检测SDC2基因甲基化的方法与流程

检测sdc2基因甲基化的方法
技术领域
1.本发明涉及一种检测sdc2基因甲基化的方法、一种检测sdc2基因甲基化的组合物及包含所述组合物的试剂盒，并且更具体地涉及一种使用特异性扩增甲基化sdc2基因的引物和能够与由所述引物特异性扩增的甲基化sdc2基因互补杂交的探针检测sdc2基因甲基化的方法、一种用于检测sdc2基因甲基化的组合物以及包含所述组合物的试剂盒。


背景技术：

2.哺乳动物细胞的基因组dna，除了a、c、g和t之外，还具有第五种碱基，即5-甲基胞嘧啶(5-mc)，其中一个甲基附接至胞嘧啶环的第五个碳原子上。5-mc始终仅附接至cg二核苷酸的c(5'-mcg-3')，并且该cg通常表示为cpg。cpg中的c大部分被其所附接的甲基甲基化。cpg的这种甲基化抑制了基因组中重复序列如alu或转座子的表达，并且cpg是哺乳动物细胞中最常发生基因外变化的位点。该cpg的5-mc通过脱氨基作用自然转化为t。因此，哺乳动物基因组中的cpg仅以1％的频率出现，远低于正常频率(1/4x1/4＝6.25％)。
3.有一个其中cpg异常密集的区域，称为cpg位点(cpg岛)。cpg位点长度为0.2-3kb，并且是c、g碱基分布百分比大于50％且cpg分布百分比为3.75％以上的高度集中区域。约45,000个cpg位点出现在整个人基因组中，并且集中发现于调控基因表达的启动子区域。实际上，cpg位点出现在持家基因的启动子中，持家基因约占人基因的一半(cross,s.等人,curr.opin.gene develop.,5:309,1995)。已知异常的dna甲基化主要发生在相应基因的5'调控区，从而降低相应基因的表达。
4.在另一方面，在正常人的体细胞中，这些持家基因启动子区域的cpg岛没有发生甲基化，而是x染色体上的印记基因和失活基因发生甲基化，从而阻止所述印记基因和失活基因在发育过程中的表达。
5.在癌变过程中，启动子cpg岛发生甲基化，并且相应基因的表达受损。特别是当肿瘤抑制基因的启动子cpg岛发生甲基化时，这些基因的表达和功能被阻断(像编码序列突变)，从而促进癌症的发生和发展，所述肿瘤抑制基因调节细胞周期或细胞凋亡、修复dna、参与细胞粘附和细胞间相互作用、并抑制侵袭和转移。由于老化，cpg岛上也可能出现部分甲基化。
6.肿瘤相关基因的启动子甲基化是癌症的重要指示物，因此可以按多种方式使用，如癌症的诊断和早期诊断、癌症风险的预测、癌症预后的预测、治疗后的随访、对化疗的反应预测等。实际上，最近已经积极尝试研究血液、痰、唾液、粪便、尿液等中的肿瘤相关基因的启动子甲基化，并将其结果用于治疗各种类型的癌症(ahlquist,d.a.等人,gastroenterol.,119:1219,2000)。
7.在此技术背景下，本技术的诸位发明人已经确定，可以使用特异性扩增甲基化sdc2基因的引物和能够与由所述引物特异性扩增的甲基化sdc2基因互补杂交的探针，以高的检测限和准确度检测sdc2基因的甲基化，由此完成了本发明。


技术实现要素：

8.本发明的一个目的是提供一种使用引物和探针检测sdc2基因甲基化的方法。
9.本发明的另一个目的是提供一种包括引物和探针的用于检测sdc2基因甲基化的组合物。
10.本发明的再另一个目的是提供一种包括所述组合物的用于检测sdc2基因甲基化的试剂盒。
11.为了实现上述目的，本发明提供了一种检测sdc2基因甲基化的方法，所述方法包括(a)用不同地修饰甲基化sdc2基因和非甲基化sdc2基因的至少一种试剂处理样品，(b)用特异性扩增所述甲基化sdc2基因的引物进行处理，并且(c)用能够与由步骤(b)中的所述引物特异性扩增的甲基化sdc2基因互补杂交的探针进行处理。
12.此外，本发明提供了一种用于检测sdc2基因甲基化的组合物，所述组合物包含不同地修饰甲基化sdc2基因和非甲基化sdc2基因的至少一种试剂、特异性扩增所述甲基化sdc2基因的引物和能够与由所述引物特异性扩增的甲基化sdc2基因互补杂交的探针。
13.此外，本发明提供了一种包含所述组合物的用于检测sdc2基因甲基化的试剂盒。
附图说明
14.图1示出对粪便dna用多重引物组进行甲基化验证的结果。
具体实施方式
15.除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义相同的含义。通常，本文所用的命名法在本领域中为熟知的并且为典型的。
16.本技术的诸位发明人设计了能够代表sdc2基因的整个cpg岛的甲基化特异性检测引物和探针，并通过甲基化特异性扩增确定可以仅在甲基化dna中特异性检测甲基化。此外，使用甲基化特异性检测引物和探针评价了sdc2基因在结直肠癌组织、粪便和血液中诊断结直肠癌的能力。基于其结果，确认了结直肠癌的诊断灵敏性和特异性非常高，所以在结直肠癌诊断方面是很有用的。
17.因此，本发明的一方面涉及一种检测sdc2基因甲基化的方法，所述方法包括(a)用不同地修饰甲基化sdc2基因和非甲基化sdc2基因的至少一种试剂处理样品，(b)用特异性扩增所述甲基化sdc2基因的引物进行处理，并且(c)用能够与由步骤(b)中的所述引物特异性扩增的甲基化sdc2基因互补杂交的探针进行处理。
18.根据本发明，步骤(a)是用不同地修饰甲基化dna区域和非甲基化dna区域的至少一种试剂处理含有靶dna的样品。
19.如本文所用，术语“甲基化”是指修饰成5-甲基胞嘧啶(5-mc)，其中甲基附接至胞嘧啶碱基环的第五个碳，并且5-甲基胞嘧啶始终仅附接至cg二核苷酸的c(5'-mcg-3')，并且这种cg通常称为cpg。cpg的甲基化抑制了基因组中重复序列如alu或转座子的表达，并且cpg是哺乳动物细胞中最常发生基因外变化的位点。该cpg的5-mc通过脱氨作用自然转化为t，因此，哺乳动物基因组中的cpg仅以1％的频率存在，远低于正常频率(1/4x1/4＝6.25％)。
20.有一个其中cpg异常密集的区域，称为cpg岛。cpg岛长度为0.2-3kb，并且是c、g碱基分布百分比大于50％且cpg分布百分比为3.75％以上的高度集中位点。约45,000个cpg岛出现在整个人基因组中，并且集中发现于调控基因表达的启动子区域。cpg岛实际上出现在持家基因的启动子中，持家基因约占人基因的一半。
21.从样本中分离的核酸是从样本的生物样品中获得的。为了诊断结直肠癌或结直肠癌的进展阶段，必须通过刮取或活检从结直肠组织中分离核酸。这种样品可以通过本领域已知的各种医学程序获得。
22.通过与来自不存在结直肠组织细胞生长异常的样本的核酸的相同部分进行比较来测量从样本获得的样品的核酸的甲基化程度。高甲基化指示至少一种核酸中存在甲基化的等位基因。当在不存在结直肠组织细胞生长异常的样本中测试相同的核酸时，甲基化等位基因不会出现。
[0023]“正常”细胞是不显示异常细胞形态或细胞学特性变化的细胞。“肿瘤”细胞是癌细胞，而“非肿瘤”细胞是作为患病组织的部分但不是肿瘤部位的细胞。
[0024]
根据本发明，通过确定从样本中分离的至少一种核酸的甲基化阶段，可以对样本的结直肠组织中的细胞生长异常进行早期诊断。可以将至少一种核酸的甲基化阶段与从未展现出异常结直肠组织细胞生长的样本分离的至少一种核酸的甲基化阶段进行比较。优选地，核酸是含有cpg的核酸，如cpg岛。
[0025]
根据本发明，可以诊断样本的结直肠组织中的细胞生长异常的倾向性(predisposition)，包括确定从样本中分离的至少一种核酸的甲基化。可以将至少一种核酸的甲基化阶段与从在结直肠组织中没有异常细胞生长倾向性的样本中分离的至少一种核酸的甲基化阶段进行比较。
[0026]
如本文所用，术语“倾向性”是指易经受上述细胞生长异常的特性。具有倾向性的样本是尚未展现出细胞生长异常但其中存在细胞生长异常或发生细胞生长异常的可能性增加的样本。
[0027]
靶dna中cpg甲基化的存在可以是疾病的指示物，并且例如可以测量靶dna的启动子、5'非翻译区和内含子中的任何一个的cpg甲基化。
[0028]
含有cpg的基因通常是dna。然而，本发明的方法可以使用含有例如dna或者dna和rna(包括mrna)的样品进行，其中dna或rna可以是单链或双链，或者可以使用含有dna-rna杂交体的样品。
[0029]
也可以使用核酸混合物。如本文所用，术语“多重”包括在一种基因中存在多个待检测的特定核酸序列位点的情况和在一个管(单个反应器)中包括多个靶dna序列的情况。待检测的特定核酸序列可以是大分子的一部分，或者可以最初以离散分子的形式存在，其中特定序列构成整个核酸序列。核酸序列不一定是以纯形式存在的核酸，并且核酸可以是复杂混合物中的一小部分，如在人总dna中包含的一种。
[0030]
特别地，本发明涉及检测在单个反应器中的样品中多个靶dna序列的甲基化，其中所述样品可以包括多个靶dna序列，并且可以不受限制地使用任何靶dna，只要它是当其表达由于异常甲基化而被抑制时影响癌症发生或发展的基因以及控制基因即可。
[0031]
在本发明中，样品可以源自人体，并且样品可以包括例如结直肠癌组织、细胞、粪便、尿液、血液、血清或血浆。
[0032]
可以不受限制地使用不同地修饰甲基化dna和非甲基化dna的至少一种试剂，只要它能够区分非甲基化胞嘧啶碱基和甲基化胞嘧啶碱基即可，并且所述试剂的例子可以包括但不限于亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐、二亚硫酸盐及其组合。特别地，被所述试剂甲基化的胞嘧啶碱基未发生转化，而非甲基化胞嘧啶碱基可以转化为尿嘧啶或除胞嘧啶之外的碱基。
[0033]
在本发明中，步骤(b)是用特异性扩增所述甲基化sdc2基因的引物进行处理。
[0034]
引物可包括至少一个cpg二核苷酸。例如，对于pcr，正向和反向引物可以配对并同时使用。正向引物可以包括例如选自seq id no:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、和34至1140的序列。反向引物可以包括例如选自seq id no:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、和1141至1159的序列。特异性扩增甲基化sdc2基因的引物的特定引物对在实施例1的表1和实施例4的表5中列出。
[0035]
在本发明中，步骤(c)是用能够与由所述引物特异性扩增的甲基化sdc2基因互补杂交的探针进行处理。
[0036]
在杂交反应中，用于实现特定严格水平的条件根据待杂交核酸的特性而变化。例如，在选择杂交条件时考虑待杂交的核酸位点的长度、同源性程度、核苷酸序列组成(例如gc/at比率)和核酸类型(例如rna、dna)。另一个考虑因素是核酸是否固定在例如过滤器等上。
[0037]
非常严格条件的例子如下：室温下2x ssc/0.1％sds(杂交条件)，室温下0.2x ssc/0.1％sds(低严格条件)，42
°
下0.2x ssc/0.1％sds(中严格条件)和68℃下0.1x ssc(高严格条件)。洗涤过程可以使用这些条件中的任何一种进行，并且例如可以使用高严格条件或上述条件中的每一种。可以按上述顺序每次应用这些条件10至15分钟，或者可以重复应用上述条件的全部或一些。然而，如上所述，最佳条件根据所涉及的特殊杂交反应而变化，并且可以通过实验确定。通常，高严格条件用于目的探针的杂交。
[0038]
探针可以包括例如至少一个cpg二核苷酸。特别地，探针可以包括选自seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、和1160至1178的序列。
[0039]
在一些情况下，探针可以被可检测地标记，并且可以用例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合物或酶标记。如上所述的探针的适当标记是本领域熟知的技术，并且可以通过典型方法进行。
[0040]
可以基于荧光信号检测扩增产物的量。检测方法可以包括使用嵌入剂(所述嵌入剂通过与探针所结合的扩增产物的双链dna结合而展示荧光)的嵌入方法，使用其中5'端用荧光材料标记且3'端用淬灭剂标记的寡核苷酸的方法，等。
[0041]
根据本发明的扩增可以通过实时定量扩增(例如实时聚合酶链式反应(pcr))进行，并且在实时pcr中，可以使用荧光信号检测pcr扩增产物的量。随着实时pcr的进行，荧光信号的强度随多核苷酸量的增加成比例地增加，并且获得了显示荧光信号强度(取决于扩增循环数)的扩增特征曲线。
[0042]
总体上，扩增特征曲线被划分为：基线区域，所述基线区域显示基本上不反映多核苷酸量的背景荧光信号；指数区域，所述指数区域中荧光信号随着多核苷酸产物的量的增加而增加；以及平台区域，所述平台区域中pcr达到饱和并且因此荧光信号的强度不再增加。
[0043]
通常，从基线区域到指数区域的转变点(即当pcr扩增产物的量达到荧光可检测的量时的点)处的荧光信号强度称为阈值，并且与扩增特征曲线上的阈值对应的扩增循环数称为阈值循环(ct)值。
[0044]
通过测量ct值、分析其中基于标准材料的ct(阈值循环)值确定浓度的标准曲线、并确认扩增基因的浓度，可以确定甲基化特异性灵敏性和/或特异性。
[0045]
在一个实施方案中，可以使用选自以下的任何方法检测甲基化：pcr、甲基化特异性pcr、实时甲基化特异性pcr、使用甲基化dna特异性结合蛋白的pcr、使用甲基化dna特异性结合抗体的pcr、定量pcr、基因芯片、测序、合成法测序、和连接法测序。
[0046]
(1)甲基化特异性pcr：对于通过甲基化特异性pcr的检测，在用硫酸氢盐处理时，5'-cpg'-3区域的胞嘧啶在甲基化的情况下仍为胞嘧啶，而在非甲基化的情况下转化为尿嘧啶。因此，对于用亚硫酸氢盐处理后转化的核苷酸序列，可以制备与其中存在5'-cpg-3'核苷酸序列的区域相对应的引物。当使用引物进行pcr时，在甲基化的情况下，由于使用了与甲基化核苷酸序列相对应的引物，产生了pcr产物，并且可以通过琼脂糖凝胶电泳确认甲基化。此处，甲基化检测探针可以是taqman、分子信标、或具有自我报告功能或能量转移标记功能的探针，但不限于此。
[0047]
(2)实时甲基化特异性pcr：实时甲基化特异性pcr是一种由甲基化特异性pcr改进得到的实时测量方法，并且包括用亚硫酸氢盐处理基因组dna，设计对应于甲基化核苷酸序列的pcr引物，并使用这些引物进行实时pcr。此处，有两种检测方法：使用与扩增核苷酸序列互补的taqman探针的检测方法和使用sybr green的检测方法。因此，实时甲基化特异性pcr能够仅选择性地定量分析甲基化dna。这样，使用体外甲基化dna样品创建标准曲线，并且还将核苷酸序列中没有5
’‑
cpg-3’序列的基因扩增作为标准化的阴性对照组，由此定量分析甲基化的程度。
[0048]
(3)使用甲基化dna特异性结合蛋白的pcr、定量pcr和dna芯片测定：在使用甲基化dna特异性结合蛋白的pcr或dna芯片方法中，在将仅与甲基化dna特异性结合的蛋白质与dna混合后，所述蛋白质仅与甲基化dna特异性结合，因此可以选择性分离甲基化dna。
[0049]
此外，甲基化可以通过定量pcr来测量，并且将用甲基化dna特异性结合蛋白分离的甲基化dna用荧光染料标记并与集成有互补探针的dna芯片杂交，从而测量甲基化。
[0050]
(4)差异甲基化的检测-亚硫酸氢盐测序方法：另一种检测含有甲基化cpg的核酸的方法包括使含核酸样品与修饰非甲基化胞嘧啶的药剂接触，并且使用cpg特异性寡核苷酸引物扩增样品中的含cpg核酸。此处，寡核苷酸引物的特征可以在于通过区分修饰的甲基化和非甲基化核酸来检测甲基化核酸。扩增步骤是可选和优选的，但不是必需的。该方法依赖于pcr反应以区分经修饰的(例如，经化学修饰的)甲基化dna和非甲基化dna。
[0051]
(5)亚硫酸氢盐测序方法：另一种检测含有甲基化cpg的核酸的方法包括使含核酸样品与修饰非甲基化胞嘧啶的药剂接触，并且使用非甲基化依赖性寡核苷酸引物扩增样品中的含cpg核酸。此处，寡核苷酸引物的特征可以在于在不区分修饰的甲基化和非甲基化核酸的情况下来扩增核酸。已结合亚硫酸氢盐测序描述了扩增产物，以用于通过下一代测序方法检测甲基化核酸或使用测序引物通过sanger方法测序。
[0052]
(6)下一代测序方法包括合成法测序方法和连接法测序方法。这些方法的特征在于，不是创建细菌克隆，而是将单个dna片段空间上分离、原位扩增(克隆扩增)并测序。此
处，由于同时读取了数十万个片段，因此这种方法也称为大规模平行测序方法。
[0053]
基本上，进行合成法测序方法，使用通过依序附接单核苷酸或二核苷酸获得信号的方法，并且其例子可包括焦磷酸测序、离子激流和solexa方法。
[0054]
基于合成法测序方法的ngs设备的例子包括roche的454平台、illumina的hiseq平台、life technology的ion pgm平台、以及pacific biosciences的pacbio平台。454和ion pgm使用再现pcr作为克隆扩增方法，而hiseq使用桥式扩增。合成法测序方法通过检测经依序附接一个核苷酸合成dna时产生的磷酸、质子、或预附接荧光来读取序列。在检测序列的方法中，454使用的是用磷酸的焦磷酸测序方法，而ion pgm使用质子检测。hiseq和pacbio检测荧光以解码序列。
[0055]
连接法测序方法是使用dna连接酶的测序技术，所述dna连接酶识别dna核苷酸序列中某些位置的核苷酸。与大多数使用聚合酶的测序技术不同，连接法测序方法不使用聚合酶，并且其特征在于dna连接酶不会连接错配的序列。其中一个例子是solid系统。在该技术中，间隔读取两个碱基，通过引物重置独立重复五次，因此通过重复读取每个碱基两次来提高准确性。
[0056]
在连接法测序方法中，在由16个组合构成的二核苷酸引物组中，依次连接对应于核苷酸序列的二核苷酸引物，最后分析这些连接的组合，并完成对应dna的核苷酸序列。
[0057]
此处，下一代测序方法可以通过合成法测序方法或连接法测序方法来举例说明。甲基化dna特异性结合蛋白不限于mbd2bt，并且抗体为5
’‑
甲基-胞嘧啶抗体，但不限于此。
[0058]
关于本发明中使用的引物，当在步骤(a)中使用诸如亚硫酸氢盐等试剂时，5'-cpg'-3位点的胞嘧啶在甲基化的情况下仍然为胞嘧啶，而在非甲基化的情况下转化为尿嘧啶。因此，对于用诸如亚硫酸氢盐等试剂处理后转化的核苷酸序列，可以制备与其中存在5'-cpg-3'核苷酸序列的区域相对应的引物。
[0059]
引物可以被设计为与sdc2基因中待扩增基因座的每条链具有“大体上”互补性。这意味着引物具有足够的互补性，以在聚合反应条件下与相应的核酸链杂交。
[0060]
本发明的另一方面涉及一种用于检测sdc2基因甲基化的组合物，所述组合物包含不同地修饰甲基化sdc2基因和非甲基化sdc2基因的至少一种试剂、特异性扩增所述甲基化sdc2基因的引物和能够与由所述引物特异性扩增的甲基化sdc2基因互补杂交的探针。
[0061]
由于根据本发明的组合物中含有的组分与上述组分重叠，因此对上述组分的描述同样适用于此。
[0062]
本发明的再另一方面涉及一种包括上述组合物的用于检测靶dna甲基化的试剂盒。
[0063]
在一个实施方案中，所述试剂盒包括在其中容纳样品的隔室化承载装置、包含试剂的容器、包含能够扩增sdc2基因5'-cpg-3'的引物的容器、以及包含用于检测扩增产物的探针的容器。
[0064]
承载装置适用于容纳一个或多个单独容器，如瓶子和管，所述一个或多个单独容器含有用于本发明方法的独立部件。在本发明的说明书中，本领域普通技术人员可以容易地确定容器中必要药剂的分配。
[0065]
通过以下实施例可以更好地理解本发明。这些实施例仅用于说明本发明，且不应解释为限制本发明的范围，如对于本领域的普通技术人员而言清楚的。
[0066]
实施例1：结直肠癌组织中sdc2基因诊断结直肠癌的能力评价
[0067]
为评价sdc2基因诊断结直肠癌的能力，设计了11组能够代表sdc2基因的整个cpg岛的甲基化特异性检测引物和探针(表1)，并且进行了甲基化特异性实时pcr(qmsp)。为此，从20名结直肠癌患者的手术组织中使用癌组织和与其相邻的正常组织分离基因组dna(qiamp dna小量试剂盒，qiagen)，并将基因组dna(2.0μg)使用ez dna甲基化-金试剂盒(zymo research，美国)用硫酸氢盐处理，溶解在10μl无菌蒸馏水中，并用于甲基化特异性实时pcr(qmsp)。使用亚硫酸氢盐处理的基因组dna作为模板并使用下表1中设计的甲基化特异性引物和探针进行qmsp。对于qmsp，使用rotor-gene qpcr仪(qiagen)。制备总计20μl的pcr反应溶液(20ng模板dna、4μl 5x aptataq dna master(roche diagnostics)、2μl(2pmol/μl)pcr引物、2μl(2pmol/μl)taqman探针和10μl d.w.)，并在95℃5分钟、随后95℃15秒和适当的退火温度(58℃至61℃)1分钟的条件下进行共40个循环的pcr。通过测量循环阈值(c
t
)值来确认pcr产物是否被扩增。使用epitect pcr对照dna组(qiagen，目录号59695)测试甲基化和非甲基化对照dna连同样品dna。使用col2a1基因(kristensen等人,2008)作为内部对照基因。使用c
t
(循环阈值)值测量每个样品的甲基化程度。
[0068]
使用结直肠癌组织和与其相邻的正常组织的c
t
值，通过roc曲线分析(medcalc程序，比利时)计算每个引物和探针组用于结直肠癌诊断的灵敏性和特异性(表2)。
[0069]
[表1]
[0070]
sdc2基因qmsp的引物和探针序列
[0071][0072]
使用结直肠癌组织及与其相邻的正常组织的dna，基于sdc2基因甲基化的验证结果，结直肠癌诊断的灵敏性为80％(16/20)至95.0％(19/20)并且其特异性为85.0％(3/20)至95.0％(1/20)，评价为优异。因此，证实sdc2基因甲基化在结直肠癌诊断中是非常有用的。
[0073]
[表2]
[0074]
结直肠癌组织中sdc2基因诊断结直肠癌的能力评价
[0075][0076]
实施例2：使用粪便dna，对sdc2基因诊断结直肠癌的能力评价
[0077]
为了评价sdc2基因诊断结直肠癌的能力，使用实施例1中描述的sdc2基因甲基化特异性检测引物和探针(表1)进行甲基化特异性实时pcr(qmsp)。为此，从20名结直肠癌患者(延世大学医学中心西富兰斯医院(yonsei medical center severance hospital))和20名正常人(延世大学医学中心西富兰斯医院检查)的粪便dna中分离基因组dna(粪便dna小量试剂盒，qiagen)，并将基因组dna(2.0μg)使用ez dna甲基化-金试剂盒(zymo research，美国)用亚硫酸氢盐处理，溶解在10μl无菌蒸馏水中，并用于甲基化特异性实时pcr(qmsp)。通过实施例1中描述的方法进行qmsp。
[0078]
使用来自结直肠癌患者和正常人的粪便dna的c
t
值，通过roc曲线分析(medcalc程序，比利时)计算每个引物和探针组用于结直肠癌诊断的灵敏性和特异性(表3)。
[0079]
[表3]
[0080]
粪便dna中sdc2基因诊断结直肠癌的能力评价
[0081][0082]
使用来自结直肠癌患者(20个人)和正常人(20个人)的粪便dna，基于sdc2基因甲基化的验证结果，结直肠癌诊断的灵敏性为80％(16/20)至90.0％(18/20)并且其特异性为85.0％(3/20)至90.0％(2/20)，评价为优异。因此，证实在粪便dna中sdc2基因甲基化在结直肠癌诊断中是非常有用的。
[0083]
实施例3：在血液中，对sdc2基因诊断结直肠癌的能力评价
[0084]
为了评价sdc2基因诊断结直肠癌的能力，使用实施例1中描述的sdc2基因甲基化特异性检测引物和探针(表1)进行甲基化特异性实时pcr(qmsp)。为此，从10名结直肠癌患者(忠南大学医院(chungnam national university hospital))和10名正常人(innovative research，美国)(dynabead，thermo fisher)各自的1ml血清中分离dna，并将dna使用ez dna甲基化-金试剂盒(zymo research，美国)用硫酸氢盐处理，溶解在10μl无菌蒸馏水中，并用于甲基化特异性实时pcr(qmsp)。通过实施例1中描述的方法进行qmsp。
[0085]
使用产生自对来自结直肠癌患者和正常人的血清dna进行的qmmsp的c
t
值，通过roc曲线分析(medcalc程序，比利时)计算每个引物和探针组用于结直肠癌诊断的灵敏性和特异性(表4)。
[0086]
[表4]
[0087]
血液(血清)dna中sdc2基因诊断结直肠癌的能力评价
[0088][0089]
使用来自结直肠癌患者(10个人)和正常人(10个人)的血液dna，基于sdc2基因甲基化的验证结果，结直肠癌诊断的灵敏性为70％(14/20)至90.0％(18/20)并且其特异性为85.0％(3/20)至90.0％(2/20)，评价为优异。因此，证实在血液dna中sdc2基因甲基化在结直肠癌诊断中是非常有用的。
[0090]
实施例4：使用粪便dna，对sdc2基因诊断结直肠癌的能力评价
[0091]
为了评价sdc2基因诊断结直肠癌的能力，使用实施例1中描述的sdc2基因甲基化特异性检测引物和探针(表1)进行甲基化特异性实时pcr(qmsp)。为此，从20名结直肠癌患者(延世大学医学中心西富兰斯医院)和20名正常人(延世大学医学中心西富兰斯医院检查)的粪便dna中分离基因组dna(粪便dna小量试剂盒，qiagen)，并将基因组dna(2.0μg)使用ez dna甲基化-金试剂盒(zymo research，美国)用亚硫酸氢盐处理，溶解在10μl无菌蒸馏水中，并用于甲基化特异性实时pcr(qmsp)。通过实施例1中描述的方法进行qmsp。
[0092]
使用来自结直肠癌患者和正常人的粪便dna的c
t
值计算每个引物和探针组用于结直肠癌诊断的阳性频率(图1)。
[0093]
如图1所示，所有引物组在结肠镜检查时在正常人中均展现出阴性甲基化(特异性：100％)。在结直肠癌患者中，新设计引物的阳性甲基化频率高于韩国专利号1142131中描述的seq id no:27(tagaaattaataagtgagagggcgt)和seq id no:28(gactcaaactcgaaaactcgaa)sdc2引物组的阳性甲基化频率(图1中，sdc2项示出对韩国专利号1142131的引物的阳性甲基化频率)。
[0094]
引物和探针组在结直肠癌患者中的阳性甲基化频率示于下表5中。
[0095]
[表5]
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粪便dna中引物和探针组的阳性甲基化频率
[0097][0098]
*韩国专利号1142131中描述的seq id no:27(tagaaattaataagtgagagggcgt)和seq id no:28(gactcaaactcgaaaactcgaa)sdc2引物组中的阳性甲基化频率
[0099]
基于其结果，确认所有新设计的引物和探针组在结直肠癌患者中均展现出高阳性甲基化频率。
[0100]
实施例5：通过多重甲基化特异性引物和探针设计对sdc2基因甲基化检测的评价
[0101]
为评价sdc2基因诊断结直肠癌的能力，设计了1,107组能够代表sdc2基因的整个cpg岛的甲基化特异性检测引物和探针(表6)，并且进行了甲基化特异性实时pcr(qmsp)。为此，使用亚硫酸氢盐处理的人甲基化dna和非甲基化dna(epitect pcr对照dna组，qiagen，目录号59695)评价了这些引物和探针检测sdc2基因甲基化的能力。将20ng dna溶解在10μl无菌蒸馏水中，然后用于甲基化特异性实时pcr(qmsp)。对于qmsp，使用rotor-gene q pcr仪(qiagen)。制备总计20μl的pcr反应溶液(20ng模板dna、4μl5x aptataq dna master(roche diagnostics)、2μl(2pmol/μl)pcr引物、2μl(2pmol/μl)taqman探针和10μl d.w.)，并在95℃5分钟、随后95℃15秒和适当的退火温度(58℃至61℃)1分钟的条件下进行共40个循环的pcr。通过测量循环阈值(ct)值来确认pcr产物是否被扩增。使用col2a1基因(kristensen等人,2008)作为内部对照基因。对于每个样品的甲基化程度，使用ct(循环t)值通过roc曲线分析(medcalc程序，比利时)计算每个引物和探针组用于结直肠癌诊断的灵敏性和特异性。
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[表6]
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sdc2基因qmsp的引物和探针序列
[0104]
[0105][0106]
基于引物和探针对sdc2基因甲基化的测量结果，在非甲基化dna中未检测到甲基化而仅在甲基化dna中检测到甲基化(表6)，表明这些引物和探针适用于检测sdc2甲基化。
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[表7]
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对sdc2基因甲基化具有特异性的引物和探针的甲基化检测结果
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[0151][0152]
实用性
[0153]
本发明具有通过以下方式提供对于结直肠癌诊断赋予信息的方法的效果：以高检测灵敏性检测作为结直肠癌特异性标记基因的sdc2基因的cpg岛的甲基化。由于结直肠癌可以在初始转化阶段就被诊断出来，所以早期诊断是可能的，并且本发明的方法能够比典型方法更准确且快速地诊断结直肠癌，因此是有用的。
[0154]
尽管已如上所述详细公开了本发明的具体实施方案，但对于本领域普通技术人员清楚的是，描述仅为优选的示例性实施方案且不应解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同物定义。
[0155]
序列表文本文本
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附有电子文件。