从曼地亚红豆杉中同时提取三尖杉宁碱和紫杉醇的方法与流程

1.本发明属于从红豆杉科植物中分离提取有效活性成分技术领域，尤其是涉及一种从曼地亚红豆杉中同时提取三尖杉宁碱和紫杉醇的方法。


背景技术：

2.红豆杉是集观赏、材用、药用为一体的经济价值极高的树种，从红豆杉的树皮和枝叶中提取的紫杉醇是世界公认的具有抗癌功效的天然化合物，是一种具有紫杉烷二萜骨架的新型抗癌药物，也是目前所了解的唯一一种可促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。它对大多数实体肿瘤有强力抑制作用，而对正常细胞基本无影响，尤其对晚期卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和卡波济氏肉瘤的疗效确切、副作用较小，因此成为目前药品行业研究的重点。随着研究的进一步深入，紫杉醇类药物的抗癌作用得到更加广泛的应用，现已成为一线抗癌药物和广谱的抗肿瘤药物。
3.三尖杉宁碱是与紫杉醇共生的一种天然紫杉烷类化合物，和紫杉醇在化学结构上只有酰胺基侧链有所不同。由于三尖杉宁碱和紫杉醇在结构和性质上极其相似，从而造成紫杉醇与三尖杉宁碱的分离十分困难，反复多次分离是必需的。此外，作为一种生物大分子物质，紫杉醇受温度、有机溶剂、酸、碱等环境条件的影响，容易发生降解或异构而生成其他紫杉烷类物质。基于上述因素，研究开发更加简单方便、高效、成本低廉的分离纯化工艺，成为紫杉醇研究中的焦点问题。
4.虽然紫杉醇是主要从太平洋红豆杉(短叶红豆杉)的树皮中提取的天然产物，但在红豆杉科的其它成员例如加拿大红豆杉(t.canadensis)和云南红豆杉(t.yunnanensis)中也发现了紫杉醇。紫杉醇也存在于其它红豆杉种的地上部分和根中，例如欧洲红豆杉(t.baccata)(其针叶中含有紫杉醇及其类似物)、亚洲红豆杉(西藏红豆杉(t.wallichiana)和中国红豆杉(t.chinensis))以及以观赏为目的栽培的红豆杉树。曼地亚红豆杉(taxus media)是东北红豆杉(taxus cuspidata)与欧洲红豆杉(taxes baccata)的天然杂交种，生长速度快，不仅树皮中含有紫杉醇，枝叶中紫杉醇含有量也明显高于国内红豆杉，含量高达0.03％～0.052％，是红豆杉树皮最佳替代原料，不仅可有效保护该资源，还因紫杉醇含有量高而使得其生产成本大大降低，故最适宜生产天然紫杉醇。我国从1995年开始引种加拿大和美国曼地亚红豆杉优良品种，并进行了大规模种植与栽培。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明的目的是提供一种从曼地亚红豆杉中同时提取三尖杉宁碱和紫杉醇的方法，其工艺流程简单，易于操作，绿色无毒、高效，成本低，适合大规模生产。
6.为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种从曼地亚红豆杉中同时提取三尖杉宁碱和紫杉醇的方法，其包括以下步骤：
8.步骤s1、将原料曼地亚红豆杉枝叶阴干、粉碎、过筛，得到0.1～2.5mm的粉料；将粉料以丁烷为溶剂、并以体积浓度70～95％的乙醇或甲醇为夹带剂进行亚临界萃取，得到曼
地亚红豆杉浸膏和残渣；亚临界萃取条件为：粉料与溶剂的料液比为1:3～7kg/l，夹带剂与溶剂的体积比为1:10～50，萃取温度为40～90℃，超声波功率为500～800w，萃取压力为0.2～1.0mpa，萃取时间为30～100min，萃取次数为1～4次；
9.步骤s2、将步骤s1中得到的曼地亚红豆杉浸膏用蒸馏水打散，采用第一溶剂进行萃取，浸膏与第一溶剂的质量比为1:10～30，将萃取后的剩余物减压浓缩，得到曼地亚红豆杉萃取剩余物；第一溶剂为石油醚、氯仿、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、或四氢呋喃；
10.步骤s3、将步骤s2中得到的曼地亚红豆杉萃取剩余物加入第二溶剂进行溶解，萃取剩余物与第二溶剂的料液比为1:10～20kg/l；搅拌使其充分溶解，静置30～100min，将上清液倒入另一容器中，再重复上述搅拌、静置操作3～5次，最后将上清液减压浓缩至干状；第二溶剂为体积浓度10～90％的甲醇、乙醇或乙腈溶液；
11.步骤s4、将步骤s3中得到的干状物，采用第三溶剂进行溶解，干状物与第三溶剂的料液比为1:1～5g/ml，向上述溶解液中加入剩余物的质量5～20％的活性炭，60～80℃吸附1～3h，过滤，收集滤液，滤液浓缩至比重为2.0～3.0，得到曼地亚红豆杉上样液；第三溶剂为甲醇、丙酮、乙醇或乙腈；
12.步骤s5、中高压液相色谱分离：将第一色谱柱和第二色谱柱串联，第一色谱柱所用填料为mci，第二色谱柱所用填料为c18，采用体积浓度5～30％的乙腈或甲醇平衡柱子，紫外检测器波长为200～400nm，待基线稳定后，将步骤s4中的上样液采用预装柱进行上样，采用体积浓度30～70％的乙腈或甲醇作为流动相，根据uv检测收集洗脱液，uv检测器的检测波长为200～254nm，先流出的洗脱液含有三尖杉宁碱，后流出的洗脱液含有紫杉醇，经减压浓缩、过滤和干燥，分别得到高纯度三尖杉宁碱和紫杉醇，三尖杉宁碱的纯度为95％～99％，紫杉醇的纯度为95％～99％。
13.进一步地，上述的步骤s1中，亚临界萃取条件为：粉料与丁烷的料液比为1:3～5kg/l，丁烷与乙醇或甲醇的体积比为1:10～35，萃取温度为40～65℃，超声波功率为500～700w，萃取压力为0.2～0.8mpa，萃取时间为30～60min，萃取次数为1～3次。
14.更进一步地，上述的步骤s1中，亚临界萃取条件为：粉料与丁烷的料液比为1:4kg/l，丁烷与乙醇或甲醇的体积比为1:20，萃取温度为40℃，超声波功率为500w，萃取压力为0.8mpa，萃取时间为30min，萃取次数为2次。
15.进一步地，上述的步骤s5中，第一色谱柱中，填料粒径为10～100μm，柱长为310～920mm，柱内径为15～100mm。
16.进一步地，上述的步骤s5中，第二色谱柱中，填料粒径为5～50μm，柱长为310～920mm，柱内径为15～100mm。
17.本发明从曼地亚红豆杉中同时提取三尖杉宁碱和紫杉醇的方法，其三尖杉宁碱得率为0.5～1％，紫杉醇得率为0.1～1％。
18.由于采用如上所述的技术方案，本发明具有如下优越性：
19.本发明从曼地亚红豆杉中同时提取三尖杉宁碱和紫杉醇的方法，其操作灵活简便，反应及处理条件温和，亚临界流体萃取技术具有节能、环保和效率高的优点，采用第一溶剂萃取能够有效地去除色素和部分树胶类物质，采用第二溶剂、第三溶剂沉淀的方法能够进一步去除浸膏中含有的粘性果胶类物质，方便后续的上样；采用活性炭不仅能够去除样品中的色素类物质，还能有效地把一些粘性不溶物去除，更好地保护后续柱色谱填料，方
便下次重复利用；通过第一色谱柱和第二色谱柱串联的方法达到了对三尖杉宁碱和紫杉醇有效分离效果；整个工艺过程中采用单一的溶剂系统，溶剂能够回收，可以重复利用，避免溶剂的浪费，污染环境；能够同时制备三尖杉宁碱和紫杉醇，制得的三尖杉宁碱和紫杉醇纯度高，制备过程没有毒性有机溶剂的使用，绿色制备，适宜于大规模工业化生产。
附图说明
20.图1是本发明从曼地亚红豆杉中同时提取三尖杉宁碱和紫杉醇的方法的工艺流程图；
21.图2是本发明从曼地亚红豆杉中同时提取三尖杉宁碱和紫杉醇的方法的制备色谱图；
22.图3a是三尖杉宁碱的质谱图；
23.图3b是三尖杉宁碱的核磁氢谱图；
24.图3c是三尖杉宁碱的碳谱图；
25.图4a是紫杉醇的质谱图；
26.图4b是紫杉醇的核磁氢谱图；
27.图4c是紫杉醇的碳谱图。
具体实施方式
28.参照附图和以下实施例可以对本发明作进一步详细说明；但是，以下实施例仅仅是例证，本发明并不局限于这些实施例。
29.如图1、2所示，一种从曼地亚红豆杉中同时提取三尖杉宁碱和紫杉醇的方法，其包括以下步骤：
30.步骤s1、将原料曼地亚红豆杉枝叶阴干、粉碎、过筛，得到0.1～2.5mm的粉料；将粉料以丁烷为溶剂、并以体积浓度70～95％的乙醇或甲醇为夹带剂进行亚临界萃取，得到曼地亚红豆杉浸膏和残渣；亚临界萃取条件为：粉料与溶剂的料液比为1:3～7kg/l，夹带剂与溶剂的体积比为1:10～50，萃取温度为40～90℃，超声波功率为500～800w，萃取压力为0.2～1.0mpa，萃取时间为30～100min，萃取次数为1～4次；
31.步骤s2、将步骤s1中得到的曼地亚红豆杉浸膏用蒸馏水打散，采用第一溶剂进行萃取，浸膏与第一溶剂的质量比为1:10～30，将萃取后的剩余物减压浓缩，得到曼地亚红豆杉萃取剩余物；第一溶剂为石油醚、氯仿、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、或四氢呋喃；
32.步骤s3、将步骤s2中得到的曼地亚红豆杉萃取剩余物加入第二溶剂进行溶解，萃取剩余物与第二溶剂的料液比为1:10～20kg/l；搅拌使其充分溶解，静置30～100min，将上清液倒入另一容器中，再重复上述搅拌、静置操作3～5次，最后将上清液减压浓缩至干状；第二溶剂为体积浓度10～90％的甲醇、乙醇或乙腈溶液；
33.步骤s4、将步骤s3中得到的干状物，采用第三溶剂进行溶解，干状物与第三溶剂的料液比为1:1～5g/ml，向上述溶解液中加入剩余物的质量5～20％的活性炭，60～80℃吸附1～3h，过滤，收集滤液，滤液浓缩至比重为2.0～3.0，得到曼地亚红豆杉上样液；第三溶剂为甲醇、丙酮、乙醇或乙腈；
34.步骤s5、中高压液相色谱分离：将第一色谱柱和第二色谱柱串联，第一色谱柱所用
填料为mci，第二色谱柱所用填料为c18，采用体积浓度5～30％的乙腈或甲醇平衡柱子，紫外检测器波长为200～400nm，待基线稳定后，将步骤s4中的上样液采用预装柱进行上样，进样量为100～500ml，柱温为室温，采用体积浓度30～70％的乙腈或甲醇作为流动相，流速为10～50ml/min，根据uv检测收集洗脱液，uv检测器的检测波长为200～254nm，先流出的洗脱液含有三尖杉宁碱，后流出的洗脱液含有紫杉醇，经减压浓缩、过滤和干燥，分别得到高纯度三尖杉宁碱和紫杉醇，三尖杉宁碱的纯度为95％～99％，紫杉醇的纯度为95％～99％，三尖杉宁碱得率为0.5～1％，紫杉醇得率为0.1～1％。
35.上述的步骤s1中，优选的，亚临界萃取条件为：粉料与丁烷的料液比为1:3～5kg/l，丁烷与乙醇或甲醇的体积比为1:10～35，萃取温度为40～65℃，超声波功率为500～700w，萃取压力为0.2～0.8mpa，萃取时间为30～60min，萃取次数为1～3次；更优选的，亚临界萃取条件为：粉料与丁烷的料液比为1:4kg/l，丁烷与乙醇或甲醇的体积比为1:20，萃取温度为40℃，超声波功率为500w，萃取压力为0.8mpa，萃取时间为30min，萃取次数为2次。
36.上述的步骤s5中，第一色谱柱中，填料粒径为10～100μm，柱长为310～920mm，柱内径为15～100mm；第二色谱柱中，填料粒径为5～50μm，柱长为310～920mm，柱内径为15～100mm。
37.本发明从曼地亚红豆杉中同时提取三尖杉宁碱和紫杉醇的方法，其提取得到的三尖杉宁碱具有如式(ⅰ)所示的化学结构式，紫杉醇具有如式(ⅱ)所示的化学结构式：
[0038][0039]
实施例1
[0040]
一种从曼地亚红豆杉中同时提取三尖杉宁碱和紫杉醇的方法，其包括以下步骤：
[0041]
步骤s1、将原料曼地亚红豆杉枝叶阴干、粉碎、过筛，得到0.1～2.5mm的粉料；将粉
17),1.24(3h,s,h-16),1.68(3h,s,h-19),1.80(3h,s,h-18),1.88(1h,m,h-6β),2.23(3h,s,10-oac),2.33(2h,m,h-14),2.38(3h,s,4-oac),2.54(1h,ddd,j＝15.1,9.9,6.3hz,h-6α),3.79(1h,d,j＝7.1hz,h-3),4.19(1h,d,j＝8.1hz,h-20b),4.31(1h,d,j＝8.1hz,h-20a),4.40(1h,dd,j＝11.1,6.5hz,h-7),4.79(1h,br.s,h-2’),4.95(1h,dd,j＝9.1,2.2hz,h-5),5.67(1h,d,j＝7.1hz,h-2),5.78(1h,d,j＝9.1hz,h-3’),6.23(1h,t,j＝8.8hz,h-13),6.27(1h,s,h-10),6.95(1h,d,j＝8.4hz,3
’‑
nh),7.42(2h,o.t,4'-obz,ph-m),7.47(1h,o.t,4'-obz ph-p),7.75(2h,d,4'-obz,ph-o),7.50-7.35(5h,3
’‑
ph),7.49(2h,o.t,2-obz,ph-m),7.60(1h,t,2-obz,ph-p),8.13(2h,d,2-obz,ph-o).
13
c-nmr(cdcl3,400mhz)δ:78.99(c-1),75.19(c-2),45.58(c-3),81.15(c-4),84.41(c-5),35.66(c-6),72.13(c-7),58.59(c-8),203.6(c-9),75.65(c-10),132.73(c-11),142.76(c-12),72.81(c-13),35.53(c-14),43.16(c-15),20.84(c-16),26.84(c-17),14.82(c-18),9.5(c-19),77.19(c-20),170.35,22.62(4-oac),172.5,22.61(10-oac),167.47(2-obz,c＝o),129.72,128.4,133.61(2-obz,ph),172.71(c-1’),73.1(c-2’),55.02(c-3’),128.40,126.91(3
’‑
ph),166.90(4
’‑
obz,c＝o),126.91,128.75,130.19(4
’‑
obz,ph)。
[0048]
实施例2
[0049]
一种从曼地亚红豆杉中同时提取三尖杉宁碱和紫杉醇的方法，其包括以下步骤：
[0050]
步骤s1、将原料曼地亚红豆杉枝叶阴干、粉碎、过筛，得到0.1～2.5mm的粉料；将粉料以丁烷为溶剂、并以体积浓度75％的乙醇为夹带剂进行亚临界萃取，得到曼地亚红豆杉浸膏和残渣；亚临界萃取条件为：粉料与丁烷的料液比为1:3.5kg/l，乙醇与丁烷的体积比为1:15，萃取温度为55℃，超声波功率为500w，萃取压力为0.5mpa，萃取时间为45min，萃取次数为3次；
[0051]
步骤s2、将步骤s1中得到的曼地亚红豆杉浸膏用蒸馏水打散，采用石油醚进行萃取，浸膏与石油醚的质量比为1:15，将萃取后的剩余物减压浓缩，得到曼地亚红豆杉萃取剩余物；
[0052]
步骤s3、将步骤s2中得到的曼地亚红豆杉萃取剩余物加入体积浓度30％的甲醇溶液进行溶解，萃取剩余物与甲醇的料液比为1:13kg/l，搅拌使其充分溶解，静置40min，将上清液倒入另一容器中，重复上述操作4次，最后将上清液减压浓缩至干状；
[0053]
步骤s4、将步骤s3中得到的干状物，采用丙酮进行溶解，干状物与丙酮的料液比为1:2g/ml，向上述溶解液中加入剩余物的质量10％的活性炭，70℃吸附2h，过滤，收集滤液，滤液浓缩至比重为2.5，得到曼地亚红豆杉上样液；
[0054]
步骤s5、中高压液相色谱分离：将第一色谱柱和第二色谱柱串联，第一色谱柱所用填料为mci，填料粒径为30μm，柱长为310mm，柱内径为30mm，第二色谱柱所用填料为c18，填料粒径为10μm，柱长为380mm，柱内径为35mm，采用体积浓度5％的乙腈平衡柱子，紫外检测器波长为227nm，待基线稳定后，将步骤s4中的上样液采用预装柱进行上样，进样量为150ml，柱温为室温，采用体积浓度38％的乙腈作为流动相，流速为30ml/min，根据uv检测收集洗脱液，uv检测器的检测波长为200nm，先出的洗脱液含有三尖杉宁碱，后出的洗脱液含有紫杉醇，经减压浓缩、过滤和干燥，分别得到高纯度三尖杉宁碱和紫杉醇，hplc检测，三尖杉宁碱的得率为0.65％，紫杉醇的得率为0.55％，三尖杉宁碱的纯度为98.8％，紫杉醇的纯度为99.4％。
[0055]
实施例3
[0056]
一种从曼地亚红豆杉中同时提取三尖杉宁碱和紫杉醇的方法，其包括以下步骤：
[0057]
步骤s1、将原料曼地亚红豆杉枝叶阴干、粉碎、过筛，得到0.1～2.5mm的粉料；将粉料以丁烷为溶剂、并以体积浓度78％的甲醇为夹带剂进行亚临界萃取，得到曼地亚红豆杉浸膏和残渣；亚临界萃取条件为：粉料与丁烷的料液比为1:4kg/l，甲醇与丁烷的体积比为1:20，萃取温度为60℃，超声波功率为550w，萃取压力为0.6mpa，萃取时间为60min，萃取次数为3次；
[0058]
步骤s2、将步骤s1中得到的曼地亚红豆杉浸膏用蒸馏水打散，采用正己烷进行萃取，浸膏与正己烷的质量比为1:18，将萃取后的剩余物减压浓缩，得到曼地亚红豆杉萃取剩余物；
[0059]
步骤s3、将步骤s2中得到的曼地亚红豆杉萃取剩余物加入体积浓度50％乙醇溶液进行溶解，萃取剩余物与乙醇溶液的料液比为1:15kg/l，搅拌使其充分溶解，静置50min，将上清液倒入另一容器中，重复上述操作5次，最后将上清液减压浓缩至干状；
[0060]
步骤s4、将步骤s3中得到的干状物，采用丙酮进行溶解，干状物与丙酮的料液比为1:3g/ml，向上述溶解液中加入剩余物的质量15％的活性炭，80℃吸附3h，过滤，收集滤液，滤液浓缩至比重为3.0，得到曼地亚红豆杉上样液；
[0061]
步骤s5、中高压液相色谱分离：将第一色谱柱和第二色谱柱串联，第一色谱柱所用填料为mci，填料粒径为60μm，柱长为500mm，柱内径为50mm，第二色谱柱所用填料为c18，填料粒径为20μm，柱长为460mm，柱内径为50mm，采用体积浓度15％的甲醇平衡柱子，紫外检测器波长为300nm，待基线稳定后，将步骤s4中的上样液采用预装柱进行上样，进样量为200ml，柱温为室温，采用体积浓度50％的甲醇作为流动相，流速为35ml/min，根据uv检测收集洗脱液，uv检测器的检测波长为234nm，先出的洗脱液含有三尖杉宁碱，后出的洗脱液含有紫杉醇，经减压浓缩、过滤和干燥，分别得到高纯度三尖杉宁碱和紫杉醇，hplc检测，三尖杉宁碱的得率为0.81％，紫杉醇的得率为0.49％，三尖杉宁碱的纯度为97.8％，紫杉醇的纯度为98.6％。
[0062]
实施例4
[0063]
一种从曼地亚红豆杉中同时提取三尖杉宁碱和紫杉醇的方法，其包括以下步骤：
[0064]
步骤s1、将原料曼地亚红豆杉枝叶阴干、粉碎、过筛，得到0.1～2.5mm的粉料；将粉料以丁烷为溶剂、并以体积浓度82％的甲醇为夹带剂进行亚临界萃取，得到曼地亚红豆杉浸膏和残渣；亚临界萃取条件为：粉料与丁烷的料液比为1:5kg/l，甲醇与丁烷的体积比为1:30，萃取温度为70℃，超声波功率为650w，萃取压力为0.7mpa，萃取时间为50min，萃取次数为3次；
[0065]
步骤s2、将步骤s1中得到的曼地亚红豆杉浸膏用蒸馏水打散，采用乙酸乙酯进行萃取，浸膏与乙酸乙酯的质量比为1:20，将萃取后的剩余物减压浓缩，得到曼地亚红豆杉萃取剩余物；
[0066]
步骤s3、将步骤s2中得到的曼地亚红豆杉萃取剩余物加入体积浓度55％乙醇溶液进行溶解，萃取剩余物与乙醇溶液的料液比为1:16kg/l，搅拌使其充分溶解，静置60min，将上清液倒入另一容器中，重复上述操作3次，最后将上清液减压浓缩至干状；
[0067]
步骤s4、将步骤s3中得到的干状物，采用丙酮进行溶解，干状物与丙酮的料液比为
1:3.5g/ml，向上述溶解液中加入剩余物的质量17％的活性炭，80℃吸附2h，过滤，收集滤液，滤液浓缩至比重为2.6，得到曼地亚红豆杉上样液；
[0068]
步骤s5、中高压液相色谱分离：将第一色谱柱和第二色谱柱串联，第一色谱柱所用填料为mci，填料粒径为60μm，柱长为500mm，柱内径为50mm，第二色谱柱所用填料为c18，填料粒径为20μm，柱长为460mm，柱内径为50mm，采用体积浓度18％的甲醇平衡柱子，紫外检测器波长为350nm，待基线稳定后，将步骤s4中的上样液采用预装柱进行上样，进样量为300ml，柱温为室温，采用体积浓度55％的甲醇作为流动相，流速为40ml/min，根据uv检测收集洗脱液，uv检测器的检测波长为229nm，先出的洗脱液含有三尖杉宁碱，后出的洗脱液含有紫杉醇，经减压浓缩、过滤和干燥，分别得到高纯度三尖杉宁碱和紫杉醇，hplc检测，三尖杉宁碱的得率为0.81％，紫杉醇的得率为0.49％，三尖杉宁碱的纯度为97.8％，紫杉醇的纯度为98.6％。
[0069]
实施例5
[0070]
一种从曼地亚红豆杉中同时提取三尖杉宁碱和紫杉醇的方法，其包括以下步骤：
[0071]
步骤s1、将原料曼地亚红豆杉枝叶阴干、粉碎、过筛，得到0.1～2.5mm的粉料；将粉料以丁烷为溶剂、并以体积浓度90％的甲醇为夹带剂进行亚临界萃取，得到曼地亚红豆杉浸膏和残渣；亚临界萃取条件为：粉料与丁烷的料液比为1:6kg/l，甲醇与丁烷的体积比为1:40，萃取温度为80℃，超声波功率为700w，萃取压力为0.8mpa，萃取时间为60min，萃取次数为4次；
[0072]
步骤s2、将步骤s1中得到的曼地亚红豆杉浸膏用蒸馏水打散，采用石油醚进行萃取，浸膏与石油醚的质量比为1:25，将萃取后的剩余物减压浓缩，得到曼地亚红豆杉萃取剩余物；
[0073]
步骤s3、将步骤s2中得到的曼地亚红豆杉萃取剩余物加入体积浓度70％的乙腈溶液进行溶解，萃取剩余物与乙腈溶液的料液比为1:18kg/l，搅拌使其充分溶解，静置80min，将上清液倒入另一容器中，重复上述操作5次，最后将上清液减压浓缩至干状；
[0074]
步骤s4、将步骤s3中得到的干状物，采用甲醇进行溶解，干状物与甲醇的料液比为1:4g/ml，向上述溶解液中加入剩余物的质量20％活性炭，75℃吸附1.5h，过滤，收集滤液，滤液浓缩至比重为3.0，得到曼地亚红豆杉上样液；
[0075]
步骤s5、中高压液相色谱分离：将第一色谱柱和第二色谱柱串联，第一色谱柱所用填料为mci，填料粒径为80μm，柱长为460mm，柱内径为50mm，第二色谱柱所用填料为c18，填料粒径为50μm，柱长为800mm，柱内径为100mm，采用体积浓度30％的乙腈平衡柱子，紫外检测器波长为350nm，待基线稳定后，将步骤s4中的上样液采用预装柱进行上样，进样量为400ml，柱温为室温，采用体积浓度60％的乙腈作为流动相，流速为50ml/min，根据uv检测收集洗脱液，uv检测器的检测波长为254nm，先出的洗脱液含有三尖杉宁碱，后出的洗脱液含有紫杉醇，经减压浓缩、过滤和干燥，分别得到高纯度三尖杉宁碱和紫杉醇，hplc检测，三尖杉宁碱的得率为0.84％，紫杉醇的得率为0.95％，三尖杉宁碱的纯度为98.5％，紫杉醇的纯度为99.2％。
[0076]
实施例6
[0077]
一种从曼地亚红豆杉中同时提取三尖杉宁碱和紫杉醇的方法，其包括以下步骤：
[0078]
步骤s1、将原料曼地亚红豆杉枝叶阴干、粉碎、过筛，得到0.1～2.5mm的粉料；将粉
料以丁烷为溶剂、并以体积浓度95％的甲醇为夹带剂进行亚临界萃取，得到曼地亚红豆杉浸膏和残渣；亚临界萃取条件为：粉料与丁烷的料液比为1:7kg/l，甲醇与丁烷的体积比为1:50，萃取温度为90℃，超声波功率为800w，萃取压力为1.0mpa，萃取时间为100min，萃取次数为4次；
[0079]
步骤s2、将步骤s1中得到的曼地亚红豆杉浸膏用蒸馏水打散，采用四氢呋喃进行萃取，浸膏与四氢呋喃的质量比为1:30，将萃取后的剩余物减压浓缩，得到曼地亚红豆杉萃取剩余物；
[0080]
步骤s3、将步骤s2中得到的曼地亚红豆杉萃取剩余物加入体积浓度90％的甲醇溶液进行溶解，萃取剩余物与甲醇溶液的料液比为1:20kg/l，搅拌使其充分溶解，静置50min，将上清液倒入另一容器中，重复上述操作5次，最后将上清液减压浓缩至干状；
[0081]
步骤s4、将步骤s3中得到的干状物，采用丙酮进行溶解，干状物与丙酮的料液比为1:5g/ml，向上述溶解液中加入剩余物的质量10％活性炭，60℃吸附2h，过滤，收集滤液，滤液浓缩至比重为2.2，得到曼地亚红豆杉上样液；
[0082]
步骤s5、中高压液相色谱分离：将第一色谱柱和第二色谱柱串联，第一色谱柱所用填料为mci，填料粒径为100μm，柱长为920mm，柱内径为100mm第二色谱柱所用填料为c18，填料粒径为50μm，柱长为920mm，柱内径为100mm，采用体积浓度30％的甲醇平衡柱子，紫外检测器波长为400nm，待基线稳定后，将步骤s4中的上样液采用预装柱进行上样，进样量为500ml，柱温为室温，采用体积浓度70％的甲醇作为流动相，流速为50ml/min，根据uv检测收集洗脱液，uv检测器的检测波长为254nm，先出的洗脱液含有三尖杉宁碱，后出的洗脱液含有紫杉醇，经减压浓缩、过滤和干燥，分别得到高纯度三尖杉宁碱和紫杉醇，hplc检测，三尖杉宁碱的得率为0.82％，紫杉醇的得率为0.78％，三尖杉宁碱的纯度为99.3％，紫杉醇的纯度为98.2％。
[0083]
上述实施例2～6中，本发明从曼地亚红豆杉中同时提取三尖杉宁碱和紫杉醇的方法，其提取得到的三尖杉宁碱和紫杉醇的核磁数据与实施例1相同。
[0084]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。