一种与桃果实高糖相关的SNP分子标记及其应用的制作方法

一种与桃果实高糖相关的snp分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种与桃果实高糖相关的snp分子标记及其应用，属于分子标记辅助选择技术领域。


背景技术：

2.桃是世界上最重要的经济水果树种之一，二倍体(2n＝16)，由于其基因组小(～250m)、童期相对较短(2～3年)，被视为蔷薇科进化和功能基因组研究的宝贵资源和重要的模式植物 (shulaev et al.,2008)。桃原产于中国，4,000年前已在中国驯化，随后通过丝绸之路传递到欧洲各国(faust et al.,1995)。在我国，桃是第三大落叶果树，广泛栽培于全国各地，是农业生产的一个重要组成部分。
3.果实的有机酸是风味形成的重要因素。成熟桃果实有机酸的主要成分包括苹果酸和柠檬酸，其次是奎宁酸，果实发育过程中各种有机酸积累的时间不同，苹果酸比柠檬酸更早地积累(moingetal et al.,1998；reigetal et al.,2013)，低酸品种通常包含更低的苹果酸和柠檬酸含量。尽管果实的有机酸含量是数量性状，根据ph值，桃果实可简单地分为两类，低酸(ph》4) 和正常酸(ph《4)。低酸品种通常会更受市场消费者的欢迎，因为低酸通常会产生更高的糖酸比(iglesiasetal et al.,2009)。果实低酸性状由d位点(doux)调控，低酸对正常酸为显性遗传(yoshida et al.,1970)。dirlewanger et al(1998；2006)最早将调控低酸性状的d位点定位到染色体pp05的前端。而且发现这一区间包含ph，可滴定酸的主效数量性状位点(qtl)，同时也包含调控糖含量变异的数量性状位点(qtl)(dirlewangeretal et al.,1999)。进一步基于低酸品种和正常酸品种“fantasia”杂交后代的f2群体的连锁作图分析表明，调控低酸性状的主效基因定位到5号染色体的前端的0.4cm的基因组区间，位于ssr 标记d-scar0和cppct040之间(boudehri et al.,2009)。基于公布的桃参考基因组序列(verdeet al.,2013)，该区间物理长度约～250kb，包含～25个注释的编码基因，然而真正的候选基因仍未鉴定。前人报道这一区域同时包含低酸和糖qtl(dirlewanger et al.,1999；dirlewanger etal.,2005；zeballos et al.,2016)。然而，到目前为止，与桃果实高糖紧密连锁的分子标记仍未被开发，难以实现早期对桃果实高糖进行分子鉴定。


技术实现要素：

4.本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种与桃果实高糖相关的snp分子标记及其应用。本技术发现在桃基因组pp05染色体的0.72mb处存在桃果实高糖相关snp位点，并通过一对引物的扩增就可得到这些变异位点的序列信息，通过确定与桃果实高糖基因紧密连锁的分子标记可以实现早期对目标性状进行分子鉴定。
5.本发明的第一个目的是提供了与桃果实高糖相关的snp分子标记及其应用，本发明的另一目的是提供用于检测所述的与桃果实高糖相关的snp分子标记的引物及其检测方法。
6.一种与桃果实高糖相关的snp分子标记，所述snp分子标记为位于桃基因组pp05染色体的720,760bp位点处的多态性为g/t的分子标记；
7.当基因型为g/g或者g/t表现桃果实高糖，当基因型为t/t表现桃果实低糖。
8.上述与桃果实高糖相关的snp分子标记在筛选和鉴定桃果实高糖种质资源中的应用。
9.上述应用的应用方法，包括如下步骤：
10.1)提取待测桃树基因组的dna；
11.2)以待测桃树的基因组dna为模板，利用引物对进行pcr扩增反应；
12.3)分析扩增产物的snp位点，当基因型为g/g或者g/t表现桃果实高糖，当基因型为 t/t表现桃果实低糖。
13.进一步的，上述引物对包括引物f和引物r，所述引物f的核苷酸如seq id no.1，所述引物r的seq id no.2所示。
14.进一步的，上述应用方法中所述的步骤2)中所述的pcr扩增反应体系为：10ng/μl dna 模板1μl，10μlm引物各1μl，2
×
phanta max master mix 12.5μl，余量为双蒸水，补齐至 25μl。
15.进一步的，上述应用方法中所述的步骤2)中所述的pcr扩增的反应条件：95℃预变性 30min；95℃变性15s；退火15s；72℃延伸(15-30s/kb)，循环32-34次，72℃终延伸5min。
16.有益效果：
17.(1)本发明采用基于重测序技术，对桃果实高糖的基因进行了精细定位，在精细定位区域内，开发出稳定的、共显性和多态性的snp分子标记，获得了与桃果实高糖基因紧密连锁的snp分子标记，命名为fsc-snp-0.72。由于研究的对象具有果实高糖的种质，已依据获得的紧密连锁标记克隆出了目标性状的基因，应用于分子辅助选育优良桃品种。
18.(2)本发明不仅为桃果实高糖基因的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育具有果实高糖基因的桃树新品种提供了高效途径。
19.(3)本发明基于开发的分子标记引物对提供用于辅助筛选具有特定果实高糖的桃树新品种的方法。
20.(4)通过本发明提供的分子标记，可以实现早期对桃果实高糖形状进行分子鉴定和筛选，具有高效、限制少、准确的优点。
21.(5)本发明方法简便、快捷，有很好的应用推广前景。
附图说明
22.图1与桃果实高糖相关的snp分子标记的位置。
23.图2 417份桃资源的系统进化树、pca(主成分分析)、群体结构和ld(连锁不平衡) 消减趋势。
24.图3 pp05号染色体中的snp可以控制果实糖含量变异和果实风味。
25.图4 prupe.5g006300在果实发育进程中的表达模式和群体中的基于snp的基因型频率分析。
具体实施方式
26.为了使本技术领域人员更好地理解本技术中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本技术一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。
27.实施例1
28.一、自然品种群体中果实高糖基因标记的开发
29.为解决获得准确的表型关联位点，本发明结合417份覆盖各主要产区的栽培桃品种高深度重测序数据(平均深度20.3x)进行变异(snps)检测，筛选到snps位点3,749,618个，利用全基因组关联分析(gwas)，发现一个位于桃基因组pp05染色体720,760bp处的snp 表现为与高糖具有强相关性，如图1中方框中所示，命名为fsc-snp-0.72。
30.图2为417份桃资源的系统进化树、pca、群体结构和ld消减趋势。图2中的a.为基于全基因组范围过滤的高质量snp变异数据，基于临近法构建的进化树。图2中的b是前2 个成分主(pc1和pc2)的pca图。图2中的c是k＝3的群体结构图。x轴表示品种，y轴表示祖先关系的比例。x轴上的品种与系统进化品种排列顺序方式相同。图2中的d是4个群体的基因组平均ld消减趋势图：全部、p1群体、p2群体和p3群体。
31.图3为pp05号染色体中的snp可以控制果实糖含量变异和果实风味。图3中的a为果实低酸性状的曼哈顿图。gwas基于417份桃资源的snp变异数据。虚线表示基因组范围上的显著临界值。x轴代表桃基因组的8条染色体。y轴表示-log10(p)；图3中的b为果实低酸性状的gwas的qq图。x轴表示-log10转换的p预期值，y直轴表示
–
log10转换的p 实际值；图3中的c为候选基因prupe.5g006300的基因结构和基于snp的单倍型分析。长方形表示外显子，直线表示内含子。虚线处表示snp位置( 1584)。ref，alt分别表示参考基因组碱基(g)和突变碱基(t)；图3中的d为snp两侧的氨基酸序列的比对分析。红星表示极其保守的氨基酸位置( 527)。如图3所示，结合417份覆盖各主要产区的栽培桃品种深度重测序数据(平均深度20.3x)进行变异(snps)检测，共检测到3,749,618snps位点，利用全基因组关联分析(gwas)，对桃低酸性状进行分析，发现一个位于桃基因组pp05染色体720,760bp处的snp表现为与桃含量具有强相关性。单倍型分析表明存在高糖(g/g) 与低糖基因型(tt)。蛋白质进化分析表明pp05染色体720,760处snps导致该基因保守氨基酸的改变，可能改变该基因的功能，从而影响桃糖含量。
32.图4为prupe.5g006300在果实发育进程中的表达模式和群体中的基于snp的基因型频率分析。图4中的a.为根据公共rna-seq数据(38)，在果实发育进程中，prupe.5g006300在 2个品种中的表达模式。dafb，花后天数；图4中的b为西方群体(n＝26)和东方群体(n＝372) 中snp基因型频率。g是参考基因组碱基，t为突变碱参；图4中的c为48个品种中 prupe.5g006300的相对表达水平(40dafb)。如图4所示，基因表达模式表明该基因在果实发育后期高表达，在不同品种间表达没有明显差异。基因型频率分析表明西方桃品种均为高糖品种(g/g)，而东方桃品种主要为中间类型(g/t)。
33.当fsc-snp-0.72位点为g/g或g/t基因型时，桃树果实为高糖类型。当fsc-snp-0.72 位点为t/t基因型时，桃树果实为低糖类型。
34.综上，当pp05染色体720,760bp位点为g/g或g/t基因型时，则待检桃品种果实为高糖类型；该位点为t/t时，则待测样品为低糖类型。
35.二、基因组dna的提取
36.基因组dna的提取使用dna secure新型植物基因组dna提取试剂盒(天根生化科技 (北京)有限公司)。首先选取新鲜干净的桃树叶片～0.3g，在液氮环境下利用研钵充分研磨成细粉状。然后根据试剂盒内附说明书进行基因组dna的提取，最终产物置于-20℃保存备用。
37.三、snp开发的引物设计
38.参考桃基因组v2.0序列(https://www.rosaceae.org)，采用primer 3 (https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计引物，引物参数为退火温度在57～65℃之间，引物长度18～27bp，开发基于snp侧翼的序列的分子标记，扩增片段长度约为100～1,000bp。
39.四、pcr扩增体系
40.总体积为25μl，具体组分如下表所示：
41.表1 pcr扩增体系
[0042][0043][0044]
四、pcr扩增及电泳检测
[0045]
pcr仪上的反应条件设置为：95℃预变性30min；95℃变性15sec；根据引物的tm值 (56-72℃)，退火15sec；根据基因长度于72℃延伸(15-30s/kb)；变性、退火及延伸过程共循环32-34次；72℃终延伸5min；利用1％琼脂糖凝胶对pcr结果进行凝胶电泳检测。采用天根生化科技(北京)有限公司的琼脂糖凝胶dna回收试剂盒对琼脂糖凝胶电泳产物进行回收。
[0046]
表2 与桃果实高糖相关snp标记分布、序列和命名
[0047][0048]
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。