一种核酸提取的裂解结合液及其提取方法与流程

1.本发明属于核酸提取技术领域，具体涉及一种用于核酸提取的裂解结合液及提取方法。


背景技术：

2.核酸提取在核酸分子检测领域是极其关键的一步。自1957年meselsonm等首次采用密度梯度离心法分离dna以来，报道了多种核酸提取方法，许多研究者在核酸的提取方法上进行了不懈的探索，对核酸的各种材料和试剂进行了改进，十二烷基磺酸钠、酚、脲和胍盐等各种试剂纷纷被应用到核酸提取实验中，各种用于核酸提取的商品化试剂盒也应运而生。这些固相法通常需采取数次快速离心、真空抽滤等步骤来实现分离，而且对于样本需求量大，耗费样品较多，不便于高通量、自动化操作，严重限制了在临床基因诊断领域的应用。随着分子生物学技术的发展，为满足高通量处理样本和获得高质量核酸的实验要求，核酸提取分离技术也更趋向于简便快捷、高质量、高纯度和高通量发展，核酸质量的好坏直接决定了后续实验的成败。近年来分子诊断技术快速发展，随着基因测序等技术的成熟，成本进一步降低，在临床上的应用也越来越普遍。分子诊断检测的样本类型多达数十种，而处理后产物适用的检测项目也涵盖了荧光定量pcr、基因测序、基因芯片、生物质谱等各类分子生物学技术平台。然而，无论是哪一类检测项目，准确的检验结果无疑依赖于高质量的标本及标本前处理过程。因此临床分子诊断自动化趋势将逐步在国内临床实验室成为主导，而自动化首先将在目前手工操作较普及且对结果影响最大的核酸提取上实现。采用磁珠提取法，核酸提取率和提取纯度主要受提取液的影响，如裂解液、结合液、洗涤液和洗脱液等，若提取样品的量和纯度不太高，不但不能有效的检出，甚至影响检测结果，甚至不能完全满足后续的实验要求。
3.作为携带遗传信息的重要物质，核酸通常存在于复杂的实际样品中，例如血液，细胞，粪便，树叶等等。这些样品中的核酸通常无法直接被用于分子生物学实验和检测，需要进一步的纯化以去除干扰物质才能进行下游的一些实验和分析。分离提取核酸的方法在文献中多有报道(e.g.chapter 2(dna)and chapter4(rna)of f.ausubeletal.,eds.,current protocols in molecular biology,wiley
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interscience,newyork,1993)。这些方法通常需要将样品在一定溶液中重悬并通过化学试剂或者酶的方法将细胞破裂，将核酸释放出来。这一过程称为裂解。释放出的核酸在溶液中会可逆的结合于吸附核酸的材料上。这些材料包括玻璃颗粒，玻璃纤维，磁珠，硅藻土，硅胶等，或者以上各种材料的变化或组合。高浓度的离液盐将有利于核酸结合到上述材料上。在接下来的步骤中，通过离心或者加入磁场等外界作用力，收集这些结合核酸的材料。这些结合核酸的材料接下来会被特定溶液洗涤，例如80％乙醇，以去除杂质。最后这些结合核酸的材料会被洗脱液处理并将核酸洗脱下来，一般是加热至60度并以重蒸水进行洗脱。以此原理为基础，研究者报道了大量的提取核酸的方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种核酸提取的裂解结合液，包括以下物质成分：5～500mm的tris
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hcl缓冲液、20～1000mm的多巴胺、100～400mm的三羟甲基氨基甲烷、50～200mm的异硫氰酸胍、0.4％～3％的三羟甲基氨基甲烷、0.02％～2％的壬基酚聚氧乙烯醚、0.03％～1.5％的聚氧乙烯壬基酚磷酸酯、0.1％～2％的烯丙基聚氧乙烯醚、0.05％～1.8％的聚丙二醇二缩水甘油醚、0.08％～4％的月桂酸单甘油酯、0.06％～3.5％的单乙酸甘油酯、余量为纯水。
5.进一步地，所述裂解结合液还包括4％～8％的磁珠。
6.进一步地，所述裂解结合液的ph值控制在6.5～7.0之间。
7.进一步地，所述磁珠为直径400～600nm的超顺磁性纳米微球。
8.其提取方法包括以下步骤：
9.s1：将上述裂解结合液和磁珠加入到离心管中，震荡混合均匀，然后加入待测样品，涡旋振荡均匀后，加热至40～80℃、离心。
10.s2：将步骤s1离心后的液体静置，取上清液加入到另一离心管中，加入酶、均匀，静置，然后加入磁珠，置于磁力架上吸附，去掉上清液。
11.s3：将洗涤液加入到上述离心管中，重复上述步骤s2一次。
12.s4：将离心管晾干后加入洗脱液，摇荡均匀，再次离心后取上清液待用。
13.进一步地，所述酶为核糖核酸酶。
14.进一步地，所述离心过程中离心速率控制在6000～12000rpm/min，离心时间控制在6～20min。
15.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
16.本发明中，核酸提取裂解结合液可以对样品进行边裂解、边吸附，减少了操作步骤，并且可以保证所提取的核酸纯度好，浓度高；并且本发明裂解结合液中的各个成分具有较好的协同作用，协同使用能够大幅提高提取出来的dna浓度质量。
具体实施方式
17.下面对本发明实施例作具体详细的说明，本实施例在本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
18.实施例1
19.一种核酸提取的裂解结合液的提取方法，包括以下物质成分：5mm的tris
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hcl缓冲液、20mm的多巴胺、100mm的三羟甲基氨基甲烷、50mm的异硫氰酸胍、0.4％的三羟甲基氨基甲烷、0.02％的壬基酚聚氧乙烯醚、0.03％的聚氧乙烯壬基酚磷酸酯、0.1％的烯丙基聚氧乙烯醚、0.05％的聚丙二醇二缩水甘油醚、0.08％的月桂酸单甘油酯、0.06％的单乙酸甘油酯、余量为纯水。
20.其中，所述裂解结合液还包括4％的磁珠，所述裂解结合液的ph值控制在6.5之间，所述磁珠为直径400nm的超顺磁性纳米微球。
21.其提取方法包括以下步骤：
22.s1：将上述裂解结合液和磁珠加入到离心管中，震荡混合均匀，然后加入待测样品，涡旋振荡均匀后，加热至40℃、离心。
23.s2：将步骤s1离心后的液体静置，取上清液加入到另一离心管中，加入核糖核酸酶、均匀，静置，然后加入磁珠，置于磁力架上吸附，去掉上清液。
24.s3：将洗涤液加入到上述离心管中，重复上述步骤s2一次。
25.s4：将离心管晾干后加入洗脱液，摇荡均匀，再次离心后取上清液待用；其中，所述离心过程中离心速率控制在6000rpm/min，离心时间控制在6min。
26.实施例2
27.一种核酸提取的裂解结合液的提取方法，包括以下物质成分：500mm的tris
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hcl缓冲液、1000mm的多巴胺、400mm的三羟甲基氨基甲烷、200mm的异硫氰酸胍、3％的三羟甲基氨基甲烷、2％的壬基酚聚氧乙烯醚、1.5％的聚氧乙烯壬基酚磷酸酯、2％的烯丙基聚氧乙烯醚、1.8％的聚丙二醇二缩水甘油醚、4％的月桂酸单甘油酯、3.5％的单乙酸甘油酯、余量为纯水。
28.其中，所述裂解结合液还包括8％的磁珠，所述裂解结合液的ph值控制在7.0之间，所述磁珠为直径600nm的超顺磁性纳米微球。
29.其提取方法包括以下步骤：
30.s1：将上述裂解结合液和磁珠加入到离心管中，震荡混合均匀，然后加入待测样品，涡旋振荡均匀后，加热至80℃、离心。
31.s2：将步骤s1离心后的液体静置，取上清液加入到另一离心管中，加入核糖核酸酶、均匀，静置，然后加入磁珠，置于磁力架上吸附，去掉上清液。
32.s3：将洗涤液加入到上述离心管中，重复上述步骤s2一次。
33.s4：将离心管晾干后加入洗脱液，摇荡均匀，再次离心后取上清液待用；其中，所述离心过程中离心速率控制在12000rpm/min，离心时间控制在20min。
34.实施例3
35.一种核酸提取的裂解结合液的提取方法，包括以下物质成分：200mm的tris
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hcl缓冲液、500mm的多巴胺、200mm的三羟甲基氨基甲烷、100mm的异硫氰酸胍、0.9％的三羟甲基氨基甲烷、0.6％的壬基酚聚氧乙烯醚、0.85％的聚氧乙烯壬基酚磷酸酯、0.8％的烯丙基聚氧乙烯醚、0.8％的聚丙二醇二缩水甘油醚、2.2％的月桂酸单甘油酯、1.2％的单乙酸甘油酯、余量为纯水。
36.其中，所述裂解结合液还包括5％的磁珠，所述裂解结合液的ph值控制在6.7之间，所述磁珠为直径500nm的超顺磁性纳米微球。
37.其提取方法包括以下步骤：
38.s1：将上述裂解结合液和磁珠加入到离心管中，震荡混合均匀，然后加入待测样品，涡旋振荡均匀后，加热至60℃、离心。
39.s2：将步骤s1离心后的液体静置，取上清液加入到另一离心管中，加入核糖核酸酶、均匀，静置，然后加入磁珠，置于磁力架上吸附，去掉上清液。
40.s3：将洗涤液加入到上述离心管中，重复上述步骤s2一次。
41.s4：将离心管晾干后加入洗脱液，摇荡均匀，再次离心后取上清液待用；其中，所述离心过程中离心速率控制在8000rpm/min，离心时间控制在10min。
42.实施例4
43.一种核酸提取的裂解结合液的提取方法，包括以下物质成分：400mm的tris
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hcl缓冲液、800mm的多巴胺、300mm的三羟甲基氨基甲烷、150mm的异硫氰酸胍、2.6％的三羟甲基氨基甲烷、1.8％的壬基酚聚氧乙烯醚、1.3％的聚氧乙烯壬基酚磷酸酯、1.8％的烯丙基聚氧乙烯醚、1.5％的聚丙二醇二缩水甘油醚、3.5％的月桂酸单甘油酯、3.2％的单乙酸甘油酯、余量为纯水。
44.其中，所述裂解结合液还包括7％的磁珠，所述裂解结合液的ph值控制在6.8之间，所述磁珠为直径550nm的超顺磁性纳米微球。
45.其提取方法包括以下步骤：
46.s1：将上述裂解结合液和磁珠加入到离心管中，震荡混合均匀，然后加入待测样品，涡旋振荡均匀后，加热至70℃、离心。
47.s2：将步骤s1离心后的液体静置，取上清液加入到另一离心管中，加入核糖核酸酶、均匀，静置，然后加入磁珠，置于磁力架上吸附，去掉上清液。
48.s3：将洗涤液加入到上述离心管中，重复上述步骤s2一次。
49.s4：将离心管晾干后加入洗脱液，摇荡均匀，再次离心后取上清液待用；其中，所述离心过程中离心速率控制在10000rpm/min，离心时间控制在15min。
50.实验例
51.选取同样的粪便样品，将实施例1～4样品检测同一批样本提取出的dna浓度质量，结果如下表1：
52.表1.测试结果：
[0053][0054]
从表1中可以看出，本发明实施例1～4的裂解结合液具有优异的dna质量浓度。