一种利用含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统及高表达重组蛋白的细胞的制作方法

一种利用含有硒代半胱氨酸的gpi锚定蛋白表达系统及高表达重组蛋白的细胞
技术领域
1.本发明涉及细胞工程技术领域，特别是涉及一种利用含有硒代半胱氨酸的gpi锚定蛋白表达系统及高表达重组蛋白的细胞。


背景技术：

2.利用哺乳动物细胞生产重组蛋白受到了越来越多的关注，因为它们越来越多地被用于生物制药和临床研究。哺乳动物细胞系，例如中国仓鼠卵巢细胞(cho)，幼仓鼠肾细胞，小鼠骨髓瘤细胞和人胚肾293(hek293)细胞，由于其合适的蛋白折叠、组装和翻译后修饰能力，已被广泛用于重组蛋白的生产。近年来药物蛋白的需求量逐年增加，目前提高生产率主要通过提高基因转染效率和基因扩增率，宿主细胞工程，培养基优化及工艺工程和开发。但是，高产细胞株的筛选和选择仍然基于基因整合，其次是药物选择或荧光激活细胞分选(facs)。此外，大多数重组药物蛋白是分泌蛋白，难以从大量细胞中选择高产细胞系。因此，大规模生产仍然是耗时耗力的工作。通过选择系统的进一步改进，仍然存在提高生产率的机会。
3.哺乳动物细胞中，大多数膜蛋白通过糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚固定在细胞表面。gpi锚定蛋白(gpi-aps)在内质网中合成。具有gpi信号的蛋白质被识别，切割，然后gpi通过由pigk，gpaa1，pigs，pigt和pigu组成的gpi转酰胺酶复合物转移到新生蛋白质c末端。pigk是gpi转酰胺酶的催化亚基。破坏pigk会导致gpi-ap表面表达缺失。当将gpi附着信号添加到分泌蛋白的c末端时，这些蛋白就表示为gpi-ap。因此，有可能通过gpi锚定在细胞表面表达广泛的分泌型重组蛋白。
4.硒是具有重要生物医学潜力的必需微量元素，被掺入硒蛋白中存在的氨基酸硒代半胱氨酸。硒蛋白在各种器官中被广泛认为是抗氧化剂。硒缺乏会引起多种疾病，包括不育，发育迟缓和免疫力低下。编码硒蛋白的基因在3'端非翻译区(utr)中包含sec插入序列(secis)，这对于识别框内密码子uga(通常是终止密码子)作为掺入sec残基的信号是必不可少的。secis元素和框架内uga密码子的组合已用于鉴定多种生物中的硒蛋白质组。硒对于阻止sars病毒病毒突变有独特作用。此外，病毒可使人体产生大量自由基，造成一系列连锁反应，而硒的强大清除自由基作用可破坏这一循环，从而保护脏器不受侵害。美国西弗吉尼亚大学医学院的研究者们建议每天服用200微克硒，以提高人体免疫力，对抗“非典”。此外，缺硒人群食欲较差，也是导致其缺硒和抗病能力下降的原因之一。研究还发现，适量补硒可有效减轻焦虑、抑郁和疲倦，利于机体康复。美国国家科学院食物营养协会推荐10岁以上儿童及成人每人每日硒的摄入量宜在50-200微克。目前临床推荐的安全使用剂量为5ug/kg
·
d体重(治疗量)。一般认为，成人对硒的正常生理需要量为60-400ug/d。长期过量服用硒可导致脱发、指甲和皮肤变暗等。我国从东北到西南存在着一条缺硒地带，这些低硒地区人群每日硒摄入量不足10ug，从而导致多种疾病发生。如江苏省启东县为贫硒地区，当地居民血硒水平仅(0.076
±
0.0237)ug/ml，导致肝炎及肝癌高发。目前，许多国家正积极开发有
egfp-pigk-ko、ppb-frt-pgkp-purodtk、ppb-frt-purodtk-pigk、pcmv-hypbase、orf-uga-gpi-uaa-secis中的一种或几种。
17.本发明的有益效果：
18.1)本发明通过结合糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚定蛋白和硒代半胱氨酸生物合成的特点，构建了硒代半光氨酸的gpi锚定蛋白表达系统。该系统可以将可溶性重组蛋白表达到细胞膜表面，避免蛋白分泌到培养基，通过检测细胞膜表面蛋白的量分析重组蛋白的表达量，大大简化了检测和筛选高表达细胞的难度。与其它筛选系统相比，该系统将重组可溶蛋白表达在细胞膜表面，利用流式分选，筛选方便，高效。
19.2)通过构建重组蛋白与gpi和硒代半胱氨酸信号序列的融合表达质粒，可以实现所有分泌蛋白高表达细胞株的筛选。
20.3)该系统还可以通过控制gpi锚定蛋白的表达控制蛋白质的分泌。与目前筛选高表达重组蛋白细胞株的方法(主要包括提高基因拷贝数，抗生素筛选，分泌蛋白检测)相比，该方法可通过流式分选，能够高效的从大量的细胞中挑选高表达重组蛋白的细胞，同时通过添加硒元素和调控gpi合成基因的表达改变重组蛋白的表达形式。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
22.图1利用硒代半胱氨酸gpi锚定蛋白(gps)表达系统表达重组溶酶体酸性脂肪酶(lipa)；
23.图2为通过向培养基中添加硒元素诱导gpi锚定化lipa的表达；
24.图3为利用转座子系统消除gpi锚定形式的lipa；
25.图4为通过细胞分选富集高表达重组lipa的细胞。
具体实施方式
26.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
27.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
28.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。以本领域技术人员能够实施为准，制定了以下实施例。
29.本技术中，所用的试剂及其用量：嘌呤霉素(1μg/ml)和链霉素/青霉素(1μg/ml)。以小鼠单克隆抗cd59(克隆5h8)和小鼠单克隆抗flag m2(f1804，sigma)为主要一级抗，浓度为10μg/ml。以藻红蛋白(pe)结合的山羊抗鼠igg(abcm,ab97024)，为二级抗体。
fiauridine[1-(2-脱氧-2-氟-β-d-阿拉伯呋喃基)-5-碘-2，4(1h，3h)-嘧啶二酮；fiau](sigma,sml0632)，浓度为1μm和亚硒酸钠(sigma，s5261)。
[0030]
本发明构建了含有硒代半胱氨酸的gpi锚定蛋白表达系统，并将其应用到筛选富集高表达重组溶酶体酸性脂肪酶(lipa)细胞和α-半乳糖苷酶a(gala)细胞方面的应用。
[0031]
实施例1
[0032]
含硒代半胱氨酸的gpi锚定蛋白表达系统的构建(以重组溶酶体酸性脂肪酶(lipa)为例)，该系统是通过结合氧化还原酶蛋白家族硒代半胱氨酸和gpi锚定蛋白合成特点构建起来的。
[0033]
准备载体：准备载体pme-puro-shf-gpi，其带有一个嘌呤霉素抗性基因(puro)，一个带有信号肽的his和flag标签基因(shf)以及gpi修饰信号序列；
[0034]
将pme-puro-shf-gpi通过in-fusion同源重组连接连接lipa(溶酶体酸性脂肪酶)，生成质粒pme-puro-sshf-lipa-gpi，将终止密码子uga(在含有硒的环境之下具有表达能力的硒代半胱氨酸sec的密码子)插入pme-puro-shf-lipa-gpi的gpi附着信号序列之前(shf表示内质网信号序列加上带有his6-flag-标签)通过引物对ctaatgaggaaatatcagtgactcgagaatggtgggaca和tgtcccaccattctcgagtcactgatatttcctcattag进行定点诱变，生成pme-puro-shf-lipa-tga-gpi。使用引物组tcatccctaagcggccgccaccacctatcagcactgaaaac和gactagtctagcggccgcgccagcactgcatgcactgaaacactatcttg扩增人selt基因的secis序列并通过同源重组将lipa-tga-gpi序列的终止密码子(uaa)插入到noti位点之前。将shf-lipa-gpi和shf-lipa-sec-gpi-secis序列切割并连接到pme-hyg中，分别生成pme-hyg-shf-lipa-gpi和pme-hyg-shf-lipa-sec-gpi-secis。载体名称中元件sec的密码子为uga，在一定的条件下也为终止密码子，将sec的密码子uga取代为ugc，此时质粒中元件sec位置表示的生产硒代半胱氨酸或者终止翻译位置转化为对于半胱氨酸(cys)的翻译，质粒转化为pme-hyg-shf-lipa-cys-gpi-secis。将上述质粒瞬时或稳定地转染到hek293细胞中。
[0035]
本实施例还可以将质粒转染到cho细胞中构建硒代半胱氨酸的gpi锚定蛋白表达系统，和hek293细胞中的结果一样，利用该系统可以在cho细胞中筛选富集高表达重组溶酶体酸性脂肪酶(lipa)细胞和α-半乳糖苷酶a(gala)细胞，能够实现质粒的稳定存在、表达和代际遗传，本实施例提供的系统可以在cho细胞中筛选富集高表达重组溶酶体酸性脂肪酶(lipa)细胞和α-半乳糖苷酶a(gala)细胞，本系统在多种不同的哺乳动物细胞中均具有良好的表达，在考虑到到hek293细胞是人源细胞，重组蛋白的糖基化修饰与人体细胞更加接近，因此将质粒转染到hek293细胞中是较好的选择。
[0036]
1、细胞膜表面gpi锚定化lipa的检测及分析
[0037]
1)流式细胞分析细胞膜表面lipa：在胰蛋白酶/edta溶液中收获细胞以进行cd59染色，或在包含2毫摩尔edta和0.5％牛血清白蛋白(bsa)的磷酸盐缓冲液(pbs)中进行细胞标记。将5
×
105个细胞/样品悬浮在facs溶液(pbs，1％bsa和0.1％nan3)中。用抗cd59或抗flag(10微克/毫升)作为第一抗体对细胞染色。pe缀合的山羊抗小鼠igg用作第二抗体。将带有抗体的细胞悬液在冰上孵育25分钟。染色后，使用accuric6流式细胞仪(bd)分析细胞。
[0038]
2)培养基中分泌蛋白的检测：将培养基以10,000
×
g离心5分钟，然后在新管中收集1毫升上清液，然后加入20微升预洗涤的抗flag珠。将试管在4℃旋转2小时，然后以10,000
×
g离心1分钟。除去上清液，并用冷pbs洗涤结合了标签蛋白的珠子3次。蛋白质用50微
升flag肽(500微克/毫升)洗脱，将45微升收集在新管中并与15微升样品缓冲液混合，然后在95℃煮沸5分钟。
[0039]
对于细胞裂解物，除去培养基后，在细胞分选溶液中收获5
×
105个细胞，并在4℃下用冷的pbs洗涤。将裂解缓冲液(100微升，50毫摩尔tris-hcl[ph7.5]，150毫摩尔nacl，1％triton-x100、1毫摩尔edta，蛋白酶抑制剂混合物，1毫摩尔苯基甲基磺酰氟)加入细胞沉淀，并将混合物在冰上孵育30分钟。孵育后，将试管在10,000
×
g下于4℃离心15分钟。收集上清液并与样品缓冲液混合，然后在95℃下煮沸5分钟。将每个样品的等分试样上样至10孔和15孔凝胶(分别为10和5微升)。使用抗flag一抗和辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠igg二抗检测重组lipa。使用imagequant
tm las4000仪器(ge)可视化蛋白质。
[0040]
硒元素诱导细胞膜表面gpi形式的蛋白表达：在补充有不同浓度亚硒酸钠的6孔板中培养稳定表达shf-lipa-sec-gpi-secis的细胞(1
×
105)3d。之后，通过流式细胞术评估lipa的表面表达。
[0041]
实施例2：
[0042]
构建去除pigk基因的系统：首先，使用crispr/cas9系统将pigk(gpi锚定蛋白转酰胺酶复合物的一个催化亚基)基因敲入hek293细胞中。bbsi切割了载体px330-egfp(addgen购买，购买链接https://www.addgene.org/42230/)。将pigk-ko靶序列组caccgctcttgtccttcggcagcgtgg和aaacccacgctgccgaaggacaagagc连接到消化的px330-egfp中，产生px330-egfp-pigk-ko，敲除掉pigk基因的质粒在转入细胞后产生的蛋白无法被gpi，锚定化修饰，全部分泌到培养基中，变为可溶性蛋白。转染后，用细胞分选仪s3(bio-radlaboratories)分选带有egfp的细胞。将收集的细胞培养7天或更长时间，并进行有限稀释以获得克隆的ko细胞。选择没有wt等位基因的克隆，通过测序分析dna序列，然后，将pigk表达构建体插入到pigk-ko细胞的基因组中，载体为ppb-frt-pgkp-purodtk，包含一个pgk启动子，一个多克隆位点，一个牛生长激素多腺苷酸化信号，一个sv40启动子和puroδtk，其两侧均为pb末端重复序列和flippase识别靶标(frt)结束。将pigk扩增并克隆到ppb-frt-pgkp-purodtk的ecori和noti位点中以制备ppb-frt-purodtk-pigk。将ppb-frt-purodtk-pigk与pcmv-hypbase共转染到pigk-ko细胞中，然后用嘌呤霉素(1微克/毫升)选择2周。
[0043]
为了从稳定表达hf-lipa-sec-gpi的细胞中去除含有pigk基因和puroδtk选择标记的基因盒，将细胞培养到90％汇合，然后用4微克pcmv-hypbase或pcag-flbase-ires-purodna分别用于pbase和flippase。2天后，利用含1微升mfiau的培养基，每天更换培养基持续7天。使用流式细胞术通过内源gpi-apcd59的表达检查从基因组中去除基因盒。
[0044]
1、硒代半胱氨酸的gpi锚定蛋白表达系统的验证：
[0045]
1)首先，设计一个新的构建体，该构建体在3'-utr中具有sec插入序列(secis)，并且在开放阅读框(orf)和gpi附着信号之间具有uga密码子，从而生成orf-uga-gpi-uaa-secis。sec被掺入约4％至10％的蛋白质分子中，而uga密码子被认为是终止密码子，而其他》90％(附图1)。因此，在该系统中，某些蛋白质表达为gpi-ap，其余蛋白质则分泌为可溶性蛋白质。将构建体指定为gps(带有sec的gpi锚定蛋白)(附图1)。
[0046]
2)为了分析gps系统是否有效，首先构建质粒，以表达带有gpi附加信号(shf-lipa-gpi)和shf-lipa-gpi与gps系统(shf-lipa-sec)融合的his6-flag标签的lipa-gpi)，
将聚合酶链式反应扩增lipa基因并通过融合pcr插入pme-hyg-shf-gpi质粒上构建pme-hyg-shf-lipa-gpi，之后再通过pcr扩增secis序列并插入pme-hyg-shf-lipa-gpi载体上，最后再通过定点突变引入sec编码基因构建pme-hyg-shf-lipa-sec-gpi-secis质粒。质粒pme-hyg-shf-gpi和pme-hyg-shf-lipa-sec-gpi-secis通过sspi线性化后稳定表达到hek293细胞中。具体如下：嘌呤霉素(1μg/ml)和链霉素/青霉素(1μg/ml)。以小鼠单克隆抗cd59(克隆5h8)和小鼠单克隆抗flag m2(f1804，sigma)为主要一级抗，浓度为10μg/ml。以藻红蛋白(pe)结合的山羊抗鼠igg(abcm,ab97024)为二级抗体。fiauridine[1-(2-脱氧-2-氟-β-d-阿拉伯呋喃基)-5-碘-2，4(1h，3h)-嘧啶二酮；fiau](sigma,sml0632)，浓度为1μm和亚硒酸钠(sigma，s5261)。
[0047]
当shf-lipa-gpi在hek293细胞中表达时，它在细胞表面表达，可以通过用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶c(pi-plc)处理来消除(附图1b)。shf-lipa-sec-gpi在细胞表面微弱表达(shf-lipa-gpi的7.8％，附图1b，中上图)。该蛋白质被pi-plc切割，表明sec是通过secis元件介导的uga密码子掺入的，因此lipa的一部分以gpi锚定的形式在细胞表面表达。由于sec在氧化条件下可以与蛋白质中的半胱氨酸形成硫-硒键，因此sec可能抑制shf-lipa-sec-gpi的折叠，从而导致低表面表达。为了测试这种可能性，将shf-lipa-sec-gpi的uga密码子替换为编码半胱氨酸残基(shf-lipa-cys-gpi)的tgc。shf-lipa-cys-gpi在细胞表面的表达水平与shf-lipa-gpi一致，表明cys或sec的存在不会影响lipa-gpi的折叠或表达(附图1b)。接下来，我们检查了lipa在培养基中的分泌。分泌了shf-lipa(无gpi信号)。相反，lipa-gpi或lipa-cys-gpi没有被有效地分泌。但是，shf-lipa-sec-gpi被分泌到培养基孔中(附图1c)。综上所述，这些数据表明gps系统可以以gpi锚定和分泌形式的混合物形式表达重组蛋白。
[0048]
3)硒元素诱导表达的验证：shf-lipa-sec-gpi构建体中的uga密码子主要被识别为终止密码子，因此大多数重组lipa被分泌为硒代半胱氨酸的gpi锚定蛋白表达系统中的可溶性蛋白。我们验证了补充硒的培养基是否通过上调硒代半胱氨酸合成来增加gpi锚定形式的表达(附图2a)。我们在细胞中稳定表达shf-lipa-sec-gpi。然后，在不同浓度的亚硒酸钠中培养细胞。通过添加亚硒酸盐，lipa表面gpi锚定形式的表达增加了(附图2b)。我们选择3μm亚硒酸钠溶液(培养基中的终浓度)进行以下实验。
[0049]
实施例3
[0050]
通过敲除pigk基因消除gpi形式重组蛋白的验证：即使我们使用gps系统获得了高度表达重组蛋白的细胞系，某些重组蛋白也以gpi-ap的形式在细胞表面表达。当作为药物施用时，小部分gpi锚定形式可能会影响蛋白质特性，例如活性和免疫原性。因此，我们接下来试图从细胞中消除gpi锚定的形式。
[0051]
为了这个目的，我们建立了可以调节gpi生物合成基因pigk表达的细胞系。从hek293细胞中剔除内源性pigk，导致gpi-ap表达丢失(附图3a)。然后，将包含pigk基因片段和在两侧带有frt位点和pb转座子识别位点的puroδtk基因的盒子重新插入基因组中，以恢复所拯救细胞中的gpi-ap表达。在该系统中，可以通过flp重组酶或pb转座酶将pigk排除(附图3b和3c)。切除purotk时，细胞对核苷类似物fiau产生抗性。通过表达flp重组酶或pbase，然后进行fiau处理，可以将细胞转化为pigk-ko细胞。通过引入flp重组酶或pbase，内源性cd59和shf-lipa-sec-gpi的表达均降低(附图3d)。
[0052]
硒代半胱氨酸(gps)重组蛋白表达系统在富集重组分泌蛋白中的应用
[0053]
为了选择高度表达我们目标蛋白的细胞，我们在添加了3μm亚硒酸钠的培养基中培养了稳定表达shf-lipa-sec-gpi的细胞。我们对细胞进行了分选，其中通过添加硒提高了lipa-sec-gpi的表面表达(高表达)(附图4a)，还收集了未增加lipa-sec-gpi的细胞(低表达)，通过蛋白质印迹分析蛋白质分泌到培养基中。与未分选或低分选的细胞相比，细胞(高表达)在细胞裂解液和培养基中均显示出较高的shf-lipa表达(附图4b)。这些结果表明gps系统可用于选择高度表达分泌的重组蛋白的细胞。
[0054]
本发明：
[0055]
1.利用编码硒蛋白的基因在3'端非翻译区(utr)的sec插入序列(secis)可以将识别框内密码子uga(通常是终止密码子)转化成硒代半胱氨酸，构建含有硒代半胱氨酸的gpi锚定蛋白表达系统，在该系统中，部分重组蛋白通过secis元件和框内uga密码子在细胞表面以gpi锚定的形式部分表达，而大多数重组蛋白则直接分泌到培养基中。
[0056]
2.获得的含有硒代半胱氨酸的gpi锚定蛋白表达系统，通过添加硒元素可以将分泌型重组蛋白表达到细胞膜表面，利用流式细胞分选仪，可以快速富集高表达重组分泌蛋白的细胞。然后，我们可以通过使用转座子系统敲除pigk基因来消除gpi锚定部分的重组蛋白。
[0057]
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。