一种黄精均一多糖及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于中草药大分子多糖分离纯化技术领域，具体涉及一种黄精均一多糖及其制备方法与应用。


背景技术：

2.黄精，是百合科植物黄精、滇黄精、多花黄精的干燥根茎。作为中国传统中药材之一，同时也是著名的药食同源药材，有补气血，强肾脏的作用，具有较高的药用价值及商业价值。多糖是黄精属植物含量最高的成分，黄精多糖具有抗衰老、抗肿瘤、增强免疫力、降血脂血糖等作用。然而，现有技术中对于黄精多糖的报道多是关于其功能的，很少有人研究黄精均一多糖。因此，从黄精药材中提取得到粗多糖，对黄精多糖进行分离纯化，有利于对黄精多糖的进一步研究。


技术实现要素：

3.本发明基于关于黄精多糖分离纯化、黄精多糖的组成、初步结构表征、药理作用研究较少的问题，为了进一步研究黄精多糖，提供了一种黄精均一多糖，其活性成分由甘露糖、岩藻糖和半乳糖组成。
4.进一步地限定，甘露糖、岩藻糖和半乳糖的比例为1:15:1。
5.本发明还提供了一种上述黄精均一多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
6.s1、利用蒸馏水对黄精根茎进行提取，获得的滤液经浓缩得提取液；
7.s2、将s1获得的提取液与乙醇溶液混合，充分搅拌后静置，经抽滤获得沉淀，再对沉淀烘干后获得黄精粗多糖；
8.s3、依次利用阴阳离子串联交换树脂柱和sephacyrl s400凝胶柱对黄精粗多糖进行纯化，获得黄精均一多糖。
9.进一步地限定，其特征在于，s1所述提取是指将黄精根茎与蒸馏水按照1g：3ml～1g：4ml的料液比进行混合，沸水状态下煎煮1～2h后经过滤收集滤液和滤渣；按照上述操作对滤渣重复提取1～2次，再合并每次提取得到的滤液。
10.进一步地限定，s2所述提取液与95％乙醇溶液的体积比为1：3～1：4；静置时间为10～14h。
11.进一步地限定，s2还包括在静置获得沉淀后，再次利用体积分数为95％的乙醇溶液醇沉1～2次。
12.进一步地限定，s3所述阴阳离子串联交换树脂柱纯化的方法是取s2获得的黄精粗多糖，用蒸馏水配制成3％的多糖溶液，离心后，取上清加入fpa90cl和fpc3500阴阳离子串联交换树脂柱中，依次利用蒸馏水、0.5mol/l nacl和1mol/l nacl进行洗脱，对洗脱获得的各组分依次进行浓缩、透析、浓缩、冷冻干燥后，获得水洗组分。
13.进一步地限定，所述透析是指；用流水透析15～50h，再用蒸馏水透析20～28h。
14.进一步地限定，s3所述sephacyrl s400凝胶柱纯化的方法是将s3阴阳离子串联交
换树脂柱纯化获得的水洗组分配置成浓度为3％的多糖溶液，离心后，取上清加入sephacyrl s400凝胶柱中，依次用蒸馏水、0.1mol
·
l
‑1、0.2mol
·
l
‑1、0.3mol
·
l
‑1、0.4mol
·
l
‑1、0.5mol
·
l
‑1、1mol
·
l
‑1nacl进行梯度洗脱，流速2ml
·
min
‑1，收集水洗组分和0.1mol
·
l
‑1、0.2mol
·
l
‑1、nacl盐洗组分，经蒸馏水透析、减压浓缩、冷冻干燥后，获得黄精均一多糖。
15.本发明还提供了上述黄精均一多糖在制备治疗肾炎的药物中的应用。
16.本发明的有益效果：
17.本发明通过水提醇沉法对黄精根茎进行提取，获得黄精粗多糖，该方法得率高，不易改变多糖结构；将粗多糖过阴阳离子串联交换树脂柱除去蛋白、色素及其他杂质，再过离子交换琼脂凝胶柱得黄精均一多糖。紫外全波长扫描图谱显示该黄精均一多糖无蛋白质、核酸及多肽等杂质；红外光谱中显示多糖特征峰，证实了该黄精均一多糖的结构；用hplc
‑
elsd法测其分子量时图谱显示单峰且峰形对称，表明该纯化多糖组分均一且纯度较高，测得其分子量都为4000da左右，表明是大分子组分。此外，该本发明获得的黄精均一多糖对于肾炎的治疗有良好的效果，可用于制备治疗肾炎的药物，为肾炎的治疗提供了另一种可行的办法。
附图说明
18.图1为总多糖的标准曲线图；
19.图2为糖醛酸标准曲线图；
20.图3为蛋白标准曲线图；
21.图4为样品psp
‑
1s的洗脱曲线图；
22.图5为psp
‑
1s紫外全波长扫描图；
23.图6为psp
‑
1s红外光谱扫描图；
24.图7为葡聚糖标准曲线图；
25.图8为psp
‑
1s色谱图；
26.图9为pmp柱前衍生高效液相分析结果图；
27.图10为psp
‑
1s完全酸水解pmp衍生物的高效液相分析结果图；
28.图11为各组肾组织病理形态学观察结果图。
具体实施方式
29.以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
30.实施例1：黄精均一多糖的制备方法
31.(一)黄精多糖的提取
32.采用蒸馏水浸提，乙醇沉淀的方法提取黄精多糖，具体步骤为：取处理好的黄精药材干燥根茎2.6kg，每次加入药材500g，按照黄精与蒸馏水料液比1g：3ml的比例加入蒸馏水，在微沸状态下煎煮90min，滤出药液，按照上述提取方法对药渣重复提取2次，合并药液并将其浓缩获得提取液；按照提取液与体积分数为95％乙醇溶液的体积比为1：4的比例向
提取液中边搅拌边缓慢添加95％乙醇溶液，完成后静置过夜，重复沉淀两次，然后对沉淀进行抽滤，取沉淀，将沉淀放入烘箱干燥，称重保存，得黄精粗多糖(psp)510g，得率为19.62％。
33.黄精粗多糖含量测定
34.(1)黄精总多糖的含量测定
35.黄精总多糖的含量测定采用硫酸
‑
苯酚法具体步骤如下：
36.①
标准曲线的绘制
37.按表1加入相应试剂后，晃匀，放置10min，沸水浴15min后流水使其冷却，测定波长为490nm，测定结果如表2所示，标准曲线如图1所示。
38.表1相应试剂的配制(单位：ml)
[0039][0040]
表2多糖标准曲线测定结果
[0041][0042][0043]
②
转化系数的计算
[0044]
取粗多糖样品溶液0.2ml溶液于10ml试管中，用蒸馏水补齐至2ml，制备三份，按同法处理后，在490nm下测定吸光值，根据下式计算转化系数：
[0045][0046]
上式中w为多糖质量，c为葡萄糖浓度，d为稀释因子。
[0047]
样品吸光度为0.427；根据上式计算得转换系数为1.44，带入公式(式中w为多糖质量，c为葡萄糖浓度，d为稀释因子，f为转换系数)，计算出在黄精粗多糖中黄精多糖含量为62.58％。
[0048]
(2)糖醛酸含量测定
[0049]
本实验需要糖醛酸对照品溶液0.4mg/ml。按表3加入相应试剂后，85℃水浴20min，放冷，摇匀，2h后测定，波长为530nm，测定结果如表4所示，标准曲线如图2所示。
[0050]
表3相应试剂的配制
[0051][0052]
表4糖醛酸标准曲线测定结果
[0053][0054]
取0.4mg/ml的样品溶液1ml于具塞试管中，同法测定吸光度后，代入标准曲线计算糖醛酸的含量。样品吸光度为0.233；经计算黄精多糖中糖醛酸含量为18.27％。
[0055]
(3)蛋白含量测定
[0056]
本实验采用考马斯亮蓝g
‑
250法测定黄精粗多糖中的蛋白含量，具体步骤如下：
[0057]
配制0.5mg/ml牛血清蛋白标准溶液，溶剂为0.9％nacl溶液，按表5加入相应试剂后，立刻摇匀，室温放置15min，在590nm处测定吸光度值，蛋白测定结果如表6所示，测定标准曲线如图3所示。
[0058]
表5相应试剂的配制
[0059][0060]
表6蛋白标准曲线测定结果
[0061][0062]
精密称取psp 100mg，用0.9％nacl溶液溶解定容于100ml容量瓶中。取1ml样品，同法操作得吸光度后代入标准曲线。样品吸光度为0.058，黄精多糖中蛋白质含量为1.55％。
[0063]
(二)黄精粗多糖的分离纯化
[0064]
取黄精粗多糖80g用蒸馏水配成3％的多糖溶液，离心，取上清液使其经过fpa90cl和fpc3500阴阳离子串联交换树脂柱。首先以蒸馏水作为洗脱液，流速10ml
·
min
‑1，苯酚
‑
硫酸法跟踪检测，至无糖组分流出时，改用0.5mol
·
l
‑1nacl洗脱，至无糖组分流出为止，再改为1.0mol
·
l
‑1nacl洗脱，至无糖组分流出为止，最后用2.0mol
·
l
‑1nacl洗柱。将各个组分浓缩后用3500da透析袋透析，经流水透析48h，蒸馏水透析24h后，将袋内溶液减压浓缩，冷冻干燥后得到水洗组分和0.5mol
·
l
‑1nacl盐洗组分，分别记为：psp
‑
1、psp
‑
2。
[0065]
将上述步骤获得的psp
‑
1溶解于双蒸水配成浓度为3％的多糖溶液，离心，上清液以sephacyrl s
‑
400凝胶柱进行纯化。依次用蒸馏水、0.1mol
·
l
‑1、0.2mol
·
l
‑1、0.3mol
·
l
‑1、0.4mol
·
l
‑1、0.5mol
·
l
‑1、1mol
·
l
‑1nacl进行梯度洗脱，流速2ml
·
min
‑1，流出液10ml/管自动部分收集器分管收集，隔管苯酚
‑
硫酸法显色，以洗脱管数
‑
光密度值绘制洗脱曲线，合并相同峰位的样品，得水、0.1mol
·
l
‑1、0.2mol
·
l
‑1、nacl组分。将蒸馏水洗脱组分，合并相同峰位的组分(图4)，用蒸馏水透析，透析袋内液减压浓缩，冷冻干燥，将所得洗脱组分命名为psp
‑
1s，多次富集样品，冻干后获得的蓬松白色絮状物和淡黄色蓬松絮状物即为黄精均一多糖。
[0066]
对获得的黄精均一多糖psp
‑
1s进行检测：
[0067]
(1)纯化组分紫外全波长扫描
[0068]
在紫外全波长扫描图中，200～300nm是否存在紫外吸收峰可以判断多糖中蛋白质和核酸存在情况。取多糖组分psp
‑
1s配制成0.1mg/ml溶液，在200～400nm范围内进行全波长扫描，结果如图5所示，从图5中可以看出，紫外扫描图在260nm和280nm处没有明显吸收峰，初步表示纯化多糖中无核酸、蛋白质、多肽等杂质。
[0069]
(2)纯化组分红外光谱扫描
[0070]
以1：200的质量比将多糖粉末psp
‑
1s和kbr粉末混合，在玛瑙研钵中使其充分混匀后研碎成细粉。压片后，在红外4000～400cm
‑1波长范围内扫描并分析结果(如图6)。得到图谱显示psp
‑
1s具有多糖特征。红外谱图显示，三种多糖在1100～1000cm
‑1，1600～1400cm
‑1，3000～2800cm
‑1，3500～3300cm
‑1均有多糖的特征吸收峰，3500～3300cm
‑1处出现了一宽峰，是o
‑
h伸缩振动吸收峰，说明存在分子间和分子内氢键；在3000～2800cm
‑1之间的弱吸收峰，是c
‑
h伸缩振动吸收峰，1630～1609cm
‑1之间的弱吸收峰为c＝o非对称伸缩振动、1425～1416cm
‑1(c＝o对称伸缩振动)是糖醛酸中质子化羧基特征峰。1145cm
‑1，1091～1096cm
‑1，1045～1014cm
‑1也是糖醛酸的特征峰。
[0071]
(3)纯化组分分子量测定
[0072]
利用hplc
‑
elsd法测其分子量，将不同分子量的葡聚糖标准品及psp
‑
1s溶于流动相，配制成2mg/ml的溶液，过0.45μm微孔滤膜。以保留时间tr为横坐标，lgm为纵坐标绘制标准曲线(图7)。得到的色谱图如图8所示，图谱中只有一个峰，且峰形对称，说明组分均一且纯度高。psp
‑
1s保留时间为12.283min。代入标准曲线，初步计算多糖分子量在4000da左右。
[0073]
(4)单糖组成分析
[0074]
①
对照品溶液的制备
[0075]
精确称取man、rha、galua、glc、gal、ara等单糖对照品11种，分别配制成1mmol/l的标准单糖水溶液。另精确称取11种单糖对照品配制成1mmol/l的混合标准单糖水溶液。
[0076]
②
多糖酸水解样品溶液制备
[0077]
称取精制多糖10mg，加入2mol/l三氟乙酸溶液2ml，充入n2封管，于120℃水浴条件下水解180min，得水解样品溶液，加入甲醇，减压蒸干，重复3次，直至三氟乙酸被完全除去。加蒸馏水2ml溶解，备用。
[0078]
③
标准单糖、混合单糖和多糖水解样品的pmp衍生
[0079]
精密移取标准单糖对照品、混合单糖对照品及多糖的水解样品溶液各1.4ml，依次加入700μl pmp甲醇溶液和同体积0.3mol/l naoh溶液，70℃水浴加热反应40min，取出，待样品冷却至室温，加入700μl、0.3mol/l盐酸中和，用等体积乙酸异戊酯溶剂混匀，分液漏斗萃取3次，弃去上清，用等体积的氯仿萃取1次，弃氯仿萃取层，保存甲醇
‑
水相，滤膜过滤，样品备用。
[0080]
④
液相条件
[0081]
dikma c18柱；流动相a：0.1mol/l磷酸盐缓冲液(ph6.7)，流动相b：乙腈；流速：1.0ml/min；检测波长：245nm；进样：10μl；洗脱条件如表7所示。
[0082]
表7 hplc洗脱条件
[0083][0084]
⑤
pmp柱前衍生高效液相分析结果如图9所示，psp
‑
1s完全酸水解pmp衍生物的高效液相分析结果如图10所示。
[0085]
多糖中单糖组成的摩尔比计算方法：内标加校正因子法计算。
[0086]
甘露糖：岩藻糖：半乳糖＝1:11:5。
[0087]
采用阴阳离子串联交换树脂、sephacryl s
‑
400凝胶等为载体，分别用水和不同浓度的nacl进行梯度洗脱，通过透析、冷冻干燥后得到多糖组分psp
‑
1s，通过红外光谱、红外光谱、高效液相(hplc)对其纯度进行鉴定，证实多糖组分为均一多糖。pmp柱前衍生高效液相分析结果：甘露糖：岩藻糖：半乳糖＝1:11:5。
[0088]
(三)黄精多糖治疗肾炎的实验研究
[0089]
本试验涉及的主要药物和实验动物如下：
[0090]
药物：盐酸多柔米星注射液(浙江海正药业股份有限公司)；醋酸泼尼松片(广东华南药业集团有限公司)。
[0091]
实验动物：正常健康sd大鼠，雄性，200
±
20g，合格证号为scxk(辽)2015
‑
0001，购于辽宁长生生物技术有限公司。动物实验环境温度为20℃，湿度为60％，动物自由饮水、进食。
[0092]
本实验中动物实验经黑龙江中医药大学动物实验伦理委员会批准。
[0093]
(1)黄精多糖提取物制备
[0094]
选择道地黄精药材，参照药典及中药炮制学教材方法，制备饮片。多糖制备方法同上。
[0095]
(2)动物分组、造模及给药
[0096]
在室温的环境适应性饲养3d后，并按体重随机平均分为随机分成4组(每组10只大鼠)：正常组，模型组，阳性药组(醋酸泼尼松片)，治疗组(黄精多糖剂量水提物)。除正常对
照组予以尾静脉注射生理盐水外，其余各组一次性尾静脉注射阿霉素6.5mg/kg，两周后再次尾静脉注射阿霉素3.0mg/kg。1周后测24h尿蛋白定量>80mg为造模成功。在实验过程中，治疗组的大鼠每天分别给予216mg/kg剂量提取物，醋酸泼尼松阳性对照组按每天10mg/kg灌胃给药，正常组及模型组每天以蒸馏水灌胃。实验周期为5周，分别在造模后1w、3w、5w收集大鼠24h尿液进行尿蛋白定量分析。
[0097]
(3)样本采集与检测
[0098]
①
24小时尿蛋白定量
[0099]
分别于给药1w、3w、5w后，进行24h尿液收集，采用全自动生化分析仪测定24h尿蛋白，24h尿蛋白定量＝尿蛋白浓度
×
24h尿量。
[0100]
②
肾功相关生化指标检查
[0101]
各组大鼠在给药五周后用腹腔麻醉。腹主动脉取血，收集血样本，于3500r/min，4℃下离心10min，分离血清。全自动生化分析仪测定血清总蛋白(tp)、血清白蛋白(alb)、肌酐(alb)3项生化指标。
[0102]
③
肾组织病理形态学观察
[0103]
i取肾组织
[0104]
实验结束后，取左肾用10％中性福尔马林溶液固定，留作he检测。
[0105]
ii he染色
[0106]
摘取肾脏，取部分肾组织用10％中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋切片，将切片入二甲苯，水化，苏木素
‑
伊红(he)染色，再将切片经梯度酒精脱水，二甲苯透明，树脂胶封固，在光学显微镜下进行病理形态检查。
[0107]
(4)结果
[0108]
①
24小时尿蛋白定量
[0109]
各组24h尿蛋白定量分析结果如表1所示，由表8可知，模型组大鼠24h尿蛋白量从第3周开始明显升高，与空白组比较有显著性差异(p<0.01)；5周后，黄精多糖、阳性药组与模型组比较有显著性差异(p<0.05，p<0.01))，并且阳性药组与黄精多糖比较无显著性差异。
[0110]
表8各组24
‑
h尿蛋白定量分析结果
[0111][0112]
②
肾功相关生化指标检查
[0113]
各组肾功相关生化指标检查结果如表9所示，与模型组相比，正常组cr显著升高，alb、tp显著下降且有统计学意义(p<0.01)；与模型组相比，黄精多糖组、阳性药cr均有一定程度的下降，alb、tp显著提高(p<0.01)，表明黄精多糖具有明显改善肾功能作用，并且阳性药组与黄精多糖比较无显著性差异。
[0114]
表9各组肾功相关生化指标检查结果
[0115][0116]
####
△△
p<0.01,
△
p<0.05,compared with control group；**p<0.01,*p<0.05,compared with model group
[0117]
③
肾组织病理形态学观察
[0118]
各组肾组织病理形态学观察如图11所示，从肾脏形态学观察，正常对照组大鼠，肾小球、肾小管未见明显病变。模型组肾小球轻度萎缩，少许炎细胞浸润，球囊壁轻度增厚，小球囊腔轻度扩张，甚至局部区域出现空腔，髓质区域出现蛋白管型，上皮细胞脱落入管腔；间质可见明显纤维化、灶性炎细胞浸润纤维组织增生和萎缩的肾小管周围可见纤维化组织包围；系膜细胞增生，毛细血管充血。
[0119]
给药组系膜细胞及系膜基质增生程度，毛细血管球与球囊壁粘连，球囊壁局灶增厚程度较模型组轻；组织间血管淤血、出血，肾小管管腔轻微变形，肾脏组织空泡和纤维化程度都比模型组有明显的改善。