同时鉴定哈克尼西棉与三裂棉不育胞质的SSR标记的制作方法

同时鉴定哈克尼西棉与三裂棉不育胞质的ssr标记
技术领域
1.本发明涉及一种分子标记，具体涉及一种同时鉴定哈克尼西棉(cms
‑
d2)与三裂棉(cms
‑
d8)不育胞质的ssr标记，属于生物技术领域。


背景技术：

2.杂种优势的利用可显著提高棉花的产量、改进棉花品质以及增强棉花抗性。研究表明，棉花杂交品种比常规品种增产约15％。杂交制种是利用棉花杂种优势的有效方式，在生产实践中，杂交制种的常用方法为人工去雄授粉法、化学杀雄法和“三系配套”法。人工去雄授粉法由于人工费用逐年增高，成本越来越高，且杂交种纯度低，无法保证种子质量；化学杀雄法，可减少人工去雄的人力物力投入，但杀雄效果不稳定且易造成环境污染；利用细胞质雄性不育三系配套法制种程序简便，具有人力投入小、减少物力消耗、种子纯度较高、成本较低等优点，适合大面积制种，这将成为杂交棉商业化制种最优途径之一。推广三系杂交(不育系、保持系和恢复系)棉花，对于增加植棉效益，提高棉农收入，稳定杂交棉种植面积，发展棉花加工业等都具有重要意义。
3.但是，在三系杂交棉的推广过程中，由于不育基因存在胞质负效应，大大降低了棉花杂种优势利用的经济价值。棉花细胞质负效应是指不育胞质基因对其花粉活性、产量、品质等性状也有一定的不利影响，这种影响高温时更加显著。因此棉花不育胞质对杂种一代的遗传效应如何，是关系到棉花细胞质雄性不育能否成功地应用于棉花杂交种生产的重要问题，一直受到棉花育种工作者的高度关注。目前研究较多的两套细胞质雄性不育材料为哈克尼西棉细胞质雄性不育(cms
‑
d2)和三裂棉细胞质雄性不育(cms
‑
d8)，无法完全区分类型，且无法鉴定其胞质负效应，更无从谈起尽量克服其胞质负效应。准确辨别不育胞质类别不仅对不育机理的研究有较大的帮助，而且可以提高生产中种子纯度的鉴定效率。因此开发简单可行的辨别两套棉花不育基因的分子标记，意义重大。
4.dna是生物的基本遗传物质，dna多态性是生物多样性的本质内容。分子标记直接从分子水平反映出核苷酸序列的任何差异，它不受发育阶段、环境因素以及基因是否表达的影响，数量非常丰富，遗传稳定。目前关于分子标记的研究较多。申请人所在的课题组长期从事于棉花三系配套方面的研究，也申请了与棉花三系配套相关的分子标记专利。cn201210092777.6提供了用于鉴定含哈克尼西棉不育胞质的棉花恢复系的ssr标记的引物，对含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花恢复系材料进行了分子水平的多态性检测。上述ssr标记仅能检测一套细胞质雄性不育(哈克尼西棉)是否为恢复系。cn201910682012.x公开了同时鉴定棉花细胞质雄性不育恢复基因rf1、rf2的indel标记，该indel标记可以鉴定棉花的两套细胞质雄性不育的不同的恢复基因类型，对不同恢复基因(rf1/rf2)的棉花新恢复系材料的选育和保证三系杂交种种子纯度方面具有重要作用，上述indel标记能检测两套细胞质雄性不育的恢复基因类型，但不涉及不育胞质类别鉴定。截至目前，尚未发现对棉花不育系与保持系进行鉴定以及对两种不同不育胞质进行分型的分子标记。


技术实现要素：

5.为了解决传统常规育种方法无法鉴定两种不同不育胞质的问题，本发明提供一种同时鉴定哈克尼西棉与三裂棉不育胞质的ssr标记。该ssr标记不仅与哈克尼西棉细胞质雄性不育基因连锁，而且与三裂棉细胞质雄性不育基因连锁，该核苷酸的简单重复序列多态性呈现在聚丙烯酰胺电泳图上可鉴定棉花单株是否含有不育基因且能判定含有不育基因的类型(cms
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d2/cms
‑
d8)。本发明利用同一ssr标记不仅可以鉴定棉花三系材料的不育系与保持系，且能够同时区分棉花的两套细胞质雄性不育基因，还可以鉴定不同三系配套的杂交种，在不同不育基因的棉花新材料的选育及保证三系杂交种种子纯度方面起到重要作用。
6.本发明的技术方案是：一种同时鉴定哈克尼西棉与三裂棉不育胞质的ssr标记，其特征是，ssr标记引物为：上游引物为：5
’‑
gactacccacggagcggtgaaa
‑3’
(seq id no.1)；下游引物为：5
’‑
attggggcgattttcctcttag
‑3’
(seq id no.2)。
7.本发明还提供了上述的ssr分子标记引物在鉴定哈克尼西棉细胞质雄性不育基因与三裂棉细胞质雄性不育基因中的应用。
8.本发明还提供了上述的ssr分子标记引物在对不同基因的棉花新不育系材料的选育方面的应用。
9.本发明还提供了一种采用上述的ssr分子标记引物鉴定哈克尼西棉细胞质雄性不育基因与三裂棉细胞质雄性不育基因的方法，其特征是，
10.1)以待测棉花材料的线粒体dna为模板，用上述的ssr分子标记引物进行pcr扩增；
11.2)对上述pcr扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；
12.pcr产物聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示出现三条带，如果在158bp处显示特异扩增条带，则为含棉花保持系材料；如果在127bp处显示特异扩增条带，则为含哈克尼西棉细胞质雄性不育材料；如果在132bp处显示特异扩增条带，则为三裂棉细胞质雄性不育材料。
13.pcr扩增体系如下：20μl反应体系，内含10
×
buffer(含mg2 )2μl、dntp(10mm)0.4μl、taq酶0.2μl、上、下游引物(10μm)各0.8μl、dna模板(300～500ng/μl)0.5μl和ddh2o15.3μl。
14.pcr扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸10s，34个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
15.本发明提供的鉴定方法，用于棉花两类细胞质雄性不育基因的鉴定，可以显著减少田间材料的鉴定工作量，提高准确性，确保不育系材料的纯度。该方法用于不育系的选育和改良，可以加速选育进程，降低育种成本，提高鉴定效率。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
17.1)多效：本ssr标记不仅可以鉴定棉花三系材料的不育系与保持系，含有可育胞质或者不育胞质的杂交种，而且可以鉴定两套不同类型的细胞质雄性不育胞质或者其杂交种，因此比单独检测一套细胞质雄性不育，其适用范围更广(尤其适用于两套细胞质雄性不育相配套的杂交的情况)。
18.2)准确率高：ssr标记具有简单可靠、可重复、易辨别等优点，只需要经pcr扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳即可检测。本发明利用一对ssr标记引物，能够从分子水平上区分出不育系系材料所含不育基因类型(d2/d8)、三系杂交种所含的不育基因的类型，且不受植株生育
时期和环境因素的影响，提高了不育基因鉴定的准确性与高效性。
19.3)操作简单，鉴定快速：ssr标记对不同不育基因的棉花新材料的选育及保证三系杂交种种子纯度方面具有重要作用。与常规育种相比，ssr标记节约了大量人力、物力。在不育系改良、构建新的不育系以及三系杂交制种过程中，可以适量减少田间性状调查以及多代回交试验的工作量，只需要提取棉花dna后，用ssr引物特异性扩增后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳就可鉴定，整个鉴定检测的过程仅需约5小时，短时，高效且鉴定结果比田间性状调查更准确。
20.4)简单实用：与caps标记相比，ssr标记具有分布密度大、准确性较高、重演性较好、易鉴定等特点，用本发明的ssr标记引物进行pcr扩增时，没有非特异性条带扩增。本发明的ssr分子标记应用于棉花含有不同不育基因的不育系的分子辅助选择育种研究中有良好前景，本发明用于棉花杂交种商业制种的种子纯度鉴定工作中有很大实用值。
附图说明
21.图1为mssr59分子标记引物的pcr产物核苷酸序列图；
22.图2为保持系及两种不育系种子检查结果，图中，1
‑
5、16、19、20、23、25、27、29、30、36
‑
39为cms
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d2不育系种子；6
‑
10、17、18、21、22、24、26、28、40为cms
‑
d8不育系种子；11
‑
15、31
‑
35为保持系种子；
23.图3为三种父本不同(cms
‑
d2、cms
‑
d8和保持系)的f1检查结果，图中，1
‑
10、31、33、35、37、38、39是以cms
‑
d2为父本配制的f1代种子；11
‑
20、32、34、36、40是以cms
‑
d8为父本配制的f1代种子；21
‑
30是以保持系为父本配制的f1代种子。
具体实施方式
24.下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
25.实施例1：
26.以含哈克尼西棉(cms
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d2)、三裂棉(cms
‑
d8)雄性不育胞质的棉花不育系和保持系的叶片为研究材料，通过对64对线粒体ssr标记(根据ncbi上已发表的哈克尼西棉不育系及保持系的线粒体基因组序列设计，线粒体基因组序列号为jx536494.1、jx065074.1)的筛选，共获得8个可以区分不育系与保持系的线粒体ssr标记，1个可以区分cms
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d2与cms
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d8的线粒体ssr标记(命名为mssr59)。
27.将mssr59的pcr产物纯化，连接t载体，转大肠杆菌测序得到cms
‑
d2的pcr产物(d2a
‑
mssr59)为127bp，cms
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d8的pcr产物(d8a
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mssr59)为132bp，保持系的产物(b
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mssr59)为158bp。cms
‑
d2的pcr产物比cms
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d8的pcr产物少了“ataat”5bp，两者比保持系则少了近30bp，如图1所示。因此该标记可以同时将cms
‑
d2、cms
‑
d8、保持系区分开来。最终得到了一种与棉花细胞质雄性不育基因共分离的ssr分子标记，所述分子标为mssr59；其核苷酸序列如表1所示。
28.表1 mssr59引物序列
29.30.实施例2
31.(1)提取dna
32.分别取哈克尼西棉、三裂棉雄性不育胞质的棉花不育系和保持系的种子以及哈克尼西棉、三裂棉雄性不育胞质的棉花不育系、保持系与恢复系配制的f1代种子，采用ctab法提取线粒体dna。
33.(2)pcr扩增
34.利用上述mssr59分子标记引物对，对提取的dna采用taq(5u/ul，全式金公司)体系进行pcr扩增，pcr扩增体系如下：20μl反应体系，内含10
×
buffer(含mg
2
)2μl、dntp(10mm)0.4μl、taq酶0.2μl、上、下游引物(10μm)各0.8μl、dna模板(300～500ng/μl)0.5μl和ddh2o15.3μl。
35.pcr扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸10s，34个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
36.(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳
37.扩增结束后，将20μl pcr产物加入4μl溴酚蓝上样缓冲液，充分混匀后待用；用2.5μl移液枪吸取2μlpcr产物与溴酚蓝的混合液点在聚丙烯酰胺凝胶样品孔中，接通电源，220v电泳1.5h。电泳完成后，将电泳板内的凝胶小心取出放置于固定专用槽内；向固定专用槽内加入480ml纯水、54ml无水乙醇和3.6ml的冰乙酸；于摇床上缓慢固定至少8分钟；将固定液倒去，纯水洗涤一遍，进行下一步渗透；称取1.2g硝酸银，溶于540ml的纯水中配成渗透液，注入渗透槽内；于摇床上缓慢固定至少12分钟；将渗透液倒去，纯水洗涤两遍，进行下一步显色；该反应过程在通风橱内进行，称取24g氢氧化钠，溶于1600ml的纯水中配成显色液，注入显色槽内混匀后，加入10ml甲醛溶液；将显色槽放置在通风橱内的摇床上，让摇床缓慢摇动(约38rpm)，显色直到有ssr条带出现为止；显色完成后将胶片用纯水至少洗涤两遍；将洗涤干净的胶片放置于胶片灯上进行拍照保存。
38.(4)结果判断
39.判断标准：pcr产物聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示出现三条带，如果在158bp处显示特异扩增条带，则为含棉花保持系材料；如果在127bp处显示特异扩增条带，则为含哈克尼西棉(cms
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d2)细胞质雄性不育材料；如果在132bp处显示特异扩增条带，则为三裂棉(cms
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d8)细胞质雄性不育材料。
40.检测结果见图2、图3。
41.图2中1
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5、16、19、20、23、25、27、29、30、36
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39为cms
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d2不育系种子；6
‑
10、17、18、21、22、24、26、28、40为cms
‑
d8不育系种子；11
‑
15、31
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35为保持系种子，从图2可以看出：cms
‑
d2不育系种子在127bp处显示特异扩增条带，三裂棉cms
‑
d8在132bp处显示特异扩增条带，保持系种子在158bp处显示特异扩增条带，与判断标准一致。
42.图3中，1
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10、31、33、35、37、38、39是以cms
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d2为父本配制的f1代种子；11
‑
20、32、34、36、40是以cms
‑
d8为父本配制的f1代种子；21
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30是以保持系为父本配制的f1代种子。从图3可以看出：以cms
‑
d2为父本配制的f1代种子在127bp处显示特异扩增条带，以cms
‑
d8为父本配制的f1代种子在132bp处显示特异扩增条带，以保持系为父本配制的f1代种子在158bp处显示特异扩增条带，与判断标准一致。
43.以上所述，仅为本发明最佳的实施方式，任何熟悉该技术领域的科技人员在本发
明披露的技术范围内，可显而易见地获得的技术方案的简易变化或等效替换均属于本发明的保护范围。