一种农用微生物菌剂及其制备工艺的制作方法

一种农用微生物菌剂及其制备工艺
发明领域
1.本技术属于微生物肥料领域，具体地，本技术提供了一种农用微生物菌剂及其制备工艺，以及在番茄种植和缺磷土壤改造中的应用。


背景技术：

2.据统计，我国8成以上的耕地处于不同程度的缺磷，要实现现代农业要求的高产必需使用磷肥，番茄、大豆、甘薯等常见作物都是高需磷的种类。我国是世界磷肥第一消费大国，每年磷肥消费量1000万吨左右以上。与土地情况不相适应的是，我国磷矿资源缺乏，保有储量151.98亿吨，数十年内高品质磷矿资源将开采殆尽，磷肥日益成为限制我国农业可持续发展的瓶颈。
3.另一方面，磷肥施入土壤后大部分被土壤固定：在石灰性土壤中有效磷转变成溶解度极低的磷灰石；在酸性土壤中形成磷酸铁和磷酸铝。我国在磷肥/磷矿缺乏的同时，多年来的磷肥使用也造成了土壤磷积累，这些累积磷多以难溶无机磷形态存在，释放缓慢，作物难以利用，即所谓闭蓄态磷或者高稳定性磷。
4.解决土壤磷的活化与释放是提高土壤磷和磷肥利用效率，进而实现我国农业可持续发展的必由之路。溶磷微生物是一类具有活化土壤难溶无机磷能力的有益微生物，应用溶磷微生物活化土壤难溶磷是世界公认的安全、经济和有效的生物措施。目前此类溶磷菌剂多为单一菌株的菌剂，溶磷效果和适应的土壤类型受限。
5.大量研究表明，微生物肥料是一种保护生态环境、提高农作物产量和品质的好方法。微生物肥料是由一种或数种有益活体微生物制备而成的菌剂，借助其代谢过程或代谢产物，以改善植物生长条件，达到促进植株生长的作用。因此，保持微生物活性是制备微生物肥料的关键，载体材料的选用和添加对微生物肥料的质量有关键影响。在用量相同的条件下，不同载体材料对菌体的吸附能力存在差异。同时由于各种微生物的特性不同，同种载体材料对不同菌体的保存期也不同。因此，确定菌剂中的合适微生物载体材料对提高菌剂中的微生物活性和延长菌剂的保质期具有重要的意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的是通过提供一种含微生物载体材料的农用微生物菌剂，解决农用微生物菌剂存在有效活菌数少、肥效不稳定和保质期短的问题。本发明通过在菌剂中加入硅藻土，提高了溶磷微生物的有效活菌数，获得了稳定长期的肥效，并在农作物生产应用中取得了良好的收益。
7.为了达到上述发明目的，本发明提供了以下的技术方案：
8.一种农用微生物菌剂，所述菌剂包括微生物载体材料。
9.优选，所述微生物载体材料为硅藻土。
10.优选，所述农用微生物菌剂按质量比包括下述组分，溶磷微生物8％-12％、微生物载体材料4％-6％、蛋白胨20％-30％、磷酸二氢钾4％-8％、葡萄糖2％-6％和水50％-60％，
所述微生物载体材料为硅藻土。
11.优选，按质量比，所述农用微生物菌剂包括溶磷微生物10％、微生物载体材料5％、蛋白胨25％、磷酸二氢钾6％、葡萄糖4％，余量为水。
12.优选，所述农用微生物菌剂中霉菌杂菌数≤3.0
×
106，杂菌率≤30％，细度≥80％，ph 6.5-7.5，水分≤20％。
13.优选，所述溶磷微生物包含菠萝泛菌和凹陷芽孢杆菌。
14.优选，所述菠萝泛菌和凹陷芽孢杆菌有效活菌数比例为2:1。
15.进一步，本技术提供了一种所述农用微生物菌剂的制备工艺，该工艺的步骤如下：
16.1)将原菌种进行活化扩大培养；
17.2)清洗干净发酵罐进行空气净化消毒，对种子罐、发酵罐及原料进行灭菌；
18.3)接种，进行发酵，发酵结束后的菌液经检测菌数及各项指标合格后，打入储罐并输入喷雾干燥机进行干燥制粉；
19.4)将菌粉输送至造粒机中，形成颗粒，合格大小的产品取样检测各项指标合格后，包装成成品入库。
20.进一步，本技术提供了所述的农用微生物菌剂及其制备工艺在番茄种植中的应用。
21.进一步，本技术提供了所述的农用微生物菌剂及其制备工艺在缺磷土壤改造中的应用。
22.本发明的有益效果：通过在菌剂中添加不同微生物载体材料，如常用的草炭、硅藻土、滑石粉和甘蔗渣，从中择选出了硅藻土是对本发明菌剂中的溶磷微生物有保持活性，保质期延长效果较好的微生物载体材料。本发明的农用微生物菌剂通过硅藻土的添加和使用，较好的吸附了溶磷微生物，维持其活性并在应用中实现了稳定长期的肥效，对农作物的生产有较大的促进作用，获得了良好的经济收益。
具体实施方式
23.菌种和培养基：
24.菠萝泛菌(pantoea ananatis)：申请人购买自中国农业科学院后自行保藏并传代，初始来源为atcc 19321；
25.凹陷芽孢杆菌(bacillus depressus)：申请人购买自中国农业科学院后自行保藏并传代，初始来源为cgmcc的1.15124；
26.黑曲霉(aspergillus niger)：申请人购买自中国农业科学院后自行保藏并传代，初始来源为accc 32579；
27.哈茨木霉(trichoderma harzianum)：申请人购买自中国农业科学院后自行保藏并传代，初始来源为accc 32517。
28.传代时菠萝泛菌和凹陷芽孢杆菌使用各自专用培养基，实验中两种菌使用相同的改进的牛肉膏蛋白胨培养基(每升加入磷酸二氢钾0.1g、磷酸氢二钾0.1g、硫酸铵2.5g，碳酸钙 10g，硫酸亚铁0.005g)。
29.其他原料：
30.蛋白胨、葡萄糖：烟台味丹生物科技有限公司；
31.磷酸二氢钾：四川盛丰化工有限公司；
32.硅藻土购自市售产品。
33.主要设备：
34.主要生产设备名称品牌型号数量生产单位名称种子罐rsb-3501个温州市万福机械制造厂发酵罐gjb-2.01个温州食品机械有限公司储罐1000l2个庆云县信诚塑业有限公司喷雾干燥机tpg型1台江苏先锋干燥工程有限公司螺旋提升机fq6101台河南力王机械设备有限公司挤压造粒机wnj-300-1q1台山东省潍坊市农业机械研究所自动包装机whfbzj-011台上海迈威包装机械有限公司
[0035][0036][0037]
主要实验方法：
[0038]
溶磷实验：
[0039]
使用难溶磷固体培养基：葡萄糖10g、mgso4·
7h2o 0.4g、磷源5g，(nh4)2so
4 0.5g、nacl0.2g、kcl 0.3g、mnso
4 0.03g、feso4·
7h2o 0.01g、琼脂20g、酵母膏0.5g、水1000ml。磷源分别为磷酸钙、羟基磷灰石、磷酸铁。
[0040]
将待测菌株制作成相近od的菌悬液，取200μl菌悬液于6cm培养皿中均匀涂板。25摄氏度培养1日后用6mm的打孔器打成菌饼，将菌饼接入上述培养基平板上，25摄氏度培养3日后测定溶磷圈直径(d)与菌落直径(d)的比值(d/d)大小，以此来确定菌株的溶磷能力。
[0041]
大田实验：
[0042]
实验地点1：内蒙古杭锦后旗二道桥温室大棚
[0043]
供试土壤：试验地为8米跨度温室大棚，土壤为灌淤土，地势平坦，排灌较好，肥力中等，为轻化盐土(表1)。
[0044]
表1供试土壤养分状况
[0045][0046]
供试肥料：浙江丰瑜生态科技股份有限公司生产的微生物菌剂，菌种为菠萝泛菌(pantoeaananatis)和凹陷细胞芽孢杆菌(cytobacillus depressus)，剂型为颗粒，技术指标为有效活菌数≥2.0亿/克。
[0047]
供试品种及栽培方式：番茄品种为普罗旺斯。采用起垄覆膜、吊蔓式立体栽培方式。2 月7日幼苗6-7片真叶时定植。大行距60—70
㎝
，小行距40
㎝
，株距50-55
㎝
，亩留苗2500 株。
[0048]
试验设计与施肥方法：
[0049]
试验设计：常规施肥 基施供试颗粒菌剂(t)、常规施肥 基施灭活基质(ck1)、常规施肥 (ck2)三个处理。重复4次，小区面积30m2，随机区组排列，设立保护行1米，其他管理一致。
[0050]
t1：在常规施肥的基础上，于整地时基施亩基施颗粒微生物菌剂8kg；
[0051]
ck1：在常规施肥的基础上，于整地时基施等量灭活基质8kg；
[0052]
ck2：即常规施肥。于2019年1月22日定植前15天进行整地，施足基肥，结合翻地每亩施充分腐熟的农家肥5000kg，重过磷酸钙80kg，硫酸钾35kg，深耕30厘米，深浇一水，保墒压碱。当第一盘果长到核桃大时，浇临界水、追肥，每次亩追施复合肥20kg；以后每隔10天浇一水，每盘果座稳后随水追肥。
[0053]
实验地点2：内蒙古五原县葵博园农业局温室大棚
[0054]
供试土壤：试验地为8米跨度温室大棚，土壤为灌淤土，地势平坦，排灌较好，肥力中等，为轻化盐土(表2)。
[0055]
表2供试土壤养分状况
[0056][0057]
供试肥料：浙江丰瑜生态科技股份有限公司生产的微生物菌剂，菌种为菠萝泛菌(pantoeaananatis)和凹陷细胞芽孢杆菌(cytobacillus depressus)，剂型为颗粒，技术指标为有效活菌数≥2.0亿/克。
[0058]
供试品种及栽培方式：番茄品种为普罗旺斯。采用起垄覆膜、吊蔓式立体栽培方式。2 月5日幼苗6-7片真叶时定植。大行距60—70
㎝
，小行距40
㎝
，株距50-55
㎝
，亩留苗2500 株。
[0059]
试验设计与施肥方法
[0060]
试验设计：常规施肥 基施供试颗粒菌剂(t)、常规施肥 基施灭活基质(ck1)、常规施肥 (ck2)、三个处理。重复4次，小区面积30m2，随机区组排列，设立保护行1米，其他管理一致。
[0061]
t1：在常规施肥的基础上，于整地时基施亩基施颗粒微生物菌剂8kg；
[0062]
ck1：在常规施肥的基础上，于整地时基施等量灭活基质8kg；
[0063]
ck2：即常规施肥。于2019年1月20日定植前15天进行整地，施足基肥，结合翻地每亩施充分腐熟的农家肥5000kg，重过磷酸钙80kg，硫酸钾35kg，深耕30厘米，深浇一水，保墒压碱。当第一盘果长到核桃大时，浇临界水、追肥，每次亩追施复合肥20kg；以后每隔10天浇一水，每盘果座稳后随水追肥。
[0064]
实施例1微生物有机肥中菌种的选定
[0065]
按照现有技术的研究，已经发现大量菠萝泛菌有不同程度的溶磷能力，发明人在研究微生物有机肥时，尝试了从不同途径获得得多种菠萝泛菌菌株，其普遍存在对难溶磷的溶解性能不足和在实际土壤中施用效果不佳等问题。针对此问题，发明人尝试了不同的菌种组合的溶磷效果，结果如下表(实际验证的菌种更多，由于很多组合有拮抗效果以及保密和继续申请原因，未予以全面展示)：
[0066]
表3单一菌种和菌种组合的溶磷效果
[0067]
菌种磷酸钙d/d羟基磷灰石d/d磷酸铁d/d菠萝泛菌2.372.54—黑曲霉2.211.57—凹陷芽孢杆菌1.821.431.27哈兹木霉—1.76—菠萝泛菌 黑曲霉*2.262.621.21菠萝泛菌 凹陷芽孢杆菌*4.624.292.85菠萝泛菌 哈兹木霉*2.563.091.43
[0068]“*”菌种组合时在平板上200微升菌悬液由两种菌悬液各100微升组成。
[0069]“—”无溶磷圈或无可测量的明显溶磷圈。
[0070]
结果显示待测的菠萝泛菌和黑曲霉都有较好的难溶磷溶解能力，哈兹木霉和凹陷芽孢杆菌虽然在筛选中显示出一定的溶磷性能，但在难溶磷的溶解能力上有明显不足。而菠萝泛菌 凹陷芽孢杆菌以及菠萝泛菌 哈兹木霉的组合相比单菌株明显提高了难溶磷的溶磷能力，特别是对磷酸铁的溶磷能力。
[0071]
随后，发明人进一步验证了不同比例的菠萝泛菌 凹陷芽孢杆菌以及菠萝泛菌 哈兹木霉组合的溶磷效果。结果如表4所示：
[0072]
表4不同比例菌种组合的溶磷效果
[0073][0074][0075]“—”无溶磷圈或无可测量的明显溶磷圈。
[0076]
结果表明，活菌数2:1的菠萝泛菌 凹陷芽孢杆菌具有最好的溶磷效果。
[0077]
实施例2实际菌剂的配制工艺
[0078]
将菠萝泛菌与凹陷芽孢杆菌(活菌数比例为2:1，实际肥料检测中有效活菌数≥2.0亿/g) 与蛋白胨、磷酸二氢钾、葡萄糖、硅藻土和水，配制成颗粒状微生物菌剂。
[0079]
本发明的农用微生物菌剂的基本生产过程为：按配方，将原菌种进行活化扩大培养，清洗干净发酵罐进行空气净化消毒，对种子罐、发酵罐及原料进行灭菌，接种，进行发酵，发酵结束后的菌液经检测菌数及各项指标合格后，打入储罐并输入喷雾干燥机进行干燥制粉，将菌粉输送至造粒机中，形成颗粒，合格大小的产品取样检测各项指标合格后，包装成成品入库。其霉菌杂菌数≤3.0
×
106，杂菌率≤30％，细度≥80％，ph 6.5-7.5，水分≤20％。
[0080]
实施例3农用微生物菌剂的有效菌体释放率和存活率检测
[0081]
选取不同微生物载体材料，以相同的质量比加入农用微生物菌剂，采用下述检测方法进行实验。其中本发明选取了滑石粉、硅藻土、草炭和甘蔗渣等常用微生物载体材料。
[0082]
菌体释放率检测方法：将菌剂放置在阴凉处保存，两天后取10g样品加入100ml生理盐水在200r/min下振荡2h,然后立即用稀释平板计数法测定释放的菌数。用接种菌数与释放菌数(测定时载体实际的有效活菌数)相比计算释放率。结果如表5：
[0083]
表5不同微生物载体材料的菌体释放率
[0084][0085][0086]
存活率检测方法：将放置在室温下的菌剂在2、10、20、40、80和100d分别取10g样品加100ml生理盐水在200r/min下振荡2h,取样方法同上。用稀释平板计数法,测定在不同时期释放的活菌数,并以该菌数对初始菌数的比值作为菌体存活率。结果如表6：
[0087]
表6不同微生物载体材料的菌体存活率
[0088][0089]
通过菌体释放率和存活率实验结果可以看出，添加硅藻土作为微生物载体材料的微生物菌剂中有效活菌数较高。
[0090]
实施例4大田实验结果
[0091]
将实施例2制备的农用微生物菌剂与先前制备的性质类似的菠萝泛菌微生物菌剂(实际肥料检测中有效活菌数≥2.0亿/g)用于实际大田实验，结果如下表：
[0092]
杭锦后旗：
[0093]
表7施用颗粒微生物菌剂对番茄生长状况的影响
[0094][0095]
表8施用颗粒微生物菌剂对番茄产量的影响
[0096][0097][0098]
表9方差分析表
[0099][0100]
通过试验调查结果可以看出，在番茄上施用颗粒微生物菌剂与常规施肥相比，番茄表现出茎秆粗壮、株果数与单果重增加，裂果减少，脐腐病发病率降低，能改善番茄营养生长与生殖生长状况。
[0101]
通过试验产量对比可以看出，番茄施用颗粒微生物菌剂，可极显著提高番茄的产量，增产率达到9.1％，增收3300元/亩，施用浙江丰瑜生态科技股份有限公司生产的颗粒微生物菌剂实现了增产增效。
[0102]
五原县：
[0103]
表10施用颗粒微生物菌剂对番茄生长状况的影响
[0104][0105]
表11施用颗粒微生物菌剂对番茄产量的影响
[0106][0107]
表12方差分析表
[0108][0109]
通过试验调查结果可以看出，在番茄上施用颗粒微生物菌剂与常规施肥相比，番茄表现出茎秆粗壮、株果数与单果重增加，裂果减少，脐腐病发病率降低，能改善番茄营养生长与生殖生长状况。
[0110]
通过试验产量对比可以看出，番茄施用颗粒微生物菌剂，可显著提高番茄的产量，增产率达到6.3％，增收2154元/亩，施用浙江丰瑜生态科技股份有限公司颗粒微生物菌剂实现了增产增效。