GRB7基因在结直肠癌的诊断、预后检测评价和药物制备中的应用的制作方法

grb7基因在结直肠癌的诊断、预后检测评价和药物制备中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及grb7基因在结直肠癌的诊断、治疗、预后检测评价和药物制备中的应用。


背景技术：

2.结直肠癌(colorectal cancer，crc)是全球范围内常见的恶性肿瘤。2018 年全球癌症统计报告结果表明，在常见肿瘤中，结直肠癌的发生率和死亡率均位居前三位。结直肠癌的发生除了遗传因素外，还很大程度上与人们的饮食习惯和生活方式有关。
3.早期结直肠癌患者的治疗方式通常采用外科切除手术，再加上一些辅助药物治疗就能有较好的治疗效果；疾病晚期或者被诊断为不可切除的患者通常采用化疗、分子靶向治疗等方式，但在治疗过程中，患者经常出现耐药问题，所以结直肠癌的临床预后仍然不尽人意，尤其是当crc患者出现淋巴结转移时，预后更差。
4.在结直肠癌靶向治疗中，egfr单抗药物cetuximab最早被批准用于转移性结直肠癌的治疗。它可作为kras野生型结直肠癌患者的临床一线治疗药物。但是在结直肠癌患者中，kras突变的患者约占50％，临床研究表明携带这种突变的患者对egfr相关抑制剂的治疗响应率极低。结直肠癌靶向治疗耐药导致的低反应率严重制约了结直肠癌靶向治疗的临床效果，成为临床治疗急需解决的问题。由于基因突变引起的各种诱导细胞增殖和存活的代偿传导途径的激活，以及信号传导网络的复杂，导致针对结直肠癌患者的靶向mapk疗法临床获益率不高。结直肠癌的耐药问题亟需解决。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种grb7基因在结直肠癌的诊断、治疗、预后检测评价和药物制备方面的应用，提供一种新的结直肠癌诊断标志物grb7基因，并能够特异性指示结直肠癌患者的靶向治疗敏感性及预后判断，有助于临床治疗方案更精准的个体化选择及改善预后；还可作为结直肠癌治疗靶点、用于制备结直肠癌治疗药物。
6.为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
7.grb7作为标志物、诊断靶点在制备治疗结直肠癌药物中的应用，该grb7 基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.一种检测grb7基因的试剂在结直肠癌诊断或预后中的应用。
9.进一步地，该试剂可特异性识别grb7基因，并能通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定等方法检测grb7基因的表达量。
10.进一步地，该试剂可用于制备检测grb7基因表达量的试剂盒。
11.一种grb7基因表达抑制剂或敲除试剂在制备治疗结直肠癌药物中的应用，该药物能够抑制结直肠癌细胞的增殖、促进细胞凋亡。
12.一种grb7基因表达抑制剂或敲除试剂在制备提高结直肠癌治疗效果的辅助药物
中的应用，所述辅助药物能够抑制结直肠癌细胞的增殖、促进细胞凋亡。
13.进一步地，结直肠癌为kras突变的结直肠癌。
14.一种用于结直肠癌诊断或预后检测的试剂盒，试剂盒包括检测grb7基因表达量的试剂。
15.进一步地，试剂盒包括特异性识别grb7基因的试剂。
16.进一步地，特异性识别grb7基因的试剂选自：特异性扩增grb7基因的引物；或特异性识别grb7基因的探针。
17.一种治疗结直肠癌的联合药物，包括grb7基因表达抑制剂或敲除试剂，以及结直肠癌抑制剂。
18.进一步地，结直肠癌抑制剂为mek抑制剂或mapk抑制剂。
19.进一步地，抑制grb7基因表达能够降低细胞对mek抑制剂或mapk抑制剂的耐受性；过表达grb7基因则会提升细胞对mek抑制剂或mapk抑制剂的耐受性。
20.进一步地，联合药物是能够抑制结直肠癌细胞的增殖、促进细胞凋亡的药物。
21.本发明的有益效果：
22.本发明提供一种新的结直肠癌诊断标志物grb7基因，并能够特异性指示结直肠癌患者的靶向治疗敏感性及预后判断，有助于临床治疗方案更精准的个体化选择及改善预后；还可作为结直肠癌治疗靶点、用于制备结直肠癌治疗药物。
附图说明
23.图1为结直肠癌样本中基因grb7的mrna表达量；
24.图2为结直肠癌样本中基因grb7的蛋白表达量；
25.图3为grb7的dfs生存曲线；
26.图4为qpcr检测grb7的shrna敲除效率；
27.图5为敲减grb7后对细胞hct116增殖的影响；
28.图6为敲减grb7后对细胞hct116凋亡的影响；
29.图7为grb7在meki处理之后的表达量差异；
30.图8为meki处理改变了grb7在细胞内的分布情况；
31.图9为敲减grb7后协同meki促进细胞增殖；
32.图10为敲减grb7后协同meki促进细胞凋亡；
33.图11为过表达grb7促进细胞对meki的耐受。
具体实施方式
34.下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
35.结直肠癌细胞系hct116和hek293t购买于美国典型培养物保藏中心 (atcc)。
36.实施例1证明grb7的含量在结直肠癌患者中含量显著升高
37.1、用tcga(the cancer genome atlas癌症基因图谱)数据库中结直肠癌病人的正
常组织(normal)和肿瘤组织(cancer)的基因表达量进行了统计分析 (图1，****p<0.0001)，结果表明不仅在kras突变的结直肠癌中，甚至在整个数据库的结直肠癌样本中，grb7在肿瘤中的表达量高于正常组织。
38.2、在结直肠癌患者的正常和肿瘤组织中，用免疫组织化学的方式检测grb7 的表达量(图2)，再对染色的强度进行量化。结果也证明grb7在肿瘤中的表达量显著高于正常组织
39.3、用tcga(the cancer genome atlas癌症基因图谱)数据库中结直肠癌病人的正常组织(normal)和肿瘤组织(cancer)基因表达量和临床信息进行dfs (无疾病生存期)分析，结果表明grb7表达高的患者预后较差(图3，p＝0.0062)，提示grb7作为结直肠癌预后标志物的作用。
40.实施例2证明grb7能调节肿瘤细胞的增殖和凋亡
41.1、构建靶向grb7的shrna
42.从选择了两条靶向grb7的shrna序列，通过分子克隆的方式将其克隆在载体plko上，并通过慢病毒系统包装表达shrna，对grb7进行靶向敲减。利用荧光定量pcr(q
‑
pcr)检测grb7的敲减效率。如图4所示，两株敲减后的细胞grb7相对表达量均低于30％，表明shrna靶向性较好，敲减效率符合要求。
43.2、用克隆形成方法检测敲减grb7对细胞增殖的影响
44.将hct116在常规下培养过夜，然后加入表达shrna的病毒颗粒进行感染。感染24h之后加入嘌呤霉素筛选稳定株。将筛选得到的稳定株进行克隆形成实验，大约2周之后，进行结晶紫染色，从而得到不同条件下细胞的增殖情况。如图5所示，敲减grb7之后显著降低了细胞的增殖。
45.3、检测敲减grb7对细胞凋亡的影响
46.将hct116感染表达shrna的病毒颗粒24小时之后，更换新鲜培养基继续培养48小时，用标记了fitc的annexin v和pi对凋亡细胞进行染色，采用流式细胞仪检测细胞凋亡。图6结果显示敲减grb7之后显著促进了细胞的凋亡。
47.实施例3grb7参与了meki的耐药过程
48.1、meki处理影响了grb7的表达量以及胞内分布情况
49.利用geo数据库信息，我们用生物信息学的方法分析了meki处理前后 grb7的mrna表达量，结果如图7显示，meki处理之后，显著增加了grb7 的表达量。此外，我们检测了meki处理是否对grb7的分布产生影响。将 hct116铺到细胞培养皿中，分别用1μm azd6244处理0，24，48，96小时。处理之后，利用蛋白核质分离试剂盒分别提取细胞核和细胞浆蛋白。之后用western blot的方法检测grb7的表达量。同时利用细胞核和细胞浆蛋白内参指示核质分离效果。结果如图8所示，meki处理之后，显著增加了细胞浆中的蛋白表达量，可能预示着meki处理促进了grb7在细胞浆的作用。
50.2、敲减grb7协同meki抑制细胞增殖
51.用长期克隆形成实验检测敲减grb7是否能协同meki发挥作用。将 hct116过夜培养，用表达grb7的shrna或者载体病毒颗粒24小时之后，加入药物1μm azd6244处理两周左右，知道对照组长满。用0.05％的结晶紫染液对细胞进行染色，由此检测细胞的增殖情况。结果如图9所示，与对照组相比，敲减grb7显著增加了hct116对meki的敏感性。
52.3、敲减grb7协同meki促进细胞凋亡
53.gsk1120212(曲美替尼)是mek的另外一种小分子抑制剂，目前已被fda 批准用于多种肿瘤的败选哪个治疗。靶向grb7的shrna协同meki促进了细胞的凋亡。感染shrna和对照的hc116细胞，分别用不同浓度(0，30nm，60nm) 的gsk1120212处理24小时后，利用annexin v
‑
pi的凋亡检测试剂盒检测细胞的凋亡水平，结果如图10所示。结果表明，shrna处理之后，显著增加了meki 对肿瘤细胞的杀伤作用。
54.4、过表达grb7显著增加了细胞对meki的耐受
55.我们在体外构建grb7过表达的慢病毒载体，通过慢病毒感染将外源grb7 引入hct116细胞。首先通过检测细胞中grb7蛋白表达情况来鉴定过表达效率。如图11a所示，与对照(cppt)细胞相比，过表达后的细胞grb7蛋白水平显著升高，说明grb7的过表达效率很高。
56.接下来我们用不同浓度(0、0.01、0.1、1、10μm)的meki分别处理cppt 和过表达grb7的细胞，药物处理72小时后，用mts法检测药物对细胞增殖的影响。如图11b所示，在实验组(过表达grb7)细胞中，meki对细胞的半数抑制浓度相比于对照组升高，表明过表达grb7的细胞对meki的耐受性有所增加。在长期克隆形成实验中，我们用不同浓度(0、0.125、0.25、0.5、1、5μm) 的meki隔天处理细胞，图11c的结果显示，实验组相较于对照cppt组在 azd6244 1μm、5μm时对药物的耐受性更强。以上实验结果表明，过表达grb7 有助于增加结直肠癌细胞对meki的耐受性。
57.综合上述失去功能和获得功能实验结果，表明grb7的表达变化显著影响 hct116细胞对meki的耐受性。