生产结晶L-草铵膦铵盐一水合物的方法与流程

生产结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物的方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年4月16日提交的美国临时申请no.62/834,675和2020年2月18日提交的美国临时申请no.62/978,005的优先权，其通过引用整体并入本文。
3.通过efs
‑
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4.序列表的正式副本通过efs
‑
web作为ascii格式的序列表形式以电子方式提交，文件名为asp 021.pct
‑
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‑
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1184814.txt，创建于2020年3月26日，并且具有13,767字节的大小，并且与说明书一起同时提交。包含在该ascii格式文件中的序列表作为说明书的组成部分，并且通过引用整体并入本文。
5.发明背景
6.外消旋物质的各个分子的生物活性通常不同，并且通常只有两种对映异构体中的一种表现出显著的活性。d,l
‑
草铵膦(d,l
‑
glufosinate)就是这种情况，它是一种非选择性、叶面施用的除草剂，在世界范围内大量使用。l
‑
草铵膦抑制植物内谷氨酰胺合成酶，这导致植物死亡，而d
‑
草铵膦对映异构体基本无除草活性(ruhland等人，(2002)environ.biosafety res.1:29
‑
37)。目前几乎所有商业化的草铵膦生产均为外消旋体(duke等人，2010 toxins 2:1943
‑
1962)，这意味着应用于农业土地的只有约一半是有用的；另一半代表对环境的负担，没有任何益处。
7.l
‑
草铵膦可以通过如美国专利no.4,499,027、5,420,329、7,772,426、7,795,464和8,076,503中公开的不对称化学合成生产。尽管这些方法在技术上是可行的，但是与外消旋草铵膦的生产相比，没有一种方法在商业上被证明具有成本效益。在许多情况下，外消旋体的拆分可以通过与另一种手性化合物形成非对映异构体或非对映异构盐来实现；美国专利4,647,692中公开了与α氨基酸一起使用的这种技术的实例。如美国专利no.5,767,309和5,869,668所公开的，该技术可以与奎宁或辛可宁一起使用以拆分外消旋草铵膦。wo 2018/108797公开了使用(
‑
)
‑
麻黄碱拆分外消旋草铵膦。然而，麻黄碱受到全世界大多数政府机构越来越多的监管和控制，以防止转用于非法生产甲基苯丙胺。其它方法已经公开，其中如美国专利9,834,802和wo 2019/018406中所述，将外消旋草铵膦中的无活性d
‑
草铵膦转化成活性l
‑
草铵膦。以稳定的固体形式生产的l
‑
草铵膦是商业生产非常需要的。因此，专门生产l
‑
草铵膦对映异构体的方法是期望的。
8.发明概述
9.提供了结晶l
‑
草铵膦铵盐(glufosinate ammonium)一水合物的组合物和制备方法以及用途。在一个方面，本公开提供了制备结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物的方法。该方法包括：
10.(i)形成包含草铵膦原料和水溶液的混合物，
11.其中草铵膦原料包含l
‑
草铵膦铵盐和d
‑
草铵膦铵盐，并且
12.其中水溶液包含水、可与水混溶的有机溶剂和任选的氨源，例如氢氧化铵；
13.(ii)使l
‑
草铵膦铵盐一水合物从步骤(i)的混合物中结晶，形成l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体；和
14.(iii)在步骤(ii)后使至少部分l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体与水溶液分离；
15.由此制备结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物；
16.其中结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物包含l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b。
17.在一些实施方案中，l
‑
草铵膦晶种用于步骤(ii)结晶步骤中。
18.本文进一步描述了结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物的脱盐和最终分离的方法。得到l
‑
草铵膦的结晶形式的方法可以包括由草铵膦的任何外消旋混合物得到结晶l
‑
草铵膦。照此，本文所述的方法还可以用于在将d
‑
草铵膦酶促转化成l
‑
草铵膦后进一步得到结晶l
‑
草铵膦。在如us 9,834,802、us 10,260,078和pct/us2018/042503(通过引用整体并入本文)中所述生成包含l
‑
草铵膦的混合物后，可以使溶液经历如下方法，得到富含l
‑
草铵膦的l
‑
草铵膦混合物。因此，可以使任何d
‑
和l
‑
草铵膦混合物经历本文所述的方法，得到结晶l
‑
草铵膦。此类方法可以包括如下：
19.方法i：脱盐。脱盐方法包含下列步骤：
20.(i)向反应器中添加包含草铵膦原料和水溶液的混合物并且搅拌混合物；
21.(ii)使用“氨源”将溶液的ph调节至ph 6
‑
7；
22.(iii)在反应器中，在约70℃的夹套温度减压浓缩得到的溶液，直至总溶解的固体浓度为至少20
‑
70wt％(例如30
‑
60wt％、40
‑
50wt％或45
‑
50wt％)；
23.(iv)将混合物冷却至2
‑
15℃并且使用过滤或离心分离硫酸铵晶体，随后向剩余溶液中添加甲醇以促进另外的硫酸铵晶体形成，使用例如过滤或离心将其分离；
24.(v)过滤或离心后，使用气流或气体在环境压力或减压下在环境温度或升高的温度分别干燥得到的滤液或上清液，得到“l
‑
草铵膦原料”(用于下述方法)。可以使用任何适合的“氨源”，包括例如氨气、氢氧化铵、碳酸铵等。
25.方法iia：最终分离。在一个方面，最终分离方法可以包括下列步骤：
26.(i)形成包含“l
‑
草铵膦原料”(任选得自上述脱盐方法)和水溶液的混合物，
27.其中“l
‑
草铵膦原料”包含l
‑
草铵膦铵盐和d
‑
草铵膦铵盐，并且
28.其中水溶液包含水和可与水混溶的有机溶剂；
29.(ii)使l
‑
草铵膦铵盐一水合物从步骤(i)的混合物中结晶，形成l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体；和
30.(iii)在步骤(ii)后使至少部分l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体与水溶液分离；
31.由此制备结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物；
32.其中结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物包含l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b。
33.在一些实施方案中，l
‑
草铵膦晶种用于步骤(ii)。
34.方法iib：最终分离。在另一个方面，该方法可以包括下列步骤：
35.(i)形成包含“草铵膦原料”(任选得自上述脱盐方法)和水溶液的混合物，
36.其中“草铵膦原料”包含l
‑
草铵膦铵盐和d
‑
草铵膦铵盐，并且
37.其中水溶液包含水、可与水混溶的有机溶剂和“氨源”；
38.(ii)使l
‑
草铵膦铵盐一水合物从步骤(i)的混合物中结晶，形成l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体；和
39.(iii)在步骤(ii)后使至少部分l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体与水溶液分离；
40.由此制备结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物；
41.其中结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物包含l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b。可以使用任何适合的“氨源”，包括但不限于氨气、氢氧化铵和碳酸铵。
42.在一些实施方案中，l
‑
草铵膦晶种用于步骤(ii)结晶步骤。可以将结晶l
‑
草铵膦铵盐水合物配制在组合物中，其用于防治农田和其它地区不需要的植物的生长。
43.附图简述
44.图1显示l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b的x
‑
射线粉末衍射(xrpd)数据。
45.图2显示l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b的热重分析(tga)数据，显示在123.4℃开始的特征吸热。
46.图3显示l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b的红外(ir)光谱数据。
47.图4显示l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式a的x
‑
射线粉末衍射(xrpd)数据。
48.发明详述
49.本公开基于如下发现：l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b可用于由包含l
‑
草铵膦和d
‑
草铵膦的混合物直接生产纯化的l
‑
草铵膦。因此，在单一步骤中得到铵盐形式的l
‑
草铵膦，无需用手性试剂进行拆分步骤或添加大量酸或其它不需要的物质。在一些实施方案中，l
‑
草铵膦可以得自美国专利no:9,843,802和10,260,078中所述的酶促转化方法。在该方法中，d
‑
氨基酸氧化酶(daao)和转氨酶用于将d
‑
草铵膦转化成l
‑
形式。例如，可以将酶固定在聚合物珠上并且批量重复使用。
50.美国专利no:9,843,802和10,260,078描述了具有改善的酶活性的修饰的daao酶。下文的实施例13描述了用于本发明方法的另外的突变体daao酶。第一个反应在于用daao酶将d
‑
草铵膦转化成4
‑
(羟基
‑
甲基磷酰基)
‑2‑
氧代丁酸(ppo)。
51.以稳定的固体形式生产的l
‑
草铵膦是商业化生产高度期望的。某些形式的固体l
‑
草铵磷具有吸湿性，并且因此必须采取额外措施来消除这些固体l
‑
草铵膦形式与水蒸气的接触。已经观察到无定形l
‑
草铵膦固体在实验室中与环境空气接触时特别吸湿并且经常潮解。结晶l
‑
精草铵膦游离酸的吸湿性显著低于非
‑
结晶l
‑
精草铵膦游离酸。wo 2019/018406公开了几种l
‑
草铵膦的结晶形式，并且这些形式中的两种(表示为“形式a”和“形式b”)现已被鉴定为l
‑
草铵膦铵盐的一水合物晶体。与非
‑
结晶形式的l
‑
草铵膦相比，形式a和形式b一水合物晶体具有低吸湿性并且因此更适合于商业化生产。
52.已经发现用于使l
‑
草铵膦铵盐结晶为一水合物晶体的方法可以导致l
‑
草铵膦铵盐从包含l
‑
草铵膦和d
‑
草铵膦的混合物中优先结晶。用这种方法得自包含以“共晶点”以上比例的相对量的l
‑
草铵膦和d
‑
草铵膦的草铵膦原料的晶体具有高光学纯度，即包含相对于d
‑
草铵膦高比例的l
‑
草铵膦的晶体。在某些情况下，结晶固体不含或几乎不含d
‑
草铵膦。从结晶得到的母液富含d
‑
草铵膦，其可以被回收并且随后通过本文所述的方法转化成l
‑
草铵膦。由低于共晶点的草铵膦原料获得的晶体包含大量的l
‑
草铵膦和d
‑
草铵膦，并且在某些情况下，该比例与外消旋草铵膦铵盐差别不大。本文描述了生产具有高光学纯度和低吸湿性的l
‑
草铵膦铵盐的一水合物晶体的方法。
53.i.从草铵膦原料中分离盐的方法
54.本文提供了从草铵膦原料(本文也称作脱盐)分离盐的方法，以便提供适用于如下述所公开的方法ii的l
‑
草铵膦原料。盐可以选自硫酸钠、硫酸铵、氯化钠、氯化铵、柠檬酸钠、柠檬酸铵、碳酸钠、碳酸铵、碳酸氢钠、碳酸氢铵、甲酸钠、甲酸铵、乙酸钠、乙酸铵、磷酸
一钠、磷酸二钠、磷酸一铵和磷酸二铵。
55.方法i：脱盐。在如本文所述的脱盐方法中，将包含草铵膦原料和水溶液的混合物加入到反应器中并且开始搅拌，其中“草铵膦原料”包含l
‑
草铵膦铵盐、d
‑
草铵膦铵盐和盐；并且“水溶液”包含水和可与水混溶的有机溶剂。然后可以使用氨源将溶液的ph调节至ph 6
‑
7，所述氨源包括但不限于氨气、氢氧化铵或碳酸铵。在反应器中在约70℃的夹套温度减压浓缩得到的溶液，直至总溶解的固体浓度为至少20
‑
70wt％，例如30
‑
60wt％、40
‑
50wt％或45
‑
50wt％。浓缩后，可以将混合物冷却至10℃
‑
15℃，在此期间，硫酸铵结晶。将混合物进一步冷却至4℃
‑
10℃并且搅拌至少30分钟。然后将混合物过滤或离心，以除去硫酸铵晶体，并且分离水性滤液1。用甲醇洗涤硫酸铵饼，并且保留甲醇洗涤液。可以使用nutsche型过滤器或如本领域技术人员过滤有机材料所确定的任何适合的过滤器进行过滤。将水性滤液1加入到反应器中，并且开始搅拌。任选地，将预先分离的硫酸铵晶体加入到混合物中以充当晶种。将甲醇加入到反应器中，然后将混合物冷却至10℃
‑
15℃。加入先前步骤中保留的甲醇洗涤液作为部分第一甲醇添加物。将第二部分甲醇加入到反应器中，并且将混合物冷却至4℃
‑
10℃。在该温度将混合物搅拌至少30分钟。将混合物过滤或离心以除去硫酸铵晶体。分离得到的水性滤液2。用甲醇洗涤硫酸铵饼并且将洗涤滤液与水性滤液2合并，得到“草铵膦溶液”。可以使用气流或气体在环境压力或减压下在环境温度或升高的温度干燥“草铵膦溶液”，得到“l
‑
草铵膦原料”。
56.ii.制备结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物的方法
57.本文提供了制备结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物的方法。结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物包含l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b。
58.方法iia：最终分离。在一个方面，最终分离方法可以包括下列步骤：
59.(i)形成包含草铵膦原料、例如任选得自上述脱盐方法的“l
‑
草铵膦原料”和水溶液的混合物，
60.其中草铵膦原料包含l
‑
草铵膦铵盐和d
‑
草铵膦铵盐，并且
61.其中水溶液包含水和可与水混溶的有机溶剂；
62.(ii)使l
‑
草铵膦铵盐一水合物从步骤(i)的混合物中结晶，形成l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体；和
63.(iii)在步骤(ii)后使至少部分l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体与水溶液分离；
64.由此制备结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物。在一些实施方案中，l
‑
草铵膦晶种用于步骤(ii)。
65.方法iib：最终分离。在另一个方面，制备结晶l
‑
草铵膦的方法可以包括下列步骤：
66.(i)形成包含草铵膦原料和水溶液的混合物，
67.其中草铵膦原料包含l
‑
草铵膦铵盐和d
‑
草铵膦铵盐，并且
68.其中水溶液包含水、可与水混溶的有机溶剂和氨源；
69.(ii)使l
‑
草铵膦铵盐一水合物从步骤(i)的混合物中结晶，形成l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体；和
70.(iii)在步骤(ii)后使至少部分l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体与水溶液分离；由此制备结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物。
71.草铵膦原料和l
‑
草铵膦原料中l
‑
草铵膦铵盐与d
‑
草铵膦铵盐的摩尔比可以不同，
这取决于多个因素，例如合成草铵膦的方法或进行的纯化程度。l
‑
草铵膦铵盐与d
‑
草铵膦铵盐的摩尔比范围可以为例如约50:50
‑
约90:10或约55:45
‑
约85:15或约60:40
‑
约80:20或约65:35
‑
约75:25。在一些实施方案中，草铵膦原料和l
‑
草铵膦原料中l
‑
草铵膦铵盐与d
‑
草铵膦铵盐的摩尔比为至少50:50。在一些实施方案中，草铵膦原料和l
‑
草铵膦原料中l
‑
草铵膦铵盐与d
‑
草铵膦铵盐的摩尔比为至少70:30。在一些实施方案中，草铵膦原料和l
‑
草铵膦原料中l
‑
草铵膦铵盐与d
‑
草铵膦铵盐的摩尔比为至少76:24。在一些实施方案中，草铵膦原料和l
‑
草铵膦原料中l
‑
草铵膦铵盐与d
‑
草铵膦铵盐的摩尔比为50:50。
72.其它组分包括杂质例如反应副产物也可能存在于草铵膦原料中。在一些实施方案中，草铵膦原料和l
‑
草铵膦原料还包含一种或多种成分，其选自l
‑
谷氨酸及其盐、d
‑
谷氨酸及其盐、l
‑
焦谷氨酸及其盐、2
‑
氧代戊二酸及其盐、琥珀酸及其盐、2
‑
氧代
‑4‑
(羟基(甲基)
‑
膦酰基)丁酸及其盐、硫酸钠、硫酸铵、氯化钠、氯化铵、柠檬酸钠、柠檬酸铵、碳酸钠、碳酸铵、碳酸氢钠、碳酸氢铵、甲酸钠、甲酸铵、乙酸钠、乙酸铵、磷酸一钠、磷酸二钠、磷酸一铵和磷酸二铵。在一些实施方案中，草铵膦原料包含l
‑
谷氨酸。
73.尽管非
‑
草铵膦组分的数量和用量可以不同，但是草铵膦原料和l
‑
草铵膦原料中的草铵膦的量至少为约50％(w/w)。草铵膦原料和l
‑
草铵膦原料中的草铵膦的量可以为例如至少55％(w/w)或至少约60％(w/w)或至少约65％(w/w)或至少约70％(w/w)。草铵膦原料和l
‑
草铵膦原料中草铵膦的量可以范围可以为约50％(w/w)
‑
约95％(w/w)或约55％(w/w)
‑
约90％(w/w)或约60％(w/w)
‑
约90％(w/w)或约65％(w/w)
‑
约90％(w/w)或约70％(w/w)
‑
约90％(w/w)或约75％(w/w)
‑
约90％(w/w)。在一些实施方案中，草铵膦原料和l
‑
草铵膦原料中的草铵膦的量范围为约70％(w/w)
‑
约90％(w/w)。在一些实施方案中，草铵膦原料和l
‑
草铵膦原料中的草铵膦的量范围为约75％(w/w)
‑
约85％(w/w)。
74.本公开的方法中应用的水溶液通常包含水和可与水混溶的有机溶剂。所谓“可混溶”是指有机溶剂与水形成均匀混合物，既不与水分离也不与水发生化学反应。可与水混溶的有机溶剂的实例包括但不限于c1‑6烷醇，例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、仲丁醇、叔丁醇、正戊醇、环戊醇和环己醇；低分子量酰胺，例如n,n
‑
二甲基甲酰胺、n,n
‑
二甲基乙酰胺、n
‑
甲基
‑2‑
吡咯烷酮等；酮和酮
‑
醇，例如丙酮、甲基乙基酮、环己酮和双丙酮醇；可与水混溶的醚，例如四氢呋喃、二烷等；和多元醇，例如乙二醇、二甘醇、三甘醇、聚乙二醇、聚丙二醇和1,2,6
‑
己三醇；和亚砜，例如二甲亚砜和环丁砜。
75.在一些实施方案中，可与水混溶的溶剂选自甲醇、乙醇、1
‑
丙醇、2
‑
丙醇、乙腈、四氢呋喃、1,4
‑
二烷、1
‑
甲基
‑2‑
丙醇、1,2
‑
丙二醇和1,2
‑
乙二醇。在一些实施方案中，可与水混溶的有机溶剂是甲醇。
76.水溶液中可与水混溶的有机溶剂与水之比可以不同，这取决于多种因素，例如所使用的特别的可与水混溶的有机溶剂或待纯化的草铵膦的量。通常，可与水混溶的有机溶剂在水溶液中的量至少为约30％体积。水溶液中可与水混溶的有机溶剂与水之比的范围可以为例如约30:70
‑
约95:5或约35:65
‑
约95:5或约40:60
‑
约95:5或约45:55
‑
约95:5或约50:50
‑
约90:10或约55:45
‑
约85:15或约60:40
‑
约80:20或约65:35
‑
约75:25。
77.在一些实施方案中，水溶液中可与水混溶的有机溶剂与水之体积比的范围为约45:55
‑
约95:5。在一些实施方案中，水溶液中可与水混溶的有机溶剂与水之体积比范围为
约45:55
‑
约65:35。在一些实施方案中，水溶液中可与水混溶的有机溶剂与水之比的范围为约45:55
‑
约55:45。在一些实施方案中，水溶液中可与水混溶的有机溶剂与水之比为约50:50。在一些实施方案中，水溶液中可与水混溶的有机溶剂与水之比为约60:40。
78.该方法中使用的水溶液通常包含氨源，例如氨气或铵盐，例如氢氧化铵或碳酸铵，浓度范围从几毫摩尔到一摩尔或以上。例如，水溶液中氢氧化铵的浓度范围可以为约100mm
‑
约750mm或约200mm
‑
约600mm或约200mm
‑
约550mm或约250mm
‑
约500mm或约300mm
‑
约450mm或约325mm
‑
约425mm或约350mm
‑
约400mm或约350mm
‑
约370mm。在一些实施方案中，水溶液中氢氧化铵的浓度范围可以为约0.1m
‑
约1m。在一些实施方案中，水溶液中氢氧化铵的浓度范围可以为350mm
‑
约450mm。在一些实施方案中，水溶液不含氢氧化铵。在一些实施方案中，分离的晶体可以包含形式a和形式b晶体的混合物。
79.以使得草铵膦在得到的混合物中的浓度适合于草铵膦晶体形成的量合并l
‑
草铵膦原料和水溶液。通常，结晶前，草铵膦在l
‑
草铵膦原料中的摩尔浓度为至少100mm(例如250mm或以上，或500mm或以上，或1m或以上)。在一些实施方案中，步骤(i)(方法iia和iib)中l
‑
草铵膦原料与水溶液之重量比的范围可以为约0.5:1
‑
约5:1。在一些实施方案中，步骤(i)(方法iia和iib)中l
‑
草铵膦原料与水溶液之重量比的范围可以为约1:1
‑
约2:1。步骤(i)(方法iia和iib)中l
‑
草铵膦原料与水溶液之重量比可以为例如约1.1:1或约1.2:1或约1.3:1或约1.4:1或约1.5:1或约1.6:1或约1.7:1或约1.8:1或约1.9:1或约2:1。
80.使l
‑
草铵膦铵盐一水合物结晶可以包括加热包含原料和水溶液的混合物。例如，可以将混合物加热至约40℃
‑
约80℃或以上的温度范围，这取决于多种因素，例如草铵膦在混合物中的浓度或用于水溶液中的可与水混溶的有机溶剂。将混合物加热至至少40℃或至少约45℃或至少约50℃或至少约55℃或至少约60℃或至少约65℃或至少约70℃或至少约75℃或至少约80℃或至少约85℃或至少约90℃的温度。在一些实施方案中，将步骤(i)(方法iia和iib)的混合物加热至约45℃
‑
约55℃的温度范围，并且保持在升高的温度约5分钟
‑
约24小时的时间期限。在一些实施方案中，将步骤(i)的混合物加热至至少约45℃。在一些实施方案中，将加热的混合物维持在至少45℃(例如至少50℃或至少45℃)的温度约10分钟
‑
约6小时的时间期限，然后从混合物中分离l
‑
草铵膦晶体。在一些实施方案中，将加热的混合物维持在约45℃或约50℃达至少约1小时。加热后，可以冷却混合物(例如至约30℃或以下的温度，例如约25℃或约20℃或约4℃)。
81.可以将包含草铵膦的晶种加入到包含原料和水溶液的加热的或不加热的混合物中，以便促进l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体形成。通常，晶种中l
‑
草铵膦与d
‑
草铵膦的摩尔比(l:d之比)至少为约90:10。在一些实施方案中，草铵膦晶种包含l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b。如下所述，已经发现，约76:24的l:d之比为共晶点，高于该点，l
‑
草铵膦铵盐一水合物可以从水性混合物中有效地结晶。因此，可以以系统中用于草铵膦总量的l:d之比为至少76:24这样的量加入包含l
‑
草铵膦的晶种。
82.通常将包含草铵膦晶种的混合物维持在足以形成l
‑
草铵膦铵盐一水合物结晶的温度一定时间期限，例如在25
‑
50℃达几分钟至几天的时间期限。在一些实施方案中，将包含草铵膦晶种的混合物维持在约30℃的温度达约1小时
‑
约24小时的时间期限，然后从混合物中分离l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体。
83.可以以一定量加入草铵膦晶种，例如，约0.05％(w/w)
‑
约0.1％(w/w)或约0.1％
(w/w)
‑
约0.5％(w/w)或约0.5％(w/w)
‑
约1％(w/w)或约1％(w/w)
‑
约5％(w/w)或约5％(w/w)
‑
约10％(w/w)或约10％(w/w)
‑
约20％(w/w)或约20％(w/w)
‑
约30％(w/w)。在一些实施方案中，可以以基于l
‑
草铵膦原料中草铵膦的量加入约0.05％(w/w)
‑
约30％(w/w)范围的量的草铵膦晶种。在一些实施方案中，可以以基于l
‑
草铵膦原料中草铵膦的量加入约0.1％(w/w)
‑
约2.5％(w/w)范围的量的草铵膦晶种。在一些实施方案中，基于l
‑
草铵膦原料中草铵膦的量加入约0.1％(w/w)
‑
约0.5％(w/w)范围的量的草铵膦晶种。
84.可以便利地通过过滤、离心或其组合从水性混合物中分离l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体。在一些实施方案中，将晶体分离为滤饼或离心沉淀，然后可以用水、可与水混溶的溶剂或其组合洗涤。可以在环境温度或升高的温度，在减压或在环境压力下用空气或气流(例如氮气或氩气)干燥分离的晶体。例如，可以在约18
‑
25℃或约25
‑
40℃或约40
‑
60℃或约60
‑
70℃或约70
‑
80℃或约80
‑
90℃或约90
‑
100℃的温度干燥晶体。在一些实施方案中，在37℃干燥晶体。可以监测干燥，并且例如，当晶体样品的质量不再因水或溶剂蒸发而减少时，停止干燥。可以将晶体的大聚集物研磨以减少晶体成块。因此，本公开的一些实施方案提供了如上所述的方法，其中步骤(iii)中分离至少部分l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体包含过滤步骤(ii)的混合物、离心步骤(ii)的混合物或其组合。
85.通过使用本文提供的方法得到的结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物颗粒的大小范围便利地用于制剂。在一些实施方案中，将晶体与水和其它制剂成分混合，形成除草产品。在一些实施方案中，90％的结晶l
‑
草铵膦铵盐颗粒小于约350微米，如根据基于容量分布测量值(即“d
v
90”)确定的。例如，颗粒的d
v
90可以小于约350微米或小于约300微米或小于约250微米或小于约200微米或小于约150微米或小于约125微米或小于约100微米或小于约75微米或小于约50微米或小于约25微米。
86.有利地，根据本文提供方法制备的结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物的特征在于高l:d比。尽管结晶产物可以包含一些d
‑
草铵膦，但是结晶产物的l:d之比显著高于草铵膦原料的l:d之比。在一些实施方案中，结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物产物中l
‑
草铵膦与d
‑
草铵膦的摩尔比为至少90:10。结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物产物中l
‑
草铵膦与d
‑
草铵膦的摩尔比可以为例如至少91:9或至少92:8或至少93:7或至少94:6或至少95:5或至少96:4或至少97:3或至少98:2或至少99:1。
87.基于x
‑
射线粉末衍射(xrpd)图显示选自以下的至少3个峰(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个峰)，可以将结晶产物鉴定为l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b：10.0、11.4、12.5、16.5、17.4、18.1、19.6、20.0、21.8、22.9、23.6、24.0、25.1、25.5、26.1、26.3、26.4、27.9、28.2、28.4、28.7、29.2、30.2、30.9、31.6、31.7、32.7、33.0、33.3、34.3、35.2、36.7、37.2、37.4、37.8、38.3、38.7和39.3
°
2θ，
±
0.2
°
2θ，如使用cu
‑
kα辐射的衍射仪所测定的。在一些实施方案中，xrpd图包含选自以下的至少6个峰：10.0、12.5、16.5、17.4、18.1、19.6、20.0、21.8、22.9、23.6、24.0、25.5、26.3、26.4、29.2、34.3、35.2和37.4
°
2θ，
±
0.2
°
2θ。在一些实施方案中，xrpd图包含选自以下的至少10个峰：10.0、12.5、16.5、17.4、18.1、19.6、20.0、21.8、22.9、23.6、24.0、25.5、26.3、26.4、29.2、34.3、35.2和37.4
°
2θ，
±
0.2
°
2θ。在一些实施方案中，xrpd图基本上根据图1。
88.在一些实施方案中，l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b的特征在于差示扫描量热(dsc)曲线显示在约123℃开始的吸热。在一些实施方案中，l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b的特征
在于基本上根据图2的dsc曲线。在一些实施方案中，l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b的特征在于基本上根据图3的ir光谱。
89.本公开的非限制性实例方法可以如下进行。将包含至少76.5％l
‑
草铵膦铵盐与23.5％d
‑
草铵膦铵盐之比并且具有约75％重量的总草铵膦铵盐组成的固体l
‑
草铵膦铵盐原料装入适合的容器中。向容器中加入包含稀氢氧化铵的甲醇和水的混合物；甲醇与水的比例范围为70:30
‑
50:50。将混合物在搅拌下加热至约50℃以确保固体溶解；可以采用另外的方法来辅助溶解，例如超声处理。将混合物老化1小时后，将l
‑
草铵膦铵盐水合物晶种(“形式b”)加入混合物中。然后以逐步方式将混合物缓慢冷却至30℃并且混合约16小时。将所得浆液从容器中取出并且分批离心。用甲醇洗涤所得滤饼；也可以包括将滤饼在甲醇中的再悬浮。第二次离心后，使固体在环境条件下干燥。
90.iii.包含l
‑
草铵膦一水合物的组合物
91.本文所述的结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物可以用于施用于预防或防治杂草的作物田地。可以将组合物配制成用于喷洒田地的液体。以有效量提供在组合物中的l
‑
草铵膦。例如，组合物中l
‑
草铵膦铵盐一水合物的量可以为约10克、约50克、约100克、约150克、约200克、约250克、约300克、约350克、约400克、约450克、约500克、约550克、约600克、约650克、约700克、约750克、约800克、约850克、约900克、约950克、约1,000克、约1,050克、约1,100克、约1,150克、约1,200克、约1,250克、约1,300克、约1,350克、约1,400克、约1,450克或约1,500克l
‑
草铵膦/公顷。
92.本文所述的除草组合物(包括施用于植物前需要稀释的浓缩物)包含l
‑
草铵膦铵盐一水合物(即活性成分)和一种或多种液体或固体形式的佐剂组分。在一些情况下，除草组合物还包含残留的d
‑
草铵膦和/或ppo。
93.组合物通过将活性成分与一种或多种佐剂混合来制备，例如稀释剂、增充剂、载体、表面活性剂、有机溶剂、保湿剂或调理剂，以提供精细的颗粒固体、丸、溶液、分散体或乳液形式的组合物。因此，活性成分可以与佐剂一起使用，例如精细的固体、有机来源的液体、水、润湿剂、分散剂、乳化剂或这些的任何适合的组合。在一些实施方案中，l
‑
草铵膦铵盐一水合物以约10％(w/w)
‑
30％(w/w)范围的量存在，基于配制的组合物的总重量。从经济和方便的角度来看，水是优选的稀释剂。然而，正如本领域技术人员所理解的，并非所有化合物都耐水解，并且在某些情况下，这可能要求使用非水溶剂介质。
94.在一些实例中，配制的组合物可以包含一种或多种表面活性剂。用于配制的组合物的适合的表面活性剂包括烷基醚硫酸钠。表面活性剂可以以占配制的组合物的重量的10％(w/w)
‑
40％(w/w)的量存在。配制的组合物可以任选包含一种或多种有机溶剂。任选地，溶剂可以是1
‑
甲氧基
‑2‑
丙醇、双丙二醇、乙二醇及其混合物。一种或多种溶剂可以以占配制的组合物的重量的0.5％(w/w)
‑
20％(w/w)的量存在。
95.配制的组合物还可以包含一种或多种多糖保湿剂。适合的多糖保湿剂的实例包括例如烷基多糖、戊糖、高果糖谷物糖浆、山梨醇和糖蜜。多糖保湿剂，例如烷基多糖，可以以占配制的组合物的重量的4％(w/w)
‑
20％(w/w)范围的量存在于配制的组合物中。稀释剂也可以包含在配制的组合物中。适合的稀释剂包括水和其它水性组分。任选地，稀释剂以生产用于包装或使用的组合物所需的量存在。
96.本文所述的配制的组合物、特别是液体和可溶性粉末可以包含足以使给定组合物
易于分散在水或油中的量的一种或多种表面活性剂作为进一步的佐剂组分。将表面活性剂掺入组合物中显著增强了它们的功效。如本文所用，表面活性剂包括润湿剂、分散剂、助悬剂和乳化剂。阴离子、阳离子和非离子试剂可以同等方便地使用。适合的润湿剂包括烷基苯和烷基萘磺酸盐、硫酸化脂肪醇、胺或酰胺、异硫代硫酸钠长链酸酯、磺基琥珀酸钠酯、硫酸化或磺酸化脂肪酸酯石油磺酸盐、磺酸化植物油、二叔炔二醇、烷基酚的聚氧乙烯衍生物(特别是异辛基苯酚和壬基苯酚)和己糖醇酐的单高级脂肪酸酯的聚氧乙烯衍生物(例如山梨坦)。示例性分散剂包括甲基纤维素、聚乙烯醇、木质素磺酸钠、聚合烷基萘磺酸盐、萘磺酸钠、聚亚甲基双萘磺酸盐和n
‑
甲基
‑
n
‑
(长链酸)月桂酸钠。
97.可制成包含一种或多种活性成分、惰性固体增充剂和一种或多种润湿剂和分散剂的水分散性粉末组合物。惰性固体增充剂通常具有矿物来源，例如天然粘土、硅藻土和衍生自二氧化硅的合成矿物等。此类增充剂的实例包括高岭石、凹凸棒粘土和合成硅酸镁。水悬浮液可以通过在分散剂存在下溶解或彼此混合以及研磨水不溶性活性成分的水性浆液以获得非常精细的颗粒的浓缩浆液来制备。所得浓缩水悬浮液的特征在于其极小的粒径，因此在稀释和喷洒时，覆盖非常均匀。可乳化油通常是活性成分在与水不混溶或部分与水不混溶的溶剂中与表面活性剂一起形成的溶液。用于本文所述活性成分的适合溶剂包括烃和与水不混溶的醚、酯或酮。适用于本文提供的配制的组合物中的其它组分描述于wo 2019/018406和美国专利no.4,692,181和5,258,358中，其通过引用整体并入本文。
98.本文所述的配制的组合物还可以包含其它添加剂，例如肥料、植物毒素和植物生长调节剂、杀虫剂等，其用作佐剂或与任何上述佐剂组合使用。本文所述的配制的组合物也可以与其它材料例如肥料、其它植物毒素等混合，并且以单次施用的方式施用。
99.认识到配制的除草组合物可以与其它除草剂组合使用。本文所述的除草组合物通常与一种或多种其它除草剂联合施用以控制更广泛种类的不期望植被。当与其它除草剂联合使用时，本发明要求保护的化合物可以与其它一种或多种除草剂配制，与其它一种或多种除草剂桶混或与其它一种或多种除草剂依次施用。可以与本文所述配制的除草组合物联合施用的一些除草剂包括：酰胺除草剂，例如二丙烯草胺(allidochlor)、6
‑
芳基吡啶甲酸酯(6
‑
arylpicolinate)、氟丁酰草胺(beflubutamid)、胺酸杀(benzadox)、苄草胺(benzipram)、溴丁酰草胺(bromobutide)、唑草胺(cafenstrole)、cdea、氯硫酰草胺(chlorthiamid)、6
‑
环丙基吡啶甲酸酯(6
‑
cyclopropylpicolinate)、三环赛草胺(cyprazole)、二甲噻草胺(dimethenamid)、高效二甲噻草胺(dimethenamid
‑
p)、双苯酰草胺(diphenamid)、三唑磺(epronaz)、乙胺草醚(etnipromid)、四唑酰草胺(fentrazamide)、氟胺草唑(flupoxam)、氟磺胺草醚(fomesafen)、氟硝磺酰胺(halosafen)、丁脒酰胺(isocarbamid)、异草胺(isoxaben)、敌草胺(napropamide)、萘草胺(naptalam)、烯草胺(pethoxamid)、炔苯酰草胺(propyzamide)、氯藻胺(quinonamid)和牧草胺(tebutam)；嘧啶二酮除草剂，例如苯嘧磺草(saflufenacil)；苯胺除草剂，例如丁酰草胺(chloranocryl)、落草胺(cisanilide)、稗草胺(clomeprop)、环酰草胺(cypromid)、吡氟酰草胺(diflufenican)、乙氧苯草胺(etobenzanid)、酰苯磺威(fenasulam)、氟噻草胺(flufenacet)、氟苯啶草(flufenican)、苯噻草胺(mefenacet)、氟磺酰草胺(mefluidide)、唑酰草胺(metamifop)、庚酰草胺(monalide)、萘丙胺(naproanilide)、甲氯酰草胺
(pentanochlor)、氟吡酰草胺(picolinafen)和敌稗(propanil)；芳基苯胺除草剂，例如新燕灵(benzoylprop)、麦草伏(flamprop)和高效麦草伏甲酯(flamprop
‑
m)；氯乙酰苯胺除草剂，例如乙草胺(acetochlor)、甲草胺(alachlor)、丁草胺(butachlor)、丁烯草胺(butenachlor)、异丁草胺(delachlor)、乙酰甲草胺(diethatyl)、二甲草胺(dimethachlor)、吡唑草胺(metazachlor)、异丙甲草胺(metolachlor)、精异丙甲草胺(s
‑
metolachlor)、丙草胺(pretilachlor)、毒草胺(propachlor)、异丙草胺(propisochlor)、丙炔草胺(prynachlor)、特丁草胺(terbuchlor)、甲氧噻草胺(thenylchlor)和二甲苯草胺(xylachlor)；磺酰苯胺除草剂，例如氟磺胺草(benzofluor)、氟草磺胺(perfluidone)、嘧氟磺草胺(pyrimisulfan)和氟唑草胺(profluazol)；磺酰胺除草剂，例如磺草灵(asulam)、除草隆(carbasulam)、酰苯磺威(fenasulam)和氨磺乐灵(oryzalin)；抗生素除草剂，例如双丙氨酰膦(bilanafos)；苯甲酸除草剂，例如草灭畏(chloramben)、麦草畏(dicamba)、2,3,6
‑
tba和杀草畏(tricamba)；嘧啶基氧基苯甲酸除草剂，例如双草醚(bispyribac)和嘧草醚(pyriminobac)；嘧啶基硫代苯甲酸除草剂，例如嘧草硫醚(pyrithiobac)；酞酸除草剂，例如氯酞酸(chlorthal)；2
‑
吡啶甲酸除草剂，例如氯氨吡啶酸(aminopyralid)、二氯吡啶酸(clopyralid)和氨氯吡啶酸(picloram)；喹啉羧酸除草剂，例如二氯喹啉酸(quinclorac)和喹草酸(quinmerac)；含砷除草剂，例如二甲胂酸(cacodylic acid)、cma、dsma、六氟砷酸钾(hexaflurate)、maa、mama、msma、亚砷酸钾(potassium arsenite)和亚砷酸钠(sodium arsenite)；苯甲酰基环己二酮除草剂，例如甲基磺草酮(mesotrione)、磺草酮(sulcotrione)、特糠酯酮(tefuryltrione)和环磺酮(tembotrione)；苯并呋喃基烷基磺酸酯除草剂，例如呋草磺(benfuresate)和乙呋草磺(ethofumesate)；氨基甲酸酯除草剂，例如磺草灵(asulam)、特唑威(carboxazole)、草败死(chlorprocarb)、二氯苄草酯(dichlormate)、酰苯磺威(fenasulam)、隆草特(karbutilate)和特草灵(terbucarb)；苯基氨基甲酸酯除草剂，例如燕麦灵(barban)、bcpc、除草隆(carbasulam)、卡草胺(carbetamide)、cepc、氯炔灵(chlorbufam)、氯苯胺灵(chlorpropham)、cppc、甜菜安(desmedipham)、棉胺宁(phenisopham)、甜菜宁(phenmedipham)、甜菜宁乙酯(phenmedipham
‑
ethyl)、苯胺灵(propham)和灭草灵(swep)；环己烯肟除草剂，例如禾草灭(alloxydim)、丁苯草酮(butroxydim)、烯草酮(clethodim)、环己烯草酮(cloproxydim)、噻草酮(cycloxydim)、环苯草酮(profoxydim)、稀禾定(sethoxydim)、吡喃草酮(tepraloxydim)和肟草酮(tralkoxydim)；环丙基异唑除草剂，例如异氯草酮(isoxachlortole)和异唑草酮(isoxaflutole)；二酰亚胺除草剂，例如双苯嘧草酮(benzfendizone)、吲哚酮草酯(cinidon
‑
ethyl)、三氟嗪(flumezin)、氟胺草酯(flumiclorac)、丙炔氟草胺(flumioxazin)和炔草胺(flumipropyn)；二硝基苯胺除草剂，例如乙丁氟灵(benfluralin)、仲丁灵(butralin)、氨基乙氟灵(dinitramine)、乙丁烯氟灵(ethalfluralin)、氯乙氟灵(fluchloralin)、异丙乐灵(isopropalin)、氟烯硝草(methalpropalin)、甲磺乐灵(nitralin)、氨磺乐灵(oryzalin)、二甲戊灵(pendimethalin)、氨氟乐灵(prodiamine)、环丙氟灵(profluralin)和氟乐灵(trifluralin)；二硝基苯酚除草剂，例如地乐特(dinofenate)、丙硝酚(dinoprop)、戊硝酚(dinosam)、地乐酚(dinoseb)、地乐硝酚(dinoterb)、dnoc、硝草酚(etinofen)和丁硝酚
(medinoterb)；二苯基醚除草剂，例如氯氟草醚(ethoxyfen)；硝基苯基醚除草剂，例如三氟羧草醚(acifluorfen)、苯草醚(aclonifen)、甲羧除草醚(bifenox)、甲氧除草醚(chlomethoxyfen)、草枯醚(chlomitrofen)、乙胺草醚(etnipromid)、三氟硝草醚(fluorodifen)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen)、氟化除草醚(fluoronitrofen)、氟磺胺草醚(fomesafen)、呋氧草醚(furyloxyfen)、氟硝磺酰胺(halosafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、除草醚(nitrofen)、三氟甲草醚(nitrofluorfen)和乙氧氟草醚(oxyfluorfen)；二硫代氨基甲酸酯除草剂，例如棉隆(dazomet)和威百亩(metam)；卤代脂族除草剂，例如五氯戊酮酸(alorac)、三氯丙酸(chloropon)、茅草枯(dalapon)、四氟丙酸(flupropanate)、六氯酮(hexachloroacetone)、碘甲烷(iodomethane)、甲基溴(methyl bromide)、一氯乙酸(monochloroacetic acid)、sma和tca；咪唑啉酮除草剂，例如咪草酸(imazamethabenz)、甲氧咪草烟(imazamox)、甲咪唑烟酸(imazapic)、咪唑烟酸(imazapyr)、咪唑喹啉酸(imazaquin)和咪唑乙烟酸(imazethapyr)；无机除草剂，例如氨基磺酸铵(ammonium sulfamate)、硼砂(borax)、氯酸钙(calcium chlorate)、硫酸铜(copper sulfate)、硫酸亚铁(ferrous sulfate)、叠氮化钾(potassium azide)、氰酸钾(potassium cyanate)、叠氮化钠(sodium azide)、氯酸钠(sodium chlorate)和硫酸(sulfuric acid)；腈除草剂，例如糠草腈(bromobonil)、溴苯腈(bromoxynil)、羟敌草腈(chloroxynil)、敌草腈(dichlobenil)、碳烯碘草腈(iodobonil)、碘苯腈(ioxynil)和双唑草腈(pyraclonil)；有机磷除草剂，例如甲基胺草磷(amiprofos
‑
methyl)、莎稗磷(anilofos)、地散磷(bensulide)、双丙氨酰膦(bilanafos)、抑草磷(butamifos)、2,4
‑
dep、dmpa、ebep、杀木膦(fosamine)、草甘膦(glyphosate)和哌草磷(piperophos)；苯氧基除草剂，例如溴酚肟(bromofenoxim)、稗草胺(clomeprop)、2,4
‑
deb、2,4
‑
dep、氟苯戊烯酸(difenopenten)、赛松(disul)、抑草蓬(erbon)、乙胺草醚(etnipromid)、氯苯氧乙醇(fenteracol)和三氟禾草肟(trifopsime)；苯氧基乙酸除草剂，例如4
‑
cpa、2,4
‑
d、3,4
‑
da、2
‑
甲基
‑4‑
氯苯氧基乙酸(mcpa)、mcpa
‑
硫代乙基和2,4,5
‑
t；苯氧基丁酸除草剂，例如4
‑
cpb、2,4
‑
db、3,4
‑
db、mcpb和2,4,5
‑
tb；苯氧基丙酸除草剂，例如调果酸(cloprop)、4
‑
cpp、2,4
‑
滴丙酸(dichlorprop)、精2,4
‑
滴丙酸(dichlorprop
‑
p)、3,4
‑
dp、2,4,5
‑
涕丙酸(fenoprop)、2甲4氯丙酸(mecoprop)和精2甲4氯丙酸(mecoprop
‑
p)；芳基氧基苯氧基丙酸除草剂，例如炔禾灵(chlorazifop)、炔草酯(clodinafop)、氯甲草(clofop)、氰氟草酯(cyhalofop)、禾草灵(diclofop)、唑禾草灵(fenoxaprop)、精唑禾草灵(fenoxaprop
‑
p)、噻唑禾草灵(fenthiaprop)、吡氟禾草灵(fluazifop)、精吡氟禾草灵(fluazifop
‑
p)、氟吡禾灵(haloxyfop)、高效氟吡禾灵(haloxyfop
‑
p)、异草醚(isoxapyrifop)、唑酰草胺(metamifop)、喔草酯(propaquizafop)、喹禾灵(quizalofop)、精喹禾灵(quizalofop
‑
p)和氟禾草灵(trifop)；亚苯基二胺除草剂，例如氨基乙氟灵(dinitramine)和氨氟乐灵(prodiamine)；吡唑基除草剂，例如吡草酮(benzofenap)、吡唑特(pyrazolynate)、吡唑氟磺草胺(pyrasulfotole)、苄草唑(pyrazoxyfen)、杀草砜(pyroxasulfone)和苯唑草酮(topramezone)；吡唑基苯基除草剂，例如异丙吡草酯(fluazolate)和吡草醚(pyraflufen)；哒嗪除草剂，例如醚草敏(credazine)、氯苯哒醇(pyridafol)和哒草特(pyridate)；哒嗪酮除草剂，例如溴莠敏(brompyrazon)、氯草敏(chloridazon)、草哒酮
(dimidazon)、氟哒嗪草酯(flufenpyr)、二甲哒草伏(metflurazon)、氟草敏(norflurazon)、草哒松(oxapyrazon)和比达农(pydanon)；吡啶除草剂，例如氯氨吡啶酸(aminopyralid)、碘氯啶酯(cliodinate)、二氯吡啶酸(clopyralid)、氟硫草定(dithiopyr)、氯氟吡氧乙酸(fluroxypyr)、卤草定(haloxydine)、氨氯吡啶酸(picloram)、氟吡酰草胺(picolinafen)、三氯吡啶酚(pyriclor)、噻草啶(thiazopyr)和三氯吡氧乙酸(triclopyr)；嘧啶二胺除草剂，例如丙草定(iprymidam)和嘧草胺(tioclorim)；季铵除草剂，例如牧草快(cyperquat)、二乙除草双(diethamquat)、双苯唑快(difenzoquat)、敌草快(diquat)、伐草快(morfamquat)和百草枯(paraquat)；硫代氨基甲酸酯除草剂，例如丁草敌(butylate)、灭草特(cycloate)、燕麦敌(di
‑
allate)、eptc、禾草畏(esprocarb)、乙硫草特(ethiolate)、isopolinate、甲硫苯威(methiobencarb)、禾草敌(molinate)、坪草丹(orbencarb)、克草敌(pebulate)、苄草丹(prosulfocarb)、稗草畏(pyributicarb)、草克死(sulfallate)、杀草丹(thiobencarb)、仲草丹(tiocarbazil)、野燕畏(tri
‑
allate)和灭草猛(vemolate)；硫代碳酸酯除草剂，例如敌灭生(dimexano)、exd和黄原酸异丙酯(proxan)；硫脲除草剂，例如灭草恒(methiuron)；三嗪除草剂，例如异丙净(dipropetryn)、三嗪氟草胺(triaziflam)和三羟基三嗪(trihydroxytriazine)；氯三嗪除草剂，例如莠去津(atrazine)、可乐津(chlorazine)、氰草津(cyanazine)、环丙津(cyprazine)、甘草津(eglinazine)、抑草津(ipazine)、灭莠津(mesoprazine)、环丙青津(procyazine)、甘扑津(proglinazine)、扑灭津(propazine)、另丁津(sebuthylazine)、西玛津(simazine)、特丁津(terbuthylazine)和草达津(trietazine)；甲氧基三嗪除草剂，例如莠去通(atraton)、醚草通(methometon)、扑灭通(prometon)、仲丁通(secbumeton)、西玛通(simeton)和特丁通(terbumeton)；甲基硫代三嗪除草剂，例如莠灭净(ametryn)、叠氮净(aziprotryne)、氰草净(cyanatryn)、敌草净(desmetryn)、二甲丙乙净(dimethametryn)、甲氧丙净(methoprotryne)、扑草净(prometryn)、西草净(simetryn)和特丁净(terbutryn)；三嗪酮除草剂，例如特津酮(ametridione)、特草嗪酮(amibuzin)、环嗪酮(hexazinone)、丁嗪草酮(isomethiozin)、苯嗪草酮(metamitron)和嗪草酮(metribuzin)；三唑除草剂，例如杀草强(amitrole)、唑草胺(cafenstrole)、三唑磺(epronaz)和氟胺草唑(flupoxam)；三唑酮除草剂，例如氨唑草酮(amicarbazone)、苯唑磺隆(bencarbazone)、唑酮草酯(carfentrazone)、氟唑磺隆(flucarbazone)、丙苯磺隆(propoxycarbazone)、甲磺草胺(sulfentrazone)和噻酮磺隆(thiencarbazone
‑
methyl)；三唑并嘧啶除草剂，例如氯酯磺草胺(cloransulam)、双氯磺草胺(diclosulam)、双氟磺草胺(florasulam)、唑嘧磺草胺(flumetsulam)、磺草唑胺(metosulam)、五氟磺草胺(penoxsulam)和啶磺草胺(pyroxsulam)；尿嘧啶除草剂，例如氟丙嘧草酯(butafenacil)、除草定(bromacil)、氟嘧苯甲酸(flupropacil)、异草定(isocil)、环草定(lenacil)和特草定(terbacil)；3
‑
苯基尿嘧啶；脲除草剂，例如苯噻隆(benzthiazuron)、苄草隆(cumyluron)、环莠隆(cycluron)、氯全隆(dichloralurea)、氟吡草腙(diflufenzopyr)、异草完隆(isonoruron)、异隆(isouron)、甲基苯噻隆(methabenzthiazuron)、特唑隆(monisouron)和草完隆(noruron)；苯基脲除草剂，例如疏草隆(anisuron)、炔草隆(buturon)、氯溴隆(chlorbromuron)、乙氧隆(chloreturon)、绿麦隆(chlorotoluron)、枯草隆(chloroxuron)、杀草隆(daimuron)、枯莠隆(difenoxuron)、
丁隆(dimefuron)、敌草隆(diuron)、非草隆(fenuron)、氟草隆(fluometuron)、氟硫隆(fluothiuron)、异丙隆(isoproturon)、利谷隆(linuron)、灭草恒(methiuron)、甲基杀草隆(methyldymron)、吡喃隆(metobenzuron)、溴谷隆(metobromuron)、甲氧隆(metoxuron)、绿谷隆(monolinuron)、灭草隆(monuron)、草不隆(neburon)、对氟隆(parafluron)、酰草隆(phenobenzuron)、环草隆(siduron)、四氟隆(tetrafluron)和噻苯隆(thidiazuron)；嘧啶基磺酰基脲除草剂，例如酰嘧磺隆(amidosulfuron)、四唑嘧磺隆(azimsulfuron)、苄嘧磺隆(bensulfuron)、氯嘧磺隆(chlorimuron)、环丙嘧磺隆(cyclosulfamuron)、乙氧嘧磺隆(ethoxysulfuron)、啶嘧磺隆(flazasulfuron)、氟吡磺隆(flucetosulfuron)、氟啶嘧磺隆(flupyrsulfuron)、甲酰胺磺隆(foramsulfuron)、氯吡嘧磺隆(halosulfuron)、唑吡嘧磺隆(imazosulfuron)、甲基二磺隆(mesosulfuron)、烟嘧磺隆(nicosulfuron)、嘧苯胺磺隆(orthosulfamuron)、环氧嘧磺隆(oxasulfuron)、氟嘧磺隆(primisulfuron)、吡嘧磺隆(pyrazosulfuron)、砜嘧磺隆(rimsulfuron)、甲嘧磺隆(sulfometuron)、磺酰磺隆(sulfosulfuron)和三氟啶磺隆(trifloxysulfuron)；三嗪基磺酰基脲除草剂，例如氯磺隆(chlorsulfuron)、醚磺隆(cinosulfuron)、胺苯磺隆(ethametsulfuron)、碘磺隆(iodosulfuron)、甲磺隆(metsulfuron)、氟磺隆(prosulfuron)、噻吩磺隆(thifensulfuron)、醚苯磺隆(triasulfuron)、苯磺隆(tribenuron)、氟胺磺隆(triflusulfuron)和三氟甲磺隆(tritosulfuron)；硫杂二唑基脲除草剂，例如丁噻隆(buthiuron)、磺噻隆(ethidimuron)、特丁噻草隆(tebuthiuron)、噻氟隆(thiazafluron)和噻苯隆(thidiazuron)；和未分类的除草剂，例如丙烯醛(acrolein)、烯丙醇(allyl alcohol)、氯丙嘧啶酸(aminocyclopyrachlor)、唑啶草酮(azafenidin)、草除灵(benazolin)、灭草松(bentazone)、双环磺草酮(benzobicyclon)、丁硫咪唑酮(buthidazole)、氰氨化钙(calcium cyanamide)、克草胺酯(cambendichlor)、伐草克(chlorfenac)、燕麦酯(chlorfenprop)、氟咪杀(chlorflurazole)、氯芴素(chlorflurenol)、环庚草醚(cinmethylin)、异草酮(clomazone)、cpmf、愈创木酚(cresol)、邻二氯苯(ortho
‑
dichlorobenzene)、哌草丹(dimepiperate)、茵多杀(endothal)、克草啶(fluoromidine)、氟啶草酮(fluridone)、氟咯草酮(flurochloridone)、呋草酮(flurtamone)、嗪草酸(fluthiacet)、茚草酮(indanofan)、灭草唑(methazole)、异硫氰酸甲酯(methyl isothiocyanate)、氟氯草胺(nipyraclofen)、och、丙炔草酮(oxadiargyl)、草酮(oxadiazon)、嗪草酮(oxaziclomefone)、五氯苯酚(pentachlorophenol)、环戊草酮(pentoxazone)、醋酸苯汞(phenylmercury acetate)、唑啉草酯(pinoxaden)、甲硫磺乐灵(prosulfalin)、嘧啶肟草醚(pyribenzoxim)、环酯草醚(pyriftalid)、灭藻醌(quinoclamine)、硫氰苯胺(rhodethanil)、吖庚磺酯(sulglycapin)、噻二唑草胺(thidiazimin)、灭草环(tridiphane)、三甲异脲(trimeturon)、茚草酮(tripropindan)和草达克(tritac)。本发明的除草组合物还可以与草甘膦(glyphosate)、麦草畏或2,4
‑
d联合用于草甘膦耐受性、麦草畏耐受性或2,4
‑
d耐受性作物。通常优选将本文所述的组合物与除草剂组合使用，所述除草剂对所处理的作物具有选择性并且补充这些组合物在所用施用率下防治的杂草谱。通常还优选同时施用本文所述的组合物和其它补充除草剂，作为组合制剂或作为桶混合物。
100.iv.使用方法
101.本文所述的组合物可以用于选择性防治农业田地或任何其它区域的杂草的方法中，所述区域包括例如铁路、草坪、高尔夫球场和需要防治杂草的其它区域。任选地，田地或其它区域可以含有种植的种子的作物或对草胺膦有抗性的作物。该方法可以包括向田地施用有效量的如本文所述的包含l
‑
草胺膦的组合物。
102.本文所述的组合物可用于施用到作物植物的田地中以预防或防治杂草。组合物可以配制成用于在田地上喷洒的液体。组合物中以有效量提供l
‑
草胺膦。如本文所用，有效量是指每公顷约10克活性成分至每公顷约1,500克活性成分，例如约50克至约400克或约100克至约350克。在一些实施方案中，活性成分是l
‑
草胺膦。例如，组合物中l
‑
草胺膦的量可以是每公顷约10克、约50克、约100克、约150克、约200克、约250克、约300克、约350克、约400克、约500克、约550克、约600克、约650克、约700克、约750克、约800克、约850克、约900克、约950克、约1,000克、约1,050克、约1,100克、约1,150克、约1,200克、约1,250克、约1,300克、约1,350克、约1,400克、约1,450克或约1,500克l
‑
草胺膦。
103.v.示例性实施方案
104.1.制备结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物的方法，该方法包括：
105.(i)形成包含l
‑
草铵膦原料和水溶液的混合物，其中：
106.l
‑
草铵膦原料包含l
‑
草铵膦铵盐和d
‑
草铵膦铵盐，并且
107.水溶液包含水和可与水混溶的有机溶剂；
108.(ii)使l
‑
草铵膦铵盐一水合物从步骤(i)的混合物中结晶，形成l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体；和
109.(iii)在步骤(ii)后使至少部分l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体与水溶液分离；
110.由此制备结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物，
111.其中结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物包含l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b。
112.2.实施方案1的方法，其中水溶液还包含氨源。
113.3.实施方案2的方法，其中氨源是氢氧化铵。
114.4.实施方案1
‑
3任一项的方法，其中草铵膦原料中l
‑
草铵膦铵盐与d
‑
草铵膦铵盐的摩尔比为至少70:30。
115.5.实施方案1
‑
4任一项的方法，其中草铵膦原料中l
‑
草铵膦铵盐与d
‑
草铵膦铵盐的摩尔比为至少50:50。
116.6.实施方案1
‑
4任一项的方法，其中草铵膦原料中l
‑
草铵膦铵盐与d
‑
草铵膦铵盐的摩尔比为至少76:24。
117.7.实施方案1
‑
6任一项的方法，其中l
‑
草铵膦原料还包含一种或多种组分，其选自l
‑
谷氨酸及其盐、d
‑
谷氨酸及其盐、l
‑
焦谷氨酸及其盐、2
‑
氧代戊二酸及其盐、琥珀酸及其盐、2
‑
氧代
‑4‑
(羟基(甲基)膦酰基)丁酸及其盐、硫酸钠、硫酸铵、氯化钠、氯化铵、磷酸一钠、磷酸二钠、磷酸一铵和磷酸二铵。
118.8.实施方案7的方法，其中l
‑
草铵膦原料包含l
‑
谷氨酸。
119.9.实施方案1
‑
8任一项的方法，其中l
‑
草铵膦原料中草铵膦的量范围为约70％(w/w)
‑
约90％(w/w)。
120.10.实施方案9的方法，其中l
‑
草铵膦原料中草铵膦的量范围为约75％(w/w)
‑
约
85％(w/w)。
121.11.实施方案1
‑
10任一项的方法，其中可与水混溶的溶剂选自甲醇、乙醇、1
‑
丙醇、2
‑
丙醇、乙腈、四氢呋喃、1,4
‑
二烷、1
‑
甲基
‑2‑
丙醇、1,2
‑
丙二醇和1,2
‑
乙二醇。
122.12.实施方案11的方法，其中可与水混溶的有机溶剂是甲醇。
123.13.实施方案1
‑
12任一项的方法，其中水溶液中可与水混溶的有机溶剂与水之体积比的范围为约45:55
‑
约95:5。
124.14.实施方案1
‑
13任一项的方法，其中水溶液中可与水混溶的有机溶剂与水之体积比的范围为约45:55
‑
约65:35。
125.15.实施方案1
‑
14任一项的方法，其中水溶液中氢氧化铵的浓度范围为约0.1m
‑
约1m。
126.16.实施方案15的方法，其中水溶液中氢氧化铵的浓度为约0.4m。
127.17.实施方案1
‑
16任一项的方法，其中步骤(i)中l
‑
草铵膦原料与水溶液之重量比范围为约0.5:1
‑
约5:1。
128.18.实施方案17的方法，其中步骤(i)中l
‑
草铵膦原料与水溶液之重量比范围为约1:1
‑
约2:1。
129.19.实施方案1
‑
18任一项的方法，其中步骤(ii)包含加热步骤(i)的混合物，形成加热的混合物。
130.20.实施方案19的方法，其中将步骤(i)的混合物加热至至少约45℃。
131.21.实施方案19或实施方案20的方法，其中在步骤(iii)之前，将加热的混合物维持在至少约45℃的温度约10分钟
‑
约6小时的时间期限。
132.22.实施方案19
‑
21任一项的方法，还包括在步骤(iii)之前冷却加热的混合物，形成冷却的混合物。
133.23.实施方案22的方法，其中将加热的混合物冷却至约30℃或以下的温度。
134.24.实施方案1
‑
18任一项的方法，其中步骤(ii)包括将草铵膦晶种添加至步骤(i)的混合物中。
135.25.实施方案19
‑
23任一项的方法，包括将草铵膦晶种添加至步骤(ii)的加热的混合物中。
136.26.实施方案24或实施方案25的方法，其中草铵膦晶种包含l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b。
137.27.实施方案24
‑
26任一项的方法，其中在步骤(iii)之前，将包含草铵膦晶种的混合物维持在约30℃的温度约1小时
‑
约24小时的时间期限。
138.28.实施方案24
‑
27任一项的方法，其中以占l
‑
草铵膦原料中草铵膦的量的约0.05％(w/w)
‑
约30％(w/w)范围的量加入草铵膦晶种。
139.29.实施方案28的方法，其中以占l
‑
草铵膦原料中草铵膦的量的约0.1％(w/w)
‑
约0.5％(w/w)范围的量加入草铵膦晶种。
140.30.实施方案1
‑
29任一项的方法，其中步骤(iii)中分离至少部分l
‑
草铵膦晶体包括过滤步骤(ii)的混合物、离心步骤(ii)的混合物或其组合。
141.31.实施方案1
‑
30任一项的方法，还包括(iv)洗涤l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体；和(v)干燥l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体的一个或多个步骤。
142.32.实施方案1
‑
31任一项的方法，其中结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物还包含d
‑
草铵膦。
143.33.实施方案32的方法，其中l
‑
草铵膦与d
‑
草铵膦的摩尔比为至少90:10。
144.34.实施方案32或实施方案33的方法，其中l
‑
草铵膦与d
‑
草铵膦的摩尔比为至少95:5。
145.35.实施方案1
‑
34任一项的方法，其中l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b的特征在于x
‑
射线粉末衍射(xrpd)图包含选自以下的至少3个峰：10.0、11.4、12.5、16.5、17.4、18.1、19.6、20.0、21.8、22.9、23.6、24.0、25.1、25.5、26.1、26.3、26.4、27.9、28.2、28.4、28.7、29.2、30.2、30.9、31.6、31.7、32.7、33.0、33.3、34.3、35.2、36.7、37.2、37.4、37.8、38.3、38.7和39.3
°
2θ，
±
0.2
°
2θ，如使用cu
‑
kα辐射的衍射仪所测定的。
146.36.实施方案1
‑
35任一项的方法，其中l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b的特征在于差示扫描量热(dsc)曲线显示在约123℃开始的吸热。
147.37.根据实施方案1
‑
36任一项的方法制备的结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物，其中结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物包含l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b。
148.38.实施方案37的结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物，还包含d
‑
草铵膦。
149.39.实施方案38的结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物，其中l
‑
草铵膦与d
‑
草铵膦的摩尔比为至少90:10。
150.40.实施方案38或实施方案39的结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物，其中l
‑
草铵膦与d
‑
草铵膦的摩尔比为至少95:5。
151.41.由草铵膦混合物制备结晶l
‑
草铵膦的方法，包括：
152.(i)制备固定化酶，其中所述酶是d
‑
氨基酸氧化酶(daao)和转氨酶；
153.(ii)使所述草铵膦混合物接触固定化酶，得到富含l
‑
草铵膦的组合物；
154.(iii)对步骤(ii)的组合物进行色谱纯化以分离l
‑
草铵膦。
155.42.由包含d
‑
草铵膦和l
‑
草铵膦的组合物制备结晶l
‑
草铵膦的方法，所述方法包括：
156.(i)使所述组合物接触daao和转氨酶；
157.(ii)使酶促反应发生，得到具有大于70％l
‑
草铵膦的组合物；
158.(iii)使l
‑
谷氨酸从步骤(ii)的组合物中结晶；
159.(iv)色谱纯化，得到包含l
‑
草铵膦的组合物；
160.(v)使步骤(iv)的组合物脱盐；和
161.(vi)通过结晶从步骤(v)的组合物中分离l
‑
草铵膦。
162.43.从草铵膦原料中分离盐的方法，包括：
163.(i)将草铵膦原料溶于水溶液；
164.(ii)将溶液的ph调节至6
‑
7；
165.(iii)浓缩溶液，直至总溶解的固体浓度为至少20
‑
70wt％(例如30
‑
60wt％、40
‑
50wt％或45
‑
50wt％)；
166.(iv)将浓缩溶液冷却至2
‑
15℃；
167.(v)使用过滤或离心分离结晶的盐；和
168.(vi)干燥剩余的溶液以分离草铵膦铵盐一水合物。
169.44.实施方案43的方法，其中盐选自硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸铵、柠檬酸钠、碳酸铵、碳酸钠、甲酸铵、甲酸钠、乙酸铵、乙酸钠、碳酸氢铵和碳酸氢钠。
170.45.实施方案44的方法，其中盐是硫酸铵。
171.46.实施方案42
‑
45任一项的方法，其中所述daao酶包含seq id no:2中所示的氨基酸序列。
172.47.实施方案42
‑
45任一项的方法，其中所述daao酶包含seq id no:3中所示的氨基酸序列。
173.48.突变体daao酶，其中所述酶包含seq id no:2中所示的氨基酸序列。
174.49.突变体daao酶，其中所述酶包含seq id no:3中所示的氨基酸序列。
175.50.突变体daao酶，其中所述酶包含seq id no:5中所示的氨基酸序列。
176.作为示例提供下列实施例，但绝不起限定作用。vi.实施例
177.实施例1.结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b的表征
178.单晶x
‑
射线衍射分析提供l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b的晶型和单元结构，参见表1：
179.表1
[0180][0181][0182]
x
‑
射线粉末衍射(xrpd)对结晶材料的分析已将图1(上迹)中的图案指定给l
‑
草铵膦铵盐一水合物。该图与图1中在先研究中结晶和分离的“形式b”(下迹)相匹配。通过离子色谱法测定的铵含量和通过卡尔
·
费歇尔分析含量测定的水含量表明，与“形式b”的xrpd图一致的晶体包含化学计量的水和氨(表2)。
[0183]
通过hplc表征晶体(ag
‑
990
‑6‑
26)显示草铵膦游离酸的量为76.29％(w/w)。谷氨酸为主要杂质，含量为0.47％(w/w)。2
‑
氧代戊二酸和l
‑
焦谷氨酸以<0.1％(w/w)存在。水，7.50％(w/w)；氨，6.79％(w/w)；钠，3.55％(w/w)；和硫酸盐，5.09％(w/w)构成了结晶材料中的剩余质量。
[0184]
表2.l
‑
草铵膦铵盐水合物形式b晶体的质量平衡
[0185]
分析物方法结果(wt％)水卡尔
·
费歇尔滴定7.50
2
‑
氧代戊二酸hplc0.08谷氨酸hplc0.47l
‑
焦谷氨酸hplc0.07草铵膦(游离酸)hplc76.29氨离子色谱6.97钠icp3.55硫酸盐离子色谱5.09甲醇气相色谱<0.01总计 100.02
[0186]
实施例2.结晶l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式a的表征
[0187]
单晶x
‑
射线衍射分析提供l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式a的晶体形式和单元结构，参见表3：
[0188]
表3.形式a的单晶x
‑
射线衍射分析
[0189][0190][0191]
x
‑
射线粉末衍射(xrpd)对结晶材料的分析已将图4中的图(上迹)指定给l
‑
草铵膦铵盐一水合物。该图与图4中在先的研究中结晶和分离的“形式a”(下迹)相匹配。
[0192]
实施例3.反溶剂:溶剂比研究
[0193]
反溶剂:溶剂比研究采用包含76.4％(w/w)总草铵膦铵盐并且具有l
‑
草铵膦:d
‑
草铵膦(l:d)之比为81:19的材料进行。使用包含甲醇、水和～0.4m氢氧化铵的流体混合物，如表4所示。
[0194]
表4.反溶剂:溶剂比研究
[0195][0196]
在所有溶剂系统中通过单一直接结晶获得具有富集的l:d
‑
草铵膦之比的晶体。在50:50
‑
70:30甲醇:水的溶剂体系中得到l:d
‑
草铵膦之比>99:1。在50:50
‑
70:30甲醇:水的溶剂体系中也获得了纯度为>90％的l
‑
草铵膦铵盐水合物晶体。
[0197]
实施例4.共晶的测定
[0198]
草铵膦总纯度为75
‑
80％和l:d
‑
草铵膦比为72:28
‑
81:19的l
‑
草铵膦铵盐批次的结晶研究在30℃进行16小时，如表5和6中所示。这些试验中甲醇与水的比例为50:50(v:v)。在室温混合6小时后取样(表5)并且在室温混合12天后再次取样(表6)。批次17、18、19、20和21经过6小时的混合期限后得到l
‑
草铵膦铵盐水合物晶体，其中主要富含l
‑
草铵膦(表5)。6小时期限后，批号13和15中未观察到晶体，但更长的混合时间确实导致这些批次中形成晶体(表6)。然而，批次13和15分别包含72:28和76:24的l
‑
草铵膦与d
‑
草铵膦的初始比例，并且从这两个批次获得的晶体并富含l
‑
草铵膦异构体(表6)。使用该方法处理的其它批次提供l:d比远大于50:50的晶体(表6)。比较批次16和20的结果表明共晶点为约76:24的l:d
‑
草铵膦之比。
[0199]
表5.在30℃结晶16小时和在室温结晶6小时后的加工批次
[0200][0201]
表6.在30℃结晶16小时和在室温结晶12天后的加工批次
[0202][0203]
实施例5.二十克级结晶过程
[0204]
在室温搅拌下将l
‑
草铵膦铵盐原料(20g；76.4％总草铵膦铵盐，l:d
‑
草铵膦铵盐之比81:19)加入含0.36m氢氧化铵的12.5ml 50:50(v:v)水:甲醇溶液。将温度升至45℃，超声处理，以溶解固体，然后将溶液在30℃放入振荡器中。1小时后，l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶种(>70％wt l
‑
草铵膦铵盐纯度，l:d
‑
草铵膦之比>97:3)作为0.2％wt原料(g/g)添加。将浆液在30℃搅拌16小时以进行结晶。将沉淀的晶体离心，用甲醇洗涤，过滤，并且干燥，得到7.8g纯化的l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体：l
‑
草铵膦铵盐一水合物纯度89.8％wt；l:d
‑
草铵膦之比98.5:1.5；从原料的l
‑
草铵膦铵盐收率54.5％。
[0205]
实施例6.一百克级结晶过程
[0206]
在室温搅拌下将l
‑
草铵膦铵盐原料(100g；76.4％总草铵膦铵盐，l:d
‑
草铵膦铵盐之比81:19)加入含0.36m氢氧化铵的62ml 40:60(v:v)水:甲醇溶液。将温度升至50℃，超声处理，以溶解固体，然后将溶液保持在50℃1小时，然后添加含有10ml甲醇的100mg l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶种(>70％wt l
‑
草铵膦纯度，>97:3l:d
‑
草铵膦之比)浆液。加入晶种后，将溶液保持在50℃达20分钟，然后将温度冷却至45℃并且保持1小时。1小时后，使温度降至40℃，保持1小时，然后使其降至30℃，过夜结晶。将浆液在30℃搅拌16小时结晶。在室温30分钟后，离心沉淀的晶体，用甲醇洗涤，过滤，并且干燥，得到53.2g纯化的l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体：l
‑
草铵膦铵盐一水合物纯度86.5％wt；l:d
‑
草铵膦之比96.2:3.8；从原料的l
‑
草铵膦铵盐收率68.6％。
[0207]
实施例7.两千克级结晶过程
[0208]
在室温搅拌下将l
‑
草铵膦铵盐原料(2000g；76.4％总草铵膦铵盐，l:d
‑
草铵膦铵盐之比81:19)加入到1140g 48:52甲醇:水(0.4m nh4oh)中。将浆液转入5l夹套结晶容器。
使温度升至50℃以溶解固体(以400rpm搅拌)，然后保持在50℃达1小时，然后将40g l
‑
草铵膦铵盐晶种(>70％wt l
‑
草铵膦铵盐纯度，l:d
‑
草铵膦之比>97:3)作为在40ml甲醇中的浆液作为2％wt原料(g/g)加入。在添加晶种后将搅拌降至250rpm。30分钟后，使温度降至45℃。每30
‑
分钟温度保持后使批料温度降低5℃，直至温度为35℃。在35℃30分钟后，使搅拌降至200rpm并且使温度冷却至室温，过夜结晶(14
‑
18小时)。离心沉淀的晶体，用甲醇洗涤，过滤，并且干燥，得到1071g纯化的l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体：l
‑
草铵膦铵盐一水合物纯度84.1％wt；l:d
‑
草铵膦之比96.4:3.6；从原料的l
‑
草铵膦铵盐收率65.8％。
[0209]
实施例8.重结晶方法
[0210]
在室温搅拌下将l
‑
草铵膦铵盐原料(82.4g；76.4％总草铵膦铵盐，l:d
‑
草铵膦铵盐之比97.8:2.2)加入到35.4g 70:30(v:v)水:甲醇溶液中。在搅拌下使温度升至60℃以溶解固体。在60℃加热约1小时后，在搅拌下加入160ml甲醇以析出无机盐。将得到的浆液离心以沉淀无机盐作为固体沉淀，并且滗析母液，在室温使其结晶，历时16小时。过滤晶体，用甲醇洗涤，并且干燥，得到46.5g纯化的l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体：l
‑
草铵膦铵盐一水合物纯度99.2％wt；l:d
‑
草铵膦之比99.2:0.8；从原料的l
‑
草铵膦铵盐收率68.6％。
[0211]
实施例9：添加氨源的l
‑
草铵膦铵盐一水合物的结晶
[0212]
在室温搅拌下将l
‑
草铵膦铵盐原料(50g，77％总l
‑
草铵膦铵盐，7.3％谷氨酸铵)加入到含有总浓度0.4m氢氧化铵的36.7g 45:55(w:w)甲醇:水溶液中。使温度升至50℃，超声处理，以溶解固体。将溶液转入带有高架搅拌的玻璃圆底烧瓶中，并且以250rpm混合1小时，使温度维持至始至终维持在50℃。将1克l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b晶种(>90％wt l
‑
草铵膦铵盐纯度)作为在3ml甲醇中的浆液加入到该批料中。30分钟后，使温度降至45℃。每30
‑
分钟保持期后将批料温度进一步降低5℃，直至温度为30℃。加入3毫升甲醇，并且将浆液在30℃搅拌16小时。在室温30分钟后，用25ml甲醇稀释浆液，并且过滤。用甲醇洗涤晶体，并且干燥，得到20.7g l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体(l
‑
草铵膦铵盐一水合物纯度93.3％，从原料的收率45.5％，<1％d
‑
草铵膦铵盐，和0.58％谷氨酸铵)。通过x
‑
射线粉末衍射分析晶体，并且得到的图与l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b的图一致。测量固体的粒径并且经测定d
v
90为70.7微米。
[0213]
实施例10：不添加氨源的l
‑
草铵膦铵盐一水合物的结晶
[0214]
将l
‑
草铵膦铵盐原料(50g，77％总l
‑
草铵膦铵盐，7.3％谷氨酸铵)加入到35.0g 45:55(w:w)甲醇:水中。不添加氢氧化铵。使温度升至50℃，超声处理，以溶解固体。将溶液转入带有高架搅拌的玻璃圆底烧瓶中，并且以250rpm混合1小时，同时将温度至始至终维持在50℃。将1克l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b晶种(>90％wt l
‑
草铵膦铵盐纯度)作为在3ml甲醇中的浆液加入到该批料中。30分钟后，使温度降至45℃。每30
‑
分钟保持期后使批料温度进一步降低5℃，直至温度为30℃。加入3毫升甲醇，并且将浆液在30℃搅拌16小时。在室温30分钟后，用25ml甲醇稀释浆液，并且过滤。用甲醇洗涤晶体，并且干燥，得到12.5g l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体(l
‑
草铵膦铵盐一水合物纯度97.0％，从原料的收率28.7％，<1％d
‑
草铵膦铵盐和0.69％谷氨酸铵)。通过x
‑
射线粉末衍射分析晶体，并且得到的图与l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b的图一致，然而，存在几个与l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式a一致性的峰。测量固体的粒径并且经测定d
v
90为102微米。
[0215]
实施例11：添加外消旋草铵膦的l
‑
草铵膦铵盐一水合物的结晶
[0216]
在室温搅拌下将l
‑
草铵膦铵盐原料(37.5g，72.4％总l
‑
草铵膦铵盐、11.4％谷氨酸铵)和外消旋草铵膦铵盐(12.5g，95％总草铵膦铵盐)添加至含有总浓度为0.4m氢氧化铵的30.5g 50:50(w:w)甲醇:水溶液中。使温度升至50℃，超声处理，以溶解固体。将溶液放入带有高架搅拌的玻璃圆底烧瓶并且以250rpm混合1小时，同时至始至终将温度维持在50℃。将1克l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b晶种(>90％wt l
‑
草铵膦铵盐纯度)作为在3ml甲醇中的浆液加入。30分钟后，使温度降至45℃。每30
‑
分钟保持期后将批料温度进一步降低5℃，直至温度为30℃。加入3毫升甲醇，并且将浆液在30℃搅拌16小时。在室温30分钟后，用25ml甲醇稀释浆液，并且过滤。用甲醇洗涤晶体，并且干燥，得到20.6g l
‑
草铵膦铵盐一水合物晶体(l
‑
草铵膦铵盐一水合物纯度94.4％，从原料的收率51.8％，包含<1％d
‑
草铵膦铵盐和0.7％d
‑
草铵膦铵盐一水合物，1.53％谷氨酸铵)。
[0217]
实施例12：结晶l
‑
草铵膦的制备
[0218]
l
‑
谷氨酸的结晶
[0219]
将如wo 2019/018406实施例1中所述制备的包含l
‑
草铵膦和l
‑
谷氨酸的溶液加入反应器中并且开始搅拌。向反应器中加入浓硫酸，直至批料达到ph 5.0
‑
6.0；在硫酸添加过程中，根据需要冷却批料以将温度保持在20
‑
40℃。硫酸添加完成后，在批料中加入l
‑
谷氨酸晶种促进晶体生长。随着晶种在批料中混合，将浓硫酸加入批料中直至批料达到ph 3.5
‑
3.9，然后将批料冷却至0
‑
5℃并且在该温度保持至少15分钟。在保持期之后，过滤批料以去除l
‑
谷氨酸晶体。在最大夹套温度为70℃真空浓缩滤液，直到总溶解固体大于或等于28wt％。
[0220]
色谱
[0221]
将浓缩的滤液加入色谱系统，然后加入水洗脱液。色谱可以以分批模式或模拟移动床(smb)模式运行。给色谱柱填充羟基化聚丙烯酸酯或羟基化聚甲基丙烯酸酯树脂。当进料脉冲穿过树脂时发生分离，并且从进料位置下游的脉冲前沿收集部分纯化的l
‑
草铵膦铵盐。收集产物后继续进水以制备树脂，用于随后进行浓缩滤液进料。
[0222]
脱盐
[0223]
将包含部分纯化的l
‑
草铵膦溶液的级分加入反应器并且开始搅拌。使用氢氧化铵将溶液的ph调节至ph 6
‑
7。真空浓缩批料直到总溶解固体浓度为至少48
‑
50wt％。浓缩步骤的最高夹套温度为70℃。浓缩后，将批料冷却至10
‑
15℃，在此期间硫酸铵结晶。将批料在4
‑
10℃混合至少30分钟，然后过滤以除去硫酸铵晶体。用甲醇洗涤硫酸铵滤饼，但是甲醇洗涤液不立即与滤液合并。
[0224]
将含水滤液装入反应器并且开始搅拌。任选地，可以将先前分离的硫酸铵的晶体添加到批料中以充当晶种。将部分甲醇加入反应器，然后将批料冷却至10
‑
15℃。甲醇滤饼洗涤液作为部分第一甲醇进料加入。将第二部分甲醇加入反应器中。将批料在4
‑
10℃搅拌至少30分钟，然后过滤批料以除去硫酸铵晶体。用甲醇洗涤硫酸铵滤饼并且将洗涤滤液与批料合并。
[0225]
用于结晶的原料的制备
[0226]
将已脱盐的滤液装入反应器并且真空浓缩直至总溶解的固体的浓度为约48wt％。浓缩步骤期间的最高夹套温度为70℃。将浓缩的溶液转移到真空干燥器中，在那里将批料真空浓缩以产生总含水量低于5％的固体。
[0227]
结晶
[0228]
将固体材料装入反应器并且与甲醇和氢氧化铵水溶液合并。将浆液在混合下加热至50
‑
55℃，并且保持直到固体溶解。将由l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b晶种和甲醇组成的浆液装入反应器中。混合30分钟后，批料温度从50℃降至45℃。温度以5℃的增量降低，然后混合30分钟，直到批料温度达到30℃。加入少量甲醇，然后将批料在30℃混合至少12小时。混合时间后，将批料冷却至20
‑
25℃并且将甲醇加入批料中。混合30分钟后，过滤批料。用甲醇洗涤滤饼，并且在加热和真空下干燥所得滤饼，得到l
‑
草铵膦铵盐一水合物形式b晶体。
[0229]
实施例13：用于进行酶促反应的改进和变体daao酶
[0230]
daao序列
[0231]
将来自圆红冬孢酵母(rhodosporidium toruloides)的突变体daao的编码序列(例如，由mgsshhhhhhssglvprgshmmarirl(seq id no:4)前导序列和f58k和m213s突变组成)克隆到pet14b载体中以允许表达n末端6xhis标记的蛋白质。将该pet14b
‑
rgdaao质粒转入bl21(be3)trxb plyss细胞中。来自表7中前四个条目描述的编号相对应(ac302，mut5，mut7(seq id no:3)和mut18)的圆红冬孢酵母的野生型daao的序列如seq id no:1中所示。表7中第五项mut846的序列在seq id no:2中提供。seq id no:5代表具有接头seq id no:4的mut7序列。
[0232]
储备溶液：
[0233]
制备了以下染料储备溶液：2,4,6
‑
三溴
‑3‑
羟基苯甲酸(tbhba)在dmso中的20mg/ml储备溶液；和100mg/ml的4
‑
氨基安替比林(4
‑
aap)在水中的储备溶液。制备以下酶储备溶液：1mg/ml辣根过氧化物(hrp)6型在ph 8.0磷酸钾缓冲液中的储备溶液。制备如下底物储备溶液：在ph8.0的磷酸钾缓冲液中多种浓度的外消旋草铵膦，使外消旋草铵膦的初始反应浓度为0、1、10、100、250和500nm。daao酶在大肠杆菌(e.coli)中制备，其中将其裂解并且将无细胞提取物冷冻干燥。使用sds
‑
page和考马斯蓝染色对无细胞提取物中的酶量进行定量。
[0234]
反应混合物：
[0235]
制备下列反应混合物：
[0236]
混合物a是底物和hrp酶的组合。使用反应缓冲液为每个待测定的底物浓度制备溶液。溶液是最终底物浓度的两倍，并且hrp溶液浓度为0.2mg/ml。
[0237]
混合物b是染料混合物。向5ml反应缓冲液中加入120μl tbhba溶液和400μl 4
‑
aap溶液。
[0238]
混合物c是酶混合物。制备0.02mg/ml daao在反应缓冲液中的溶液。反应中的最终daao浓度为5μg/ml。
[0239]
方案：
[0240]
使用分光光度计，波长为460nm。进行测定的温度为30℃。测量在15分钟时进行。使用96
‑
孔板，使用多通道按以下顺序添加以下混合物(有重复)：100μl混合物a、50μl混合物b和50μl混合物c。
[0241]
如上所述测量酶动力学，绘制在michaelis menten图上，并且用于计算vmax。如下表7中所示，变体突变体daao酶表现出一定范围的活性：
[0242]
表7：活性随酶序列的变化
[0243]
变体545658213vmax(umole/min/mg)ac302vtqs3.85mut5vths2.43mut7vnhs6.09mut18lnhs4.75mut846n/an/an/an/a5.54
[0244]
序列
[0245]
seq id no:i：
[0246][0247]
seq id no:2：
[0248][0249]
seq id no:3：
[0250][0251]
seq id no:4：
[0252][0253]
seq id no:5：
[0254][0255]
应当理解，本文所使用的术语仅用于描述特别实施方案的目的，并且该术语并非旨在进行限制。本发明的范围将仅由所附权利要求限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。在提供数值范围的情况下，应理解每个居间值，到下限单位的十分之一，在该范围的上限和下限与任何其它规定或居间值之间所述范围包括在本发明内，下文另有明确规定的除外。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内并且也包括在本发明内，受所述范围内的任何具体排除的限制。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，不包括这些包括的限制之一或两者的范围也包括在本发明中。某些范围在本文中呈现，数值前有术语“约”或术语“大约”。术语“约”和“大约”在本文中用于为它后面的确切数字以及接近或近似于该术语后面的数字的数字提供字面支持。在确定数字是否接近或近似于具体列举的数字时，接近的或近似的未列举数字可以是在其呈现的上下文中提供具体列举的数字的实质等同物的数字。如果“x”是由“约”或“大约”修饰的值，则“约x”或“大约x”通常表示从0.95x到1.05x的值，包括例如从0.98x到1.02x或从0.99x到1.01x。对“约x”或“大约x”的任何提及具体表示至少数值x、0.95x、0.96x、0.97x、0.98x、0.99x、1.01x、1.02x、1.03x、1.04x和1.05x。因此，“约x”和“大约x”旨在教导和对例如“0.98x”的权利要求限制提供书面描述支持。
[0256]
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均以引用方式并入本文，其程度就如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指示为以引用方式并入一样。此外，每个引用的出版物、专利或专利申请都通过引用并入本文以公开和描述与引用出版物相关的主题。对任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开，不应被解释为承认本文描述的发明由于在先发明而无权早于此类出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，这可能需要独立确认。
[0257]
应注意，可以描述权利要求以排除任何任选要素。因此，该陈述旨在作为与权利要求要素的叙述相关联的诸如“唯一”、“仅”等排除术语的使用或“否定”限制的使用的先行基础。本领域技术人员在阅读本公开内容后将显而易见，本文描述和示例的每个单独的实施方案均具有分立的要素和特征，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，这些要素和特征可以容易地与其它几个实施方案中的任何一个的特征分开或组合。任何所述的方法均可以按照所述的事件顺序或逻辑上可能的任何其它顺序进行。尽管在本发明的实施或测试中也可以使用与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料，但目前描述代表性的示例性方法和材料。