葡萄砧木特异性分子标记及其筛选方法和应用与流程

1.本发明涉及3种葡萄砧木特异性分子标记及其筛选方法和应用，属于生物技术领域。


背景技术：

2.葡萄根瘤蚜于19世纪中期从美国东部传到欧洲，在25年内几乎摧毁了法、意、德的葡萄和酿酒业。由于美洲野生种葡萄对根瘤蚜有抵抗能力，1870年gaston bazille提出将欧洲葡萄嫁接于美洲葡萄上，由此确定了采用砧木防治根瘤蚜的技术路线，这也是果树栽培史上唯一一个因为一种害虫而需要嫁接栽培的实例。至今，世界葡萄主产区大都采用了抗性砧木嫁接栽培。
3.中国对葡萄砧木的探索不以抗线虫和抗根瘤蚜为主要研究方向，其研究重点是抗寒性砧木，其次是抗干旱、盐碱和病虫害等，进入21世纪，在葡萄酒产业和设施栽培特别是避雨栽培的带动下，中国葡萄产业快速扩张，葡萄栽培区域不断向西、向南发展，目前全国葡萄栽培面积达到55.2万hm2，总产量843万吨，但大部分葡萄园为自根系苗建园，使用抗性砧木嫁接苗栽培的比例仍然很低。随着世界性检疫害虫葡萄根瘤蚜在南北方多点的发生，以及中国大陆季风气候带来的冬季寒冷干燥和土壤盐碱等生态逆境的威胁，葡萄嫁接栽培在中国具有广阔的应用潜力，但我国有关于葡萄砧木的研究起步较晚，研究成果较少。
4.法国和德国是最早从事葡萄抗性砧木育种的国家，其采用河岸葡萄、沙地葡萄和冬葡萄作为亲本进行杂交。主要有3个杂交组合群体，除了都抗根瘤蚜以外，其耐石灰质、耐旱能力及形成的树势或产量有明显不同。
①
河岸葡萄与沙地葡萄杂交组合。生产上主要使用101
ꢀ‑
14mgt、3309c两个品种，较抗根癌病，较耐寒，较抗根结线虫能促进嫁接品种早熟，产量低，品质好。
②
河岸葡萄和冬葡萄杂交组合。育成品种有420a、so4、5bb、5c、8b等，是目前生产上使用最多的类型。耐湿不耐旱，抗根结线虫，抗寒性强，根系较浅，树势中庸偏旺，促进接穗长势，产量中等或偏高。
③
沙地葡萄和冬葡萄杂交组合。育成的砧木也是目前生产上特别是在干旱地区广泛使用的砧木，如99r、110r、140ru、1103p、1447p、225ru 等。抗旱，根系分布深，耐瘠薄，嫁接生长势旺，产量高，使接穗品种生长期延长。
5.本发明开发的葡萄砧木鉴定品种主要是河岸葡萄与沙地葡萄典型后代101-14、河岸葡萄和冬葡萄杂交典型后代5bb及沙地葡萄和冬葡萄典型后代1103p，这3个品种也是目前应用最多的品种，通过本发明能够准确鉴定3种常用葡萄砧木，为葡萄砧木的精准生产提供技术支持。


技术实现要素：

6.本发明提供一种3种葡萄砧木的特异性分子标记的筛选方法，并应用该方法筛选到5842 个品种特异的snp标记，基于这些标记开发出两种简便、快速、可靠鉴定3种葡萄砧木的方法，为从源头上准确控制葡萄品种奠定技术基础。
7.本发明采用下述技术方案予以实现：
8.首先，本发明提供一种利用简化基因组测序技术super-gbs筛选3种葡萄砧木的特异性分子标记的方法，包括如下步骤：
9.(1)利用品种已知且准确的6株1103p、6株5bb和5株101-14葡萄砧木为样品，取叶片提取基因组dna；
10.(2)按照简化基因组测序技术super-gbs方法构建文库，文库质检合格后上机测序；
11.(3)对测序数据进行过滤后，使用gatk获得snp位点；
12.(4)对snp进行过滤，过滤条件为：snp测序深度不低于4；剔除maf小于0.01的位点；剔除snp分型缺失率高于20％的位点；剔除所有样品中分型一致的位点；
13.(5)根据每个品种的分型结果，筛选每个品种内所有个体分型完全一致、分型一致位点没有个体缺失，且与其他品种不同的位点；最终筛选到5842个snp位点，具体见表1。
14.(6)利用5842个snp位点或者其中的部分snp位点构建进化树和聚类分析。
15.根据表1筛选到5842个snp位点，能够筛选出几百组准确鉴定3种葡萄砧木品种的snp 位点标记群，其中三组能够准确鉴定3种葡萄砧木品种的snp位点标记群信息及标记扩增引物信息如下如表2-表7：
16.表2能够准确鉴定3种葡萄砧木品种的一组snp位点信息
17.染色体chrom位置pos1103p5bb101-14nc_012008.380704aaaaggnc_012008.3116979cccgcgnc_012008.3117210ggaggg
18.表3所述表2中snp位点鉴定引物信息
[0019][0020]
表4能够准确鉴定3种葡萄砧木品种的一组snp位点信息
[0021][0022][0023]
表5所述表4中snp位点鉴定引物信息
[0024][0025]
表6能够准确鉴定3种葡萄砧木品种的一组snp位点信息
[0026]
染色体chrom位置pos1103p5bb101-14nc_012007.347129ttttctnc_012007.3175994acccacnc_012007.3343319gtgggg
[0027]
表7所述表6中snp位点鉴定引物信息
[0028][0029]
其次，本发明提供一种利用pcr方法鉴定3种葡萄砧木的方法，包括如下步骤：
[0030]
(1)从表1的snp位点中筛选几个snp位点组合成能够鉴定3种葡萄砧木品种的位点群；
[0031]
(2)根据位点所在的基因组位置设计特异性的pcr扩增引物；
[0032]
(3)提取3种葡萄砧木基因组dna；
[0033]
(4)依据权利要求2所述的snp标记群筛选方法进行snp标记位点群筛选，已经筛选出的三个位点群及位点对应的特异性引物，如表2-表7；
[0034]
(5)利用能够扩增出snp位点的引物进行pcr扩增；
[0035]
(6)将获得的pcr产物进行一代测序；
[0036]
(7)根据测序信息对照snp位点信息进行葡萄砧木品种的分析和鉴定。
[0037]
本发明的有益效果：
[0038]
本发明对3种葡萄砧木的组培苗、嫁接苗、成品苗能够准确的区分，确保种苗繁育企业对品种的把控，减少繁育过程中误差造成的经济损失。
附图说明
[0039]
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
[0040]
图1附图为利用筛选到的1103p、5bb和101-14 3种葡萄砧木的5842个特异snp标记构建进化树，能够准确的区分3种葡萄砧木。
sciences)，室温静置5min，以去除300bp以下小片段。从上清中回收磁珠，并用200μl 70％酒精洗脱3遍。最后用40μl 10mm tris.hcl(ph 8.0)从磁珠中回收dna。
[0065]
4.扩增
[0066]
depc水：16μl；taq5
×
master mix：5μl；primer 1(10μm：0.5μl；primer 2(10μm)： 0.5μl；纯化后的连接产物：3μl。
[0067]
所有成分混匀后置于pcr仪中，反应条件为95℃预变性30s，扩增16个循环，每个循环95℃变性30s，62℃退火20s，68℃延伸15s，最后在68℃延伸5min，4℃保存。
[0068]
5.混库
[0069]
使用qubit测定每个样品的文库浓度，浓度大于5ng/μl的样品用于混库测序。通过加入 0.7倍体积的sera-mag beads去除文库中的引物和小片段，然后根据测序量需求进行混样测序，测序平台为illumina nova pe150。建库过程所用的接头和引物序列详见下表8。
[0070]
表8 super-gbs测序文库构建接头及引物序列
[0071]
名称序列(5
’‑3’
)common adaptor topgatcggtctcggcattcctgctgaaccgctcttccgatctcommon adaptor botcgagatcggaagagcggggactttaagcpsti adaptor topcacgacgctcttccgatctaacxxxxxxtgcapsti adaptor botyyyyyyagatcggaagagcgtcgtgprimer1aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctprimer2caagcagaagacggcatacgagatcggtctcggcattcctgctgaa
[0072]
6.分析
[0073]
对3种葡萄砧木品种，共17个样品进行super-gbs测序，一共得到47m高质量reads。将高质量reads比对到参考基因组上，比对率为76.65％～86.17％，所有样品的平均测序深度为 38.12
×
。利用gatk(v3.8-1)软件得到snp位点，然后筛选3个品种间至少有一个品种与其它品种不同的snp位点，最终获得5842个snp位点，采用treebest软件分析，利用r包ggtree绘图，这些位点可用于3种葡萄砧木品种的准确鉴定，鉴定结果见图1。
[0074]
实施例2
[0075]
本实施例提供按照本发明的方法对山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集的3种葡萄砧木各2株进行品种鉴定，同时加入已知品种的3种葡萄砧木样品(实施例1中样品)的测序数据作为对照进行试验和验证。包括如下步骤：
[0076]
(1)从山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集1103p、5bb和101-14各2株，提取基因组dna；
[0077]
(2)按照简化基因组测序技术super-gbs方法构建文库，文库质检合格后上机测序；
[0078]
(3)对测序数据进行过滤后，使用gatk获得snp位点；
[0079]
(4)对snp进行过滤，过滤条件为：snp测序深度不低于4；剔除maf小于0.01的位点；剔除snp分型缺失率高于20％的位点；剔除所有样品中分型一致的位点，保留与表1中的5842个位点重合的snp位点，最终获得5608个snp位点；
[0080]
(5)利用最终获得的5608个snp位点构建进化树，确定采集的葡萄样品的品种。
[0081]
具体的操作步骤如下：
[0082]
本实施例主要包含以下步骤，即酶切、连接、纯化、扩增、混库和分析。
[0083]
1.酶切：
[0084]
对从山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集的6株1103p、5bb和101-14进行 super-gbs建库，具体过程如下(以下为每个样品使用量)：
[0085]
depc水：21.4μl；10
×
cutsmart buffer：3μl；psti-hf(4units)：0.2μl；mspi(8units)： 0.4μl；dna(50ng/μl)：5μl。
[0086]
所有成分混匀后37℃酶切2h，然后75℃保温20min使酶灭活。
[0087]
2.连接：
[0088]
在40μl体系中连接adapter，barcode及酶切片段。
[0089]
depc水：13μl；10
×
t4 ligase buffer：4μl；psti adaptor(0.1μm)：1μl；commonadaptor(10μm)：1.5μl；t4 dna ligase(400u/μl)：0.5μl。酶切产物：20μl。
[0090]
所有成分混匀后22℃酶切2h，然后65℃保温20min使酶灭活。
[0091]
3.纯化
[0092]
取连接产物35μl加入0.7倍体积的sera-mag beads(ge healthcare life sciences)，室温静置5min，以去除300bp以下小片段。从上清中回收磁珠，并用200μl 70％酒精洗脱3遍。最后用40μl 10mm tris.hcl(ph 8.0)从磁珠中回收dna。
[0093]
4.扩增
[0094]
depc水：16μl；taq5
×
master mix：5μl；primer 1(10μm)：0.5μl；primer 2(10μm)： 0.5μl；纯化后的连接产物：3μl。
[0095]
所有成分混匀后置于pcr仪中，反应条件为95℃预变性30s，扩增16个循环，每个循环95℃变性30s，62℃退火20s，68℃延伸15s，最后在68℃延伸5min，4℃保存。
[0096]
5.混库
[0097]
使用qubit测定每个样品的文库浓度，浓度大于5ng/μl的样品用于混库测序。通过加入 0.7倍体积的sera-mag beads去除文库中的引物和小片段，然后根据测序量需求进行混样测序，测序平台为illumina nova pe150。建库过程所用的接头和引物序列详见实施例1中的表8。
[0098]
6.分析
[0099]
对葡萄砧木12个样品进行super-gbs测序，一共得到16.4m高质量reads。将高质量reads 比对到参考基因组上，比对率为75.25-84.43，所有样品的平均测序深度为37.27。利用gatk (v3.8-1)软件得到大量snp位点，与表1中的5842个snp位点进行比对，最终获得5842 个snp位点中的5608个snp位点，采用treebest软件分析，利用r包ggtree绘图，这些位点可用于3种葡萄砧木品种的准确鉴定，鉴定结果见图2。
[0100]
实施例3
[0101]
本实施例提供按照本发明的snp位点设计相对应的pcr检测引物，对山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集多份葡萄砧木基因组dna进行pcr扩增，并通过测序的方法进行 3种葡萄砧木品种鉴定，同时加入已知品种的3种葡萄砧木作为阳性对照进行试验和验证。包括如下步骤：
[0102]
(1)对本公司购买的标准机构提供的品种准确的1103p、5bb和101-14品种各取2株，提取基因组dna；
[0103]
(2)从山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集1103p、5bb和101-14各2株，提取基因组dna；
[0104]
(3)从5842个snp位点中挑取位点组成能够准确鉴定3种葡萄砧木品种的snp位点群见表2；
[0105]
(4)根据挑取的snp位点所在的基因组位置设计pcr扩增的上下游引物见表3；
[0106]
(5)利用表3中3种葡萄砧木品种的通用引物进行pcr扩增；
[0107]
(6)对扩增的序列进行一代测序；
[0108]
(7)参照所用的snp位点信息，根据测序结果中对应的位点的序列进行葡萄砧木品种的分型判读。
[0109]
具体的操作步骤如下：
[0110]
本实施例主要包含以下步骤，即pcr、测序、比对和分析。
[0111]
1、pcr扩增
[0112]
根据表2中的位点所在位置设计pcr扩增引物，引物序列见表3。扩增条件为94℃ 3min,94℃30sec,55℃45sec,72℃45sec,37个循环，72℃7min,12℃30min。扩增体系如下。
[0113]
dna：2μl；taq2
×
master mix：25μl；primer f(10μm)：1μl；primer r(10μm)：1μl； ddh2o：21μl。
[0114]
2.测序
[0115]
将获得的pcr扩增产物利用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在预计位置获得特异扩增条带的样品寄送上海生工生物有限公司进行测序。
[0116]
3.序列比对
[0117]
测序获得的结果利用dnaman软件或者snapgene进行序列比对，利用本发明5842个位点中筛选的一组snp位点标记群(见表2)进行3种葡萄砧木品种的分型。
[0118]
4.分析
[0119]
序列比对鉴定结果发现，3种葡萄砧木品种1103p、5bb和101-14共计6株鉴定结果与实际品种情况相符。
[0120]
实施例4
[0121]
本实施例提供按照本发明的snp位点设计相对应的pcr检测引物，对山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集多份葡萄砧木树苗基因组dna进行pcr扩增，并通过测序的方法进行3种葡萄砧木品种鉴定，同时加入已知品种的3种葡萄砧木作为阳性对照进行试验和验证。包括如下步骤：
[0122]
(1)对本公司购买的标准机构提供的品种准确的1103p、5bb和101-14品种各取2株，提取基因组dna；
[0123]
(2)从山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集1103p、5bb和101-14各2株，提取基因组dna；
[0124]
(3)从5842个snp位点中挑取位点组成能够准确鉴定3种葡萄砧木品种的snp位点群见表4；
[0125]
(4)根据挑取的snp位点所在的基因组位置设计pcr扩增的上下游引物见表5；
[0126]
(5)利用表5中3种葡萄砧木品种的通用引物进行pcr扩增；
[0127]
(6)对扩增的序列进行一代测序；
[0128]
(7)参照所用的snp位点信息，根据测序结果中对应的位点的序列进行葡萄砧木品种的分型判读。
[0129]
具体的操作步骤如下：
[0130]
本实施例主要包含以下步骤，即pcr、测序、比对和分析。
[0131]
1、pcr扩增
[0132]
根据表4中的位点所在位置设计pcr扩增引物，引物序列见表5。扩增条件为94℃ 3min,94℃30sec,55℃45sec,72℃45sec,37个循环，72℃7min,12℃30min。扩增体系如下。
[0133]
dna：2μl；taq2
×
master mix：25μl；primer f(10μm)：1μl；primer r(10μm)：1μl； ddh2o：21μl。
[0134]
2.测序
[0135]
将获得的pcr扩增产物利用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在预计位置获得特异扩增条带的样品寄送上海生工生物有限公司进行测序。
[0136]
3.序列比对
[0137]
测序获得的结果利用dnaman软件或者snapgene进行序列比对，利用本发明5842个位点中筛选的一组snp位点标记群(见表4)进行3种葡萄砧木品种的分型。
[0138]
4.分析
[0139]
序列比对鉴定结果发现，3种葡萄砧木品种1103p、5bb和101-14共计6株鉴定结果与实际品种情况相符。
[0140]
实施例5
[0141]
本实施例提供按照本发明的snp位点设计相对应的pcr检测引物，对山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集多份葡萄砧木树苗基因组dna进行pcr扩增，并通过测序的方法进行3种葡萄砧木品种鉴定，同时加入已知品种的3种葡萄砧木作为阳性对照进行试验和验证。包括如下步骤：
[0142]
(1)对本公司购买的标准机构提供的品种准确的1103p、5bb和101-14品种各取2株，提取基因组dna；
[0143]
(2)从山东大丰园农业有限公司品种圃随机采集1103p、5bb和101-14各2株，提取基因组dna；
[0144]
(3)从5842个snp位点中挑取位点组成能够准确鉴定3种葡萄砧木品种的snp位点群见表6；
[0145]
(4)根据挑取的snp位点所在的基因组位置设计pcr扩增的上下游引物见表7；
[0146]
(5)利用表7中3种葡萄砧木品种的通用引物进行pcr扩增；
[0147]
(6)对扩增的序列进行一代测序；
[0148]
(7)参照所用的snp位点信息，根据测序结果中对应的位点的序列进行葡萄砧木品种的分型判读。
[0149]
具体的操作步骤如下：
[0150]
本实施例主要包含以下步骤，即pcr、测序、比对和分析。
[0151]
1、pcr扩增
[0152]
根据表6中的位点所在位置设计pcr扩增引物，引物序列见表7。扩增条件为94℃ 3min,94℃30sec,55℃45sec,72℃45sec,37个循环，72℃7min,12℃30min。扩增体系如下。
[0153]
dna：2μl；taq2
×
master mix：25μl；primer f(10μm)：1μl；primer r(10μm)：1μl； ddh2o：21μl。
[0154]
2.测序
[0155]
将获得的pcr扩增产物利用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在预计位置获得特异扩增条带的样品寄送上海生工生物有限公司进行测序。
[0156]
3.序列比对
[0157]
测序获得的结果利用dnaman软件或者snapgene进行序列比对，利用本发明5842个位点中筛选的一组snp位点标记群(见表6)进行3种葡萄砧木品种的分型。
[0158]
4.分析
[0159]
序列比对鉴定结果发现，3种葡萄砧木品种1103p、5bb和101-14共计6株鉴定结果与实际品种情况相符。
[0160]
从5842个snp位点中挑取其他snp位点标记群，同样可以准确鉴定1103p、5bb和 101-14这3个葡萄砧木品种。
[0161]
表1中，数字1-3分别代表的11种葡萄品种依次为：1103p、5bb、101-14。
[0162]
表1如下：
[0163]
[0164]
[0165]
[0166]
[0167]
[0168]
[0169]
[0170]
[0171]
[0172]
[0173]
[0174]
[0175]
[0176]
[0177]
[0178]
[0179]
[0180]
[0181]
[0182]
[0183]
[0184]
[0185]
[0186]
[0187]
[0188]
[0189]