一种检测喉鳞癌放疗敏感性相关基因ATM和ATR基因突变的试剂盒及其应用的制作方法

一种检测喉鳞癌放疗敏感性相关基因atm和atr基因突变的试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子诊断技术领域，具体地说，是一种检测喉鳞癌放疗敏感性相关基因atm和atr基因突变的试剂盒及其应用。


背景技术：

2.喉癌是头颈部的高发肿瘤，而鳞状细胞癌是其最常见的病理类型。放疗是喉鳞癌的主要治疗方法之一，对于大部分喉鳞癌患者都有着十分良好的治疗作用。但在部分喉癌患者中，放疗的效果不佳。如果能尽早判断患者肿瘤的放疗敏感性，可以准确地判断患者是否适合进行放疗，从而指导临床实践，并且极大地提升患者预后，减少患者不必要的花费以及医疗资源的浪费。
3.atm(ataxia telangiectasia
‑
mutated)和atr(atm and rad3 related)在dna损伤修复中处于顶端最为关键的位置，而dna损伤修复是放射线对肿瘤细胞杀伤作用的关键影响因素。atm、atr具有磷酸化激酶活性，在细胞放射损伤时感受dna链断裂而表达上升并迅速活化，作用于下游靶蛋白相应位点，进而导致细胞周期阻滞和dna修复。atm或者atr存在突变时，细胞无法及时修复放疗损伤的dna，因而放疗敏感性更高。检测atm、atr相关突变，对于判断患者是否适合接受放疗有着重要的意义。
4.本发明中所采用的检测喉鳞癌中atm/atr基因突变的具体方法和试剂盒目前还未见报道。目前喉鳞癌atm、atr基因突变的检测并非临床常规项目，单独检测价格昂贵，开发新的检测试剂盒有着较大的研究价值。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种检测喉鳞癌放疗敏感性相关基因atm和atr基因突变的试剂盒及其应用。
6.第一方面，本发明提供了检测vstm2l,tspan8,rdh10,prodh,pitx2,odc1,masp1,klhdc8a,gprc5d,ctag2,ccl26和abca13基因或蛋白表达量的试剂在制备预测喉鳞癌个体或样本是否存在atm和/或atr基因突变的试剂盒中的应用。
7.作为一个优选例，所述检测vstm2l,tspan8,rdh10,prodh,pitx2,odc1,masp1,klhdc8a,gprc5d,ctag2,ccl26和abca13基因或蛋白表达量的试剂为基因特异性引物、基因特异性探针或抗体。
8.作为另一优选例，所述试剂盒包含操作说明书，所述操作说明书记载有以下内容：
9.检测来自喉鳞癌个体的肿瘤组织样本中的vstm2l,tspan8,rdh10,prodh,pitx2,odc1,masp1,klhdc8a,gprc5d,ctag2,ccl26和abca13基因表达量的log2(fpkm 1)值；
10.将以上值代入评分模型score＝(
‑
0.7519
×
vstm2l) (
‑
0.7602
×
tspan8) (0.1142
×
rdh10) (0.1816
×
prodh) (0.3597
×
pitx2) (0.0034
×
odc1) (
‑
0.3224
×
masp1) (0.4007
×
klhdc8a) (0.0877
×
gprc5d) (0.1375
×
ctag2) (
‑
0.9765
×
ccl26)
(0.4486
×
abca13) 7.047，计算评分；
11.如评分score≥0时，认为所述喉鳞癌个体或样本不存在atm和/或atr基因突变；当评分score<0时，代表所述喉鳞癌个体或样本存在atm和/或atr基因突变。
12.第二方面，本发明提供了检测vstm2l,tspan8,rdh10,prodh,pitx2,odc1,masp1,klhdc8a,gprc5d,ctag2,ccl26和abca13基因或蛋白表达量的试剂在制备预测喉鳞癌个体放疗敏感性的试剂盒中的应用。
13.作为一个优选例，所述检测vstm2l,tspan8,rdh10,prodh,pitx2,odc1,masp1,klhdc8a,gprc5d,ctag2,ccl26和abca13基因或蛋白表达量的试剂为基因特异性引物、基因特异性探针或抗体。
14.作为另一优选例，所述试剂盒包含操作说明书，所述操作说明书记载有以下内容：
15.检测来自喉鳞癌个体的肿瘤组织样本中的vstm2l,tspan8,rdh10,prodh,pitx2,odc1,masp1,klhdc8a,gprc5d,ctag2,ccl26和abca13基因表达量的log2(fpkm 1)值；
16.将以上值代入评分模型score＝(
‑
0.7519
×
vstm2l) (
‑
0.7602
×
tspan8) (0.1142
×
rdh10) (0.1816
×
prodh) (0.3597
×
pitx2) (0.0034
×
odc1) (
‑
0.3224
×
masp1) (0.4007
×
klhdc8a) (0.0877
×
gprc5d) (0.1375
×
ctag2) (
‑
0.9765
×
ccl26) (0.4486
×
abca13) 7.047，计算评分；
17.如评分score≥0时，认为所述喉鳞癌个体对放疗敏感；当评分score<0时，代表所述喉鳞癌个体对放疗不敏感。
18.第三方面，本发明提供了一种预测喉鳞癌个体或样本是否存在atm和/或atr基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由检测vstm2l,tspan8,rdh10,prodh,pitx2,odc1,masp1,klhdc8a,gprc5d,ctag2,ccl26和abca13基因或蛋白表达量的试剂组成。
19.作为一个优选例，所述检测vstm2l,tspan8,rdh10,prodh,pitx2,odc1,masp1,klhdc8a,gprc5d,ctag2,ccl26和abca13基因或蛋白表达量的试剂为基因特异性引物、基因特异性探针或抗体。
20.作为另一优选例，所述试剂盒包含操作说明书，所述操作说明书记载有以下内容：
21.检测喉鳞癌个体或样本中的vstm2l,tspan8,rdh10,prodh,pitx2,odc1,masp1,klhdc8a,gprc5d,ctag2,ccl26和abca13基因表达量的log2(fpkm 1)值；
22.将以上值代入评分模型score＝(
‑
0.7519
×
vstm2l) (
‑
0.7602
×
tspan8) (0.1142
×
rdh10) (0.1816
×
prodh) (0.3597
×
pitx2) (0.0034
×
odc1) (
‑
0.3224
×
masp1) (0.4007
×
klhdc8a) (0.0877
×
gprc5d) (0.1375
×
ctag2) (
‑
0.9765
×
ccl26) (0.4486
×
abca13) 7.047，计算评分；
23.如评分score≥0时，认为所述喉鳞癌个体或样本不存在atm和/或atr基因突变，所述喉鳞癌个体对放疗敏感；当评分score<0时，代表所述喉鳞癌个体或样本存在atm和/或atr基因突变，所述喉鳞癌个体对放疗不敏感。
24.第四方面，本发明提供了一种预测喉鳞癌个体放疗敏感性的试剂盒，所述试剂盒由检测vstm2l,tspan8,rdh10,prodh,pitx2,odc1,masp1,klhdc8a,gprc5d,ctag2,ccl26和abca13基因或蛋白表达量的试剂组成。
25.作为一个优选例，所述检测vstm2l,tspan8,rdh10,prodh,pitx2,odc1,masp1,klhdc8a,gprc5d,ctag2,ccl26和abca13基因或蛋白表达量的试剂为基因特异性引物、基因
特异性探针或抗体。
26.作为另一优选例，所述试剂盒包含操作说明书，所述操作说明书记载有以下内容：
27.检测喉鳞癌个体或样本中的vstm2l,tspan8,rdh10,prodh,pitx2,odc1,masp1,klhdc8a,gprc5d,ctag2,ccl26和abca13基因表达量的log2(fpkm 1)值；
28.将以上值代入评分模型score＝(
‑
0.7519
×
vstm2l) (
‑
0.7602
×
tspan8) (0.1142
×
rdh10) (0.1816
×
prodh) (0.3597
×
pitx2) (0.0034
×
odc1) (
‑
0.3224
×
masp1) (0.4007
×
klhdc8a) (0.0877
×
gprc5d) (0.1375
×
ctag2) (
‑
0.9765
×
ccl26) (0.4486
×
abca13) 7.047，计算评分；
29.如评分score≥0时，认为所述喉鳞癌个体或样本不存在atm和/或atr基因突变，所述喉鳞癌个体对放疗敏感；当评分score<0时，代表所述喉鳞癌个体或样本存在atm和/或atr基因突变，所述喉鳞癌个体对放疗不敏感。
30.本文中，相关的基因可参考genebank，所述“vstm2l”基因可参考gene id:128434；“tspan8”基因可参考gene id:7103；“rdh10”基因可参考gene id:157506；“prodh”基因可参考gene id:5625；“pitx2”基因可参考gene id:5308；“odc1”基因可参考gene id:4953；“masp1”基因可参考gene id:5648；“klhdc8a”基因可参考gene id:55220；“gprc5d”基因可参考gene id:55507；“ctag2”基因可参考gene id:30848；“ccl26”基因可参考gene id:10344；“abca13”基因可参考gene id:154664。
31.本发明优点在于：
32.1、本发明首次提出了vstm2l,tspan8,rdh10,prodh,pitx2,odc1,masp1,klhdc8a,gprc5d,ctag2,ccl26和abca13基因或蛋白组合物可用于检测喉鳞癌患者肿瘤组织中放疗敏感性相关基因atm/atr的突变，可以有效指导喉鳞癌患者的个体化治疗，提高临床获益，同时避免不必要的医疗资源浪费。
33.2、atm/atr基因突变目前在临床上属于非常规检测项目，单独检测上述基因突变费用较高。本发明可通过临床上已广泛应用的rna测序技术判定喉鳞癌患者是否存在上述基因突变，具有经济实惠，准确性高、灵敏度和特异性好的优点。
附图说明
34.附图1是该预测模型的受试者工作特性曲线(roc)。
35.附图2是tcga数据库分析得到的184个差异基因。
具体实施方式
36.下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
37.实施例1喉鳞癌atm/atr突变的评分模型构建
38.1.方法
39.我们首先从tcga数据库中获得111个喉鳞癌样本数据，根据是否存在atm或atr基因突变将样本分为突变组(n＝11)和野生组(n＝100)，进而计算并筛选出184个差异基因。通过对111个样本的上述184个差异基因的表达量数据[log2(fpkm 1)形式]进行lasso回归分析，我们得到了与atm/atr基因突变显著相关的12个基因为：vstm2l,tspan8,rdh10,prodh,pitx2,odc1,masp1,klhdc8a,gprc5d,ctag2,ccl26,abca13。
[0040]
通过二分类logistic回归构建评分模型(
‑
0.7519
×
vstm2l) (
‑
0.7602
×
tspan8) (0.1142
×
rdh10) (0.1816
×
prodh) (0.3597
×
pitx2) (0.0034
×
odc1) (
‑
0.3224
×
masp1) (0.4007
×
klhdc8a) (0.0877
×
gprc5d) (0.1375
×
ctag2) (
‑
0.9765
×
ccl26) (0.4486
×
abca13)。
[0041]
我们基于该评分模型计算每个样本的得分，通过roc曲线获取最佳阈值点，为
‑
7.047。将这一数值整合在评分模型中，得到最终的评分模型score＝(
‑
0.7519
×
vstm2l) (
‑
0.7602
×
tspan8) (0.1142
×
rdh10) (0.1816
×
prodh) (0.3597
×
pitx2) (0.0034
×
odc1) (
‑
0.3224
×
masp1) (0.4007
×
klhdc8a) (0.0877
×
gprc5d) (0.1375
×
ctag2) (
‑
0.9765
×
ccl26) (0.4486
×
abca13) 7.047。
[0042]
根据评分模型将tcga样本分为两组，评分高于0归于野生组，评分低于0归于突变组。
[0043]
实验结果表明：该预测模型灵敏度为0.909，特异度为0.960。
[0044]
实施例2效果验证
[0045]
将复旦大学附属眼耳鼻喉科医院收集的50例喉鳞癌癌样本进行rna测序并检测了atm/atr基因突变。将rna表达数据代入实施例1的预测模型得到每个样本的score评分，当检测样本评分score≥0时，认为该样本不存在atm或atr基因突变；当检测样本评分score<0时，代表该样本存在atm或atr基因突变。实验结果表明：该预测模型灵敏度为0.888，特异度为0.927。
[0046]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。