维生素k2(mk
‑
7)高产菌株及其筛选方法和生产维生素k2(mk
‑
7)的方法
技术领域
1.本发明涉及一种维生素k2(mk
‑
7)高产菌株及其筛选方法和利用其生产维生素k2(mk
‑
7)的方法，属于微生物发酵领域。
背景技术：
2.维生素k2也称为甲萘醌，是一种脂溶性维生素，其最初是从纳豆中分离得到，维生素k2根据主环上所带异戊二烯侧链长短不同命名为mk
‑
4到 mk
‑
13，其中最为重要的亚型是甲萘醌
‑
7(mk
‑
7)，即维生素k2侧链上含有7个异戊二烯单元，mk
‑
7的活性最强，作用最持久，安全性最高，服用剂量最低，在血液中半衰期最久。
3.维生素k2(mk
‑
7)在预防动脉钙化、促进肝功能恢复、降低糖尿病风险、预防癌症和帕金森等疾病具有一定作用，其在预防和治疗骨质疏松中发挥重要作用。维生素k2(mk
‑
7)作为新一代保健食品，其功能正在受到越来越多的关注，目前已经被广泛用作膳食补充剂和保健品。
4.近年来维生素k2(mk
‑
7)的制备和工业化已经成为研究热点，目前获取维生素k2(mk
‑
7)的方式分为三种：(1)从发酵食品中直接摄取，例如纳豆、豆豉、奶酪等食品中含有微量的维生素k2(mk
‑
7)，但其中含量很低，不能满足人体的正常摄入量。(2)化学合成维生素k2(mk
‑
7)，目前可以人工化学合成维生素k2(mk
‑
7)，但化学合成反应步骤复杂，产率低，而且还会产生低活性的顺式异构体，同时伴随产生大量副产物，环境污染严重。 (3)微生物发酵生产维生素k2(mk
‑
7)，目前已经从纳豆中分离出纳豆芽孢杆菌，该菌不产生内毒素，是食品安全级菌种，该菌种适合在发酵罐中发酵生产。但该菌种的发酵单位很低，需要通过菌种选育筛选出高产菌种，并且配合恰当的发酵培养基配方和控制工艺来提高发酵单位，这样才能达到大规模工业化的生产标准。
技术实现要素：
5.针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种维生素k2(mk
‑
7)高产菌株及其筛选方法和利用其生产维生素k2(mk
‑
7)的方法，目的之一在于：选育出一株维生素k2(mk
‑
7)高产菌株，使其能够遗传稳定且能够高产维生素k2 (mk
‑
7)；目的之二在于：提供一种培养维生素k2(mk
‑
7)高产菌株的最优发酵培养基配方和控制工艺，该培养基配方和控制工艺有利于提高维生素 k2(mk
‑
7)高产菌株的发酵单位。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种维生素k2(mk
‑
7)高产菌株，命名为纳豆芽孢杆菌(bacillus subtilisnatto)bk21018，菌株保藏编号为cctcc m20211066，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(cctcc)，中国武汉，武汉大学，保藏日期为2021年8月23日。
8.纳豆芽孢杆菌(bacillus subtilis natto)bk21018的微生物学特征如下：
9.单菌落的形态为：菌落呈黄白色、圆形、中间凸起、菌落具有规则褶皱，显微镜下芽
孢呈椭圆形。
10.上述维生素k2(mk
‑
7)高产菌株的筛选方法为利用亚硝基胍诱变，并通过摇瓶筛选，具体步骤如下：
11.(a)纳豆芽孢杆菌菌悬液制备：出发菌株为纳豆芽孢杆菌(bacillussubtilisnatto)bk09112(华北制药股份有限公司倍达分厂自有菌株)，将斜面菌体加无菌水利用接种环刮下来，转移至灭菌且含10个玻璃珠的250ml三角瓶中，再向该三角瓶中加入30ml蒸馏水，然后将该三角瓶放在摇床上200r/min振荡15min，将洗下来的菌体液转移到一个无菌的试管中备用，菌体浓度为107个/ml；
12.(b)亚硝基胍诱变：向菌液中加入终浓度为1.0g/l的亚硝基胍，30℃水浴处理10min，用pb缓冲液洗涤5次去除亚硝基胍残留；
13.(c)平皿分离：以出发菌株菌悬液作为对照组，将诱变后的菌悬液和对照组分别稀释10
‑3‑
10
‑5倍后涂布在lb培养基上，在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％条件下避光培养1
‑
2天；
14.(d)高产菌株筛选：挑取单菌落接种到lb斜面培养基上，在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％条件下避光培养1
‑
2天，斜面菌种成熟后进行摇瓶初筛，将斜面挖块儿接种到30
‑
40ml种子培养基摇瓶中，在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％、220rpm的条件下培养15
‑
20小时，菌种成熟后将其接种到30
‑
40ml发酵培养基摇瓶中，在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％、220rpm的条件下培养6
‑
8天，得到发酵液，利用hplc法测定各发酵液中维生素k2(mk
‑
7)的效价，效价高于对照20％的发酵液所对应的菌株进行摇瓶复试，复试过程同初筛，复试和初筛发酵液中维生素k2(mk
‑
7)效价最高的发酵液对应的菌株即为纳豆芽孢杆菌(bacillussubtilisnatto)bk21018。
15.进一步，步骤(c)和步骤(d)中所述lb培养基按质量体积比计算，成分为：0.5％酵母提取物，1.0％胰蛋白胨，0.5％氯化钠，1.5％琼脂，用蒸馏水配制，ph值为7.0
±
0.2。
16.进一步，步骤(d)中所述种子培养基按质量体积比计算，成分为：0.5
‑
1.5％甘油，0.2
‑
1.0％酵母粉，0.2
‑
1.0％大豆蛋白胨，用蒸馏水配制，ph值为7.0
±
0.2。
17.进一步，步骤(d)中所述发酵培养基按质量体积比计算，成分为：2
‑
8％甘油，0.2
‑
0.8％酵母粉，2
‑
10％大豆蛋白胨，01
‑
0.5％氯化钠，0.1％
‑
2％蔗糖，0.001％
‑
0.1％烟酰胺，0.001％
‑
0.1％天冬氨酸，用蒸馏水配制，ph值为7.0
±
0.2。
18.本发明还提供了利用上述维生素k2(mk
‑
7)高产菌株发酵生产维生素k2(mk
‑
7)的方法，具体步骤如下：
19.(1)将纳豆芽孢杆菌(bacillussubtilisnatto)bk21018菌株接种到lb培养基中，并在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％条件下避光培养1
‑
2天，斜面成熟后4℃保藏；
20.(2)将斜面接种到种子罐培养基中，并在37
±
0.5℃、200
‑
300rpm、通气比1:1.0
‑
1:1.2的条件下培养12
‑
18小时，待菌体离心量达到3％后发酵用种子即为长好；
21.(3)将长好的种子接种到发酵罐培养基中，在37
±
0.5℃、200
‑
350rpm、通气比1:1.0
‑
1:1.5的条件下培养6
‑
8天，即可制得维生素k2(mk
‑
7)发酵液。
22.进一步，步骤(1)中所述lb培养基按质量体积比计算，成分为：0.5％酵母提取物，1.0％胰蛋白胨，0.5％氯化钠，1.5％琼脂，用蒸馏水配制，ph值为7.0
±
0.2。
23.进一步，步骤(2)中所述种子培养基按质量体积比计算，成分为：0.5
‑
1.5％甘油，
0.2
‑
1.0％酵母粉，0.2
‑
1.0％大豆蛋白胨，用自来水配制，ph值为7.0
±
0.2。
24.进一步，步骤(3)中所述发酵培养基按质量体积比计算，成分为：2
‑
8％甘油，0.2
‑
0.8％酵母粉，2
‑
10％大豆蛋白胨，01
‑
0.5％氯化钠，0.1％
‑
2％蔗糖，0.001％
‑
0.1％烟酰胺，0.001％
‑
0.1％天冬氨酸，用自来水配制，ph值为7.0
±
0.2。
25.进一步，步骤(3)中所述培养的操作还包括：发酵过程中补入无菌的40％的甘油，甘油含量控制在0.1
‑
10mg/ml；
26.发酵过程中补入无菌的大豆蛋白胨，氨基氮含量控制在1
‑
5mg/ml；
27.发酵培罐运行至24h后每12h向罐中补入终浓度为0.005％
‑
0.01％烟酰胺；补入10％氢氧化钠溶液，ph值为6.2
‑
6.7。
28.本发明的有益效果在于：
29.本发明采用亚硝基胍诱变的方法，筛选到纳豆芽孢杆菌(bacillussubtilisnatto)bk21018，该菌株具有摇瓶效价高，传代稳定性良好等特点。
30.纳豆芽孢杆菌bk21018用于发酵时，配合最优发酵培养基和控制工艺，其发酵单位可以达到240mg/l(以mk
‑
7计算)以上，与出发菌株相比提高了243％，大幅度提高维生素k2(mk
‑
7)的发酵单位。该菌株可以有效的提高维生素k2(mk
‑
7)的产量，明显降低发酵用的原材料、水、电和蒸汽等成本，减少单位产量的污染排放，具有较高的经济效益。
具体实施方式
31.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.实施例1
33.维生素k2(mk
‑
7)高产菌株的筛选
34.1.1、培养基的制备
35.lb培养基制备：称取5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，5g氯化钠，15g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml，然后用质量分数为30％的氢氧化钠溶液调节ph至7.0
±
0.2，分装置至若干试管中，121℃下灭菌20min，灭菌完成后铺成斜面，凝固后得到斜面培养基，将灭菌后的lb培养基倒至平皿中得到lb培养基。
36.种子培养基制备：称取10g甘油，5g酵母粉，10g大豆蛋白胨，蒸馏水定容至1000ml，然后用质量分数为30％的氢氧化钠溶液调节ph至7.0
±
0.2，每个250ml三角瓶分装30ml种子培养基，8层纱布封口，121℃下灭菌20min，冷却后得种子培养基。
37.发酵培养基制备：称取180g甘油，15g酵母粉，240g大豆蛋白胨，7.5g氯化钠，30g蔗糖，0.06g烟酰胺，0.06g天冬氨酸，蒸馏水定容至3000ml，然后用质量分数为30％的氢氧化钠溶液调节ph至7.0
±
0.2，每个250ml三角瓶分装30ml发酵培养基，8层纱布封口，121℃下灭菌20min，冷却后得发酵培养基。
38.1.2、维生素k2(mk
‑
7)高产菌株筛选的操作步骤如下：
39.(a)纳豆芽孢杆菌菌悬液制备：出发菌株为纳豆芽孢杆菌bk09112(华北制药股份有限公司倍达分厂自有菌株)，将一支斜面菌体加无菌水利用接种环刮下来，转移至灭菌的
250ml三角瓶中(含10个玻璃珠)，再向该三角瓶中加入30ml蒸馏水，然后将该三角瓶放在摇床上200r/min振荡15分钟，将洗下来的菌体液转移到一个无菌的试管中备用，菌体浓度为107个/ml。
40.(b)亚硝基胍诱变：向菌液中加入终浓度为1.0g/l的亚硝基胍，30℃水浴处理10min。用pb缓冲液洗涤5次去除亚硝基胍残留。
41.(c)平皿分离：以出发菌株菌悬液为对照组，将诱变后的菌悬液和对照组分别稀释10
‑3‑
10
‑5倍后涂布在lb培养皿上，在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％条件下避光培养1天。
42.(d)高产菌株筛选：挑取单菌落接种到lb斜面培养基上，在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％条件下避光培养1天，斜面菌种成熟后进行摇瓶初筛，将斜面挖块儿接种到30ml种子培养基摇瓶中，在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％、 220rpm的条件下培养17小时，菌种成熟后将其接种到30ml发酵培养基摇瓶中，在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％、220rpm的条件下培养7天，得到发酵液，利用hplc法测定各发酵液中维生素k2(mk
‑
7)的效价，效价高于对照20％的发酵液所对应的菌株进行摇瓶复试，复试过程同初筛，初筛和复试发酵液中最高维生素k2(mk
‑
7)效价为228mg/l和239mg/l，对应的菌株命名为纳豆芽孢杆菌bk21018。
43.(e)bk21018菌株超低温冷冻保藏：向保存有bk21018菌株的斜面中加入10ml含有20％甘油的无菌水溶液，用接种环将孢子刮下，混匀后用吸管分装至冷冻管中(1ml/支)，注明菌株名称，制备时间和有效期，冷冻至超低温冰箱中。
44.实施例2
45.维生素k2(mk
‑
7)高产菌株的遗传稳定性考察
46.(1)取实施例1中保藏的纳豆芽孢杆菌bk21018接种于实施例1制备的斜面培养基，在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％条件下避光培养2天，斜面菌种成熟后将其再次接种于斜面培养基中进行培养，重复四次；
47.(2)将步骤(1)中五次培养出的菌株分别各自转接至实施例1制备的种子培养基中，在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％、220rpm的条件下培养16 小时，菌种成熟后各自转至接实施例1制备的发酵培养基中，在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％、220rpm的条件下培养7天，制得五组含有维生素k2 (mk
‑
7)的发酵液；
48.(3)以hplc测定步骤(2)中发酵液中维生素k2(mk
‑
7)的效价，其结果依传代培养顺序依次为：232g/ml、239g/ml、231g/ml、236g/ml、 233g/ml。
49.由上结果可知，纳豆芽孢杆菌bk21018具有较好的传代稳定性。
50.实施例3
51.维生素k2(mk
‑
7)高产菌株发酵工艺控制
52.3.1、培养基的制备
53.种子罐培养基制备：称取100g甘油，100g酵母粉，100g大豆蛋白胨，用自来水配制定容至9l，然后用质量分数为30％的氢氧化钠溶液调节ph至 7.0
±
0.2，对种子罐进行实消，121℃下灭菌30min，利用循环水冷却，冷却后得10l种子培养基。
54.发酵罐培养基制备：称取3000g甘油，250g酵母粉，4000g大豆蛋白胨， 150g氯化钠，500g蔗糖，1g烟酰胺，1g天冬氨酸，用自来水定容至45l，然后用质量分数为30％的氢氧化钠溶液调节ph至7.0
±
0.2，对发酵罐进行实消， 121℃下灭菌30min，利用循环水冷却，冷却后得50l发酵培养基。
55.高产菌株发酵工艺控制：将bk21018菌株接种到lb培养基中，并在 37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％条件下避光培养1天，斜面成熟后将斜面接种到种子罐培养基中，并在37
±
0.5℃、230rpm、通气比1:1.0的条件下培养15 小时，待菌体离心量达到3％后将长好的种子接种到发酵罐培养基中，在 37
±
0.5℃、300rpm、通气比1:1.5的条件下培养7天。
56.3.2、纳豆芽孢杆菌bk21018发酵生产维生素k2(mk
‑
7)，步骤如下：
57.(1)将纳豆芽孢杆菌(bacillus subtilis natto)bk21018菌株接种到lb 培养基中，并在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％条件下避光培养1
‑
2天，斜面成熟后4℃保藏；
58.(2)将斜面接种到种子罐培养基中，并在37
±
0.5℃、200
‑
300rpm、通气比1:1.0
‑
1:1.2的条件下培养12
‑
18小时，待菌体离心量达到3％后发酵用种子即为长好；
59.(3)将长好的种子接种到发酵罐培养基中，在37
±
0.5℃、200
‑
350rpm、通气比1:1.0
‑
1:1.5的条件下培养6
‑
8天，即可制得维生素k2(mk
‑
7)发酵液；发酵过程中补入无菌的40％的甘油，甘油含量控制在0.1
‑
10mg/ml；补入无菌的大豆蛋白胨，氨基氮含量控制在1
‑
5mg/ml；发酵培罐运行至24h后每12h 向罐中补入终浓度为0.005％
‑
0.01％烟酰胺；补入10％氢氧化钠溶液，将发酵罐的ph值控制在6.2
‑
6.7。
60.将上述工艺重复进行三次，取三次所得发酵液分别以hplc测定发酵液中维生素k2(mk
‑
7)的效价，测定结果依次为246g/ml、238g/ml、236g/ml，平均值为240g/ml。
61.实施例4
62.出发菌株对比实验
63.以纳豆芽孢杆菌bk21018的出发菌株bk09112号菌(华北制药股份有限公司倍达分厂自有菌株)为发酵菌株，采用实施例3的发酵罐控制条件进行三次平行实验发酵结束后hplc测定生素k2(mk
‑
7)发酵液中的效价，分别为75g/ml、63g/ml、69g/ml，平均值为70g/ml。
64.实施例5
65.发酵工艺优化对比实验
66.以纳豆芽孢杆菌bk21018为发酵菌株，采用实施例3的发酵罐控制条件进行三次平行实验，发酵培养基中不加入蔗糖，烟酰胺，天冬氨酸，发酵培罐运行过程中不向罐中补入烟酰胺。发酵结束后hplc测定生素k2(mk
‑
7) 发酵液中的效价，分别为167g/ml、155g/ml、149g/ml，平均值为157g/ml。
67.比较出发菌株发酵液的平均效价与实施例3的发酵液效价可知，与出发株相比本发明所述的纳豆芽孢杆菌bk21018菌株的维生素k2(mk
‑
7)发酵单位提高了243％。纳豆芽孢杆菌bk21018高产菌株，配合最优发酵配方和控制工艺，大幅提高了维生素k2(mk
‑
7)的发酵单位。该菌株和工艺可以用于正式生产，生产过程中可以明显降低发酵用的原材料、水、电和蒸汽等成本，减少单位产量的污染排放，具有较高的经济效益。
‑
7)高产菌株及其筛选方法和生产维生素k2(mk
‑
7)的方法
技术领域
1.本发明涉及一种维生素k2(mk
‑
7)高产菌株及其筛选方法和利用其生产维生素k2(mk
‑
7)的方法，属于微生物发酵领域。
背景技术：
2.维生素k2也称为甲萘醌，是一种脂溶性维生素，其最初是从纳豆中分离得到，维生素k2根据主环上所带异戊二烯侧链长短不同命名为mk
‑
4到 mk
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13，其中最为重要的亚型是甲萘醌
‑
7(mk
‑
7)，即维生素k2侧链上含有7个异戊二烯单元，mk
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7的活性最强，作用最持久，安全性最高，服用剂量最低，在血液中半衰期最久。
3.维生素k2(mk
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7)在预防动脉钙化、促进肝功能恢复、降低糖尿病风险、预防癌症和帕金森等疾病具有一定作用，其在预防和治疗骨质疏松中发挥重要作用。维生素k2(mk
‑
7)作为新一代保健食品，其功能正在受到越来越多的关注，目前已经被广泛用作膳食补充剂和保健品。
4.近年来维生素k2(mk
‑
7)的制备和工业化已经成为研究热点，目前获取维生素k2(mk
‑
7)的方式分为三种：(1)从发酵食品中直接摄取，例如纳豆、豆豉、奶酪等食品中含有微量的维生素k2(mk
‑
7)，但其中含量很低，不能满足人体的正常摄入量。(2)化学合成维生素k2(mk
‑
7)，目前可以人工化学合成维生素k2(mk
‑
7)，但化学合成反应步骤复杂，产率低，而且还会产生低活性的顺式异构体，同时伴随产生大量副产物，环境污染严重。 (3)微生物发酵生产维生素k2(mk
‑
7)，目前已经从纳豆中分离出纳豆芽孢杆菌，该菌不产生内毒素，是食品安全级菌种，该菌种适合在发酵罐中发酵生产。但该菌种的发酵单位很低，需要通过菌种选育筛选出高产菌种，并且配合恰当的发酵培养基配方和控制工艺来提高发酵单位，这样才能达到大规模工业化的生产标准。
技术实现要素：
5.针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种维生素k2(mk
‑
7)高产菌株及其筛选方法和利用其生产维生素k2(mk
‑
7)的方法，目的之一在于：选育出一株维生素k2(mk
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7)高产菌株，使其能够遗传稳定且能够高产维生素k2 (mk
‑
7)；目的之二在于：提供一种培养维生素k2(mk
‑
7)高产菌株的最优发酵培养基配方和控制工艺，该培养基配方和控制工艺有利于提高维生素 k2(mk
‑
7)高产菌株的发酵单位。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种维生素k2(mk
‑
7)高产菌株，命名为纳豆芽孢杆菌(bacillus subtilisnatto)bk21018，菌株保藏编号为cctcc m20211066，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(cctcc)，中国武汉，武汉大学，保藏日期为2021年8月23日。
8.纳豆芽孢杆菌(bacillus subtilis natto)bk21018的微生物学特征如下：
9.单菌落的形态为：菌落呈黄白色、圆形、中间凸起、菌落具有规则褶皱，显微镜下芽
孢呈椭圆形。
10.上述维生素k2(mk
‑
7)高产菌株的筛选方法为利用亚硝基胍诱变，并通过摇瓶筛选，具体步骤如下：
11.(a)纳豆芽孢杆菌菌悬液制备：出发菌株为纳豆芽孢杆菌(bacillussubtilisnatto)bk09112(华北制药股份有限公司倍达分厂自有菌株)，将斜面菌体加无菌水利用接种环刮下来，转移至灭菌且含10个玻璃珠的250ml三角瓶中，再向该三角瓶中加入30ml蒸馏水，然后将该三角瓶放在摇床上200r/min振荡15min，将洗下来的菌体液转移到一个无菌的试管中备用，菌体浓度为107个/ml；
12.(b)亚硝基胍诱变：向菌液中加入终浓度为1.0g/l的亚硝基胍，30℃水浴处理10min，用pb缓冲液洗涤5次去除亚硝基胍残留；
13.(c)平皿分离：以出发菌株菌悬液作为对照组，将诱变后的菌悬液和对照组分别稀释10
‑3‑
10
‑5倍后涂布在lb培养基上，在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％条件下避光培养1
‑
2天；
14.(d)高产菌株筛选：挑取单菌落接种到lb斜面培养基上，在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％条件下避光培养1
‑
2天，斜面菌种成熟后进行摇瓶初筛，将斜面挖块儿接种到30
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40ml种子培养基摇瓶中，在37
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0.5℃、相对湿度40％
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60％、220rpm的条件下培养15
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20小时，菌种成熟后将其接种到30
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40ml发酵培养基摇瓶中，在37
±
0.5℃、相对湿度40％
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60％、220rpm的条件下培养6
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8天，得到发酵液，利用hplc法测定各发酵液中维生素k2(mk
‑
7)的效价，效价高于对照20％的发酵液所对应的菌株进行摇瓶复试，复试过程同初筛，复试和初筛发酵液中维生素k2(mk
‑
7)效价最高的发酵液对应的菌株即为纳豆芽孢杆菌(bacillussubtilisnatto)bk21018。
15.进一步，步骤(c)和步骤(d)中所述lb培养基按质量体积比计算，成分为：0.5％酵母提取物，1.0％胰蛋白胨，0.5％氯化钠，1.5％琼脂，用蒸馏水配制，ph值为7.0
±
0.2。
16.进一步，步骤(d)中所述种子培养基按质量体积比计算，成分为：0.5
‑
1.5％甘油，0.2
‑
1.0％酵母粉，0.2
‑
1.0％大豆蛋白胨，用蒸馏水配制，ph值为7.0
±
0.2。
17.进一步，步骤(d)中所述发酵培养基按质量体积比计算，成分为：2
‑
8％甘油，0.2
‑
0.8％酵母粉，2
‑
10％大豆蛋白胨，01
‑
0.5％氯化钠，0.1％
‑
2％蔗糖，0.001％
‑
0.1％烟酰胺，0.001％
‑
0.1％天冬氨酸，用蒸馏水配制，ph值为7.0
±
0.2。
18.本发明还提供了利用上述维生素k2(mk
‑
7)高产菌株发酵生产维生素k2(mk
‑
7)的方法，具体步骤如下：
19.(1)将纳豆芽孢杆菌(bacillussubtilisnatto)bk21018菌株接种到lb培养基中，并在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％条件下避光培养1
‑
2天，斜面成熟后4℃保藏；
20.(2)将斜面接种到种子罐培养基中，并在37
±
0.5℃、200
‑
300rpm、通气比1:1.0
‑
1:1.2的条件下培养12
‑
18小时，待菌体离心量达到3％后发酵用种子即为长好；
21.(3)将长好的种子接种到发酵罐培养基中，在37
±
0.5℃、200
‑
350rpm、通气比1:1.0
‑
1:1.5的条件下培养6
‑
8天，即可制得维生素k2(mk
‑
7)发酵液。
22.进一步，步骤(1)中所述lb培养基按质量体积比计算，成分为：0.5％酵母提取物，1.0％胰蛋白胨，0.5％氯化钠，1.5％琼脂，用蒸馏水配制，ph值为7.0
±
0.2。
23.进一步，步骤(2)中所述种子培养基按质量体积比计算，成分为：0.5
‑
1.5％甘油，
0.2
‑
1.0％酵母粉，0.2
‑
1.0％大豆蛋白胨，用自来水配制，ph值为7.0
±
0.2。
24.进一步，步骤(3)中所述发酵培养基按质量体积比计算，成分为：2
‑
8％甘油，0.2
‑
0.8％酵母粉，2
‑
10％大豆蛋白胨，01
‑
0.5％氯化钠，0.1％
‑
2％蔗糖，0.001％
‑
0.1％烟酰胺，0.001％
‑
0.1％天冬氨酸，用自来水配制，ph值为7.0
±
0.2。
25.进一步，步骤(3)中所述培养的操作还包括：发酵过程中补入无菌的40％的甘油，甘油含量控制在0.1
‑
10mg/ml；
26.发酵过程中补入无菌的大豆蛋白胨，氨基氮含量控制在1
‑
5mg/ml；
27.发酵培罐运行至24h后每12h向罐中补入终浓度为0.005％
‑
0.01％烟酰胺；补入10％氢氧化钠溶液，ph值为6.2
‑
6.7。
28.本发明的有益效果在于：
29.本发明采用亚硝基胍诱变的方法，筛选到纳豆芽孢杆菌(bacillussubtilisnatto)bk21018，该菌株具有摇瓶效价高，传代稳定性良好等特点。
30.纳豆芽孢杆菌bk21018用于发酵时，配合最优发酵培养基和控制工艺，其发酵单位可以达到240mg/l(以mk
‑
7计算)以上，与出发菌株相比提高了243％，大幅度提高维生素k2(mk
‑
7)的发酵单位。该菌株可以有效的提高维生素k2(mk
‑
7)的产量，明显降低发酵用的原材料、水、电和蒸汽等成本，减少单位产量的污染排放，具有较高的经济效益。
具体实施方式
31.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.实施例1
33.维生素k2(mk
‑
7)高产菌株的筛选
34.1.1、培养基的制备
35.lb培养基制备：称取5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，5g氯化钠，15g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml，然后用质量分数为30％的氢氧化钠溶液调节ph至7.0
±
0.2，分装置至若干试管中，121℃下灭菌20min，灭菌完成后铺成斜面，凝固后得到斜面培养基，将灭菌后的lb培养基倒至平皿中得到lb培养基。
36.种子培养基制备：称取10g甘油，5g酵母粉，10g大豆蛋白胨，蒸馏水定容至1000ml，然后用质量分数为30％的氢氧化钠溶液调节ph至7.0
±
0.2，每个250ml三角瓶分装30ml种子培养基，8层纱布封口，121℃下灭菌20min，冷却后得种子培养基。
37.发酵培养基制备：称取180g甘油，15g酵母粉，240g大豆蛋白胨，7.5g氯化钠，30g蔗糖，0.06g烟酰胺，0.06g天冬氨酸，蒸馏水定容至3000ml，然后用质量分数为30％的氢氧化钠溶液调节ph至7.0
±
0.2，每个250ml三角瓶分装30ml发酵培养基，8层纱布封口，121℃下灭菌20min，冷却后得发酵培养基。
38.1.2、维生素k2(mk
‑
7)高产菌株筛选的操作步骤如下：
39.(a)纳豆芽孢杆菌菌悬液制备：出发菌株为纳豆芽孢杆菌bk09112(华北制药股份有限公司倍达分厂自有菌株)，将一支斜面菌体加无菌水利用接种环刮下来，转移至灭菌的
250ml三角瓶中(含10个玻璃珠)，再向该三角瓶中加入30ml蒸馏水，然后将该三角瓶放在摇床上200r/min振荡15分钟，将洗下来的菌体液转移到一个无菌的试管中备用，菌体浓度为107个/ml。
40.(b)亚硝基胍诱变：向菌液中加入终浓度为1.0g/l的亚硝基胍，30℃水浴处理10min。用pb缓冲液洗涤5次去除亚硝基胍残留。
41.(c)平皿分离：以出发菌株菌悬液为对照组，将诱变后的菌悬液和对照组分别稀释10
‑3‑
10
‑5倍后涂布在lb培养皿上，在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％条件下避光培养1天。
42.(d)高产菌株筛选：挑取单菌落接种到lb斜面培养基上，在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％条件下避光培养1天，斜面菌种成熟后进行摇瓶初筛，将斜面挖块儿接种到30ml种子培养基摇瓶中，在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％、 220rpm的条件下培养17小时，菌种成熟后将其接种到30ml发酵培养基摇瓶中，在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％、220rpm的条件下培养7天，得到发酵液，利用hplc法测定各发酵液中维生素k2(mk
‑
7)的效价，效价高于对照20％的发酵液所对应的菌株进行摇瓶复试，复试过程同初筛，初筛和复试发酵液中最高维生素k2(mk
‑
7)效价为228mg/l和239mg/l，对应的菌株命名为纳豆芽孢杆菌bk21018。
43.(e)bk21018菌株超低温冷冻保藏：向保存有bk21018菌株的斜面中加入10ml含有20％甘油的无菌水溶液，用接种环将孢子刮下，混匀后用吸管分装至冷冻管中(1ml/支)，注明菌株名称，制备时间和有效期，冷冻至超低温冰箱中。
44.实施例2
45.维生素k2(mk
‑
7)高产菌株的遗传稳定性考察
46.(1)取实施例1中保藏的纳豆芽孢杆菌bk21018接种于实施例1制备的斜面培养基，在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％条件下避光培养2天，斜面菌种成熟后将其再次接种于斜面培养基中进行培养，重复四次；
47.(2)将步骤(1)中五次培养出的菌株分别各自转接至实施例1制备的种子培养基中，在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％、220rpm的条件下培养16 小时，菌种成熟后各自转至接实施例1制备的发酵培养基中，在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％、220rpm的条件下培养7天，制得五组含有维生素k2 (mk
‑
7)的发酵液；
48.(3)以hplc测定步骤(2)中发酵液中维生素k2(mk
‑
7)的效价，其结果依传代培养顺序依次为：232g/ml、239g/ml、231g/ml、236g/ml、 233g/ml。
49.由上结果可知，纳豆芽孢杆菌bk21018具有较好的传代稳定性。
50.实施例3
51.维生素k2(mk
‑
7)高产菌株发酵工艺控制
52.3.1、培养基的制备
53.种子罐培养基制备：称取100g甘油，100g酵母粉，100g大豆蛋白胨，用自来水配制定容至9l，然后用质量分数为30％的氢氧化钠溶液调节ph至 7.0
±
0.2，对种子罐进行实消，121℃下灭菌30min，利用循环水冷却，冷却后得10l种子培养基。
54.发酵罐培养基制备：称取3000g甘油，250g酵母粉，4000g大豆蛋白胨， 150g氯化钠，500g蔗糖，1g烟酰胺，1g天冬氨酸，用自来水定容至45l，然后用质量分数为30％的氢氧化钠溶液调节ph至7.0
±
0.2，对发酵罐进行实消， 121℃下灭菌30min，利用循环水冷却，冷却后得50l发酵培养基。
55.高产菌株发酵工艺控制：将bk21018菌株接种到lb培养基中，并在 37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％条件下避光培养1天，斜面成熟后将斜面接种到种子罐培养基中，并在37
±
0.5℃、230rpm、通气比1:1.0的条件下培养15 小时，待菌体离心量达到3％后将长好的种子接种到发酵罐培养基中，在 37
±
0.5℃、300rpm、通气比1:1.5的条件下培养7天。
56.3.2、纳豆芽孢杆菌bk21018发酵生产维生素k2(mk
‑
7)，步骤如下：
57.(1)将纳豆芽孢杆菌(bacillus subtilis natto)bk21018菌株接种到lb 培养基中，并在37
±
0.5℃、相对湿度40％
‑
60％条件下避光培养1
‑
2天，斜面成熟后4℃保藏；
58.(2)将斜面接种到种子罐培养基中，并在37
±
0.5℃、200
‑
300rpm、通气比1:1.0
‑
1:1.2的条件下培养12
‑
18小时，待菌体离心量达到3％后发酵用种子即为长好；
59.(3)将长好的种子接种到发酵罐培养基中，在37
±
0.5℃、200
‑
350rpm、通气比1:1.0
‑
1:1.5的条件下培养6
‑
8天，即可制得维生素k2(mk
‑
7)发酵液；发酵过程中补入无菌的40％的甘油，甘油含量控制在0.1
‑
10mg/ml；补入无菌的大豆蛋白胨，氨基氮含量控制在1
‑
5mg/ml；发酵培罐运行至24h后每12h 向罐中补入终浓度为0.005％
‑
0.01％烟酰胺；补入10％氢氧化钠溶液，将发酵罐的ph值控制在6.2
‑
6.7。
60.将上述工艺重复进行三次，取三次所得发酵液分别以hplc测定发酵液中维生素k2(mk
‑
7)的效价，测定结果依次为246g/ml、238g/ml、236g/ml，平均值为240g/ml。
61.实施例4
62.出发菌株对比实验
63.以纳豆芽孢杆菌bk21018的出发菌株bk09112号菌(华北制药股份有限公司倍达分厂自有菌株)为发酵菌株，采用实施例3的发酵罐控制条件进行三次平行实验发酵结束后hplc测定生素k2(mk
‑
7)发酵液中的效价，分别为75g/ml、63g/ml、69g/ml，平均值为70g/ml。
64.实施例5
65.发酵工艺优化对比实验
66.以纳豆芽孢杆菌bk21018为发酵菌株，采用实施例3的发酵罐控制条件进行三次平行实验，发酵培养基中不加入蔗糖，烟酰胺，天冬氨酸，发酵培罐运行过程中不向罐中补入烟酰胺。发酵结束后hplc测定生素k2(mk
‑
7) 发酵液中的效价，分别为167g/ml、155g/ml、149g/ml，平均值为157g/ml。
67.比较出发菌株发酵液的平均效价与实施例3的发酵液效价可知，与出发株相比本发明所述的纳豆芽孢杆菌bk21018菌株的维生素k2(mk
‑
7)发酵单位提高了243％。纳豆芽孢杆菌bk21018高产菌株，配合最优发酵配方和控制工艺，大幅提高了维生素k2(mk
‑
7)的发酵单位。该菌株和工艺可以用于正式生产，生产过程中可以明显降低发酵用的原材料、水、电和蒸汽等成本，减少单位产量的污染排放，具有较高的经济效益。
再多了解一些
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