自身免疫性神经精神疾病，其中形成了针对nmda受体的nr1亚基的自身抗体，并且所述自身抗体与大脑中的nmda受体(nmdar)结合(titulaer 2013)。自身抗体与nmdar的结合导致受体的内化，并从而导致受影响的神经细胞功能障碍(kreye 2016)，通常以诸如癫痫发作、意识损伤、运动障碍、记忆力减退和精神病迹象的症状为特征(dalmau 2011,pr
ü
ss 2017)。
5.从患者的血液和脑脊液中去除自身抗体产生显著的临床改善，使得许多患者在去除所述自身抗体的适当治疗后可以独立生活。然而，严重的问题与使用非特异性免疫抑制(以耗尽产生抗体的b细胞)的既定治疗方法诸如甾体治疗、血浆置换、环磷酰胺或利妥昔单抗治疗有关。这些治疗使患者的病情有所改善，但伴随着显著的副作用(titulaer 2013)。
6.在血浆置换的情况下，不良副作用通常出现为由中心静脉导管引起的损伤，循环障碍诸如低血压的发展和/或循环调节异常，即由于体液转移，凝血障碍伴血栓形成，以及感染，包括脓毒症。
7.除了药物疗法有时显著的众所周知的副作用之外，药物诱导的免疫抑制特别容易引起严重感染。此外，通过接种疫苗进行预防以及通过攻击细菌和病毒感染的有益抗体来保护身体可能会被非特异性免疫疗法所抵消。
8.例如，去除自身抗体本身通常不会导致去除产生自身抗体的细胞，即致病剂的来
源。在抗nmdar脑炎的急性期，负责的b细胞会产生大量致病的自身抗体。只要负责的b细胞保持活性，这种产生就不会因自身抗体的去除而受到抑制，从而导致必须重复去除自身抗体的程序，诸如单采(apheresis)等。
9.这些问题只能通过用于去除疾病特异性自身抗体及其产生原因的选择性方法来解决。至今为止，据发明人所知，对于治疗神经自身免疫疾病，尚没有有效的根据该原理起作用的治疗方式，即特异性去除选定的产生自身免疫抗体的细胞。
10.一般来说，表达嵌合抗原受体(car)的t细胞(car-t细胞)是经过基因工程化的人t细胞，使得其激活取决于car的t细胞定位抗体和靶细胞表面上的靶肽之间的结合。car-t细胞主要用于癌症治疗，其中它们通过car的抗原部分检测肿瘤特异性表位，并选择性激活t细胞介导的细胞毒性活性以杀伤肿瘤细胞。靶向白血病和淋巴瘤b细胞上的cd19抗原的过继性嵌合抗原受体(car)-t细胞疗法已经带来了显著的临床疗效，并且目前已有40多项cd19 car-t细胞研究在fda注册用于治疗b-nhl和b-all。
11.然而，本发明采用从工程化t细胞(caar-t细胞)表达的嵌合自身抗体受体(caar)，其中caar作为靶向结构域而不是抗体片段包含结合自身抗体的自身抗原，所述自身抗体在神经自身免疫疾病中明显可见并且由致病的b细胞呈递。caar自身抗原将工程化t细胞引导至产生自身抗体的b细胞，其中自身抗体和caar自身抗原之间的结合导致工程化t细胞的激活以及有毒介质的释放，从而导致疾病特异性b细胞的溶解(图1a)。其他b细胞(例如，产生/呈递有益抗体的b细胞，例如在接种疫苗后)仍然免于t细胞介导的b细胞耗尽(图1b)。
12.ellebrecht等人(2016，science)和wo 2015/168613描述了一种采用caar-t构建体的类似方法，该构建体针对结合皮肤细胞粘附蛋白桥粒芯蛋白3(dsg3)的自身抗体。实现了耗尽产生dsg3自身抗体的b细胞。
13.richman等人(nih授权申请9600548)也提出了表达嵌合自身抗体受体(caar)的t细胞(caart)攻击肌肉特异性激酶(musk)-mg实验性自身免疫性musk肌无力(eamm)的大鼠模型中产生自身抗体的b细胞。对于caar，传统car的单链抗肿瘤fv被自身抗原(musk胞外结构域)取代，以靶向显示在自身免疫性b细胞表面上的抗musk自身抗体。
14.fransson等人(2012)公开了慢病毒载体修饰的t细胞，其表达靶向髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog)的嵌合抗原受体(car)。ryan等人(2017年)参考了fransson，并提到了ellebrecht(2016年)中公开的dsg3-caar。这些参考文献均未教导caar，该caar作为靶向结构域包含与神经自身免疫疾病中明显可见的自身抗体结合的自身抗原。
15.wo2018127585教导了对产生自身抗体的b细胞具有特异性的嵌合自身抗体受体(caar)。建议将n-甲基-d-天冬氨酸受体作为此类自身抗原的实例。然而，对于该实施方式未提供实验支持，并且效应t细胞被排除在此类构建体的使用之外。wo2018127584教导了treg细胞的单特异性群体，其中所述treg细胞包含嵌合受体，其中所述嵌合受体识别b细胞表面标记物。没有提到包含结合神经自身免疫疾病中的自身抗体的自身抗原的caar。
16.chatenoud(2016)和tahir(2018)提供了caar技术的概述，并参考了ellebrecht(2016)的caar。ludwig(2017)、wo2015177512、kreye(2016)和mckee(2017)提供了nmdar脑炎和nmdar自身抗体的背景信息。没有提到包含结合神经自身免疫疾病中的自身抗体的自身抗原的caar。
17.因此，本发明解决了治疗神经自身免疫疾病时广泛和非特异性的免疫耗尽和免疫
抑制问题。虽然已经确立或正在开发一些治疗神经自身免疫疾病的潜在替代方案，但仍然非常需要提供有效手段来解决此类疾病，特别是治疗主要靶向中枢神经系统的神经自身免疫疾病，以避免广泛的免疫抑制。


技术实现要素：

18.根据现有技术，本发明潜在的技术问题是提供替代或改进手段来治疗和/或预防神经自身免疫疾病，诸如主要靶向中枢神经系统的神经自身免疫疾病，优选抗nmdar脑炎。本发明的进一步目的是提供这样的治疗方式，同时避免或最小化广泛和非特异性免疫抑制。
19.该问题通过独立权利要求的特征得以解决。本发明的优选实施方式由从属权利要求提供。
20.因此，本发明涉及编码嵌合自身抗体受体(caar)的核酸分子，所述核酸分子包含：
21.i.编码自身抗原或其片段的序列，所述自身抗原或其片段结合与主要靶向中枢神经系统的神经自身免疫疾病相关的自身抗体，
22.ii.编码跨膜结构域的序列，和
23.iii.编码细胞内信号传导结构域的序列。
24.据发明人所知，本发明的caar代表了首个用于治疗主要靶向中枢神经系统的神经自身免疫疾病的自身抗体特异性细胞免疫治疗方法。令人惊讶的是，本文所述的包含自身抗原的构建体将在应用于以下实例的体外和体内模型中表现出如此优异的自身抗体特异性b细胞耗尽。
25.与现有技术中所述的治疗相比，本发明带来了许多根本改进和优势，例如本文所述的caar以及本发明的相关方面，包括相应的经caar修饰的免疫细胞，为治疗本文所述的神经自身免疫疾病提供了选择性的和潜在治愈的方法。自身抗体特异性是通过加入作为经caar修饰的免疫细胞的靶向结构域的自身抗原实现的，所述自身抗原与神经自身免疫疾病中的自身抗体结合，导致选择性去除病原，而很少或没有广泛的免疫抑制。此外，消除产生自身抗体的b细胞代表了潜在治愈的效果，使得移除了病原的根本原因，从而在因果关系的层面上解决了疾病，并从而增加了长期或永久缓解疾病的机会。这些益处的结合代表了出人意料的有效方法，其在由于广泛的免疫抑制或疾病复发的潜在副作用方面风险较低。
26.因此，用于本文所述构建体中的特异性自身抗原代表了在主要靶向中枢神经系统的神经自身免疫疾病中被自身抗体靶向的一组新颖且具创造性的自身抗原。因此，根据本发明的待治疗的特定医学病症也代表了一组新颖且具创造性的自身免疫疾病，其中自身抗体主要靶向中枢神经系统。
27.本发明代表了在治疗例如周围神经自身免疫疾病诸如重症肌无力方面，与此类caar构建体的早期描述相比令人惊讶且有益的进展。与类似caar构建体的早期描述相比，主要靶向中枢神经系统的自身抗原的自身抗体的有效耗尽代表了重大且令人惊讶的医学进步。
28.本领域技术人员能够选择合适的自身抗原，已知为主要靶向中枢神经系统的自身抗体的靶标，以引入本发明的caar。例如，存在针对任何给定自身抗原的血清或脑脊液(csf)抗体表明了该自身抗原在本发明中的适宜性。此类自身免疫疾病的各种亚组如下所
示，并代表了本发明的优选非限制性实施方式。
29.在一种实施方式中，由核酸序列编码的自身抗原在自身免疫性脑病或脑脊髓病中与自身抗体结合。
30.在一种实施方式中，由核酸序列编码的自身抗原在抗n-甲基-d-天冬氨酸受体脑炎(抗nmdar脑炎)中与自身抗体结合。
31.在一种实施方式中，由核酸序列编码的自身抗原包含以下或由以下组成：n-甲基-d-天冬氨酸受体(nmdar)或一个或多个nmdar片段。
32.dalmau及其同事首次描述了抗n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)受体脑炎(dalmau等人，2008年)，他们发现多个患者表现出显著的神经精神症状。所有患者都被证实具有针对nmda受体的血清或脑脊液(csf)抗体。抗nmdar脑炎是一种严重的疾病，患者通常表现出精神症状诸如躁动、怪异且不受抑制的行为、妄想、听觉和视觉幻觉、认知功能障碍诸如短期记忆丧失、运动功能障碍诸如运动障碍和口面部运动障碍以及癫痫发作。
33.在一种实施方式中，由核酸序列编码的自身抗原包含以下或由以下组成：nmda受体的nr1亚基或其一个或多个片段。
34.在一种实施方式中，由核酸序列编码的自身抗原包含以下或由以下组成：nmda受体的nr2亚基或其一个或多个片段。
35.研究表明，nr1亚基的细胞外n末端结构域是抗nmdar脑炎中致病性自身抗体的主要表位。因此可以使用nmdar的不同部分，并因此优选的是nr1亚基或其一个或多个片段。
36.用于定义nmda受体的各种结构域的命名法不被认为局限于本发明。因此，相应地纳入了结构域的替代命名法。例如，术语“glun1”已在相关文献中用于表示术语“nr1”，术语“glun2”已在文献中用于表示“nr2”。此外，例如在ncbi数据库中的基因id:2902下，术语grin1(谷氨酸离子通道型受体nmda型亚基1)已用于描述nr1亚基。可采用诸如本领域常用的替代命名法，诸如nr1、mrd8、glun1、nmda1、ndhmsd、ndhmsr、nmd-r1和nmdar1。因此，本发明涵盖了该替代nmdar结构域命名法和相应的结构域。
37.本领域技术人员已知从nmdar确定自身抗原和相关表位的方法，诸如采用基于细胞的测定的方法，或未固定小鼠脑切片的免疫组织化学，或在各种实验条件下使用的类似方法。可以使用自身抗原的不同亚基(例如nr1和/或nr2，或其各种片段)或不同体液(血清、血浆或csf)，并且可以检测到不同的免疫球蛋白(但不限于igg、iga和/或igm)。
38.在一种实施方式中，由核酸序列编码的自身抗原包含以下或由以下组成；nmda受体的氨基末端结构域(atd)或其一个或多个片段。
39.在进一步的实施方式中，nmda受体的一个或多个片段或nmda受体的任何给定结构域是与相关疾病中存在的自身抗体结合的片段。本领域技术人员能够检测本文所述的任何相关疾病中的自身抗体，并进一步确定与所述抗体结合的自身抗原。因此，可在本发明的caar中相应地使用该自身抗原。
40.在一种实施方式中，由核酸序列编码的自身抗原包含以下或由以下组成：nmda受体的氨基末端结构域(atd)、s1结构域和s2结构域或其一个或多个片段，以及任选的定位于所述结构域或其片段之间的接头或间隔子。
41.在一种实施方式中，由核酸序列编码的自身抗原包含以下或由以下组成：nmda受体的氨基末端结构域(atd)和s1结构域和/或s2结构域或其一个或多个片段，以及任选的定
位于所述结构域或其片段之间的接头或间隔子。
42.如以下实例所示，氨基末端结构域与nmdar的s1结构域和s2结构域的组合使用导致有效的自身抗体结合，以及随后耗尽产生致病性自身抗体的细胞。
43.在一种实施方式中，由核酸序列编码的自身抗原包含以下或由以下组成：选自由富亮氨酸胶质瘤失活1(lgi1)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体(ampar)、含ig样结构域蛋白5(iglon5)、代谢型谷氨酸受体5(mglur5)、谷氨酸脱羧酶(gad)、接触蛋白相关蛋白样2(caspr2)、γ-氨基丁酸(gaba)受体诸如gaba-a和/或gaba-b、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog)和水通道蛋白4(aqp4)或其一个或多个片段组成的组的蛋白质。
44.上述附加自身抗原已知是在主要靶向中枢神经系统的神经自身免疫疾病中的致病性自身抗体的靶标。本领域技术人员能够确定抗原是否适合本文所述的方法。使用例如elisa技术的常规方法可应用于任何给定的固定化候选自身抗原，其随后与患者样本诸如尿液、血液、血清或csf孵育，并随后进行对与固定化抗原结合的抗体的检测，以便确定任何给定自身抗原是否代表合适的靶向结构域，以便引导caar工程化免疫细胞的活性以耗尽所关注的特定致病性b细胞。
45.此外，本发明的caar构建体表现出出人意料的和有利的特性。例如，当可溶性nr1反应性抗体存在于细胞培养基中时，用本发明caar转导的t细胞仅显示出轻微的杀伤效率降低。该数据将在下文更详细地描述，表明了本发明的caar表达细胞在类似于在患者中发现的情况下保持其功能，即当可溶性nr1反应性抗体存在并且潜在地作为本发明的caar表达细胞的结合靶标进行竞争时。这种特性不可能从现有技术中预料到或从现有技术中衍生出来，并且指示了本发明的caar所诱导的优异活性。这些优势与atd-caar和atd-s1-s2-t细胞都特别相关。
46.在本发明的一种实施方式中，caar表达细胞诸如t细胞在可溶性反应性抗体的存在下保持针对呈递不期望的自身抗体的靶细胞的细胞毒性活性。在优选实施方式中，caar包含自身抗原，所述自身抗原包含以下或由以下组成：nmda受体的氨基末端结构域(atd)、s1结构域和s2结构域或其一个或多个片段，以及任选的定位于所述结构域或其片段之间的接头或间隔子。
47.本发明的caar的有益特性的另一实例是，可以使用临床批准的酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼(dasatinib)暂时停止表达本发明caar的细胞，例如caar-t细胞。因此，这种特性可以实现一种“安全策略”，通过这种策略可以使用药物达沙替尼暂时灭活caar表达细胞，诸如t细胞，以帮助降低急性毒性。如果施用的caar表达细胞的细胞毒性导致了一些不期望的作用，可以施用达沙替尼以暂时去活其活性。caar表达细胞可以在药物停用后恢复其细胞毒性作用(针对呈递不期望的自身抗体的细胞)。因此，达沙替尼联合施用是调节caar表达细胞的细胞毒性的一种方式，可用于在施用后滴定副作用或作为安全开关。这种特性不可能从现有技术中预料到或从现有技术中衍生出来，并且指示了本发明的caar所诱导的优异活性。这些优势与atd-caar和atd-s1-s2-t细胞都特别相关。
48.在本发明的一种实施方式中，可通过用合适的试剂优选达沙替尼治疗而暂时抑制caar表达细胞，诸如t细胞。在优选实施方式中，caar包含自身抗原，所述自身抗原包含以下或由以下组成：nmda受体的氨基末端结构域(atd)、s1结构域和s2结构域或其一个或多个片段，以及任选的定位于所述结构域或其片段之间的接头或间隔子。
49.在一些实施方式中，caar构建体额外地编码(并且caar多肽相应地包含)标记物，诸如转导标记物(优选地为截短的表皮生长因子受体；egfrt)，以便可以富集更多数量的caar阳性t细胞。作为进一步的优点，具有额外转导标记物的构建体可以在体内环境中通过用治疗性抗体诸如西妥昔单抗作为救援药物进行治疗来实现疗法的受控结束。因此，这些构建体包含转基因编码的细胞表面多肽，用于工程化细胞的选择、体内追踪和/或消融。
50.在进一步的实施方式中，如本文所述的编码caar的核酸分子具有以下一个或多个特征：
[0051]-跨膜结构域是cd28、icos或cd8α跨膜结构域；
[0052]-细胞内结构域包含cd28、icos或cd137(4-1bb)共刺激结构域，或其任意组合；
[0053]-细胞内结构域包含cd3ζ链信号传导结构域；和/或
[0054]-核酸分子额外地包含编码定位于自身抗原和跨膜结构域之间、和/或定位于自身抗原的n-末端和/或自身抗原的片段之间、和/或定位于跨膜结构域和细胞内共刺激结构域之间的一个或多个前导多肽、接头多肽和/或间隔多肽的一个或多个序列。
[0055]
如下文的实例所示，上述跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域，任选地与本文所述的接头组合，导致有效的自身抗体特异性b细胞耗尽。这些优选实施方式是非限制性的，并且本领域技术人员能够采用替代car构建体来代替本文提到的那些优选实施方式。
[0056]
在进一步的实施方式中，本发明的caar的特征在于，共刺激结构域(跨膜结构域和细胞内信号传导结构域)包括来自cd28、cd137(4-1bb)、icos、cd134(ox40)、daplo、cd27、cd2、cd5、icam-1、lfa-1、lck、tnfr-j、tnfr-ii、fas、cd30、cd40及其组合中的任意一个或多个的信号传导结构域。
[0057]
在进一步的实施方式中，本发明的caar的特征在于，跨膜结构域选自i型跨膜蛋白的人工疏水序列和跨膜结构域、t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、icos、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137和cd154。
[0058]
在其他实施方式中，本发明的caar的特征在于，细胞内信号传导结构域包括人cd3ζ链、fcyrlii、fccri、fc受体的胞质尾区、带有胞质受体的免疫受体酪氨酸基激活基序(itam)、tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d及其组合中的一个或多个的信号传导结构域。
[0059]
下面描述的实施方式代表了由发明人开发的caar构建体的优选但非限制性实施方式。考虑了下面描述的特定结构域中的变体并且包含在本发明的范围内。
[0060]
在进一步的实施方式中，编码如本文所述的嵌合自身抗体受体(caar)的核酸分子包含：
[0061]
i.编码前导多肽的序列，其中所述前导多肽优选地是cd8前导多肽或nr1前导多肽，所述序列优选地分别包含根据seq id no 1或seq id no 2的序列；
[0062]
ii.编码自身抗原的序列，其中所述自身抗原优选地是n-甲基-d-天冬氨酸受体(nmdar)或一个或多个nmdar片段，所述序列优选地包含根据seq id no 3(atd)和/或seq id no 4(s1)和/或seq id no 5(s2)和/或seq id no 6(nr1)的序列或编码nmdar nr1蛋白的自身抗原片段(即由致病性自身抗体结合的片段)的seq id no 6的任何亚序列；
[0063]
iii.任选的编码定位于一个或多个nmdar片段之间的接头多肽的序列，所述序列优选地包含根据ggcacc(接头-1)的序列；
[0064]
iv.任选的编码定位于所述自身抗原和跨膜结构域之间的接头多肽的序列，所述序列优选地包含根据seq id no 7(接头-2)或seq id no 32(接头-2b)的序列；
[0065]
v.编码跨膜结构域优选cd8α跨膜结构域或icos跨膜结构域的序列，所述序列优选地包含根据seq id no 8(cd8α)或seq id no 9(icos)的序列；
[0066]
vi.任选的编码定位于跨膜结构域和细胞内信号传导结构域之间的接头多肽的序列，所述序列优选地包含根据ggcagc(接头-3)的序列；和/或
[0067]
vii.编码细胞内信号传导结构域的序列，所述细胞内信号传导结构域优选地包含cd137(4-1bb)共刺激结构域和cd3ζ链信号传导结构域，所述序列优选地分别包含根据seq id no 10(cd137)和seq id no 11(cd3z)的序列，其中任选地将接头序列定位在共刺激结构域和信号传导结构域之间。
[0068]
在一些实施方式中，编码如本文所述的嵌合自身抗体受体(caar)的核酸分子包含根据seq id no 24(atd-s1-s2)或seq id no 25(atd-s1)或seq id no 26(atd)或seq id no 27(atd-icos)的序列。
[0069]
在优选实施方式中，本发明涉及分离核酸分子，任选地呈分离载体诸如分离病毒载体或转座子的形式，所述分离核酸分子选自由以下组成的组：
[0070]
a)包含核苷酸序列的核酸分子，
[0071]-所述核苷酸序列编码如本文所述的caar多肽，
[0072]-所述核苷酸序列编码靶向(即细胞外抗原结合(自身抗体结合)结构域或其部分，所述序列包含seq id no 3、4、5和/或6中的一个或多个，和/或
[0073]-所述核苷酸序列编码如本文所述的caar多肽，所述序列包含seq id no 24、25、26和/或27中的一个或多个；
[0074]
b)与根据a)的核苷酸序列互补的核酸分子；
[0075]
c)包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列具有足够的序列同一性以在功能上类似于/等效于根据a)或b)的核苷酸序列，包含优选地与根据a)或b)的核苷酸序列至少50％，优选60％、70％、80％、85％、90％或95％的序列同一性；
[0076]
d)作为遗传密码的结果退化为根据a)到c)的核苷酸序列的核酸分子；和/或
[0077]
e)根据a)到d)的核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列通过缺失、添加、置换、易位、倒位和/或插入进行修饰，并且在功能上类似于/等效于根据a)到d)的核苷酸序列。
[0078]
如本文所述的核苷酸序列的长度变化也包含在本发明中。本领域技术人员能够提供长于或短于seq id no 3-6的核酸序列变体，其仍将表现出与本文所述蛋白质的密码足够的相似性，以便提供所需的结果。
[0079]
例如，如本文所述，包含比所公开形式少10个、20个、30个、40个或最多50个核酸的seq id no 3-6的较短变体也可实现对自身抗原的有效编码。因此，也考虑了seq id no 3-6的片段。此外，如本文所述，包含比seq id no 3-6多10个、20个、30个、40个或最多50个任何给定附加序列的核酸的seq id no 3-6的较长变体也可实现有效结果。
[0080]
在进一步的方面，本发明涉及包含编码如本文所述的嵌合自身抗体受体(caar)的核酸分子的载体。
[0081]
在一些实施方式中，载体是病毒载体，诸如慢病毒载体或逆转录病毒载体。
[0082]
在一些实施方式中，载体是作为转染载体的纳米颗粒。
28(atd-s1-s2)或seq id no 29(atd-s1)或seq id no 30(atd)或seq id no 31(atd-icos)的序列。
[0100]
如本文所述的氨基酸序列的长度变化也包含在本发明中。本领域技术人员能够提供长于或短于seq id no 14-17的氨基酸序列变体，其仍将表现出与本文所述的特定蛋白质足够的相似性，以便提供所需的结果。例如，如本文所述，包含比全长形式少10个、20个、30个、40个或最多50个氨基酸的seq id no 14-17的较短变体也可实现有效结合。因此，也考虑了seq id no 14-17的片段。此外，如本文所述，包含10个、20个、30个、40个或最多50个任何给定附加序列的氨基酸的seq id no 14-17的较长变体也可实现有效结果。
[0101]
在本发明的其他实施方式中，所使用的自身抗原蛋白质可包含以下或由以下组成：与seq id no 14-17具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。优选地，序列变体包含与seq id no 14-17至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且优选地表现出与本文所述的特定人蛋白质的功能相似性。通过确定如本文所述的相同或类似的自身抗原结合和/或自身抗体特异性b细胞耗尽来评估功能相似性。本领域技术人员已知用于确定所需结合的合适体外测定。
[0102]
氨基酸序列还可在seq id no 14-17的蛋白质的n-末端和/或c-末端包含0至100个、2至50个、5至20个或例如8至15个，或从0至20的任何值的氨基酸添加或缺失。只要基本上保持蛋白质关于自身抗体结合的特性，就也可以用附加的接头序列或序列的去除来修饰末端。
[0103]
本发明的另一令人惊讶的方面是如本文所公开的caar的改进的稳定性。caar多肽可容易地在适当条件下长期储存，而不会丧失任何结合亲和力。
[0104]
本发明的优选氨基酸和核苷酸序列：
[0105]
[0106]
[0107]
[0108]
[0109]
[0110]
[0111]
[0112]
[0113][0114]
在进一步的方面，本发明涉及基因修饰的免疫细胞，其包含如本文所述的编码caar的核酸分子或含有此类核酸分子的载体，和/或表达如本文所述的caar。
[0115]
在一种实施方式中，基因修饰免疫细胞选自由t细胞、nk细胞、巨噬细胞或树突状细胞组成的组。
[0116]
在一种实施方式中，如本文所述的基因修饰免疫细胞是t淋巴细胞(t细胞)，并且所述t淋巴细胞是cd8 和/或cd4 细胞毒性t淋巴细胞或其混合物。
[0117]
在一些实施方式中，可编辑caar工程化免疫细胞以缺失tcr以避免gvhd反应。在一些实施方式中，可编辑caar工程化免疫细胞以缺失hla以避免同种异体排斥并成为“通用caar-t细胞”。
[0118]
在优选实施方式中，免疫细胞优选地为t淋巴细胞、nk细胞、巨噬细胞或树突状细胞。在一些优选实施方式中，免疫细胞具有细胞毒性，优选地对呈递和/或分泌自身抗体的b细胞具有细胞毒性。细胞毒性免疫细胞在本领域已知响应于不期望的试剂、细胞或病原体表现出细胞溶解和/或其他有益活性。通过将这些细胞的活性导向特定的免疫原性靶标，即本文所述的自身抗原，可通过本文所述的免疫细胞的相应活性消除致病细胞。
[0119]
在优选实施方式中，免疫细胞是t淋巴细胞，优选细胞毒性t淋巴细胞或t辅助细胞。
[0120]
在一些实施方式中，caar工程化免疫细胞可被工程化以额外共表达细胞因子(诸如il-15、il-12、ifn-γ、ifn-α、gm-csf、flt3l、il-21、il-23)或共刺激配体(cd80、cd86、cd40l)以改善免疫治疗效果。
[0121]
在一些实施方式中，caar工程化免疫细胞可被工程化以额外共表达sirna或shrna或mirna以下调，或可用crispr/cas进行基因编辑以敲除t细胞受体和主要组织相容性复合体的表达，使得这些细胞可用作同种异体细胞疗法。
[0122]
在一些实施方式中，caar工程化免疫细胞可被工程化以额外共表达sirna或shrna或mirna以下调，或可用crispr/cas进行基因编辑以敲除t细胞表面上的检查点分子(pd1、tim3、lag等)的表达。
[0123]
采用下调主要组织相容性复合体或t细胞表面上的检查点分子的组合方法在优化局部免疫环境以增强本发明的caar工程化免疫细胞对致病性b细胞的细胞溶解作用方面产生了额外的潜在协同效应。
[0124]
在进一步的方面，本发明涉及如本文所述的用于治疗或预防主要靶向中枢神经系统的神经自身免疫疾病的免疫细胞。
[0125]
在一些实施方式中，本发明涉及如本文所述的用于治疗或预防自身抗体介导的精神病症的免疫细胞。
[0126]
在一种实施方式中，本发明不包括治疗或预防主要靶向周围神经系统的神经自身免疫疾病。在一种实施方式中，此类疾病为重症肌无力。
[0127]
在一些实施方式中，本发明涉及如本文所述的用于治疗或预防自身免疫性脑病或
脑脊髓病的免疫细胞。
[0128]
因此，本发明涉及caar工程化免疫细胞的医学用途。因此，本发明还包括用于治疗或预防如本文所述的医学病症的方法，包括向有此需要的受试者施用如本文所述的(包括/表达本发明的caar的)免疫细胞。
[0129]
在一些实施方式中，自身免疫性脑病是与针对n-甲基-d-天冬氨酸受体(nmdar)的自身抗体相关的医学病症。
[0130]
在优选实施方式中，待治疗的医学病症为抗nmdar脑炎。
[0131]
因此，本发明的主题是本发明的caar或相应的工程化免疫细胞在治疗受试者的疾病或病症中的医学用途，所述疾病或病症与抗nmdar抗体相关，并且在特定实施方式中，额外具有选自包括根据以下列表的临床症状/病症的组的至少一种临床症状或临床病症(括号中的icd编号是指定义临床病症的who国际疾病分类)：
[0132]-精神异常，包括抑郁(f32)、伴有精神症状的躁狂(f30.2)、焦虑(f06.4)、恐怖性焦虑(f40)、妄想(f22.0)、强迫性障碍(f42)、器质性妄想性障碍(f06.3)、紧张症(f06.1、f20.2)、急性多态性精神病性障碍(f23.0、f23.1)、解离性障碍(f44)
[0133]-运动障碍，包括动作障碍/肌张力障碍(g24)、肌阵挛(g25.3)、震颤(g25.0、g25-1、g25-2)、抽搐(f95、g25.69)
[0134]-癫痫发作(g40)
[0135]-换气不足(r06.89)
[0136]-轻度认知损害(f06.7)
[0137]-阿尔茨海默病性痴呆(f00)、血管性痴呆(f01)、其他疾病痴呆(f02)
[0138]-妊娠。
[0139]
本发明具有以下优点：
[0140]-高选择性去除产生nmda受体抗体的b细胞；
[0141]-短期治疗效果和长期、潜在永久性的致病性抗体耗尽；
[0142]-预防或显著降低临床复发的风险；
[0143]-没有或减少严重的一般免疫抑制，即降低感染或脓毒症的风险；
[0144]-没有或减少对疫苗接种的负面影响；
[0145]-没有或减少毒性免疫副作用；
[0146]-不期望的免疫应答是可治疗的，例如通过il-6拮抗剂；
[0147]-立即(优选在数小时内)耗尽致病性b细胞；
[0148]-低施用次数，优选地进行细胞的单次施用，例如通过静脉内途径。
[0149]
根据本发明，任何给定方面的实施方式被认为适用于其他方面和实施方式，从而预期如本文所公开的特定实施方式的组合。例如，关于医学治疗公开的实施方式可以被合并为caar的功能特征，反之亦然。
具体实施方式
[0150]
所有引用的专利和非专利文献的文件，其全部内容通过援引并入本文。
[0151]
自身抗原和疾病描述：
[0152]
本发明涉及能够将免疫细胞靶向产生自身抗体的b细胞的嵌合自身抗体受体
(caar)，其中该caar包含自身抗原或其片段，所述自身抗原或片段结合与主要靶向中枢神经系统的神经自身免疫疾病相关的自身抗体。
[0153]
因此，caar的自身抗原代表靶向亚基，相当于car的细胞外抗原结合结构域，其将免疫细胞靶向待耗尽的b细胞。
[0154]
如本文所用，术语“结合与主要靶向中枢神经系统的神经自身免疫疾病相关的自身抗体的自身抗原或其片段”表示包含在caar内的自身抗原的功能定义。本领域技术人员能够确定此类自身抗原和相关的医学病症。因此，自身抗原和抗体之间的结合是一种既定现象，且本质上反映了任何给定抗体与其靶标之间的物理相互作用。
[0155]
如本文所用，术语“主要靶向中枢神经系统的神经自身免疫疾病”涉及具有自身免疫成分的任何医学病症，其中与周围神经系统相比，存在针对主要在中枢神经系统表达的特异性自身抗原的自身抗体；或具有自身免疫成分的任何医学病症，其中自身抗体与在中枢神经系统表达的特异性自身抗原的结合是该疾病的主要致病作用。
[0156]
本领域技术人员已知各种神经自身免疫病症，其中自身抗体通常靶向主要是中枢或周围神经系统的自身抗原。然而，其中自身抗体针对存在于中枢和周围神经系统两者中的靶标的医学病症也是已知的。因此，本发明设想在本发明的caar中使用作为疾病中自身抗体靶标的自身抗原，在所述疾病中所述自身抗体主要靶向中枢神经系统的成分，或者在所述疾病中所述自身抗体的致病作用是由靶向中枢神经系统中的自身抗原的自身抗体引起的。
[0157]
如本文所用，“中枢神经系统”或cns是指由大脑和脊髓组成的神经系统部分。cns包含在背部体腔内，大脑位于颅腔内，以及脊髓位于椎管内。cns分为白质和灰质。这也可以宏观地在脑组织上看到。白质由轴突和少突胶质细胞组成，而灰质由神经元和无髓鞘纤维组成。这两种组织都包含许多神经胶质细胞(尽管白质中含有更多)，它们通常被称为cns的支持细胞。
[0158]
从脊髓和到脊髓的是周围神经系统以脊髓神经形式的投射。神经将脊髓连接到皮肤、关节、肌肉等，并允许传出运动以及传入感觉信号和刺激的传输。这允许肌肉的自主和非自主运动，以及感官感知。
[0159]
如本文所用，“周围神经系统”(pns)由大脑和脊髓外的神经和神经节组成。pns的主要功能是将cns连接到四肢和器官，基本上充当大脑、脊髓和身体其他部分之间的中继。与cns不同，pns不受脊柱和颅骨的保护，也不受血脑屏障的保护。
[0160]
主要靶向周围神经系统的神经自身免疫病症的一个实例是病症重症肌无力，在一些实施方式中，本发明未涵盖该病症。重症肌无力是一种慢性自身免疫性神经肌肉疾病，其导致骨骼肌无力，骨骼肌负责呼吸和运动身体部位，包括手臂和腿部。重症肌无力是由神经冲动传递到肌肉中的错误引起的。当神经和肌肉之间的正常通讯在神经肌肉连接处，即神经细胞与其控制的肌肉连接的地方中断时，就会发生重症肌无力。在重症肌无力中，自身抗体阻断和/或破坏神经肌肉连接处的乙酰胆碱的受体，从而阻止肌肉收缩。在大多数重症肌无力个体中，这是由乙酰胆碱受体自身的抗体引起的。然而，针对其他蛋白质诸如musk(肌肉特异性激酶)蛋白的抗体，也会导致神经肌肉连接处的传递受损。因此，根据本发明，病症重症肌无力是主要靶向周围神经系统而非中枢神经系统的神经自身免疫病症的一个实例。在一些实施方式中，当这些自身抗原主要靶向周围神经系统时，本发明不包括靶向神经肌
肉疾病的自身抗原。
[0161]
现在新兴的研究表明，自身抗体确实可以进入cns(zong等人，2017)，并且在cns中存在产生自身抗体的b细胞。在正常情况下，免疫球蛋白以较低的速率通过血脑屏障(bbb)；一个很好的实例为免疫球蛋白g(igg)。脑脊液(csf)中的igg浓度为外周循环中水平的大约1％。这表明，一旦自身抗体到达cns，它们就会引起疾病，正如在自身免疫性脑炎中观察到的那样。在某些情况下，由于中风、脑外伤、出血、微血管病或脑肿瘤，bbb也可能出现渗漏，并且抗体渗透可能增加。
[0162]
如本文所用，术语“自身抗体介导的精神病症”涉及包括自身抗体存在的任何医学病症，优选地针对主要靶向中枢神经系统的自身抗原，其中还观察到精神(神经精神)症状。许多中枢神经系统障碍，包括脑炎和严重精神障碍，已被证明与特异性神经元表面自身抗体(nsab)相关。很明显，靶向神经元表面抗原和离子通道的特异性自身抗体会导致严重的精神紊乱，即导致神经精神症状。许多研究表明，在诸如精神分裂症和双相障碍的特定精神病症中存在自身抗体。其他疾患涉及神经精神障碍，诸如精神分裂症、双相障碍、mdd、物质诱发的精神病、亨廷顿病(huntington’s disease)、阿尔茨海默病(alzheimer’s disease)和神经精神系统性红斑狼疮(zong等人，2017)。
[0163]
在一些实施方式中，待治疗的疾病是自身免疫性脑病或脑脊髓病。
[0164]“脑病”通常是指大脑的任何障碍或疾病，尤其是慢性退行性病症。脑病可能是指永久性(或退行性)脑损伤，或可逆性损伤。其可能是由大脑的直接损伤或远离大脑的疾病引起的。症状通常包括智力残疾、易怒、躁动、谵妄、困惑、嗜睡、木僵、昏迷和精神病。如本文所用，“自身免疫性脑病”是指具有自身免疫成分的任何脑部疾病。如本文所用，“自身免疫性脑脊髓病”是同时影响大脑和脊髓的具有自身免疫成分的任何疾病。
[0165]
抗n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)受体脑炎是一种常见于女性的脑炎，并且与针对nmda受体的nr1和/或nr2亚基的抗体有关，尽管主要是nr1亚基。
[0166]
抗nmda受体脑炎几年前首次在多个大型研究中描述，这些研究详细描述了该临床综合征的特征(dalmau等人，2008)。抗nmdar脑炎患者患有严重形式的脑炎，具有典型的临床多阶段特征，主要影响儿童和年轻女性。它从精神症状、记忆缺陷和癫痫发作发展为意识丧失、自主神经功能障碍、运动障碍和换气不足(dalmau等人，2011，pr
ü
ss等人，2010，pr
ü
ss等人，2013)。该疾病的标志是针对nmdar1的nr1亚基的抗体。这深刻地改变了脑炎的治疗概念，因为在2007年之前，nmdar脑炎尚未被认为是脑炎的独特亚组。因此，它之前被认为是病因不明的脑炎，且没有得到充分治疗。
[0167]
nmdar nr1是nmda受体复合物的组分，充当异四聚体的配体门控离子通道，具有高钙渗透性和对镁的电压依赖性敏感性。通道激活需要神经递质谷氨酸与ε亚基结合，甘氨酸与ζ亚基结合，加上膜去极化以消除mg2 的通道抑制。已知nmdar nr1蛋白的许多蛋白质异形体，诸如但不限于以下基因库登录号的蛋白质异形体：xp_011516885.1、xp_005266130.1、xp_005266129.1、xp_005266128.1、np_00117020.1、np_001172019.1、np_000823.4、np_015566.1、np_067544.1。所述序列或异形体或其功能类似衍生物中的任何一个或多个可以用作本文所述caar的自身抗原。
[0168]
nmdar具有多种生理作用，并且任何功能障碍，无论活性增强还是减弱，都可能导致神经精神障碍，诸如精神分裂症、双相障碍、mdd、物质诱发的精神病、亨廷顿病、阿尔茨海
默病和神经精神系统性红斑狼疮(npsle)。因此，nmdar在包括抑郁在内的多种精神障碍中起关键作用。此外，非典型痴呆患者的亚组含有抗nmdar1抗体，通过非特异性去除所有抗体来去除所述抗nmdar1抗体导致在选定的病例中的临床改善(pr
ü
ss等人，2010，doss等人，2014)。此外，患有自身抗体介导的疾患的母亲的孩子也可能出现孤独症。许多研究已发现，循环母体自身抗体的存在与新生儿神经元功能障碍之间存在相关性(fox edmiston等人，2015)。具体地说，在妊娠期间可能进入胎儿室的母体抗脑自身抗体已被认定为发展孤独症谱系障碍(asd)的一个危险因素。因此，nmdar自身抗体的存在可能导致患病母亲的后代出现孤独症，使得本发明还代表了此类疾患的潜在治疗和/或避免儿童出现此类疾病的预防性方法。
[0169]
与自身免疫性脑炎中的抗nmdar主要靶向nr1亚基不同，已发现靶向nmdar的nr2亚基的自身抗体，并且这些自身抗体与系统性红斑狼疮(sle)患者中的抑郁症相关(lapteva等人，2006)。在本发明的一些实施方式中，由核酸序列编码的自身抗原包含以下或由以下组成：选自由富亮氨酸胶质瘤失活1(lgi1)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体(ampar)、含ig样结构域蛋白5(iglon5)、代谢型谷氨酸受体5(mglur5)、谷氨酸脱羧酶(gad)、接触蛋白相关蛋白样2(caspr2)、γ-氨基丁酸(gaba)受体诸如gaba-a和/或gaba-b、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog)和水通道蛋白4(aqp4)或其一个或多个片段组成的组的蛋白质。
[0170]
上述自身抗原是主要靶向中枢神经系统的神经自身免疫疾病中自身抗体的已知靶标。
[0171]
ampar是一种离子通道型谷氨酸受体，其介导cns中的快速兴奋性神经传递。lai及其同事首次报告了边缘脑炎中针对ampar的自身抗体(lai等人，2009)。这类自身免疫性脑炎的临床特征是短期记忆缺失、情绪/行为改变和惊厥，经常与副肿瘤性疾病相关、治疗反应性以及具有复发倾向。
[0172]
最近的研究已经表明，电压门控钾通道(vgkc)复合物内的抗原靶标在自身免疫神经学中起着病理生理作用，因为它们与靶向这些膜蛋白的细胞外结构域的自身抗体结合。例如，已知自身抗体结合富亮氨酸胶质瘤失活1(lgi1)和接触蛋白相关蛋白样2(caspr2)两者。具有lgi1或caspr2抗体的患者主要为男性，典型的发病年龄为中年晚期，并表现出边缘脑炎(一种脑炎形式，一种以由自身抗体引起的脑部炎症为特征的疾病)的症状，包括惊厥、失忆症和认知障碍。
[0173]
iglon5相关脑炎是一种具有不同临床表现的综合征，临床表现包括睡眠功能障碍、延髓功能障碍、舞蹈病和进行性核上性麻痹样症状。患者报告为患有iglon5相关脑炎，表现为快速进行性认知减退、脑磁共振成像上的炎性病变、脑脊液上的寡克隆带和igg1类的抗iglon5抗体(montagna等人，2018)。
[0174]
代谢型谷氨酸受体5(mglur5)已被报告为霍奇金淋巴瘤(hl)和边缘脑病(奥菲利亚综合征(ophelia syndrome))患者的自身抗原(lancaster等人，2011)。
[0175]
gaba-a受体是离子通道型受体，并且gaba是配体。gaba-ar的亚基在大脑中具有不同的分布，并且可能对gaba具有不同的敏感性，从而导致不同的功能。gaba-ar信号传导的下降会引发神经障碍的过度活跃，诸如失眠、焦虑和癫痫。最近在自身免疫性脑炎中发现了针对gaba-a受体的自身抗体(zong 2017)。
[0176]
gaba-b受体是与g蛋白门控钾通道连接的代谢型跨膜受体。缺乏功能性gaba(b)受体的小鼠表现出更多的焦虑和减少的不动性(抗抑郁类行为)。边缘脑炎中报告了针对gaba-br(抗gababr)的自身抗体(zong2017)。
[0177]
在大多数视神经脊髓炎谱系障碍(nmosd)患者中发现了抗水通道蛋白-4(aqp4)的自身抗体，并且aqp4自身抗体的检测用于对血清阳性nmosd疾病病例进行分类。nmosd是中枢神经系统(cns)的炎性病症，主要以视神经炎(on)和横贯性脊髓炎(tm)为特征。在某些诊断为血清阴性nmosd的病例中发现了针对髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog-igg)的自身抗体(fujihara，2019)。
[0178]
从上面可以明显看出，可以在本文所述的caar方法中使用各种自身抗原，以靶向主要靶向中枢神经系统的神经疾病中的自身抗体特异性致病性b细胞。
[0179]
嵌合抗原受体和嵌合自身抗体受体：
[0180]
根据本发明，嵌合抗原受体(car)多肽包含细胞外抗原结合结构域，其包含结合靶标抗原、跨膜结构域和细胞内结构域的抗体或抗体片段。car通常被描述为包含源自抗体的细胞外胞外域(抗原结合结构域)和含有源自t细胞信号传导蛋白的信号传导模块的胞内域。本发明的caar基于car构建体，但使用自身抗原来指导caar特异性。因此，如有必要，在car构建体的上下文中对car构建体和公知常识的引用适用于本发明。
[0181]
在本发明中，嵌合自身抗体受体(caar)包含代替car的细胞外抗原结合结构域的自身抗原。该自身抗原可被称为但不限于靶向结构域、结合结构域或细胞外自身抗体结合结构域，或称为细胞外胞外域。
[0182]
在优选实施方式中，胞外域优选包含与主要靶向中枢免疫系统的神经自身免疫病症中存在的自身抗体结合的自身抗原或其片段。
[0183]
所述自身抗原可附接至铰链区，所述铰链区提供灵活性并通过锚定跨膜部分将信号转导到细胞内信号传导结构域。
[0184]
跨膜结构域优选起源于cd8α或cd28。在第一代car中，信号传导结构域由tcr复合体的ζ链组成。术语“代”是指细胞内信号传导结构域的结构。第二代car配备有源自cd28或4-1bb的单一共刺激结构域。第三代car已经包括两个共刺激结构域，例如cd28、4-1bb、icos或ox40、cd3ζ。本发明优选地涉及第二代或第三代“car”格式，尽管本文所述的自身抗体结合片段可采用任何给定的car格式。
[0185]
在各种实施方式中，提供了将免疫效应细胞的细胞毒性重定向至b细胞的基因工程受体。
[0186]
这些基因工程受体在本文中称为caar。caar是将针对所需靶标(分泌/呈递致病性自身抗体的b细胞)的自身抗原-自身抗体特异性与激活t细胞受体的细胞内结构域结合以产生表现出特定细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。如本文所用，术语“嵌合”描述由来自不同来源的不同蛋白质或dna的部分组成。
[0187]
本文所述caar的主要特征是其重定向免疫效应细胞特异性的能力，从而触发抗原特异性效应t细胞的增殖、细胞因子产生(诸如ifn-γ)以及可介导表达靶自身抗体的靶b细胞死亡的分子的产生。
[0188]
自身抗原结构域：
[0189]
本发明部分基于嵌合自身抗体受体可用于靶向引起自身免疫疾病的自身抗体的
发现。本发明包括包含至少一种特异于自身抗体的嵌合自身抗体受体(caar)的组合物，包含该组合物的载体，包含包装在病毒颗粒中的caar载体的组合物，以及包含该caar的重组t细胞或其他效应细胞。本发明还包括制备表达caar的基因修饰的t细胞(caart)的方法，其中表达的caar包含与主要靶向中枢神经系统的神经自身免疫疾病中存在的自身抗体结合的自身抗原。
[0190]“细胞外抗原结合结构域”或“细胞外结合结构域”或“靶向结构域”或“自身抗原”可互换使用，并且提供具有特异性结合所关注的靶自身抗体的能力的caar。结合结构域可以来自天然、合成、半合成或重组来源。本文给出了自身抗原结构域的多个实例。
[0191]“特异性结合”应如通过本领域技术人员所理解的，由此本领域技术人员清楚地知道可用于测试结合和结合特异性的各种实验程序。本领域已知用于确定平衡缔合常数或平衡离解常数的方法。在许多蛋白质相互作用中，一些交叉反应或背景结合是不可避免的；这并不是要减损caar和自身抗体之间结合的“特异性”。“特异性结合”描述了自身抗原与自身抗体结合的结合亲和力大于背景(非特异性)结合。理解了抗体和表位之间的相互作用，在考虑术语“特异性”时，术语“针对”也适用。
[0192]“抗原(ag)”是指能够刺激动物产生抗体或t细胞反应的化合物、组合物或物质。“表位”是指与抗体结合的抗原的区域。表位既可以由连续氨基酸形成，也可以由通过蛋白质三级折叠并列的非连续氨基酸形成。
[0193]“自身抗原”是指刺激自身免疫应答产生诸如自身抗体产生的内源性抗原。自身抗原还包括自体抗原或来自正常组织的抗原，其是可能导致自身免疫疾病发展的细胞介导或抗体介导的免疫应答的靶标。
[0194]“自身抗体”是指由自身抗原特异性b细胞产生的抗体。
[0195]
本文所设想的caar的自身抗原组分的说明性实例包括但不限于seq id no 2-4和10-12中所列的序列。
[0196]
抗体和抗体片段：
[0197]
本发明的caar在一些实施方式中不包含含有如本文所述的结合靶标多肽的抗体或抗体片段的细胞外抗原结合结构域。因此，目前的caar构建体不同于普通的car构建体。
[0198]
如本文所用，“抗体”通常是指由基本上通过免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。在使用术语“抗体”的情况下，也可以认为是指术语“抗体片段”。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，它们又分别定义了免疫球蛋白类别，即igg、igm、iga、igd和ige。已知基本免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体或二聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”(l)链(约25kd)和一条“重”(h)链(约50-70kd)。每条链的n-末端定义了一个约100至110或更多氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语“可变轻链”和“可变重链”分别是指轻链和重链的这些可变区。
[0199]
本发明的caar旨在结合哺乳动物尤其是人自身抗体靶标。蛋白质名称的使用，例如定义caar构建体的自身抗原，可能对应于蛋白质的小鼠或人类版本。
[0200]
caar的附加组分
[0201]
在某些实施方式中，本文设想的caar可包含各种结构域之间的接头残基，其被添加用于分子的适当间隔和构象，例如，包含连接细胞外和跨膜结构域的氨基酸序列或自身
抗原的片段的接头。本文预期的caar可包括一个、两个、三个、四个或五个或更多个接头。在特定实施方式中，接头的长度为约1至约25个氨基酸、约5至约20个氨基酸、或约10至约20个氨基酸或任何中间长度的氨基酸。
[0202]
接头的说明性实例包括甘氨酸聚合物；甘氨酸-丝氨酸聚合物；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；以及本领域已知的其他柔性接头，诸如whitlow接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，并因此可以作为融合蛋白诸如本文所述的caar的结构域之间的中性系链。
[0203]
在特定实施方式中，caar的结合结构域后接一个或多个“接头”、“间隔子”或“接头多肽”或“间隔多肽”，其在一些实施方式中是指将自身抗体结合结构域移离效应细胞表面以实现适当接触、抗原结合和免疫细胞激活的区域。在某些实施方式中，间隔结构域是免疫球蛋白的一部分，包括但不限于一个或多个重链恒定区，例如ch2和ch3。间隔结构域可包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。在一种实施方式中，间隔结构域包括igg1或igg4的ch2和ch3结构域。
[0204]
在一些实施方式中，caar的细胞外结合结构域可后接一个或多个“铰链结构域”，其在使结合结构域远离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和激活中起作用。caar可包括结合结构域和跨膜结构域(tm)之间的一个或多个铰链结构域。铰链结构域可以来自天然、合成、半合成或重组来源。铰链结构域可包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。适于在本文所述caar中使用的说明性铰链结构域包括衍生自诸如cd8α、cd4、cd28、pd1、cd152和cd7的1型膜蛋白的细胞外区域的铰链区域，其可以是来自这些分子的野生型铰链区域或可以改变。在另一实施方式中，铰链结构域包括pd1、cd 152或cd8α铰链区域。
[0205]“跨膜结构域”是caar的一部分，其融合细胞外结合部分和细胞内信号传导结构域，并将caar锚定到免疫效应细胞的质膜上。
[0206]
tm结构域可以来自天然、合成、半合成或重组来源。tm结构域可衍生自t细胞受体的α、β或ζ链、cd3ε、cd3ζ、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd27、cd28、cd33、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd152、cd154和pd1。在一种实施方式中，本文设想的caar包括衍生自cd8α或cd28的tm结构域。
[0207]
在特定实施方式中，本文设想的caar包含细胞内信号传导结构域。“细胞内信号传导结构域”是指caar的一部分，其参与将有效caar结合到靶标自身抗体的信息转导到免疫效应细胞的内部，以激发效应细胞功能，例如激活、细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性，包括细胞毒性因子释放到caar结合靶标，或由抗原结合到细胞外caar结构域引起的其他细胞反应。
[0208]
术语“效应子功能”是指免疫效应细胞的特殊功能。例如，t细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或帮助或包括细胞因子分泌的活性。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质中转导效应子功能信号并引导细胞执行特定功能的部分。
[0209]
本文设想的caar包括一个或多个共刺激信号传导结构域，以增强表达caar受体的t细胞的功效、扩增和/或记忆形成。如本文所用，术语“共刺激信号传导结构域”是指共刺激分子的细胞内信号传导结构域。共刺激分子是除抗原受体或fc受体以外的细胞表面分子，它们在与靶标结合时提供t淋巴细胞的有效激活和功能所需的第二信号。
[0210]
多肽
[0211]“肽”、“多肽”、“多肽片段”和“蛋白质”可互换使用，除非有相反规定，并根据常规含义，即作为氨基酸序列。多肽不限于特定长度，例如，它们可以包含全长蛋白质序列或全长蛋白质片段，并且可以包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域已知的其他修饰，自然存在的和非自然存在的修饰两者。
[0212]
在各种实施方式中，本文设想的caar多肽包含蛋白质n末端处的信号(或前导)序列，其共翻译地或翻译后地指导蛋白质的转移。多肽可以使用各种众所周知的重组和/或合成技术中的任何一种来制备。本文预期的多肽具体包括本公开的caar，或具有如本文公开的caar的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或置换的序列。
[0213]
如本文所使用的“分离肽”或“分离多肽”等，是指从细胞环境中以及从与细胞的其他组分的结合中对肽或多肽分子进行体外分离和/或纯化，即其与体内物质无显著关联。类似地，“分离细胞”是指从体内组织或器官获得的细胞，并且基本上不含细胞外基质。
[0214]
核酸
[0215]
如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸分子”是指任何核酸分子，例如dna或rna，诸如信使rna(mrna)、rna、基因组rna(grna)、正链rna(rna( ))、负链rna(rna(-))、基因组dna(gdna)、互补dna(cdna)或重组dna。多核苷酸包括单链和双链多核苷酸。优选地，本发明的多核苷酸包括与本文所述的任何参考序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸或变体，典型地，其中变体保持参考序列的至少一种生物活性。在各种说明性实施方式中，本发明部分设想了包含多核苷酸的表达载体、病毒载体和转移质粒，以及包含它们的组合物和细胞。
[0216]
可以使用本领域已知和可用的各种成熟技术中的任何一种来制备、操纵和/或表达多核苷酸。为了表达所需多肽，可将编码多肽的核苷酸序列插入适当的载体中。载体的实例为质粒、自主复制序列和转座因子。其他示例性载体包括但不限于质粒、噬粒、黏粒、人工染色体诸如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或pl衍生人工染色体(pac)、噬菌体诸如λ噬菌体或ml 3噬菌体和动物病毒。可用作载体的动物病毒类别的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒和乳多空病毒(例如sv40)。表达载体的实例为pclneo载体(promega)，用于在哺乳动物细胞中表达；plenti4/v5-desttm、plenti6/v5-desttm和plenti6.2/v5-gw/lacz(invitrogen)，用于哺乳动物细胞中慢病毒介导的基因转移和表达。在特定实施方式中，本文公开的嵌合蛋白的编码序列可连接到此类表达载体中，以在哺乳动物细胞中表达嵌合蛋白。表达载体中存在的“控制元件”或“调控序列”是载体的那些非翻译区——复制起点、选择标记盒、启动子、增强子、翻译起始信号(shine-dalgarno序列或kozak序列)内含子、多聚腺苷酸化序列、5'和3'非翻译区——其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。这些元件的强度和特异性可能有所不同。根据所使用的载体系统和宿主，可以使用任意数量的合适转录和翻译元件，包括普遍存在的启动子和诱导型启动子。
[0217]
载体
[0218]
在特定实施方式中，用编码caar的逆转录病毒载体例如γ逆转录病毒载体或慢病毒载体转导细胞(例如，免疫效应细胞，诸如t细胞)。
[0219]
逆转录病毒是基因递送的常用工具。在特定实施方式中，逆转录病毒用于将编码
caar的多核苷酸递送至细胞。如本文所用，术语“逆转录病毒”是指将其基因组rna反转录成线性双链dna拷贝并随后将其基因组dna共价整合到宿主基因组中的rna病毒。一旦病毒被整合到宿主基因组中，它就被称为“前病毒”。前病毒作为rna聚合酶ii的模板并指导rna分子的表达，这些rna分子编码产生新病毒颗粒所需的结构蛋白和酶。
[0220]
适于在特定实施方式中使用的说明性逆转录病毒包括但不限于：moloney小鼠白血病病毒(m-mulv)、moloney小鼠肉瘤病毒(momsv)、harvey小鼠肉瘤病毒(hamusv)、小鼠乳腺肿瘤病毒(mumtv)、长臂猿白血病病毒(galv)、猫白血病病毒(flv)、泡沫病毒、friend小鼠白血病病毒、小鼠干细胞病毒(mscv)和劳斯肉瘤病毒(rsv)和慢病毒。
[0221]
如本文所用，术语“慢病毒”是指一组(或属)复杂的逆转录病毒。说明性慢病毒包括但不限于：hiv(人免疫缺陷病毒；包括hiv 1型和hiv 2型)；维斯那-梅迪病毒(visna-maedi virus，vmv)；山羊关节炎脑炎病毒(caev)；马传染性贫血病毒(eiav)；猫免疫缺陷病毒(fiv)；牛免疫缺陷病毒(biv)；和猿猴免疫缺陷病毒(siv)。在一种实施方式中，设想了基于hiv的载体主干(即，hiv顺式作用序列元件)。在特定实施方式中，慢病毒用于将包含caar的多核苷酸递送至细胞。
[0222]
术语“载体”在本文中用于指能够转移或运输另一核酸分子的核酸分子。被转移的核酸通常与载体核酸分子连接，例如插入载体核酸分子中。载体可以包括在细胞中直接自主复制的序列，或者可以包括足以允许整合到宿主细胞dna中的序列。有用的载体包括例如质粒(例如，dna质粒或rna质粒)、转座子、黏粒、细菌人工染色体和病毒载体。有用的病毒载体包括例如复制缺陷型逆转录病毒和慢病毒。
[0223]
如本领域技术人员将显而易见的，术语“病毒载体”广泛用于指核酸分子(例如，转移质粒)，其包括通常促进核酸分子转移或整合到细胞基因组中的病毒衍生核酸元件，或者指介导核酸转移的病毒颗粒。病毒颗粒通常包括各种病毒组分，且有时除了核酸外还包含宿主细胞组分。
[0224]
术语病毒载体可指能够将核酸转移到细胞中的病毒或病毒颗粒，或指转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒包含主要来源于病毒的结构和/或功能遗传元件。术语“逆转录病毒载体”是指含有主要来源于逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。
[0225]
因此，在优选实施方式中，本发明涉及用编码caar的表达载体转染细胞的方法。例如，在一些实施方式中，载体包含附加序列，诸如促进caar表达的序列，如启动子、增强子、poly-a信号或土拨鼠肝炎病毒(whp)转录后调控元件(wpre)和/或一个或多个内含子。在优选实施方式中，caar编码序列两侧为转座子序列，使得转座酶的存在允许编码序列整合到转染细胞的基因组中。
[0226]
在一些实施方式中，用转座酶进一步转染遗传转化的细胞，该转座酶促进caar编码序列整合到转染细胞的基因组中。在一些实施方式中，转座酶作为dna表达载体提供。然而，在优选实施方式中，转座酶作为可表达rna或蛋白质提供，使得转座酶的长期表达不会发生在转基因细胞中。例如，在一些实施方式中，转座酶作为mrna(例如，包含帽和poly-a尾的mrna)提供。根据本发明的实施方式，可以使用任何转座酶体系。然而，在一些实施方式中，转座酶是鲑鱼型tel样转座酶(sb)。例如，转座酶可以是所谓的“睡美人”转座酶，参见例如通过援引并入本文的美国专利6,489,458。在一些实施方式中，转座酶是具有增加的酶活
性的工程化酶。转座酶的一些特定实例包括但不限于sb 10、sb 11或sb 100x转座酶(参见，例如mates等人,2009,nat genet.41(6):753-61，或us9228180，其通过援引并入本文)。例如，方法可涉及用编码sb 10、sb 11或sb 100x转座酶的mrna电穿孔细胞。
[0227]
转座因子是一种天然的非病毒基因递送载体，能够介导稳定的基因组整合。睡美人(sb)转座子能够将感兴趣的核酸序列剪切并粘贴到基因组中，为转基因细胞和生物体中的长期、永久转基因表达提供基础，在这种情况下，对于免疫细胞优选t细胞的转化，使用本发明的caar编码的核酸序列。sb转座子系统具有相对良好的特性，并已在包括人类在内的大范围脊椎动物中被广泛工程化用于高效基因递送和基因发现目的。技术人员能够识别sb系统的适当变体，并在必要时将其并入本发明。下面提供了特定的非限制性实例。sb系统是一种安全且简单易用的载体，能够经济高效地快速制备治疗剂量的细胞产品。
[0228]
通常，转座子系统包括转座子和转座酶。转座子作为载体，携带待插入基因组的基因。转座酶是系统的所谓“主力”，催化转座过程。转座酶位于转座子的反向末端重复序列(itr)之间。重要的是，转座酶基因可以被任何感兴趣的核酸序列取代，并且当由单独的质粒反式编码时转座酶可以控制转座事件。转座子与转座酶的物理分离使转座子与转座酶的比率得以优化，并且还提供了以mrna而不是dna形式提供转座酶的自由。首先，转座酶识别转座子，并结合itr。在突触复合体形成过程中，转座子末端通过转座酶单体连接在一起(可能形成四聚体)。转座酶在切除后产生dna双链断裂，而在整合位点产生单链缺口。包含转座子结合转座酶的前整合复合体执行整合到宿主基因组中。sb转座是一种高度协调的反应，可有效过滤出异常的毒性转座中间体(在narayanavari&izsv
á
k,cell&gene therapy insights,2017中综述)。
[0229]
在原始sb转座子(pt)的itr内对核苷酸残基的先前优化(包括突变、缺失和添加)产生了改进的转座子版本，诸如pt2、pt3、pt2b和pt4，其可用于本文所述的caar编码序列。在一种实施方式中，采用pt4。
[0230]
涉及对sb转座酶的初级氨基酸序列进行诱变的先前筛选提供了许多过度活跃的转座酶版本。在某些细胞类型中与最初复活的转座酶(sb10)相比，sb100x是100倍过度活跃的。目前可用的sb转座酶包括但不限于sb10、sb11(活性是sb10的3倍高)、sb12(是sb10的4倍高)、hsb1
–
hsb5(是sb10的最多10倍高)、hsb13
–
hsb17(hsb17是sb10的17倍高)、sb100x(是sb10的100倍高)、sb150x(是sb10的130倍高)。在一种实施方式中，采用sb100x。
[0231]
本发明的进一步方面涉及包含如本文所述的核酸分子或载体和/或表达如本文所述的caar的基因修饰的免疫细胞。
[0232]
本发明的进一步方面涉及包含如本文所述的核酸分子的载体，优选病毒载体，更优选γ逆转录病毒载体。在本发明的另一方面，本发明涉及转座子载体，优选睡美人载体，其编码并且优选地能够表达本发明的caar。
[0233]
在优选实施方式中，旨在施用以治疗本文所述疾病的免疫细胞用如本文所述的核酸进行基因修饰，使用“睡美人”转座子系统，尤其是睡美人转座酶，编码并表达如本文所述的caar。睡美人转座子系统是一种合成dna转座子，被设计用于将精确定义的dna序列引入脊椎动物的染色体中，在本发明的上下文中用于修饰免疫细胞以表达本文所述的caar的目的。睡美人转座子结合了病毒和裸dna的优点。病毒是根据其在新宿主细胞中感染和复制的能力经过进化选择的。同时，细胞已经进化出主要的分子防御机制来保护自己免受病毒感
染。出于社会和监管原因，避免使用病毒也很重要。因此，使用非病毒载体，诸如睡美人系统，避免了细胞采用的对载体的许多(但不是全部)防御。出于这一原因，睡美人系统能够对免疫细胞进行特别有效和安全的基因改造，以便向患者施用。
[0234]
序列变体：
[0235]
保持本发明类似结合性质的所要求保护的核酸、蛋白质、抗体、抗体片段和/或caar的序列变体，例如由序列同一性％定义的序列变体，也包括在本发明的范围内。这些变体显示了替代序列，但基本上保持了相同的结合特性，诸如靶特异性，因为所提供的特定序列被称为功能类似物或功能上的类似物。序列同一性与进行序列比对时相同核苷酸或氨基酸的百分比有关。
[0236]
本文所使用的叙述“序列同一性”是指在比较窗口内，序列在核苷酸对核苷酸的基础上或氨基酸对氨基酸的基础上相同的程度。因此，“序列同一性百分比”可以通过以下计算：在比较窗口内比较两个最佳比对的序列，确定相同核酸碱基(例如，a、t、c、g、i)或相同氨基酸残基(例如，ala、pro、ser、thr、gly、val、leu、ile、phe、tyr、trp、lys、arg、his、asp、glu、asn、gln、cys和met)在两个序列中都出现的位置的数目以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100从而得到序列同一性百分比。包括与本文所述的任何参考序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸和多肽，通常其中多肽变体保持参考多肽的至少一种生物活性。
[0237]
本领域普通技术人员将认识到，由于遗传密码的简并性，存在许多编码本文所述多肽的核苷酸序列。其中一些多核苷酸与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性或序列同一性。尽管如此，由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸是本发明特别考虑的。属于所述序列同一性的序列中的缺失、置换和其他变化也包含在本发明中。
[0238]
可通过置换发生的蛋白质序列修饰也包括在本发明的范围内。本文所定义的置换是对蛋白质的氨基酸序列进行的修饰，其中一个或多个氨基酸被相同数量的(不同)氨基酸取代，产生包含不同于初级蛋白质的氨基酸序列的蛋白质。可进行优选不显著改变蛋白质功能的置换。与添加一样，置换可以是自然的，也可以是人为的。本领域众所周知，可以在不显著改变蛋白质功能的情况下进行氨基酸置换。当修饰涉及“保守”氨基酸置换时尤其如此，即一种氨基酸置换另一种具有类似性质的氨基酸。这种“保守”氨基酸可以是天然的或合成的氨基酸，由于其大小、电荷、极性和构象，可以在不显著影响蛋白质结构和功能的情况下被置换。经常，许多氨基酸可以被保守氨基酸置换，而不会对蛋白质的功能产生有害影响。
[0239]
一般来说，非极性氨基酸gly、ala、val、ile和leu；非极性芳香族氨基酸phe、trp和tyr；中性极性氨基酸ser、thr、cys、gln、asn和met；带正电的氨基酸lys、arg和his；带负电的氨基酸asp和glu，代表了保守氨基酸组。这份清单并非详尽无遗。例如，众所周知，ala、gly、ser和有时cy可以相互置换，即使它们属于不同的组。
[0240]
置换变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基被去除，并在其位置插入不同的残基。置换突变最感兴趣的位点包括高变区，但也考虑了fr改变。如果此类置换导致生物活性的变化，则可引入下表中称为“示例性置换”，或下文参考氨基酸类别进一步描述的更实质性的变化，并对产物进行筛选。
[0241]
可能的氨基酸置换：
[0242][0243][0244]
通过选择在其保持(a)置换区域内多肽主链的结构，例如，作为片或螺旋构象，(b)分子在靶标位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的大部分的作用上显著不同的置换物，实现抗体的生物学特性上的实质性修饰。
[0245]
保守氨基酸置换不限于天然存在的氨基酸，还包括合成氨基酸。常用的合成氨基酸是不同链长的ω-氨基酸和环己基丙氨酸，其为中性非极性类似物；瓜氨酸和甲硫氨酸亚砜，其为中性非极性类似物，苯基甘氨酸，其为芳香族中性类似物；磺基丙氨酸，其为带负电的类似物，以及鸟氨酸，其为带正电的氨基酸类似物。与天然存在的氨基酸一样，该列表并非详尽无遗，而仅仅是本领域众所周知的置换的示例。
[0246]
基因修饰的细胞和免疫细胞
[0247]
在特定实施方式中，本发明设想了经基因修饰以表达本文所设想的caar的细胞，用于治疗b细胞相关病症的用途。如本文所用，术语“基因工程”或“基因修饰”是指以dna或rna的形式向细胞中的总遗传物质中添加额外的遗传物质。术语“基因修饰的细胞”、“修饰的细胞”和“重定向细胞”可以互换使用。
[0248]“免疫细胞”或“免疫效应细胞”是免疫系统中具有一种或多种效应子功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、细胞因子的分泌、adcc和/或cdc的诱导)的任何细胞。
[0249]
本发明的免疫效应细胞可以是自体(autologous)/自体(autogeneic)(“自身”)或非自体(“非自身”，例如，同种异体、同基因或异种)。如本文所用的“自体”是指来自同一受试者的细胞，并代表本发明的优选实施方式。如本文所用的“同种异体”是指同一物种的细胞，它们在基因上与所比较的细胞不同。如本文所用的“同基因”是指不同受试者的细胞，它们在基因上与所比较的细胞相同。如本文所用的“异种”是指与所比较的细胞不同物种的细胞。在优选实施方式中，本发明的细胞为自体或同种异体细胞。
[0250]
与本文所设想的caar一起使用的说明性免疫效应细胞包括t淋巴细胞。术语“t细胞”或“t淋巴细胞”是本领域公知的，且旨在包括胸腺细胞、未成熟t淋巴细胞、成熟t淋巴细胞、静止t淋巴细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(cik细胞)或活化t淋巴细胞。细胞因子诱导的杀伤(cik)细胞通常是cd3和cd56阳性、非主要组织相容性复合体(mhc)限制的、自然杀伤(nk)样t淋巴细胞。t细胞可以是t辅助(th；cd4

t细胞)细胞，例如t辅助1(th1)或t辅助2(th2)细胞。t细胞可以是细胞毒性t细胞(ctl；cd8

t细胞)、cd4

cd8

t细胞、cd4 cd8 t细胞或任何其他t细胞亚群。适合在特定实施方式中使用的其他说明性t细胞群包括初始t细胞和记忆t细胞。
[0251]
例如，当在自体细胞移植后重新引入患者时，如本文所述经本发明caar修饰的t细胞可识别并杀死肿瘤细胞。与其他t细胞相比，cik细胞可具有增强的细胞毒性活性，并因此代表了本发明的免疫细胞的优选实施方式。
[0252]
如本领域技术人员所理解的，其他细胞也可用如本文所述的caar而用作免疫效应细胞。特别地，免疫效应细胞还包括nk细胞、nkt细胞、中性粒细胞和巨噬细胞。免疫效应细胞还包括效应细胞的祖细胞，其中这样的祖细胞可在体内或体外诱导分化为免疫效应细胞。
[0253]
本发明提供了制备表达本文所设想的caar的免疫效应细胞的方法。在一种实施方式中，该方法包括转染或转导从个体分离的免疫效应细胞，使得免疫效应细胞表达如本文所述的一个或多个caar。在某些实施方式中，免疫效应细胞从个体中分离并经基因修饰而无需在体外进一步操纵。这样的细胞可然后直接重新施用到个体中。在进一步的实施方式中，免疫效应细胞首先被激活和刺激以在体外增殖，然后经基因修饰以表达caar。在这方面，免疫效应细胞可在基因修饰(即，转导或转染以表达本文所设想的caar)之前和/或之后培养。
[0254]
在特定实施方式中，在本文所述免疫效应细胞的体外操纵或基因修饰之前，细胞源从受试者获得。在特定实施方式中，caar修饰的免疫效应细胞包含t细胞。t细胞可从多种来源获得，包括但不限于外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、感染部位组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在某些实施方式中，t细胞可以使用本领域技术人员已知的任何数量的技术从采集自受试者的血液单位中获得，诸如沉降，例如ficoll
tm
分离，基于抗体偶联珠的方法，诸如macs
tm
分离(miltenyi)。在一种实施方式中，来自个体循环血液的细胞通过单采获得。单采产物通常包含淋巴细胞，包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一种实施方式中，可洗涤通过单采收集的细胞以去除血浆部分并将细胞置于适当的缓冲液或介质中以进行后续处理。细胞可以用pbs或其他缺乏钙、镁和大部分(如果不是其他全部的话)二价阳离子的合适溶液洗涤。如本领域普通技术人员所理解的，洗涤步骤可通过本领域技术人员已知的方法来完成，诸如通过使用半自
动直流离心机。例如，cobe 2991细胞处理器、baxter cytomate等。洗涤后，可将细胞重新悬浮在各种生物相容性缓冲液或其他含或不含缓冲液的盐水溶液中。在某些实施方式中，可在细胞直接再悬浮培养基中去除单采样品的不希望的组分。
[0255]
在某些实施方式中，通过溶解红细胞并消耗单核细胞，例如通过percoll
tm
梯度离心，从外周血单核细胞(pbmc)分离t细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离出特定的t细胞亚群。本文使用的一种方法是通过负磁免疫细胞粘连或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，其使用针对负选择的细胞上存在的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物。
[0256]
pbmc可使用本文所设想的方法直接经基因修饰以表达caar。在某些实施方式中，在分离pbmc后，进一步分离t淋巴细胞，并且在某些实施方式中，细胞毒性t淋巴细胞和辅助t淋巴细胞都可在基因修饰和/或扩增之前或之后分选为初始、记忆和效应t细胞亚群。cd8

细胞可以通过使用标准方法获得。在一些实施方式中，通过识别与这些类型的cd8

细胞中的每一种相关联的细胞表面抗原，将cd8

细胞进一步分选为初始细胞、中央记忆细胞和效应细胞。
[0257]
免疫效应细胞，诸如t细胞，可以在使用已知方法分离后进行基因修饰，或者免疫效应细胞可以在经基因修饰之前在体外被激活和扩增(或在祖细胞的情况下被分化)。在特定实施方式中，免疫效应细胞，诸如t细胞，经本文所设想的嵌合抗原受体基因修饰(例如，用包含编码caar的核酸的病毒载体转导)，并然后在体外激活和扩增。在各种实施方式中，t细胞可以在基因修饰以表达caar之前或之后，使用如例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美国专利申请公开no.20060121005中所述的方法激活和扩增。
[0258]
在进一步的实施方式中，例如，一个、两个、三个、四个、五个或更多不同表达载体的混合物可用于基因修饰免疫效应细胞的供体群，其中每个载体编码不同的如本文所设想的嵌合抗原受体蛋白。由此产生的修饰的免疫效应细胞形成修饰的细胞的混合群，其中一部分修饰的细胞表达一种以上不同的caar蛋白。
[0259]
在一种实施方式中，本发明提供了储存靶向自身抗体的表达基因修饰的小鼠、人或人源化caar蛋白的免疫效应细胞的方法，包括冷冻保存免疫效应细胞使得细胞在解冻时保持活性。表达caar蛋白的免疫效应细胞的一部分可通过本领域已知的方法进行冷冻保存，以提供此类细胞的永久来源，用于患有b细胞相关病症的患者的未来治疗。当需要时，冷冻保存的转化免疫效应细胞可以解冻、生长和扩增成更多这样的细胞。
[0260]
在一种实施方式中，免疫细胞优选地选自由t淋巴细胞或nk细胞、更优选细胞毒性t淋巴细胞组成的组。
[0261]
在优选实施方式中，包含本文所述核酸分子或载体和/或表达本文所述caar的基因修饰的免疫细胞的特征在于，其为cd4

和/或cd8

t细胞，优选cd4 和cd8 t细胞的混合物。这些t细胞群和优选包含cd4

和cd8

转化细胞两者的组合物显示出针对各种b细胞，优选针对本文所述的那些细胞和/或相关医学病症的特别有效的细胞溶解活性。
[0262]
在优选实施方式中，包含本文所述核酸分子或载体和/或表达本文所述caar的基因修饰的免疫细胞为cd4

和cd8

t细胞，优选比率为1:10至10:1，更优选比率为5:1至1:5、2:1至1:2或1:1。施用以所述比率优选以1:1的cd4

/cd8

比率的表达本文所述caar的修饰的
caar-t细胞在治疗本文所述疾病期间产生了有益特性，例如，这些比率可产生改善的治疗反应和降低的毒性。
[0263]
组合物和制剂
[0264]
本文设想的组合物可包含一种或多种多肽、多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、基因修饰的免疫效应细胞等，如本文所设想的。组合物包括但不限于药物组合物。
[0265]“药物组合物”是指在药学上可接受或生理学上可接受的溶液中配制的组合物，用于单独或与一种或多种其他治疗形式组合施用于细胞或动物。还应理解，如果需要，本发明的组合物也可与其他试剂组合施用，诸如例如，细胞因子、生长因子、激素、小分子、化疗剂、前药、药物、抗体或其他各种药学活性剂。只要附加试剂不会对组合物提供预期治疗的能力产生不利影响，则对也可包括在该组合物中的其它组分几乎没有限制。
[0266]“药学上可接受”一词在本文中用于指那些化合物、材料、组合物和/或剂型，它们在合理的医学判断范围内，适合与人类和动物的组织接触使用，且无过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
[0267]
如本文所用，“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括但不限于经美国食品和药物管理局批准可用于人类或家畜的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增香剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂。示例性药学上可接受的载体包括但不限于糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；可可脂、蜡、动植物脂肪、石蜡、硅酮、膨润土、硅酸、氧化锌；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；乙二醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及药物制剂中使用的任何其他相容物质。
[0268]
在特定实施方式中，本发明的组合物包含一定量的本文设想的表达caar的免疫效应细胞。如本文所用，术语“量”是指基因修饰的治疗细胞例如t细胞的“有效量”或“有效的量”，以实现有益或期望的预防或治疗结果，包括临床结果。
[0269]“预防有效量”是指有效实现期望预防结果的基因修饰的治疗细胞的量。由于预防剂量用于疾病之前或早期阶段的受试者，因此预防有效量通常但不一定小于治疗有效量。术语预防不一定是指完全抑制或防止特定的医学疾患。术语预防也指降低某种医学疾患发生或其症状恶化的风险。
[0270]
基因修饰的治疗细胞的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及干细胞和祖细胞在个体中引发所需反应的能力的因素而变化。治疗有效量也是指病毒或转导的治疗细胞的任何毒性或有害影响被治疗有益作用所抵消的量。术语“治疗有效量”包括可有效“治疗”受试者(例如患者)的量。当指示治疗量时，要施用的本发明组合物的精确量可以由医师考虑到患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度以及病症上的个体差异来确定。
[0271]
一般可以说，包含本文所述免疫细胞(t细胞)的药物组合物可以102至10
10
个细胞/kg体重、优选105至106个细胞/kg体重的剂量施用，包括这些范围内的所有整数值。细胞的数量取决于该组合物的最终用途以及其中所含细胞的类型。对于本文提供的用途，细胞的体
积通常为1升或更小，可以是500ml或更小，甚至是250ml或100ml或更小。因此，所需细胞的密度通常大于106个细胞/ml，并且通常大于107个细胞/ml，通常为108个细胞/ml或更大。临床相关数量的免疫细胞可分多次输注，累积等于或超过105个、106个、107个、108个、109个、10
10
个、10
11
个或10
12
个细胞。在本发明的一些方面，特别是由于所有注入的细胞将被重定向到特定的靶抗原，因此可以施用较少数量的细胞。表达caar的细胞组合物可以这些范围内的剂量多次施用。这些细胞对接受治疗的患者可以是同种异体细胞、同基因细胞、异种细胞或自体细胞。
[0272]
一般而言，包含如本文所述被激活和扩增的细胞的组合物可用于治疗和预防免疫受损个体中出现的疾病。本发明的经caar修饰的t细胞可单独施用，或作为药物组合物与载体、稀释剂、赋形剂和/或其他组分诸如il-2或其他细胞因子或细胞群组合施用。在特定实施方式中，本文设想的药物组合物包含一定量的基因修饰的t细胞，与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。
[0273]
包含表达caar的免疫效应细胞群诸如t细胞的本发明的药物组合物可包括缓冲液，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；糖类，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。本发明的组合物优选配制用于肠胃外施用，例如血管内(静脉内或动脉内)、腹腔内或肌肉内施用。
[0274]
液体药物组合物，无论其是溶液、悬浮液还是其他类似形式，可包括以下中的一种或多种：无菌稀释剂诸如注射用水，盐溶液优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠，固定油诸如可用作溶剂或悬浮介质的合成甘油单酯或甘油二酯，聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及调节张力的试剂，诸如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可封装在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量瓶中。可注射药物组合物优选是无菌的。
[0275]
在特定实施方式中，本文设想的组合物包含有效量的表达caar的免疫效应细胞，单独或与一种或多种治疗剂组合。因此，表达caar的免疫效应细胞组合物可单独施用或与其他已知治疗诸如其他免疫疗法等组合施用。所述组合物也可与抗生素组合施用。此类治疗剂在本领域可被接受为本文所述特定疾病状态诸如特定癌症的标准治疗。设想的示例性治疗剂包括细胞因子、生长因子、甾体、nsaid、dmard、抗炎药、化疗剂、放疗剂、治疗性抗体或其他活性和辅助剂。
[0276]
治疗方法
[0277]
如本文所用，术语“个体”和“受试者”通常可互换使用，并且是指表现出疾病、障碍或病症的症状的任何动物，其可通过本文别处公开的基因治疗载体、基于细胞的疗法和方法进行治疗。在优选实施方式中，受试者包括表现出造血系统的疾病、障碍或病症例如自身免疫疾病的症状的任何动物，其可使用本文公开的基于细胞的疗法和方法进行治疗。合适的受试者包括实验动物(诸如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家畜或宠物(诸如猫或狗)。包括非人灵长类且优选人类患者。
[0278]
如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括对疾病或病理状况的症状或病理学的任何有益或期望效果，并且可以包括正在治疗的疾病或病症的一个或多个
可测量标记物的甚至最小程度的减少。治疗可任选地涉及减少或改善疾病或病症的症状，或延迟疾病或病症的进展。“治疗”不一定表示完全根除或治愈该疾病或病症或其相关症状。
[0279]
如本文所用，“预防(prevent)”和类似词语诸如“预防(prevented)”、“预防(preventing)”或“预防(prophylactic)”等，表示用于预防、抑制或降低疾病或病症发生或复发的可能性的方法。该词还指延迟疾病或病症的发作或复发，或延迟疾病或病症的症状的发生或复发。如本文所用，“预防”和类似词语还包括在疾病或病症发作或复发之前降低疾病或病症的强度、效果、症状和/或负担。
[0280]
施用的数量和频率将由诸如患者的状况、患者疾病的类型和严重程度的因素确定，尽管适当的剂量可由临床试验确定。
[0281]
本文设想的组合物的施用可以任何方便的方式进行，包括通过雾化吸入、注射、摄入、输入、植入或移植。在优选实施方式中，肠胃外施用组合物。本文使用的短语“肠胃外施用(parenteral administration)”和“肠胃外地施用(administered parenterally)”是指除肠内和局部施用以外的施用模式，通常通过注射，并且包括但不限于血管内、静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、瘤内、心内、真皮内、腹腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、椎管内和胸骨内注射和输注。在一种实施方式中，通过直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中来向受试者施用本文设想的组合物。
[0282]
附图
[0283]
通过以下附图以举例的方式说明本发明。附图将被视为提供了增强对本发明的一个或多个非限制性实施方式的支持的潜在优选实施方式的进一步描述。
[0284]
附图简要说明：
[0285]
图1：本发明方法的示意性概要。
[0286]
图2：dmda受体和对应caar构建体的示意图。
[0287]
图3：nmdar抗体和nmdar-caar-t细胞的结合导致干扰素-γ的释放。
[0288]
图4：通过hek细胞表面上呈递的nmdar nr1抗体激活caar-t细胞。
[0289]
图5：通过k562细胞表面上呈递的nmdar nr1抗体激活caar-t细胞。
[0290]
图6：由caar-t细胞对表达表面nr1反应性抗体的k562细胞的细胞溶解。
[0291]
图7：由hek细胞表面上呈递的nmdar nr1抗体诱导的caar-t细胞的细胞毒性。
[0292]
图8：在动物模型中证明治疗功效的体内方法的实验计划。
[0293]
图9：nr1-caar-t细胞在nmdar脑炎的体内模型中显示出功效。
[0294]
图10：可以用达沙替尼暂时停止atd-caar和atd-s1-s2-t细胞。
[0295]
图11：nr1-caar t细胞在可溶性nr1反应性抗体的存在下保持其功能。
[0296]
附图详细说明：
[0297]
图1：本发明方法的示意性概要。
[0298]
a：表达本发明caar构建体的caar-t细胞识别针对呈递在b细胞表面上的nmdar的自身抗原，所述caar-t细胞包括一个或多个nmdar蛋白质序列、结构域、片段或其组合作为自身抗原。这通过caar激活和t细胞的细胞溶解能力导致所述b细胞的特异性耗尽。b：本发明的caar-t细胞对产生针对其他靶标的抗体的b细胞没有作用，从而使本发明能够表现出针对产生致病性自身抗体的b细胞的特异性作用。
[0299]
图2：dmda受体和对应caar构建体的示意图。
[0300]
a：概述了nmda受体结构，指示nr1结构域的氨基末端结构域以及亚基s1和s2。跨膜结构域表示为圆筒1-4。b：优选但非限制性nmdar-caar构建体的概述，表明用于产生caar的抗原(靶向)部分的nmdar的结构域。
[0301]
图3：nmdar抗体和nmdar-caar-t细胞的结合导致干扰素-γ的释放。
[0302]
只有与nmdar抗体(003-102，008-218)结合，caar-t细胞(图中的左侧柱)才能显示出强烈的干扰素-γ释放。在elisa平板涂有对照抗体(mgo，113-115)的样品中，或在nmdar抗体与对照t细胞孵育的样品中，未检测到大量干扰素-γ(图中的右侧柱)。细胞在固定化抗体存在下孵育48h。
[0303]
图4：通过hek细胞表面上呈递的nmdar nr1抗体激活caar-t细胞。
[0304]
在进行与表达nmdar nr1抗体的靶标hek293细胞共培养48h(上图)或24h(下图)的样品中，可通过样品中大量释放的干扰素-γ观察到caar t细胞的强烈激活(图中的左侧柱)，但在与hek野生型细胞共培养或与对照t细胞联合共培养的样品中不能观察到(图中的右侧柱)。
[0305]
图5：通过k562细胞表面上呈递的nmdar nr1抗体激活caar-t细胞。
[0306]
将50,000个caar t细胞与在其表面表达nr1反应性或对照抗体的k562细胞以1:1共培养48小时。激活的atd-caar和atd-s1-s2(但非对照)t细胞大量释放干扰素-γ。
[0307]
图6：由caar-t细胞对表达表面nr1反应性抗体的k562细胞的细胞溶解。
[0308]
为了定量细胞杀伤，将靶细胞与caar t细胞在范围为30:1至1:1的不同效应物:靶标(e:t)比率下孵育4小时。死亡细胞用7-aad染色并通过流式细胞仪分析。来自用atd-caar或atd-s1-s2-caar转导的健康供体的t细胞导致对表达表面nr1反应性抗体的k562细胞的剂量依赖性杀伤。
[0309]
图7：由hek细胞表面上呈递的nmdar nr1抗体诱导的caar-t细胞的细胞毒性。
[0310]
抗体呈递hek细胞与nmdar-caar-t细胞的共培养导致广泛和提前的细胞死亡作为caar-t细胞激活的结果(左图)。相反，对照t细胞未产生细胞毒性(右图)。
[0311]
图8：在动物模型中证明治疗功效的体内方法的实验计划。
[0312]
在第1天将表面呈递nr1自身抗体并表达荧光蛋白(例如gfp)标记的荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶)的nalm6细胞注射到小鼠体内。在第5天，注射表达本发明caar的治疗性caar-t细胞或不表达caar的对照t细胞。定期进行生物发光成像，例如在时间点第1天、第5天、第8天、第12天、第15天、第19天和第22天，以评估对nalm6细胞的治疗效果。
[0313]
图9：nr1-caar-t细胞在nmdar脑炎的体内模型中显示出功效
[0314]
如图8所述，在第1天将表面呈递nr1自身抗体#003-102并表达荧光蛋白(gfp，绿色荧光蛋白)标记的荧光素酶(萤火虫荧光素酶，ffluc)的nalm6细胞注射到18只小鼠体内。在第5天，将表达本发明caar的治疗性caar-t细胞或不表达caar的对照t细胞注射到每组6只动物体内。图中描绘了第9天(治疗后4天)的体内生物发光测量。以浅灰色填充的白色云状/环状结构显示nalm6细胞的肿瘤负担。通过所示图的彩色图像，可以获得详细的基于颜色的肿瘤负荷描绘。
[0315]
图10：可以用达沙替尼暂时停止atd-caar和atd-s1-s2-t细胞
[0316]
atd-caar和atd-s1-s2-t细胞两者都可以使用临床批准的酪氨酸激酶抑制剂达沙
替尼暂时停止(“安全策略”)。来自用atd-caar或atd-s1-s2-caar转导的健康供体的t细胞导致表达nr1反应性抗体#003-102的nalm6靶细胞的剂量依赖性杀伤。为了定量细胞杀伤，将表达nr1反应性抗体#003-102的nalm6靶细胞与caar t细胞在范围为1:2至8:1的不同效应物:靶标(e:t)比率下孵育18小时。特异性溶解的百分比通过荧光素酶测定中生物发光的减少来确定。
[0317]
图11：nr1-caar t细胞在可溶性nr1反应性抗体的存在下保持其功能
[0318]
当可溶性nr1反应性抗体#003-102存在于细胞培养基中时，来自用atd-caar转导的健康供体的t细胞仅显示出杀伤效率的轻微降低(《20％)。为了定量细胞杀伤，将表达nr1反应性抗体#003-102的nalm6靶细胞与caar t细胞在范围为1:16至1:1的不同效应物:靶标(e:t)比率下孵育18小时。特异性溶解的百分比通过荧光素酶测定中生物发光的减少来确定。贯穿整个实验，可溶性抗体#003-102以0μg/ml(对照)、10μg/μl和50μg/ml三种浓度存在。
[0319]
实施例
[0320]
本发明通过下面公开的实施例来说明。这些实施例为本发明的潜在优选的非限制性实施方式的更详细描述提供了技术支持。
[0321]
实施例1：nmdar-caar构建体和对应caar-t细胞的产生
[0322]
本发明方法的示意性概要如图1所示。
[0323]
为了演示本发明的实际非限制性实施方式，发明人创建了几个caar-t构建体(图2)。这些构建体基于car载体的主链(图2b)。nmda受体的结构域已定位在car载体中，代替通常包含在car载体中的常规抗体片段。
[0324]
为此，将免疫相关细胞外nmda受体结构域的各种组合克隆到car构建体中(图2a)。如图2a所示，nmda受体的nr1亚基的氨基末端结构域(atd)和结构域s1和s2被用于代替car构建体的典型抗原结合抗体片段，从而形成嵌合自身抗体受体(caar)构建体，其中nmda受体片段用于将表达caar的t细胞引导至呈递针对nmda受体的自身抗体的b细胞。
[0325]
用于产生caar的核苷酸序列的特定优选但非限制性实施方式在上文呈现在概述本发明优选序列的表中。以下实验验证中采用的caar构建体在seq id no 19中列出。该构建体包含作为自身抗原(换句话说，caar的靶向部分)的nmda受体片段的特定免疫原性组合。
[0326]
使用穿梭载体fugw(addgene#14883)将该caar-t构建体慢病毒转导到原代人t细胞中，转导率超过60％，并使用建立的体外培养条件在8-12天内扩增10-20倍。
[0327]
在三种体外测定中测试caar-t细胞的功能。通过确定caar-t细胞与靶标抗nmdar抗体之间的接触是否导致caar-t细胞活化，收集表达本发明caar构建体的caar-t细胞的所需效果的体外证据，如干扰素γ测量和靶细胞的细胞毒性所证明。
[0328]
实施例2：通过群集的抗nmdar nr1抗体激活caar-t细胞
[0329]
为此，将elisa板涂覆人nmdar抗体，并然后与caar-t细胞或对照t细胞孵育。caar-t细胞的激活导致干扰素-γ的释放，其在上清液中测量。
[0330]
图3显示，只有nmdar抗体(003-102，008-218)和caar-t细胞结合(图中的左侧柱)，干扰素-γ的强烈释放才明显可见。在elisa平板涂有对照抗体(mgo，113-115)的样品中，或在nmdar抗体与对照t细胞孵育的样品中，未检测到大量干扰素-γ(图中的右侧柱)。
[0331]
实施例3：通过hek或k562细胞表面上呈递的nmdar nr1抗体激活caar-t细胞
[0332]
为此，发明人采用了先前建立的产生nmda受体抗体的人细胞模型。在这个模型中，hek293细胞表达定位于其细胞膜的人单克隆nmda受体抗体。人nmda受体抗体的序列先前已经确定(kreye等人，2016)。
[0333]
图4显示，与实施例2中描述的测定类似，仅在进行与靶细胞共培养48h(上图)或24h(下图)的样品中观察到caar t细胞的强烈激活(图中的左侧柱)是明显的，对应于大量释放的干扰素-γ，但在与hek野生型细胞共培养或与对照t细胞联合共培养的样品中不能观察到(图中的右侧柱)。
[0334]
图5显示，以1:1的比例将caar t细胞与在其表面表达nr1反应性或对照抗体的k562细胞共培养48小时导致干扰素γ的显著释放。
[0335]
实施例4：caar-t细胞对携带nr1抗体的hek或k562细胞的细胞毒性
[0336]
将靶k562细胞与caar t细胞在范围为30:1至1:1的不同效应物:靶标(e:t)比率下孵育。来自用atd-caar或atd-s1-s2-caar转导的健康供体的t细胞导致对表达表面nr1反应性抗体的k562细胞的剂量依赖性杀伤。在图6中提供数据的定量表示。
[0337]
为了进一步测试caar-t细胞的细胞毒性，发明人使用实施例3中描述的hek293细胞，其中nmda受体抗体呈递在其细胞膜上。图7显示，抗体呈递hek细胞与nmdar-caar-t细胞的共培养导致广泛和提前的细胞死亡作为caar-t细胞激活的结果(左图)。相反，对照t细胞未产生细胞毒性(右图)。
[0338]
实施例5：使用上述caar-t细胞评估来自nmda受体脑炎患者的人b细胞。
[0339]
为了在人模型中验证上述caar-t细胞的细胞毒性，将来自nmda受体脑炎患者的人b细胞与上述caar-t细胞一起孵育。caar-t细胞与从nmda受体脑炎患者获得的b细胞的共孵育导致患者b细胞呈递的针对nmdar自身抗体的自身抗体与本发明caar-t细胞之间相互作用，从而导致caar-t细胞激活和b细胞死亡，这将证明本发明在与疾病相关的临床前体外环境中的适用性。
[0340]
实施例6：在动物模型中证明治疗功效的体内方法。
[0341]
为了证明在体内在动物模型中的治疗效果，在第1天将表面呈递nr1自身抗体#003-102或#008-218并表达荧光蛋白(gfp，绿色荧光蛋白)标记的荧光素酶萤火虫荧光素酶(ffluc)的nalm6细胞注射到16只小鼠体内。在第5天，将表达本发明caar的治疗性caar-t细胞或不表达caar的对照t细胞注射到每组6只动物体内。作为测定的读出，确定动物存活率、靶细胞减少(通过体内生物发光测量)和血清抗体水平。实验设置原则上遵循ellebrecht等人(2016)中公开的方法。关于实验设置的示意图，请参考图8。
[0342]
该测定的潜在读出涉及生物发光成像定量(用于检测体内杀伤)、通过elisa定量抗nr1血清水平(用于检测循环抗体的减少)和被治疗动物的尸检分析(用于确定脱靶毒性)。
[0343]
还可以通过经由流式细胞仪检测获得信息，以确定caar-t细胞的扩增，并对淋巴器官、大脑或其他器官进行组织学分析，以确定脱靶效应是否明显。低脱靶效应(通过组织学分析)和显著靶细胞杀伤(通过减少的生物发光证明)将证明本发明在与疾病相关的临床前体内环境中的适用性。
[0344]
根据上述方案，通过表面呈递nr1自身抗体#003-102并表达荧光蛋白(gfp，绿色荧
光蛋白)标记的荧光素酶(萤火虫荧光素酶，ffluc)的nalm6细胞的生物发光成像已获得了初步数据。如图9所示，第9天(治疗后4天)的体内生物发光测量显示，与对照组中的0/6只动物相比，6/6只接受atd-caar治疗的动物和5/6只接受atd-s1-s2-caar治疗的动物的nalm6负荷显著降低。这些数据表明，nr1-caar-t细胞在体内环境也能杀伤其靶细胞。
[0345]
实施例7：可以使用达沙替尼暂时停止atd-caar和atd-s1-s2-t细胞
[0346]
atd-caar和atd-s1-s2-t细胞两者都可以使用临床批准的酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼暂时停止(“安全策略”)。在所进行的测定中，添加100nm达沙替尼完全消除了对靶细胞的杀伤。结果描绘于图10中。
[0347]
来自用atd-caar或atd-s1-s2-caar转导的健康供体的t细胞导致对表达nr1反应性抗体#003-102的nalm6靶细胞的剂量依赖性杀伤。为了定量细胞杀伤，将表达nr1反应性抗体#003-102的nalm6靶细胞与caar t细胞在范围为1:2至8:1的不同效应物:靶标(e:t)比率下孵育18小时。特异性溶解的百分比通过荧光素酶测定中生物发光的减少来确定。
[0348]
该数据表明，nr1-caar t细胞可以使用达沙替尼药物暂时灭活，以帮助降低急性毒性，从而使t细胞在停用药物后恢复其细胞毒性作用。
[0349]
实施例8：nr1-caar t细胞在可溶性nr1反应性抗体的存在下保持其功能
[0350]
当可溶性nr1反应性抗体#003-102存在于细胞培养基中时，来自用atd-caar转导的健康供体的t细胞仅显示出杀伤效率的轻微降低(《20％)。可溶性nr1反应性抗体的存在反映了患者的体内情况，其中致病性nr1反应性抗体可能通过与caar构建体结合而干扰nr1-caar-t细胞介导的靶细胞溶解的杀伤。
[0351]
在此实验中，为了定量细胞杀伤，将表达nr1反应性抗体#003-102的nalm6靶细胞与caar t细胞在范围为1:16至1:1的不同效应物:靶标(e:t)比率下孵育18小时。特异性溶解的百分比通过荧光素酶测定中生物发光的减少来确定。贯穿整个实验，可溶性抗体#003-102以0μg/ml(对照)、10μg/μl和50μg/ml三种浓度存在。结果描绘于图11中。
[0352]
该数据表明，nr1-caar-t细胞在类似于患者中存在的情况下保持其功能，即当可溶性nr1反应性抗体存在并且潜在地作为本发明的caar-t细胞的结合靶标进行竞争时。特别地，当添加50μg/μl高亲和力nr1抗体#003-102时，未观察到nr1-caar-t细胞功能的相关降低，这可能是高于在患者中发现的水平的可溶性nr1反应性抗体水平。这种特性不可能从现有技术中预料到或从现有技术中衍生出来。
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