一种黏果酸浆的特异性核苷酸序列、标记引物及鉴别方法与流程

1.本发明属于利用分子生物学方法鉴别黏果酸浆physalis ixocarpa的技术领域，具体涉及一种黏果酸浆的特异性核苷酸序列、分子特异性标记引物，以及利用该分子特异性标记引物对黏果酸浆进行快速鉴别的方法。


背景技术：

2.黏果酸浆physalis ixocarpa，是茄科酸浆属中的一种一年生草本植物，具有重要的药用价值和食用价值，是一种非常难得的药食同源植物。黏果酸浆果实味道清香，甜美可口，富含维生素c、胡萝卜素、钙、铁等20多种矿物质和18种人体所需要的氨基酸，同时具有一定的抗肿瘤活性。黏果酸浆与酸浆属的其他近缘物种，如大果酸浆physalis macrophysa、毛酸浆p.pubescens、小酸浆p.minima、苦蘵p.angulata及酸浆p.alkekengi var.franchetii等植物的茎、叶、花和果实等形态学特征极为相似。利用传统的表型分类方法很难将黏果酸浆与其他酸浆属相似植物鉴别开。这也为黏果酸浆的鉴定和利用带来了一定的麻烦。
3.与传统形态学鉴定方法相比，dna分子标记技术克服了环境及基因表达与否的限制，能对不同发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞作检测，可以通过基因序列差异比较分析为植物鉴别、系统分类提供直接的证据。目前虽然有一些酸浆属植物的特异性标记鉴定技术方法，但是由于特异性分子标记的特殊性，它是针对特定的物种开发的，物种不同，其引物序列信息及开发技术方案都会有所不同，目前还没有相关黏果酸浆这一酸浆植物物种的特异性位点研究。因此，为了丰富酸浆属植物的特异性分子标记数据库，也为了实现黏果酸浆的快速、准确分子鉴定，本发明提供一种黏果酸浆的特异性核苷酸序列、标记引物及鉴别方法，为黏果酸浆种质资源的鉴别及利用提供有效的分子方法技术。发明人在对黏果酸浆和多种相近酸浆属植物实验材料进行反复试验，以及在大量实验筛选及实验条件优化的基础上获得了黏果酸浆的特异性核苷酸序列，开发了可用于其快速、准确鉴定的特异性标记引物，并建立了其特有的分子鉴定方法。本发明提供的特异性标记引物及其应用方法则非常稳定、简便、直观和准确，能够实现黏果酸浆样品的快速、准确分子鉴定。


技术实现要素：

4.本发明第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种黏果酸浆的特异性核苷酸序列。
5.本发明用于鉴别黏果酸浆的特征性核苷酸序列是在对被测酸浆属植物大量dna指纹图谱特异性位点进行筛选的基础上，通过切胶回收、ta克隆和测序分析获得的，其dna序列如seq id no.1所示。
6.本发明的第二个目的是提供基于上述鉴别黏果酸浆核苷酸序列开发的用于鉴别黏果酸浆的特异性标记引物(phi4f/phi4r)，该特异性标记引物序列如下：
7.上游引物phi4f：5
’‑
acccacacctacctatgc
‑3’
，如seq id no.2所示；
8.下游引物phi4r：5
’‑
cactccacgacctcacca
‑3’
，如seq id no.3所示。
9.上述特异性分子标记引物(phi4f/phi4r)是基于上述黏果酸浆特异性核苷酸序列(如seq id no.1)开发获得的，具有非常高的特异性，以phi4f/phi4r作为特异性扩增引物，对待测酸浆属植物进行pcr扩增，电泳检测结果显示只与黏果酸浆样本dna发生反应，而不与其他酸浆属植物样品反应。因此，运用该特异性标记引物，通过常规pcr扩增及琼脂糖电泳检测即可以快速鉴别出黏果酸浆样品。
10.本发明的第三个目的是提供上述分子特异性标记引物鉴别黏果酸浆的方法。该方法为：采用引物组合phi4f/phi4r作为特异性扩增引物，以待测酸浆属植物的基因组总dna为模板，进行pcr扩增，对扩增产物进行琼脂糖电泳检测，若电泳结果出现分子量为1464bp大小的特异性片段，则待测酸浆属植物样品为黏果酸浆，反之则不是。
11.作为优选，所述方法如下：
12.步骤一、总基因组dna的提取：取待测酸浆属植物样品新鲜叶片，加液氮研磨至粉末，利用从上海生工生物工程有限公司订购的uniq
‑
10柱式植物基因组dna抽提试剂盒进行总基因组dna提取。
13.步骤二、以步骤一提取的总基因组dna为模板dna，以所述分子特异性标记引物(phi4f/phi4r)作为扩增引物，进行pcr扩增。
14.pcr扩增反应体系：2μl的含mgcl210
×
buffer，1μl的10μm上游引物phi4f()，1μl的10μm下游引物phi4r，0.8μl的10mm dntps，0.5μl的2u/μltaq酶，1μl的50ng/μl模板dna，13.7μl ddh2o，共20μl总体积。
15.pcr反应程序如下：首先，94℃预变性5min；其次，94℃变性50s，54℃退火50s，72℃延伸1.5min，共32个循环；最后，72℃进一步延伸10min。
16.步骤三、应用1.5﹪琼脂糖凝胶对步骤二扩增获得的pcr产物进行电泳检测，经凝胶成像系统拍照检测，若电泳结果出现分子量为1464bp大小的dna条带，则被检测样品为黏果酸浆，反之则不是。
17.本发明主要有益效果表现为：鉴别结果准确、检测灵敏高，耗时短，半天即可完成，应用方法简便；phi4f/phi4r为黏果酸浆专一性扩增引物，若为其他酸浆属植物样品，为阴性反应。
附图说明
18.图1是筛选获得含有黏果酸浆特异性dna条带的dna指纹图谱(箭头所指的条带是黏果酸浆特有的条带，分子量为1505bp)，其中，m为dna分子量标准trans2kdna marker(北京全式金生物技术有限公司)；通道1～4：小酸浆、通道5～8：苦蘵、通道9～12：酸浆、通道13～16：毛酸浆、通道17～20：大果酸浆、通道21～24：黏果酸浆；
19.图2是采用本发明提供的特异性分子标记引物phi4f/phi4r对被测酸浆属植物进行pcr扩增后的琼脂糖凝胶电泳检测图。其中，m为dna分子量标准trans2kdna marker(北京全式金生物技术有限公司)；通道1～4：小酸浆、通道5～8：苦蘵、通道9～12：酸浆、通道13～16：毛酸浆、通道17～20：大果酸浆、通道21～24：黏果酸浆。电泳图显示只有黏果酸浆所有样品扩增出分子量为1464bp大小的特异性dna条带；
20.图3是采用本发明提供的分子特异性标记引物phi4f/phi4r对10份不同黏果酸浆
个体样品的总基因组dna进行pcr扩增得到的dna指纹图谱。其中，m：dna分子量标准trans2kdna marker(北京全式金生物技术有限公司)；通道1～10：对应为10个不同黏果酸浆个体的样品。电泳图显示10个不同黏果酸浆个体样品均能扩增出分子量为1464bp大小的特异性dna电泳条带。
具体实施方式
21.本发明可以从分子水平上快速、准确的鉴别黏果酸浆样品材料，通过以下实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此：
22.实施例1：黏果酸浆特异性核苷酸序列的制备
23.1.总基因组dna的提取
24.剪取被测酸浆属植物样品(包括小酸浆、苦蘵、酸浆、毛酸浆、大果酸浆和黏果酸浆各4个样品)新鲜叶片200mg放入研钵，加入液氮并研磨至粉末，然后使用从上海生工生物工程有限公司订购的uniq
‑
10柱式植物基因组dna抽提试剂盒提取被测酸浆属植物样品的总基因组dna，所得基因组dna用0.8％琼脂糖胶进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测浓度，稀释至50ng/μl。
25.2.含有黏果酸浆特异性条带的dna指纹图谱筛选
26.以scot32引物(5
’‑
ccatggctaccaccgcac
‑3’
，如seq id no.4所示)为pcr扩增引物，对各被测酸浆属植物样品的基因组dna进行pcr扩增，反应体系(总体积20μl)：2μl的10
×
buffer(含mgcl2)，1μl引物scot32(10μm)，0.8μl的dntps(10mm)，0.5μl taq酶(2u/μl)，1μl模板dna(50ng/μl)，14.7μl ddh2o。
27.pcr扩增反应程序：首先，94℃预变性5min；其次，94℃变性50s，53℃退火50s，72℃延伸1.5min，共32个循环；最后，72℃进一步延伸10min。
28.通过dna指纹图谱分析，筛选获得含有黏果酸浆特异性条带的dna电泳图(如图1所示)，图1中箭头标记的条带(分子量为1505bp，通道为21～24)，是筛选出的黏果酸浆特异性dna片段。如图2所示，只有黏果酸浆(通道为21～24)扩增出分子量为1464bp大小的dna条带，而其他酸浆属植物没有扩增出分子量1464bp大小的dna条带。因此，此条带为黏果酸浆的特异性核苷酸序列。
29.3.特异性核苷酸序列克隆及测序
30.对上述筛选获得的黏果酸浆特异性dna片段(图1中箭头所指的条带)进行切胶，采用从上海生工生物工程有限公司购买的pcr产物纯化试剂盒回收纯化dna片段。然后，将所得的纯化dna片段连接到pmd 19
‑
t载体(takara)上，并转化到大肠杆菌感受态细胞中，进行ta克隆。将获得阳性克隆，送上海生工生物工程有限公司测序，得到一种黏果酸浆特异性核苷酸序列seq id no.1。
31.实施例2：黏果酸浆特异性分子标记引物(phi4f/phi4r)的制备，pcr扩增，电泳检测
32.在实施例1所得黏果酸浆特异性核苷酸序列(seq id no.1)的基础上，开发设计获得黏果酸浆特异性分子标记引物phi4f/phi4r序列(phi4f：5
’‑
acccacacctacctatgc
‑3’
，如seq id no.2所示；phi4r：5
’‑
cactccacgacctcacca
‑3’
，如seq id no.3所示。)。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。利用黏果酸浆分子特异性标记引物phi4f/phi4r对不同
被测酸浆属植物样品(具体见附图说明)进行pcr扩增及电泳检测。
33.pcr扩增反应体系(总体积20μl)：2μl的10
×
buffer(含mgcl2)，1μl的上游引物phi4f(10μm)，1μl的下游引物phi4r(10μm)，0.8μl的dntps(10mm)，0.5μl的taq酶(2u/μl)，1μl的模板dna(50ng/μl)，13.7μl ddh2o。
34.pcr反应程序如下：94℃预变性5min；32个循环(94℃变性50s，54℃退火50s，72℃延伸1.5min)；72℃延伸10min。
35.对上述获得pcr产物进行琼脂糖凝胶(1.5％)电泳检测，经过经凝胶成像系统拍照检测，电泳图如图2所示(图中，通道m为dna分子量标准trans2k dna marker；通道1～24为6种不同酸浆属植物的样品，具体见附图说明)，从图2可以看出，只有黏果酸浆(通道18～22)能够扩增出1464bp大小的特异性dna片段，而其他酸浆属植物样品没有扩增出任何条带，这表明本发明提供的特异性分子标记引物具有非常高的专一性，因此可以用于黏果酸浆样品的快速鉴别。对黏果酸浆的特异性片段进行测序，确定其序列为一种黏果酸浆特异性核苷酸序列seq id no.1的27～1490位碱基所示，其长度为1464bp。
36.实施例3：黏果酸浆特异性标记引物(phi4f/phi4r)的进一步验证
37.为了进一步验证本发明提供的分子特异性标记引物(phi4f/phi4r)的稳定性和应用范围，利用实施例2所得的黏果酸浆分子特异性标记引物phi4f/phi4r对10份来自不同黏果酸浆个体的样品总基因组dna进行pcr扩增，以及琼脂糖凝胶电泳检测。所得电泳图如附图3所示(图中，通道m为dna分子量标准trans2kdna marker；通道1～10：对应为10个不同黏果酸浆个体的样品)。附图3显示所有黏果酸浆样品都能扩增出1464bp大小的特异性dna电泳条带，说明本发明提供的分子特异性标记引物(phi4f/phi4r)具有很好的稳定性和应用范围。
38.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。