成像系统硬件1.相关申请的交叉引用2.本技术要求2018年12月10日提交的美国临时专利申请号62/777,521，2018年12月13日提交的美国临时专利申请号62/779,342，2018年12月13日提交的美国临时专利申请号62/779,348，2019年1月6日提交的美国临时专利申请62/788,867，2019年1月6日提交的美国临时专利申请号62/788,871，2019年1月6日提交的美国临时专利申请号62/788,885，2019年1月6日提交的美国临时专利申请号62/788,897，2019年1月6日提交的美国临时专利申请号62/788,905，2019年1月6日提交的美国临时专利申请号62/788,906，2019年2月27日提交的美国临时专利申请号62/811,495，2019年2月28日提交的美国临时专利申请号62/812,219，2019年3月15日提交的美国临时专利申请号62/819,439，2019年3月15日提交的美国临时专利申请号62/819,444，2019年3月15日提交的美国临时专利申请号62/819,448，2019年3月15日提交的美国临时专利申请号62/819,449，2019年3月15日提交的美国临时专利申请号62/819,453，2019年3月15日提交的美国临时专利申请号62/819,456，2019年3月15日提交的美国临时专利申请.62/819,458，2019年3月15日提交的美国临时专利申请第62/819,467，2019年3月15日提交的美国临时专利申请第62/819,468，2019年3月15日提交的美国临时专利申请第62/819,470，2019年3月15日提交的美国临时专利申请号62/819,477，2019年3月15日提交的美国临时专利申请号62/819,478，2019年3月15日提交的美国临时专利申请号62/819,486，2019年3月15日提交的美国临时专利申请号62/819,495，2019年3月15日提交的美国临时专利申请号62/819,496，2019年3月22日提交的美国临时专利申请号62/822,554，2019年3月22日提交的美国临时专利申请号62/822,565，2019年3月22日提交的美国临时专利申请号62/822,566，2019年3月22日提交的美国临时专利申请号62/822,575，2019年3月22日提交的美国临时专利申请号62/822,592，2019年3月22日提交的美国临时专利申请号62/822,605，2019年3月22日提交的美国临时专利申请号62/822,606，2019年3月22日提交的美国临时专利申请号62/822,610，2019年3月22日提交的美国临时专利申请号62/822,618，2019年3月22日提交的美国临时专利申请号62/822,622，2019年3月22日提交的美国临时专利申请号62/822,627，2019年3月22日提交的美国临时专利申请号62/822,632，2019年3月22日提交的美国临时专利申请号62/822,649，2019年3月22日提交的美国临时专利申请号62/822,680，2019年3月22日提交的美国临时专利申请号62/822,722，2019年4月26日提交的美国临时专利申请号62/839,212，2019年4月26日提交的美国临时专利申请号62/839,219，2019年4月26日提交的美国临时专利申请号62/839,223，2019年4月26日提交的美国临时专利申请号62/839,264，2019年4月26日提交的美国临时专利申请号62/839,294，2019年4月26日提交的美国临时专利申请号62/839,320，2019年4月26日提交的美国临时专利申请号62/839,346，2019年4月26日提交的美国临时专利申请号62/839,526，2019年4月26日提交的美国临时专利申请号62/839,575，2019年5月2日提交的美国临时专利申请号62/842,463，2019年6月7日提交的美国临时专利申请号62/858,331，2019年6月13日提交的美国临时专利申请62/860,993，2019年10月22日提交的美国临时专利申请62/924,241，2019年10月24日提交的美国临时专利申请62/925,578，2019年10月24日提交的美国临时专利申请号62/925,550，2019年11月6日提交的美国临时专利申请号62/931,779，2019年11月6日提交的美国临时专利申请号62/931,587，2019年11月8日提交的美国临时专利申请号62/933,318，2019年11月8日提交的美国临时专利申请号62/933,299，2019年11月11日提交的美国临时专利申请号62/933,878，2019年11月12日提交的美国临时专利申请号62/934,356，2019年11月13日提交的美国临时专利申请号62/934,766，2019年11月13日提交的美国临时专利申请号62/934,883，2019年11月13日提交的美国临时专利申请62/935,043，2019年11月19日提交的美国临时专利申请62/937,668，2019年11月22日提交的美国临时专利申请62/939,488，和2019年11月27日提交的美国临时专利申请号62/941,581的优先权。3.这些申请各自的内容通过引用其全文的方式纳入本文。
背景技术：
：：4.对象组织内的细胞由于不同细胞内的不同分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)而在细胞形态和/或功能上存在差异。细胞在组织内的特定位置(例如，细胞相对于邻近细胞的位置或细胞相对于组织微环境的位置)可以影响，例如，细胞的形态、分化、命运、活力、增殖、行为以及与组织中其它细胞的信号转导和串扰。5.空间异质性先前被研究过，所述研究使用的技术仅提供完整组织或部分组织接触中的少量分析物的数据，或提供单细胞的大量分析物数据，但无法提供有关单细胞在母体生物样品(例如，组织样品)中位置的信息。6.此外，用于空间分析物数据的成像系统在分辨率和灵敏度方面具有固有的变化性。这在很大程度上归因于除成像设备的布置、各种类型的成像设备之间的差异以及各种图像采集软件之外，成像系统组件的制造商的变化性。图像质量还受到用户执行的图像采集的变化的影响。当尝试对未知荧光强度的样品进行成像或由不同经验的用户对样品进行成像时，这个问题变得更加明显。7.此外，在实验室环境中，使用各种处理方案来制备用于分析的样品。这些方案可以在试管中、在载玻片上，或更一般地，在由基材支持的样品上进行。某些方案在稳定、受控的温度下进行，以确保样品和方案试剂的保真度。其它方案涉及温度循环和其它步骤，其中以受控方式调整样品的温度。为了在方案进行期间加热样品及其支持性基材，可以使用热循环仪、加热板或其它加热装置。例如，热循环仪可以作为聚合酶链反应方案的一部分用于核酸扩增以及转录和逆转录分析序列。例如，还可以在热循环仪和其它加热装置中对样品进行受控加热，以促进用于限制酶消化和快速诊断的温度敏感反应。8.此外，可以将生物样品放置在固体支持物上以进行分析，以鉴定或表征样品内的分析物，例如dna、rna或其它遗传物质。印刷的指示可有助于改善样品在固体支持物上的放置。技术实现要素：9.用于评估成像设备和成像系统的质量和分辨率的控制载玻片、方法和系统可以使用多种基材来实现。如本文所用，术语“基材”是指具有表面的支持物(例如，载玻片、水凝胶、膜、层、多孔膜、流动池、固体材料等)。10.如本文所用的“基材”，当前面没有修饰语“化学”或“序列分析”时，是指具有至少一个表面的构件，该表面通常起到为本文所述的生物样品、分析物和/或任何其它化学和/或物理部分、试剂和结构提供物理支持。基材可由多种固体材料、凝胶基材料、胶体材料、半固体材料(例如，至少部分交联的材料)、完全或部分固化的材料和经历相变或过渡的材料形成以提供物理支持。可用于本文所述的方法和系统的基材的示例包括但不限于载玻片(例如由各种玻璃形成的载玻片、由各种聚合物形成的载玻片)、水凝胶、层和/或薄膜，膜(例如多孔膜)、流动池、比色皿、晶片、板。在一些实施方式中，基材可以任选地包括功能元件，例如凹槽、突出结构、微流体元件(例如，通道、储器、电极、阀、密封件)和各种标识，如下文将进一步详细讨论的那些。11.在本节中，描述了此类基材的示例和使用此类基材的方法。然而，应当理解，一般来说，本文讨论的各种步骤和技术可以使用各种不同的装置和系统组件来进行，并非所有这些都被明确地阐述。12.此外，本公开的各种实施方式涉及控制载玻片(controlslide)和相关基材、使用控制载玻片的方法以及优选地意在用于评估图像质量和/或分辨率的控制载玻片系统。更具体地，实施方式包括控制载玻片及其基材、方法和系统以测试和评估空间基因表达技术中使用的成像系统的质量和/或分辨率。在一些实施方式中，本文提供的控制载玻片的明显优势在于其可用于在对样品进行成像和/或分析之前评估成像系统的可行性(viability)。例如，成像系统可能足以或可能不足以以预定或要求的分辨率检测样品。可以在处理样品之前对与本公开一致的控制载玻片或基材成像以确定成像系统是否提供足够的分辨率。又例如，传统的成像采集方法(例如，在空间基因表达技术中)除了通过对样品进行成像和/或分析之外可能没有其它方法来验证分辨率，这可能相当昂贵且低效。换言之，例如，获得空间基因表达图像的常规方法无法使用户在对样品进行成像和分析之前验证图像的分辨率和/或质量。但是与本公开的实施方式一致的控制载玻片和/或基材在这种情况下可能更高效，因为它可以允许用户定性和/或定量地评估他们的成像系统的兼容性并优化他们的图像采集而不浪费实验资源。这种控制载玻片和/或基材将适于测试和/或校准各种成像设备和系统，包括不涉及空间基因表达成像和分析的系统。13.在一些实施方式中，本文提供的控制载玻片和基材的附加优点是它为用户提供成像能力以评估具有多于一种组织化学染色和/或多于一种荧光染色的样品的图像质量。例如，用户可能有包含两个或更多个荧光团的样品。因此，通过同时对包含两个或更多个荧光标志物的一个基材进行成像，用户可以评估成像系统的图像质量并对所有荧光通道的参数进行任何必要的调整。即，成像能力可以是成像设备对样品充分成像的能力。在一些实施方式中，基材的附加优点在于它通过多个基准标志物和图示符(glyph)为用户提供对基材区域的快速参考。例如，利用空间基因表达方法中使用的显微镜载玻片(例如，具有空间条码化阵列的显微镜载玻片)的用户可能能够在图像处理过程中高效地将基材区域与显微镜载玻片中的感兴趣区域(例如，包含空间条码化阵列或样品的区域)对准。因此，用户能够正确地将样品区域和/或阵列区域与基材的基材区域对准。此外，多个基准标志物允许快速识别方向和载玻片放置。因此，本公开范围内的控制载玻片和基材能够减少实验时间并改进成像系统的校准。此外，通过与基因表达载玻片匹配的基准点(fiducial)的排列和定位，用户可以使用控制载玻片作为图像采集自动化的参考。14.本文提供的装置可以为基材表面提供一致且均匀的加热。均匀加热对于确保在基材支持的样品上进行的制备反应根据既定的方案发生并达到预期的结果也至关重要。15.此外，如果在没有上盖(upperlid)的情况下加热基材，则加热至高于室温的温度会导致在封闭的基材孔的上表面上形成冷凝。冷凝会改变基材孔中反应混合物的组成，抑制制备反应和/或产生不可预测的结果。本公开中描述的装置可用于减少或防止在基材孔中形成冷凝。16.某些类型的热循环仪和加热装置是专门为特定类型的基材(例如多孔基材)构建的。将其它类型的基材(例如标准显微镜载玻片)装入此类设备会导致基材加热不均匀。本公开中描述的装置可用于在并非为此类基材设计的加热装置内支持基材，确保对基材进行充分且均匀的热传递。具体地，这些装置可用于调整设计为接受多孔基材的热循环仪，以便其它类型的基材可以在热循环仪内有效加热，作为样品制备方案的部分。17.在一些实施方式中，本公开的装置允许基材的表面直接接触加热装置(例如，热循环仪)的表面，从而允许遍及基材的均匀加热。即，在一些实施方式中，不需要将其它基材或外壳元件定位在热源和待加热的基材之间。此外，由于本发明的装置允许基材的表面直接接触加热装置(例如热循环仪)的表面，因此用户可以更容易地控制基材的温度，并且，与使用不允许基材和加热装置(例如，热循环仪)之间的表面接触的装置相比，可以将基材的温度在更短的时间内加热到所需温度。因此，基材上的样品(例如，生物样品)可以被均匀且受控地加热。18.在一些实施方式中，所描述的装置的另一个优点是它们的设计可以是便于设置并减少用户在组装装置和基材时所花费的时间的一件式设计(one‑piecedesign)。在一些实施方式中，用户可以容易地将基材插入到所述装置中而无需固定多个部件。例如，用户可以使用单个可选工具，例如刀片，来帮助将基材插入装置中或帮助将基材从装置中移出。在一些实施方式中，用户不使用任何工具来帮助将基材插入装置中或帮助从装置中移出基材。19.在一些实施方式中，装置可以是可在使用后丢弃的一次性装置，从而防止由基材支持的样品(例如，生物样品)的任何污染或无菌性问题。例如，可以为用户对装置进行消毒和预包装，以降低样品污染的风险。20.本公开进一步描述了用于保持或支持基材的装置。特别地，所描述的装置包括分别接收第一和第二基材的第一和第二构件。在一些实施方式中，本公开的装置可用于将第一和第二基材夹在一起以用于空间转录组学应用。在一些实施方式中，第一基材可在其表面上支持样品(例如，生物基材)。在一些实施方式中，第二基材可包括多个条码化的探针和/或透化剂。21.所描述的用于保持或支持基材的装置还包括对准机构(alignmentmechanism)，该对准机构连接到所述构件中的至少一个并且对准所述第一构件和第二构件。因此，本公开的装置可以有利地将第一基材和第二基材对准可能在第一基材和第二基材的表面上的任何样品、条码化探针或透化剂。即，本公开的装置可以通过使第一基材和第二基材以对准方式彼此接触来促进样品(例如，生物样品)的分析。第一和第二基材的对准是空间转录组学应用中的关键，因为样品(例如，生物样品)可能需要与基材的条码化区域对准。22.在空间转录组学分析中将生物样品与条码化区域对准的当前方法涉及用户小心地将生物样品放置在包括多个条码化探针的基材上。因此，在一些实施方式中，所描述的装置的优点是为用户提供对准工具以将样品与条码化区域对准。本公开的装置可以减少测定分析过程中的用户误差，从而也降低样品分析成本。在一些实施方式中，本公开的装置的另一个优点是减少了可能由于用户在将生物样品与基材的条码化区域对准时出现的误差而产生的像差或成像缺陷的数量。在一些实施方式中，本公开的装置允许针对感兴趣区域进行样品预筛选。在一些实施方式中，本公开的装置允许检查存档的样品。23.一方面，本公开涉及一种基材，其包括设置在基材表面上的阵列。该阵列包括多个非金属荧光标志物。多个非金属荧光标志物中的非金属荧光标志物包括荧光探针。基材包括多个金属基准标志物，它们以框架图案布置在表面上，形成围绕阵列的周边。24.在一些实施方式中，金属基准标志物包括金。在一些实施方式中，金属基准标志物包括纳米颗粒。在一些实施方式中，框架图案为矩形或正方形。在一些实施方式中，多个金属基准标志物中的金属基准标志物具有至少0.1mm的尺寸。在一些实施方式中，非金属荧光标志物的最大尺寸小于0.1mm。在一些实施方式中，阵列包括第一非金属荧光标志物，其包括具有第一平均浓度的第一荧光探针，和，第二非金属荧光标志物，其包括具有第二平均浓度的第二荧光探针；其中第一平均浓度不同于第二平均浓度。在一些实施方式中，第一平均浓度为约0.01微摩尔(μm)至约100μm。25.在一些实施方式中，多个非金属荧光标志物包括在第一激发波长处具有第一荧光强度峰值的非金属荧光标志物的第一子集和在第二激发波长处具有第二荧光强度峰值的非金属荧光标志物的第二子集。在一些实施方式中，第一激发波长不同于第二激发波长。在一些实施方式中，多个金属基准标志物在第一激发波长下不发荧光。在一些实施方式中，多个金属基准标志物在第二激发波长下不发荧光。在一些实施方式中，第一激发波长为约560纳米(nm)至约610nm。在一些实施方式中，第二激发波长为约600纳米(nm)至约700nm。在一些实施方式中，多个非金属荧光标志物的第一子集在第一激发波长下发荧光，而多个非金属荧光标志物的第二子集在第一激发波长下不以可检测的方式发荧光。26.在一些实施方式中，荧光探针与寡核苷酸偶联。在一些实施方式中，荧光探针包括四甲基罗丹明(tritc)，红色荧光蛋白(dsred)，具有在约590nm处达到峰值的吸收波长的染料，花青‑3(cy3)，具有在约650nm处达到峰值的吸收波长的染料，花青‑5(cy5)，或其组合。27.在另一方面，本公开涉及包括阵列的基材，所述阵列包括布置在基材表面上的多个荧光标志物，所述多个荧光标志物包括荧光标志物的第一子集，其中第一子集的荧光标志物具有第一荧光探针，和荧光标志物的第二子集，其中第二子集的荧光标志物具有第二荧光探针。第一荧光探针不同于第二荧光探针。28.在一些实施方式中，第一荧光探针或第二荧光探针包括荧光染料、荧光蛋白或其组合。在一些实施方式中，第一荧光探针或第二荧光探针包括选自下组的荧光染料：吖啶染料、氟酮染料、花青染料、荧光素、噁嗪染料、菲啶染料、罗丹明染料，及其组合。在一些实施方式中，第一荧光探针或第二荧光探针包括选自下组的荧光蛋白：绿色荧光蛋白(gfp)、标签蓝色荧光蛋白(tagbfp)、蔚蓝(cerulean)、青色荧光蛋白(cfp)、金星(venus)、黄水晶(citrine)、黄色荧光蛋白(yfp)、单体增强型绿色荧光蛋白(egfp)、mcherry、mkate2、光活化型绿色荧光蛋白(pa‑gfp)、光活化型mcherry(pa‑mcherry)、荧光蛋白融合蛋白，及其组合。在一些实施方式中，多个荧光标志物是非金属的。在一些实施方式中，多个荧光标志物中的荧光标志物具有小于0.1mm的最大尺寸。29.在另一方面，本公开涉及包括阵列的基材，所述阵列包括设置在基材表面上的多个荧光标志物，和多个基准标志物以框架图案排列在表面上，形成围绕阵列的周界。多个荧光标志物中的荧光标志物包括荧光染料。30.在一些实施方式中，荧光染料与寡核苷酸偶联。在一些实施方式中，荧光染料选自下组：吖啶染料、氟酮染料、花青染料、荧光素、噁嗪染料、菲啶染料、若丹明染料及其组合。在一些实施方式中，荧光染料选自下组：四甲基罗丹明(tritc)，红色荧光蛋白(dsred)，具有在约590nm处达到峰值的吸收波长的染料，花青‑3(cy3)，具有在约650nm处达到峰值的吸收波长的染料，花青‑5(cy5)，及其组合。31.在另一方面，本公开涉及包括阵列的基材，所述阵列包括设置在基材表面上的荧光标志物，和多个基准标志物以框架图案排列在表面上，形成围绕阵列的周界。多个荧光标志物中的荧光标志物包括荧光探针。荧光标志物与多个基准标志物中的基准标志物之间的最小间距为至少50微米。32.在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为至少100微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为至少500微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为至少1,000微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为至少1,500微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为至少2,000微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为约50至约3,000微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为约500至约2,000微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为约1,000至约1,500微米。33.在另一方面，本公开涉及基材，所述基材包括设置在基材表面上的多个荧光标志物，和排列在所述表面上的多个基准标志物。多个基准标志物包括以第一图案排列的基准标志物的第一子集和以第二图案排列的基准标志物的第二子集。第二图案不同于第一图案。34.在一些实施方式中，多个基准标志物还包括以与表面上的第一和第二图案相邻的第三图案排列的基准标志物的第三子集。在一些实施方式中，基准标志物的第三子集是图示符。在一些实施方式中，第三图案是几何形状。在一些实施方式中，第三图案是圆形、沙漏形、六边形、正方形、矩形、三角形、五边形、七边形、八边形、九边形、十边形、椭圆形或正多边形。在一些实施方式中，第一图案形成第一侧并且第二图案形成第二侧。在一些实施方式中，第三图案形成第三侧，其中第三图案不同于第一图案和第二图案。在一些实施方式中，多个基准标志物还包括以形成第四侧的第四图案排列的基准标志物的第四子集，其中第四图案不同于第一、第二和第三图案。在一些实施方式中，排列第一侧、第二侧、第三侧和第四侧以在基材的表面上形成框架。在一些实施方式中，基准标志物的第一子集以与基准标志物的第二子集不同的周期彼此间隔开。在一些实施方式中，基准标志物的第一子集以比基准标志物的第二子集更高的周期性在基材的表面上彼此间隔开。在一些实施方式中，基准标志物的第一子集以比基准标志物的第二子集更低的周期性在基材的表面上彼此间隔开。在一些实施方式中，基准标志物的第一子集以形成二维斜格结构的三个交错行排列在基材的表面上。35.在另一方面，本公开涉及一种载玻片，该载玻片包括上述基材中的任一个。36.在另一方面，本公开涉及一种评估成像系统的成像能力的方法。该方法包括识别框架，该框架包括布置在基材表面上的多个金属基准标志物，使用第一波长的辐射照射基材，测量由布置在由框架界定的周界内的表面上的阵列发射的光，其中阵列包括多个非金属荧光标志物，其中多个非金属荧光标志物中的非金属荧光标志物包括荧光探针，和，在目标对象(object)的视觉呈现(visualrepresentation)上确定非金属荧光标志物的存在或不存在，包括至少两个正交空间维度中的相对维度信息，其中视觉呈现由成像系统基于阵列发射的光而生成。37.在另一方面，本公开涉及一种系统，该系统包括至少一个阵列，该阵列包括设置在基材表面上的多个非金属荧光标志物，其中多个非金属荧光标志物中的非金属荧光标志物包括荧光探针，以至少一个框架图案排列在表面上的多个金属基准标志物，形成围绕阵列的周界，以及计算装置，其包括操作性地联接到显微镜的处理器，以及具有计算机程序的非暂时性计算机可读存储介质，该计算机程序包括可由处理器执行的指令，使得处理器生成目标对象的视觉呈现，该目标对象包括至少两个正交空间维度中的相对维度信息，其中，目标对象包括至少一个框架图案和至少一个阵列。38.在另一方面，本公开涉及一种用于基材的支持装置，所述基材包括样品区域，所述支持装置包括板，所述板包括平台、连接到平台的第一表面的多个构件，和连接到平台的第二表面的支持构件，以及基材保持器(substrateholder)，所述基材保持器包括基材安装件(substratemount)和将基材保持器联接到支持构件的附接机构(attachmentmechanism)。基材保持器被配置为使当基材由基材安装件固定并且基材保持器联接到支持构件时，至少60％的样品区域被支持构件覆盖。39.在一些实施方式中，多个构件中的构件的尺寸被设计成能由加热装置的区域接收。在一些实施方式中，加热装置的区域包括热传递元件，该热传递元件被配置为将热量传递到多孔基材的孔。在一些实施方式中，热传递元件包括加热构件中的凹部。在一些实施方式中，多个构件在第一表面上形成二维阵列，并且多个构件间隔开以使得它们与多孔基材上的孔对准。在一些实施方式中，基材安装件包括形成在基材保持器中的凹部。在一些实施方式中，基材安装件包括至少一个紧固件，该紧固件被配置为将基材固定在凹部内。在一些实施方式中，附接机构包括被配置为能接收支持构件的孔口。在一些实施方式中，附接机构包括一个或多个延伸部，所述延伸部被配置为能与支持构件中的对应凹部接合。在一些实施方式中，样品区包括基材上的多个孔。在一些实施方式中，基材保持器包括尺寸设计成能接收衬垫的凹部。在一些实施方式中，基材保持器包括定位成使当基材由基材安装件固定时，在基材保持器和基材之间形成气密密封的衬垫。在一些实施方式中，样品区包括基材上的多个孔，并且衬垫包括多个孔口(aperature)，其中多个孔口中的孔口被定位成使当基材由基材安装件固定时，孔口与孔对准。在一些实施方式中，衬垫被配置为当基材由基材安装件固定时防止孔口之间的流体传输。40.在一些实施方式中，基材保持器包括多个孔口，其中多个孔口中的孔口与衬垫的孔口对准。在一些实施方式中，样品区域被支持构件完全覆盖。在一些实施方式中，基材保持器被配置为使当基材由基材安装件固定并且基材保持器联接到支持构件时，基材的至少部分接触支持构件。在一些实施方式中，接触支持构件的基材的部分包括样品区域的至少部分或在基材的与样品区域相对的一侧上的基材的部分。在一些实施方式中，支持件接触整个基材。在一些实施方式中，附接机构被配置为使得基材保持器以单一取向联接到支持构件。41.在一些实施方式中，基材保持器包括第一构件、第二构件和构造成将第一构件固定到第二构件的接合机构(engagementmechanism)。基材安装件位于第一构件或第二构件中。在一些实施方式中，接合机构是可调节的。在一些实施方式中，接合机构包括一个或多个翼形螺钉。在一些实施方式中，第一构件包括基材安装件，并且其中基材安装件包括形成在第一构件中的凹部。在一些实施方式中，第一构件包括至少一个紧固件，该紧固件被配置为将基材固定在凹部内。在一些实施方式中，第一构件包括附接机构，并且其中附接机构包括构造成能接收支持构件的孔口。在一些实施方式中，第二构件包括尺寸设计成能接收衬垫的凹部。在一些实施方式中，第二构件包括定位成使当基材由基材安装件固定并且第一构件固定至第二构件时，在基材保持器和基材之间形成气密密封的衬垫。42.在一些实施方式中，样品区包括基材上的多个孔，衬垫包括多个孔口，其中多个孔口中的孔口被定位成使当基材由基材安装件固定时，孔口对准孔。在一些实施方式中，当基材由基材安装件固定并且第一构件固定到第二构件时，衬垫被配置为防止衬垫孔口之间的流体传输。在一些实施方式中，第二构件包括多个孔口，其中所述多个孔口中的孔口与衬垫的多个孔口中的孔口对准。43.在另一方面，本公开内容涉及一种孵育布置在基材的样品区域上的样品的方法。该方法包括将基材安装在支持装置上，将基材和支持装置定位在加热装置中，和，启动加热装置以将热量传递给样品。该支持装置包括板，所述板包括平台、连接到平台的第一表面的多个构件和连接到平台的第二表面的支持构件，以及基材保持器，所述基材保持器包括基材安装件和将所述基材保持器联接至支持构件的附接机构。基材保持器被配置为使当基材由基材安装件固定并且基材保持器联接到支持构件时，至少60％的样品区域被支持构件覆盖。44.在另一方面，本公开涉及一种用于包括样品区域的基材的支持装置。该支持装置包括板，所述板包括平台，连接到平台的第一表面的多个构件以及连接到平台的第二表面的支持构件，包括第一表面和第二表面的基材安装件，所述第一表面联接到支持构件，以及基材保持器，所述基材保持器包括附接机构以将基材安装件联接到基材保持器。基材安装件的第二表面是用于接收样品的基材。45.在一些实施方式中，基材安装件是载玻片。在一些实施方式中，当基材保持器联接到支持构件时，至少60％的样品区域被支持构件覆盖。在一些实施方式中，当基材保持器联接到支持构件时，至少75％的样品区域被支持构件覆盖。在一些实施方式中，当基材保持器联接到支持构件时，至少90％的样品区域被支持构件覆盖。在一些实施方式中，当基材保持器联接到支持构件时，样品区域完全被支持构件覆盖。在一些实施方式中，多个构件中的构件的尺寸被设计成由加热装置的区域接收。在一些实施方式中，加热装置的区域包括热传递元件，该热传递元件被配置为将热量传递到多孔基材的孔。在一些实施方式中，热传递元件包括加热构件中的凹部。在一些实施方式中，多个构件在第一表面上形成二维阵列，并且多个构件间隔开以使得它们与多孔基材上的孔对准。在一些实施方式中，附接机构包括被配置为接合基材安装件的紧固件。在一些实施方式中，附接机构包括被配置为能接收支持构件的孔口。在一些实施方式中，附接机构包括被配置为与基材安装件接合的一个或多个凸片。在一些实施方式中，样品区包括基材上的多个孔。在一些实施方式中，基材保持器包括定位成使当基材由基材安装件固定时，在基材保持器和基材之间形成气密密封的衬垫。在一些实施方式中，样品区包括基材上的多个孔，并且其中所述衬垫包括多个孔口，其中多个孔口中的孔口被定位成使当基材由基材安装件固定时，所述衬垫的孔口对准孔。在一些实施方式中，衬垫被配置为当基材由基材安装件固定时防止衬垫的孔口之间的流体传输。在一些实施方式中，基材保持器包括多个孔口，其中基材保持器的多个孔口中的孔口与衬垫的孔口对准。在一些实施方式中，样品区域被支持构件完全覆盖。在一些实施方式中，基材保持器被配置为使当基材由基材安装件保持并且基材保持器联接到支持构件时，基材的至少部分接触支持构件。在一些实施方式中，接触支持构件的基材的部分包括样品区域的至少部分或在基材的与样品区域相对的一侧上的基材的部分。在一些实施方式中，支持构件接触整个基材。在一些实施方式中，附接机构被配置为使得基材保持器以单一方向联接到支持构件。46.在另一方面，本公开涉及用于包括样品区域的基材的支持装置。支持装置包括基材安装件，该基材安装件包括第一表面和第二表面，第一表面联接到支持构件，基材保持器包括将基材安装件联接至基材保持器的附接机构，衬垫，与基材保持器的底表面正交延伸的多个肋部，以及配置为将基材安装件固定到衬垫的接合机构。基材安装件的第二表面是用于接收样品的基材，并且衬垫位于基材安装件和基材保持器的底表面之间。47.在一些实施方式中，接合机构是可调节的。在一些实施方式中，接合机构包括一个或多个凸片。在一些实施方式中，接合机构包括一个或多个压闩。在一些实施方式中，基材保持器包括至少一个紧固件，该紧固件被配置为将基材安装件固定在凹部内。在一些实施方式中，基材保持器包括尺寸设计成接收衬垫的凹部。在一些实施方式中，称垫被定位成使得当基材保持器由基材保持器固定时，在基材保持器和基材保持器之间形成气密密封。在一些实施方式中，样品区域包括在基材安装件上的多个孔，并且衬垫包括第一组孔口，其中第一组孔口中的孔口被定位成使当基材安装件由基材保持器固定时，孔口与孔对准。在一些实施方式中，衬垫被配置为当基材安装件由基材保持器固定时防止第一组孔口之间的流体传输。在一些实施方式中，基材保持器包括第二组孔口，其中第二组孔口中的孔口与第一组孔口中的孔口对准。48.在另一方面，本公开内容涉及一种孵育布置在基材的样品区域上的样品的方法。该方法包括将基材安装在支持装置上，将基材和支持装置定位在加热装置中，和，启动并加热装置以将热量传递给样品。该支持装置包括板，所述板包括平台，连接到平台的第一表面的多个构件以及连接到平台的第二表面的支持构件，包括第一表面和第二表面的基材安装件，所述第一表面联接到支持构件，以及基材保持器，所述基材保持器包括附接机构以将基材安装件联接到基材保持器。基材安装件的第二表面包括用于接收样品的基材。49.在一些实施方式中，基材安装件是载玻片。在一些实施方式中，当基材保持器联接到支持构件时，至少60％的样品区域被支持构件覆盖。50.在另一方面，本公开涉及一种用于包括样品区域的基材的支持装置。支持装置包括基材安装件，所述基材安装件包括第一表面和第二表面，基材安装件的第二表面是配置用于接收样品的基材，基材保持器，所述基材保持器包括配置用于接收衬垫的第一部分，所述第一部分包括从基材保持器的表面延伸的多个肋部；以及第二部分，其被配置为接收基材安装件。第一部分和第二部分通过铰链联接在一起，从而当基材保持器处于关闭状态时，第一部分被配置为折叠在第二部分上以将基材安装件固定在第一和第二部分之间。51.在一些实施方式中，基材安装件是载玻片。在一些实施方式中，基材保持器包括设置在基材保持器的第一部分和第二部分之间的衬垫。在一些实施方式中，基材保持器的第一部分包括可释放的接合机构，其被配置为当基材保持器处于关闭状态时将第一部分固定到第二部分。在一些实施方式中，基材安装件的第一表面与从基材保持器的表面延伸的多个肋部中的至少一个接合。在一些实施方式中，第二部分限定了形成在基材保持器中的凹腔，该凹腔被配置为接收基材安装件。在一些实施方式中，第二部分限定被配置为接收基材安装件的腔。在一些实施方式中，第二部分限定凹腔内的开口(opening)，并且其中当基材保持器处于关闭状态时，开口暴露基材安装件的一侧的至少部分。52.在另一方面，本公开涉及一种样品保持器，包括第一构件和第二构件，所述第一构件包括第一保持机构(retainingmechanism)，所述第一保持机构被配置为保持包括样品的第一基材，所述第二构件包括第二保持机构，所述第二保持机构被配置为保持包括试剂介质的第二基材，和对准机构(alignmentmechanism)，所述对准机构连接到第一和第二构件中的一或两者，并且被配置为对准第一和第二构件，从而使得当第一和第二构件对准时，样品接触试剂介质的至少部分。53.在一些实施方式中，对准机构包括连接到第一和第二构件的旋转致动器。在一些实施方式中，对准机构包括位于第一和第二构件之一或两者上的一个或多个连接器，以及位于第一和第二构件之一或两者上的一个或多个接收器，其中一个或多个接收器被定位成与一个或多个连接器接合。在一些实施方式中，旋转致动器包括铰链。在一些实施方式中，旋转致动器包括折叠构件。在一些实施方式中，旋转致动器包括至少一个臂。在一些实施方式中，第一保持机构包括尺寸设计成接收第一基材的凹部。在一些实施方式中，样品保持器还包括位于凹部内的衬垫，所述衬垫被配置为保持凹部和第一基材之间的过盈配合(interferencefit)。在一些实施方式中，第一保持机构包括一个或多个构件，其被配置为向第一基材施加力以保持第一基材与第一构件之间的接触。54.在一些实施方式中，第二保持机构包括尺寸设计成接收第二基材的凹部。在一些实施方式中，第二保持机构包括一个或多个构件，所述构件被配置为向第二基材施加力以保持第二基材与第二构件之间的接触。在一些实施方式中，试剂介质包括以下中的至少一种：包含透化剂的溶液、固体透化剂和包含透化剂的水凝胶化合物。在一些实施方式中，包含透化剂的溶液包括大于约2w/v％的十二烷基硫酸钠(sds)。在一些实施方式中，包含透化剂的溶液包含约8w/v％至约12w/v％的sds。在一些实施方式中，包括透化剂的溶液包括蛋白酶k。在一些实施方式中，包括透化剂的溶液包括大于2w/v％n‑月桂酰肌氨酸或其钠盐。在一些实施方式中，第一构件包括开孔，所述开孔被定位成使得当第一基材被保持时，所述开孔与第一基材的样品区域对准。在一些实施方式中，第二构件包括至少一个开孔，所述开孔被定位成使得当第一基材被保持并且第一和第二构件被对准机构对准时，所述至少一个开孔的开孔与第一基材的样品区域的至少部分对准。55.在一些实施方式中，样品保持器还包括由至少一个开孔的一个或多个边界表面(boundingsurface)和由第二基材的后表面形成的试剂孔，其中添加到试剂孔的试剂溶液被边界表面包含并透过第二基材的背表面。在一些实施方式中，第二基材的背表面与面向第一基材上的样品的第二基材的正表面相对。在一些实施方式中，样品保持器还包括第一调节机构(adjustmentmechanism)，所述第一调节机构连接到第一构件并且被配置为在平行于支持样品的第一基材的表面的至少一个方向上平移第一基材。在一些实施方式中，对准机构被配置为当第一和第二基材对准时保持第一和第二基材之间的间隔。在一些实施方式中，对准机构被配置为保持该间隔，从而使得第一基材上的样品的至少部分接触第二基材上的试剂介质的至少部分。在一些实施方式中，当在与支持样品的第一基材的表面正交的方向上测量时，第一和第二基材之间的间隔为50μm‑1mm。56.在一些实施方式中，第一和第二基材之间的间隔为50μm‑500μm。在一些实施方式中，对准机构被配置为当第一和第二基材对准时保持第一和第二基材大致平行，从而使得第一和第二基材之间的角度为两度或更小。在一些实施方式中，该角度为0.5度或更小。在一些实施方式中，样品保持器还包括一个或多个间隔构件，所述间隔构件连接到第一和第二构件中之一或两者，所述第一和第二构件被定位成使得当第一和第二基材对准时，一个或多个间隔构件位于第一和第二构件之间。在一些实施方式中，样品保持器还包括第二调节机构，所述第二调节机构被配置为在与支持样品的第一基材的表面正交的方向上调节间隔距离。在一些实施方式中，第二调节机构是对准机构的部件。在一些实施方式中，第二调节机构连接到第一构件和第二构件之一或两者。57.在另一方面，本公开涉及一种用于包括样品的基材的支持装置。支持装置包括上述任一样品保持器；和板，所述板包括平台、连接到平台的第一表面的多个构件和连接到平台的第二表面的支持构件。所述板被配置为连接到样品保持器。58.在一些实施方式中，样品保持器和板被配置为使得当样品保持器和板连接时，接触样品的第一基材的区域的至少75％被支持构件覆盖。在一些实施方式中，多个构件中的构件的尺寸被设计成由加热装置的区域接收。在一些实施方式中，加热装置的区域包括热传递元件，该热传递元件被配置为将热量传递到多孔基材的孔。在一些实施方式中，热传递元件包括加热构件中的凹部。在一些实施方式中，支持装置还包括附接机构(attachmentmechanism)，所述连接机构被配置为将支持构件连接到样品保持器。在一些实施方式中，附接机构包括形成于样品保持器的第一构件中并被配置为接收支持构件的开孔和凹部之一或两者。59.在一些实施方式中，附接机构包括一个或多个延伸构件，所述延伸构件连接到样品保持器的第一构件并被配置为与支持构件中的相应凹部接合。在一些实施方式中，附接机构包括一个或多个延伸构件，所述延伸构件连接到支持构件并且被配置为与样品保持器的第一构件中的相应凹部接合。在一些实施方式中，多个构件在平台的第一表面上形成二维阵列，并且多个构件间隔开，从而使得它们与多孔基材上的孔对准。在一些实施方式中，接触样品的第一基材的区域被支持构件完全覆盖。在一些实施方式中，样品保持器和板被配置成使得当样品保持器和板连接时，第一基材的至少部分接触支持构件。在一些实施方式中，接触支持构件的第一基材的部分包括位于第一基材的与接触样品的第一基材的区域相对的一侧的基材的部分。在一些实施方式中，接触支持构件的第一基材的部分包括与接触样品的第一基材的表面相对的基材的表面的至少90％。在一些实施方式中，附接机构被配置为使得样品保持器以单一方向联接到支持构件。60.在另一方面，本公开内容涉及一种为印刷的阵列位置提供视觉指引的方法，包括利用带有印刷的指引的信息标记物将生物样品放置在固体支持物上，和，分析样品，其中印刷的指引为印刷的阵列位置提供视觉指引。61.在另一方面，本公开内容涉及将生物样品放置在阵列上的方法，包括利用带有印刷的指引的信息标签将生物样品放置在固体支持物上，分析生物样品，其中印刷的指引提供印刷的阵列位置的视觉指引；和，从固体支持物上取下信息标记物。62.在一些实施方式中，信息标记物是透明的。在一些实施方式中，移除信息标记物的步骤发生在分析生物样品的步骤之前。在一些实施方式中，固体支持物是载玻片。在一些实施方式中，生物样品是组织切片。在一些实施方式中，信息标记物是可移除的。在一些实施方式中，信息标记物是机械粘附的。在一些实施方式中，信息标记物用墨水印刷。在一些实施方式中，墨水是白色墨水、黑色墨水、彩色墨水、荧光墨水或其组合。在一些实施方式中，信息标记物是无光泽的。在一些实施方式中，信息标记物是有光泽的。在一些实施方式中，信息标记物包括信息标记物内部的孔洞(hole)或切口(cutout)。在一些实施方式中，信息标记物能够具有导热性和导电性。在一些实施方式中，印刷的指引是基准标志物。在一些实施方式中，基准标志物包括围绕阵列的框和标识阵列中心的点。在一些实施方式中，信息标记物包含元数据。在一些实施方式中，信息标记物占据固体支持物的部分。在一些实施方式中，信息标记物占据所有固体支持物。63.在一个方面，一种用于产生阵列上某一位置的空间rna完整性数的方法包括：(a)将用组织学染色剂染色的组织样品与阵列接触，其中所述阵列包括附接到所述阵列上某个位置的捕获探针，和，所述捕获探针包括特异性结合至来自组织样品的生物分析物的捕获域；(b)从与捕获域特异性结合的生物分析物生成cdna分子；(c)通过将标记的寡核苷酸探针与所述cdna杂交来标记所述cdna；(e)生成标记的cdna的图像和组织学染色的图像，和，利用标记的cdna的图像和组织学染色的图像生成阵列上所述位置的空间rna完整性数。64.在一些实施方式中，组织样品包括组织切片、组织内的区域或组织内的单细胞。在一些实施方式中，组织学染色剂是苏木精和伊红。在一些实施方式中，捕获域包含聚(t)序列。在一些实施方式中，生物分析物是18srrna。在一些实施方式中，标记的寡核苷酸探针是荧光标记的。在一些实施方式中，步骤(c)包括将至少四种不同的标记的寡核苷酸探针与cdna杂交。在一些实施方式中，至少四种标记的寡核苷酸探针在cdna内的不同位点处顺序杂交。在一些实施方式中，标记的寡核苷酸探针是荧光标记的。在一些实施方式中，生成标记的cdna的图像的步骤包括测量至少四种标记的寡核苷酸探针中每一种的荧光信号。在一些实施方式中，来自至少四个标记的寡核苷酸探针中的每一个的荧光信号用于产生阵列上所述位置的空间rna完整性数。65.在另一方面，确定空间分析工作流程中的工艺偏差的方法包括：(a)提供包含一种或多种测试分析物的基材，其中一种或多种测试分析物以已知量布置在基材上的已知位置；(b)在允许一种或多种捕获探针与一种或多种测试分析物相互作用的条件下，使基材与包含一种或多种捕获探针的阵列接触，其中捕获探针包含空间条形码和捕获域；(c)检测与一种或多种捕获探针相互作用的一种或多种测试分析物；和(d)基于步骤(c)中的检测确定空间分析工作流程是否准确地检测到一种或多种测试分析物的存在、数量、位置或其组合，由此确定空间分析工作流程中的工艺偏差。66.在一些实施方式中，基材包括半多孔材料。在一些实施方式中，半多孔材料包括硝化纤维素膜、水凝胶、尼龙过滤器或其组合中的至少一种。在一些实施方式中，一种或多种测试分析物包括核酸、蛋白质、脂质或其组合中的至少一种。在一些实施方式中，一种或多种测试分析物是rna。在一些实施方式中，一种或多种测试分析物以限定的图案布置在基材上。在一些实施方式中，限定的图案包括一个或多个点。67.本说明书中提到的可在因特网上获得的所有发表物、专利和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的发表物、专利、专利申请和信息项目专门和单独地通过引用纳入本文那样。对于通过引用纳入的出版物、专利、专利申请和信息项目与本说明书中所含公开内容相矛盾的内容，均意于以本说明书为准和/或本说明书优先于任何相矛盾的材料。68.在以范围来描述值的情况下，应当理解的是，该描述包括在该范围内的所有可能的子范围的公开，以及在该范围内的特定数值的公开，而不管是否明确地说明了特定数值或特定子范围。69.术语“每个”提及一组物品时，意在识别该集合中的一个单独物品，但不一定指该集合中的每一项物品，除非另有明确说明，或除非用法的上下文另有明确说明。70.本文描述了本发明的特征的各种实施方式。然而，应当理解，这些实施方式仅作为示例提供，并且在不脱离本公开的范围的情况下，本领域技术人员可以作出许多变化、改变和替换。还应理解，本文所描述的特定实施方式的各种替代方案也在本公开的范围内。附图说明71.以下附图说明了本发明的特征和优点的某些实施方式。这些实施方式无意以任何方式限制所附权利要求的范围。附图中的相同附图标记表示相同的元素。72.图1示出了示例性空间分析工作流。73.图2示出了示例性空间分析工作流。74.图3示出了示例性空间分析工作流。75.图4示出了示例性空间分析工作流。76.图5示出了示例性空间分析工作流。77.图6是示出如本文所述的条码化捕获探针的示例的示意图。78.图7是说明可裂解捕获探针的示意图，其中裂解的捕获探针可进入非透化细胞并结合到样品内的目标分析物。79.图8是示例性多重空间条码化特征的示意图。80.图9是示例性分析物捕获剂的示意图。81.图10是描绘特征固定的(feature‑immobilized)捕获探针1024和分析物捕获剂1026之间的示例性相互作用的示意图。82.图11a、11b和11c是图示如何在基于阵列的系统中利用链霉亲和素细胞标签来产生空间条码化的细胞或细胞内容物的示意图。83.图12是示出阵列内的条码化特征的布置的示意图。84.图13是示出抗扩散介质(例如盖)的侧视图的示意图。85.图14a和14b是图示电泳转移系统的展开图14a和侧视图14b的示意图，所述电泳转移系统被设置成将转录物分析物导向空间条码化捕获探针阵列。86.图15是示出利用电泳转移系统的示例性工作流方案的示意图。87.图16示出用于划分解离样品(例如来自样品的生物颗粒或个体细胞)的微流体通道结构1600的示例。88.图17a示出了微流体通道结构1700的示例，该微流体通道结构1700用于将携带空间条形码的珠递送到液滴。89.图17b示出了具有用于受控划分的几何特征的微流体通道结构1750的另一示例的截面图。90.图17c显示了工作流程示意图的示例。91.图18是使用分析物结合部分与细胞表面的共价偶联或与细胞膜元件的非共价相互作用来描绘细胞加标(celltagging)的示意图。92.图19是描绘使用细胞穿透肽或递送系统进行细胞加标的示意图。93.图20a是说明用于“像素化”样品的示范性、非限制性、非穷尽性步骤的工作流示意图，其中样品通过空心针或微针切割、压印、显微解剖或转移，将样品的一小部分移动到个体分区或孔中。94.图20b是描绘多针像素化(multi‑needlepixilation)的示意图，其中一组针头穿过支架上的样品并穿入下面含有凝胶珠和试剂的纳米孔中。一旦针进入纳米孔，细胞就会弹出。95.图21示出了用于解离空间条码化样品以通过液滴或流动池分析方法进行分析的示例性、非限制性、非穷举步骤的工作流示意图。96.图22a是示出可用于实现本文所述的各种步骤和方法的示例性样品处理装置的示意图。97.图22b是示出可用于获得生物样品、分析物和特征阵列的图像的示例成像设备的示意图。98.图22c是图22a和图22b的设备的控制单元的示例的示意图。99.图23a是显示样品载玻片(例如，控制载玻片)的示例的示意图。100.图23b是显示图23a中未显示的附加测量的样品载玻片的示例的示意图。101.图24a是说明样品载玻片的示例和选择区域的放大视图的示意图。102.图24b是说明图24a中说明的荧光标志物的浓度范围的示例的示意图。103.图25a是样品载玻片的明场显微图像。104.图25b是用594纳米(nm)激发波长采集的样品载玻片的荧光显微图像。105.图25c是用647nm激发波长采集的样品载玻片的荧光显微图像。106.图25d是通过合并图25b和25c中所示的图像获得的样品载玻片的荧光显微图像。107.图25e是图25d所示的荧光显微图像的放大图。108.图26a是说明样品载玻片的示例和选择区域的放大视图的示意图。109.图26b是说明图26a中说明的荧光标志物的浓度范围的示例的示意图。110.图26c是图26a所示阵列的荧光显微图像。111.图27a是说明样品载玻片的示例以及尺寸校准阵列和比色动态范围阵列的放大视图的示意图。112.图27b是用488nm激发波长获得的比色动态范围阵列的荧光显微图像。113.图27c是用594nm激发波长获得的比色动态范围阵列的荧光显微图像。114.图27d是用647nm激发波长获得的比色动态范围阵列的荧光显微图像。115.图28a是说明包括样品和比色动态范围阵列的样品载玻片的示意图。116.图28b是用488nm激发波长采集的样品载玻片的荧光显微图像。117.图28c是用594nm激发波长采集的样品载玻片的荧光显微图像。118.图28d是用647nm激发波长采集的样品载玻片的荧光显微图像。119.图29a‑29d显示了包括基准标志物的载玻片的示例。120.图30显示了基准标志物框内的不同图案的示例。121.图31是根据本文提供的一些实施方式的包括板和用于加热基材的基材保持器的装置的透视图。122.图32是根据本文提供的一些实施方式的图31的板的顶部透视图。123.图33是根据本文提供的一些实施方式的图31的板的底部透视图。124.图34是根据本文提供的一些实施方式的图31的基材保持器的分解图。125.图35是根据本文提供的一些实施方式的图34的基材保持器的底部构件的顶部透视图。126.图36是根据本文提供的一些实施方式的图35的底部构件的底部透视图。127.图37是根据本文提供的一些实施方式，与图31的板联接的图35的底部构件的透视图。128.图38是根据本文提供的一些实施方式，与第二板实施方式联接的图35的底部构件的透视图。129.图39是根据本文提供的一些实施方式，与图35的底部构件一起使用的紧固件的前透视图。130.图40是根据本文提供的一些实施方式，图39的紧固件的后透视图。131.图41是根据本文提供的一些实施方式，与图34的基材保持器一起使用的衬垫的透视图。132.图42是根据本文提供的一些实施方式，图34的基材保持器的顶部构件的顶部透视图。133.图43是根据本文提供的一些实施方式，图42的顶部构件的底部透视图。134.图44a、44b和44c显示了根据本文提供的一些实施方式的用于加热基材的基材保持器。图44a是基材保持器的透视图。图44b是图44a的基材保持器的分解图。图44c是图44a的基材保持器的局部透视图。135.图45a是根据本文提供的一些实施方式，图44a的基材保持器的顶部透视图。图45b是根据本文提供的一些实施方式，图44a的基材保持器的底部透视图。图45c是根据本文提供的一些实施方式，图44a的基材保持器的侧透视图。136.图46是根据本文提供的一些实施方式的衬垫的透视图。137.图47是根据本文提供的一些实施方式的基材加载器工具的顶部透视图。138.图48a‑48b是根据本文提供的一些实施方式，插入到图47的基材加载器工具中的基材保持器的侧透视图和顶部透视图。139.图49a‑c是根据本文提供的一些实施方式的基材加载器工具的另一个示例的各种透视图。140.图50a‑c是根据本文提供的一些实施方式的基材保持器工具的透视图。141.图51是显示分别支持样品和特征阵列的两个基材的示意图。142.图52a是样品保持器的示例的示意性俯视图。143.图52b‑52f是样品保持器的示例的示意性侧视图。144.图53是样品保持器的一个示例的示意侧视图。145.图54是显示基材成直角对准的示意图。146.图55是显示基材保持器上的基准标识的示意图。147.图56是显示与分析单个基材上的多个样品相关联的工作流程的示意图。148.图57a是显示使用各向异性透化层的工作流程的示意图。149.图57b是在各向异性透化层存在的情况下与特征阵列接触的样品的示意性局部视图。150.图57c是图57b的部分的示意性放大图。151.图58是显示使用包含透化剂的水凝胶层顶上的特征阵列的工作流程的示意图。152.图59是显示使用透化流体层来分析样品的工作流程的示意图。153.图60a‑60c是从图59的工作流程获得的样品的图像。154.图60d是显示图60b与图60c之间的比较图像强度的图。155.图61a‑61c是从图59的工作流程获得的另一个样品的图像。156.图61d是显示图61b和图61c之间的比较信噪比的图表。157.图62是显示使用特征阵列分析样品的工作流程的示意图，特征阵列包括浸泡在透化溶液中的珠。158.图63是显示使用注入透化溶液的水凝胶层来分析样品的工作流程的示意图。159.图64a是根据图63的工作流程分析的不同组织样品的一系列图像。160.图64b是显示图64a中底行图像之间的比较信号强度的图表。161.图65显示了带有印刷的指引的信息标记物的样品设计，以帮助用户在冷冻切片期间放置组织。点表示阵列的中心，而数字和字母表示可以放置组织样品的个体孔。162.图66显示了在将透明静态粘贴信息标记物应用于幻灯片之前的三种变化形式。这三种变化形式的尺寸不同，但由相同的材料制成。变化形式1显示没有标识的清晰信息标记物，变化形式2显示带有白色字母的清晰信息标记物，而变化形式3显示带有黑色字母的清晰信息标记物。163.图67显示了当在红色和绿色通道pmt增益600、5个像素/微米中扫描时施加了三个信息标记物中的每一个的载玻片。图像显示了具有信息标记物的每个通道中背景的差异。该图像还显示了应用于每个通道中的载玻片时每个信息标记物上字母的可见性。164.图68显示了使用干燥透化试剂的示例分析工作流程。165.图69显示了使用示例样品保持器的温度受控的第一和第二构件的示例分析工作流程。166.图70a显示了使用样品和第一基材的表面之间的间隙的分析物的示例电泳迁移的示意图。167.图70b显示了使用样品和覆层之间的间隙的分析物的示例电泳迁移的示意图。168.图70c显示分析物的示例电泳迁移的示意图，其中样品与第二基材的覆层接触。169.图70d显示分析物的示例电泳迁移的示意图，其中样品与第一基材接触。170.图71显示了用于样品电泳透化的示例设置。171.图72a显示了示例基材保持器的顶表面的透视图。172.图72b显示了示例基材保持器的底表面的透视图。173.图73a显示了处于打开位置的示例基材保持器的俯视图。174.图73b显示了处于打开位置的示例基材保持器的侧视图。175.图73c显示了示例基材保持器的示例锁定机构的侧视图。176.图74a显示了示例基材保持器和载玻片的分解透视图。177.图74b显示了处于打开位置的示例基材保持器和载玻片的透视图。178.图75a显示了由病理学家注释的侵袭性导管癌的组织切片。179.图75b显示了具有通过无监督聚类着色的点的组织图。180.图75c是由无监督聚类着色的点的tsne图。181.图75d显示了9个簇之间变化最大的基因的基因表达热图。182.图75e显示了组织切片中对应于人表皮生长因子受体2(her2)、雌激素受体(er)和孕激素受体(pr)的基因的表达水平。183.图75f显示了来自各个图上的9个簇中每一个的最高差异表达基因的基因表达水平。184.图75g显示了来自单个图上的9个簇中每一个的最高差异表达基因的基因表达水平。185.图75h是侵袭性导管细胞癌(idc)和正常乳腺组织中来自9个簇中每一个的最高差异表达基因的表达水平的图。186.图75i显示了idc和匹配正常组织中krt14的表达。187.图75j是idc和正常组织中胞外基质基因表达水平的图。188.附图中的各种附图标记表示相似的元素。具体实施方式189.i.引言190.本发明描述用于生物样品的空间分析的设备、系统、方法和组合物。本部分描述了某些通用术语、分析物、样品类型和制备步骤，这些将在本发明的后面部分中提及。191.(a)空间分析192.组织和细胞可以从任何来源获得。例如，组织和细胞可以从单细胞或多细胞生物体(例如哺乳动物)获得。从哺乳动物(例如，人)获得的组织和细胞通常具有不同的分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)，这可导致细胞形态和/或功能的差异。细胞在组织中的位置可以影响细胞的命运、行为、形态以及与组织中其他细胞的信号转导和串扰。关于哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平(基因和/或蛋白质表达)的差异的信息也可以帮助医生基于检测到的组织中不同细胞内分析物水平的差异来选择或给予对单细胞或多细胞生物体(例如哺乳动物)有效的治疗。哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平的差异也可以提供组织(例如，健康和患病组织)如何发挥功能和/或发展的信息。哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平的差异也可以提供组织中疾病发病机制的不同信息以及组织内治疗作用机制的信息。哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平的差异也可以提供有关耐药机制以及哺乳动物组织中耐药机制发展的信息。多细胞生物体(例如哺乳动物)组织中不同细胞内存在或不存在分析物的差异可提供多细胞生物体组织中耐药性机制及其发展的信息。193.本文提供的空间分析方法用于检测哺乳动物组织中的不同细胞内或哺乳动物的单个细胞内的分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)的差异。例如，空间分析方法可用于检测组织切片样品中不同细胞内分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)的差异，来自其中的数据可重组以生成从哺乳动物获得的组织样品的分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)的三维图，例如以一定程度的空间分辨率(例如单细胞分辨率)。194.发育系统中的空间异质性通常是通过rna杂交、免疫组织化学、荧光报告物、预定义的亚群的纯化或诱导以及随后的基因组概况分析(例如rna‑seq)来研究的。然而，这类方法依赖于一组相对较小的预定义标志物，因此引入了限制发现的选择偏差。这些先前的方法也依赖于先验知识。传统上，空间rna分析依赖于有限数量的rna物质的染色。相比之下，单细胞rna测序允许对细胞基因表达(包括非编码rna)进行深度概况分析，但已建立的方法将细胞从其天然空间环境(nativespatialcontext)中分离出来。195.当前的空间分析方法以高空间分辨率为样品中的多种分析物提供大量分析物水平和/或表达数据，例如，同时保留天然空间环境。空间分析方法包括，例如，使用捕获探针，该捕获探针包括空间条形码(例如，提供关于捕获探针在细胞或组织样品(例如，哺乳动物细胞或哺乳动物组织样品)内的位置的信息的核酸序列)和能够结合到由细胞产生或存在于细胞中的分析物(例如，蛋白质和/或核酸)的捕获域。如本文所述，空间条形码可以是具有独特序列、独特荧光团或荧光团的独特组合、独特氨基酸序列、独特重金属或重金属的独特组合，或任何其他独特可检测试剂的核酸。捕获域可以是能够结合到由细胞产生和/或存在于细胞中的分析物的任何试剂(例如，能够与以下杂交的核酸：来自细胞的核酸(例如，mrna、基因组dna、线粒体dna或mirna)、包含分析物的基材、分析物的结合伴侣或特异性结合至分析物的抗体)。捕获探针还可以包括与通用正向和/或通用反向引物序列互补的核酸序列。捕获探针还可包括裂解位点(例如，限制性核酸内切酶的裂解识别位点)、光不稳定键、热敏键或化学敏感键。196.可使用多种不同方法检测分析物与捕获探针的结合，例如，核酸测序、荧光团检测、核酸扩增、核酸连接检测和/或核酸裂解产物检测。在一些示例中，检测用于将特定空间条形码与由细胞(例如哺乳动物细胞)产生和/或存在于细胞中的特定分析物相关联。197.捕获探针可以例如附接在表面上，例如固体阵列、珠或盖玻片。在某些示例中，捕获探针未附接到表面。在一些示例中，捕获探针可封装于可透化组合物(例如，本文所述的任一基材)的表面内、嵌入该表面内或分层于该表面上。例如，捕获探针可被封装或布置在可透化珠(例如，凝胶珠)内。在一些示例中，捕获探针可封装于基材(例如，本文所述的任一示例性基材，例如水凝胶或多孔膜)的表面内、嵌入该表面内或分层于该表面上。198.在一些实施方式中，使细胞或包括细胞的组织样品与附接于基材(例如，基材的表面)的捕获探针接触，并且细胞或组织样品被透化以使分析物从细胞释放并结合到附接于基材的捕获探针。在一些示例中，可使用多种方法(例如，电泳、化学梯度、压力梯度、流体流或磁场)将从细胞释放的分析物主动引导至附接于基材的捕获探针。199.在其它示例中，可使用多种方法引导捕获探针与细胞或组织样品相互作用，例如，包括捕获探针中的脂质锚定剂、包括能与捕获探针中膜蛋白特异性结合或与膜蛋白形成共价键的试剂、流体流、压力梯度、化学梯度、或磁场。200.空间分析方法的非限制性方面在wo2011/127099、wo2014/210233、wo2014/210225、wo2016/162309、wo2018/091676、wo2012/140224、wo2014/060483、美国专利号10,002,316、美国专利号9,727,810、美国专利申请公开号2017/0016053、rodriques等，science363(6434)：1463‑1467，2019；wo2018/045186、lee等，nat.protoc.10(3)：442‑458，2015；wo2016/007839、wo2018/045181、wo2014/163886、trejo等，plosone14(2)：e0212031，2019、美国专利申请公开号2018/0245142、chen等，science348(6233)：aaa6090，2015、gao等，bmcbiol.15：50，2017、wo2017/144338、wo2018/107054、wo2017/222453、wo2019/068880、wo2011/094669、美国专利号7,709,198、美国专利号8,604,182、美国专利号8,951,726、美国专利号9,783,841、美国专利号10,041,949、wo2016/057552、wo2017/147483、wo2018/022809、wo2016/166128、wo2017/027367、wo2017/027368、wo2018/136856、wo2019/075091、美国专利号10,059,990、wo2018/057999、wo2015/161173、和gupta等，naturebiotechnol.36：1197‑1202，2018中描述，并可在本文中以任何组合使用。本文描述了空间分析方法的进一步非限制性方面。201.(b)一般术语202.在本发明中使用特定术语来解释所描述的设备、系统、方法和组合物的各个方面。本小节包括对本发明后面章节中出现的某些术语的解释。如果本节中的描述与本发明其他章节中的用法明显冲突，则以本节中的定义为准。203.(i)条形码[0204]“条形码”是一种标签或标识符，它传递或能够传递信息(例如，关于样品中分析物、珠和/或捕获探针的信息)。条形码可以是分析物的部分，也可以独立于分析物。条形码可以附接于分析物。特定条形码相对于其他条形码可能是独特的。[0205]条形码可以有多种不同的形式。例如，条形码可以包括多核苷酸条形码、随机核酸和/或氨基酸序列以及合成核酸和/或氨基酸序列。条形码可以以可逆或不可逆的方式附接到分析物或另一部分或结构上。例如，在对样品进行测序之前或期间，可以将条形码添加到脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)样品的片段中。条形码可以允许识别和/或定量个体测序读取结果(例如，条形码可以是或可以包括独特分子标识符或“umi”)。[0206]条形码可以在空间上解析在生物样品中存在的分子组分，例如，以单细胞分辨率(例如，条形码可以是或可以包括“空间条形码”)。在一些实施方式中，条形码同时包括umi和空间条形码。在一些实施方式中，条形码包括两个或更多个子条形码，它们一起用作单个条形码。例如，多核苷酸条形码可以包括由一个或多个非条形码序列分隔的两个或更多个多核苷酸序列(例如，子条形码)。[0207](ii)核酸和核苷酸[0208]“术语核酸”和“核苷酸”旨在与其在本领域中的用途一致，并包括天然存在的物质或其功能类似物。特别有用的核酸功能类似物能够以序列特异性方式与核酸杂交(例如，能够与两种核酸杂交，使得两种杂交的核酸之间可以发生连接)，或者能够用作复制特定核苷酸序列的模板。天然存在的核酸通常具有含有磷酸二酯键的主链。类似物结构可以具有其他主链连接，包括本领域已知的各种连接中的任何一种。天然存在的核酸通常具有脱氧核糖(例如，存在于脱氧核糖核酸(dna)中)或核糖(例如，存在于核糖核酸(rna)中)。[0209]核酸可包含具有本领域已知的这些糖部分的各种类似物中的任何一种的核苷酸。核酸可以包括天然或非天然核苷酸。就此而言，天然脱氧核糖核酸可以具有选自腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)或鸟嘌呤(g)的一个或多个碱基，并且核糖核酸可以具有选自尿嘧啶(u)，腺嘌呤(a)，胞嘧啶(c)或鸟嘌呤(g)的一个或多个碱基。本领域已知可包含在核酸或核苷酸中的有用非天然碱基。[0210](iii)探针和靶标[0211]“探针”或“靶标”，当用于核酸或核酸序列时，意指在方法或组合物的上下文中作为核酸或序列的语义标识符，并且不限制核酸或序列的结构或功能超出明确指示的范围。[0212](iv)寡核苷酸和多核苷酸[0213]术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换地用于指长度为约2至约500个核苷酸的核苷酸单链多聚体。寡核苷酸可以合成的，酶法(例如通过聚合)制备的，或使用“拆分‑汇集(split‑pool)”方法制备。寡核苷酸可以包括核糖核苷酸单体(即，可以是寡核糖核苷酸)和/或脱氧核糖核苷酸单体(即，寡脱氧核糖核苷酸)。在一些示例中，寡核苷酸可包括寡核苷酸中脱氧核糖核苷酸单体及核糖核苷酸单体的组合(例如，脱氧核糖核苷酸单体及核糖核苷酸单体的随机或有序组合)。例如，寡核苷酸的长度可以是4到10、10到20、21到30、31到40、41到50、51到60、61到70、71到80、80到100、100到150、150到200、200到250、250到300、300到350、350到400、或400到500个核苷酸。寡核苷酸可包括(例如，共价或非共价)附接到多聚体结构的一个或多个功能部分。例如，寡核苷酸可以包括一个或多个可检测的标记(例如，放射性同位素或荧光团)。[0214](v)对象[0215]“对象”是一种动物，如哺乳动物(如人或非人猿)，或禽类(如鸟)，或其他生物体，如植物。对象的示例包括但不限于哺乳动物，例如啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、有蹄类动物、马、绵羊、猪、山羊、牛、猫、狗、灵长类动物(即人类或非人灵长类动物)；植物，例如拟南芥(arabidopsisthaliana)、玉米、高粱、燕麦、小麦、水稻、油菜或大豆；藻类，例如莱茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)；线虫，如秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans)；昆虫，如黑腹果蝇(drosophilamelanogaster)、蚊子、果蝇或蜜蜂；蛛形纲动物，如蜘蛛；鱼类，如斑马鱼；爬行动物；两栖动物，如青蛙或非洲爪蟾(xenopuslaevis)；盘基网柄菌(dictyosteliumdiscoideum)；真菌，如卡氏肺孢子虫(pneumocystiscarinii)、红鳍东方鲀(takifugurubripes)、酵母，酿酒酵母(saccharamoycescerevisiae)或庞贝裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)；或恶性疟原虫(plasmodiumfalciparum)。[0216](vi)基因组[0217]“基因组”通常指来自对象的基因组信息，例如，可以是对象基因编码的遗传信息的至少部分或全部。基因组可以包括编码区(例如，编码蛋白质的区域)以及非编码区。基因组可以包括对象部分或全部染色体的序列。例如，人类基因组通常总共有46条染色体。这些的部分或全部序列可以构成基因组。[0218](vii)衔接子(adaptor)，接合物(adapter)和标签[0219]“衔接子(adaptor)”、“接合物(adapter)”和“标签(tag)”是在本公开中可以互换使用的术语，并且是指可以使用包括(但不限于)连接、杂交和标签化(tagmentation)的许多不同技术中的任一种来(在称为“加标(tagging)”的过程中)耦合到多核苷酸序列的物质。衔接子也可以是添加功能的核酸序列，例如间隔子序列、引物序列/位点、条形码序列、独特分子标识符序列。[0220](viii)杂合、杂交、退火(annealing)和链重组(anneal)[0221]术语“杂合”、“杂交”、“退火”和“链重组”在本公开中可交换地使用，并指两个不同分子内基本互补或互补核酸序列的配对。配对可以通过任何过程实现，其中核酸序列通过碱基配对与基本互补或完全互补的序列连接以形成杂交复合物。为了杂交的目的，如果两个核酸序列中至少60％(例如，至少70％、至少80％或至少90％)的个体碱基彼此互补，则两个核酸序列是“基本互补的”。[0222](ix)引物[0223]“引物”是具有3′末端的单链核酸序列，可在核酸延伸反应中用作核酸聚合酶的化学底物。rna引物由rna核苷酸形成，用于rna合成，而dna引物由dna核苷酸组成，用于dna合成。引物还可以包括rna核苷酸和dna核苷酸(例如，以随机或设计的模式)。引物还可以包括本文所述的具有其它功能性的其他天然或合成核苷酸。在一些示例中，dna引物可用于引发rna合成，反之亦然(例如，rna引物可用于引发dna合成)。引物的长度可以不同。例如，引物可以是约6个碱基到约120个碱基。例如，引物可包括多达约25个碱基。[0224](x)引物延伸[0225]“引物延伸”是指其中两个核酸序列(例如，来自两个不同捕获探针中每一个的恒定区域)通过其各自末端互补核酸序列(例如，3′末端)的重叠而连接(例如，杂交)的任何方法。在这种连接之后，可以使用另一个核酸序列作为延伸模板来进行一个或两个末端的核酸延伸(例如，酶延伸)。酶延伸可由包括但不限于聚合酶和/或逆转录酶的酶来进行。[0226](xi)邻近连接[0227]“邻近连接”是通过酶手段(例如连接酶)连接彼此邻近的两个(或更多)核酸序列的方法。在一些实施方式中，邻近连接可包括“间隙填充”步骤，该步骤涉及基于模板核酸分子的核酸序列通过聚合酶在跨越两个感兴趣核酸分子之间的距离上纳入一个或多个核酸(参见，例如，美国专利号7264929，其全部内容通过引用纳入本文)。[0228]各种不同的方法可用于邻近连接核酸分子，包括(但不限于)“粘端”和“钝端”连接。此外，单链连接可用于对单链核酸分子进行邻近连接。粘端邻近连接是在连接事件发生之前，将待连接的两个核酸分子之间的互补单链序列杂交。钝端邻近连接通常不包括来自每个核酸分子的互补区域的杂交，因为两个核酸分子在连接位点都缺乏单链突出端。[0229](xii)核酸延伸[0230]“核酸延伸”通常涉及以模板依赖的方式将一个或多个核酸(例如，a、g、c、t、u、核苷酸类似物或其衍生物)纳入分子(例如但不限于核酸序列)中，使得连续的核酸被酶(例如聚合酶或逆转录酶)纳入，从而生成新合成的核酸分子。例如，通过使用互补核酸序列作为核酸合成的模板，可以使用与互补核酸序列杂交的引物来合成新的核酸分子。类似地，与多聚(dt)序列(例如，捕获域)杂交的mrna转录物的3′多聚腺苷酸化尾可以用作相应cdna分子的单链合成的模板。[0231](xiii)pcr扩增[0232]“pcr扩增”是指利用聚合酶链反应(pcr)生成遗传物质的拷贝，包括dna和rna序列。例如，在美国专利号4683202、4683195、4800159、4965188和5512462中描述了实施pcr的合适试剂和条件，其全部内容通过引用纳入本文中。在典型的pcr扩增中，反应混合物包括待扩增的遗传物质、酶、用于引物延伸反应的一个或多个引物以及用于反应的试剂。寡核苷酸引物的长度足以在退火条件下与互补遗传物质杂交。引物的长度通常取决于扩增结构域的长度，但通常为至少4个碱基、至少5个碱基、至少6个碱基、至少8个碱基、至少9个碱基、至少10个碱基对(bp)、至少11bp、至少12bp、至少13bp、至少14bp、至少15bp、至少16bp、至少17bp、至少18bp，至少19bp，至少20bp，至少25bp，至少30bp，至少35bp，可以长达40bp或更长，其中引物的长度一般在18‑50bp之间。遗传物质可与单个引物或一组两个引物(正向和反向引物)接触，这取决于是否需要对遗传物质进行引物延伸、线性或指数扩增。[0233]在一些实施方式中，pcr扩增过程使用dna聚合酶。dna聚合酶活性可由一种或多种不同的dna聚合酶提供。在某些实施方式中，dna聚合酶来自细菌，例如，dna聚合酶是细菌dna聚合酶。例如，dna聚合酶可以来自大肠杆菌属、芽孢杆菌属、嗜热杆菌属或热球菌属的细菌。[0234]可使用的dna聚合酶的合适示例包括但不限于：大肠杆菌dna聚合酶i、bsudna聚合酶、bstdna聚合酶、taqdna聚合酶、venttmdna聚合酶，deepventtmdna聚合酶，taqdna聚合酶，热启动taqdna聚合酶，crimsontaqdna聚合酶，crimsontaqdna聚合酶，dna聚合酶，quickdna聚合酶，hemodna聚合酶，dna聚合酶，dna聚合酶，高保真dna聚合酶，铂pfxdna聚合酶、accuprimepfxdna聚合酶、phi29dna聚合酶、klenow片段、pwodna聚合酶、pfudna聚合酶、t4dna聚合酶和t7dna聚合酶。[0235]术语“dna聚合酶”不仅包括天然存在的酶，还包括其所有修饰衍生物，还包括天然存在的dna聚合酶的衍生物。例如，在一些实施方式中，dna聚合酶可经修饰以移除5′‑3′核酸外切酶活性。可使用的dna聚合酶的序列修饰衍生物或突变体包括但不限于保留至少部分功能的突变体，例如野生型序列的dna聚合酶活性。在不同的反应条件下，如温度、模板浓度、引物浓度等，突变可影响酶的活性概况，如提高或降低聚合速率。突变或序列修饰也可能影响酶的核酸外切酶活性和/或热稳定性。[0236]在一些实施方式中，pcr扩增可包括例如但不限于链置换扩增反应、滚环扩增反应、连接酶链反应、转录介导的扩增反应、等温扩增反应和/或环介导的扩增反应的反应。[0237]在一些实施方式中，pcr扩增使用与靶dna片段的3′标签互补的单个引物。在一些实施方式中，pcr扩增使用第一和第二引物，其中第一引物的至少3′末端部分与目标核酸片段的3′标签的至少部分互补，以及其中所述第二引物的至少3′末端部分展示所述靶核酸片段的5′标签的至少部分的序列。在一些实施方式中，第一引物的5′末端部分与目标核酸片段的3′标签不互补，并且第二引物的5′末端部分不展示目标核酸片段的5′标签的至少部分的序列。在一些实施方式中，第一引物包括第一通用序列和/或第二引物包括第二通用序列。[0238]在一些实施方式中(例如，当pcr扩增对捕获的dna进行扩增时)，可以使用dna连接酶将pcr扩增产物连接到其它序列。dna连接酶活性可由一种或多种不同的dna连接酶提供。在一些实施方式中，dna连接酶来自细菌，例如，dna连接酶是细菌dna连接酶。在一些实施方式中，dna连接酶来自病毒(例如，噬菌体)。例如，dna连接酶可以是t4dna连接酶。适用于连接步骤的其他酶包括但不限于tthdna连接酶、taqdna连接酶、热球菌属(菌株9on)dna连接酶(9ontmdna连接酶，可从马萨诸塞州伊普斯维奇的新英格兰生物实验室(newenglandbiolabs)获得)和ampligasetm(可从威斯康星州麦迪逊的艾匹森特生物技术公司(epicentrebiotechnologies)获得)。也可以使用衍生物，例如序列修饰的衍生物和/或其突变体。[0239]在一些实施方式中，通过逆转录聚合酶链反应(rt‑pcr)扩增遗传物质。期望的逆转录酶活性可由一种或多种不同的逆转录酶提供，其合适示例包括但不限于：m‑mlv、mulv、amv、hiv、arrayscripttm、multiscribetm、thermoscripttm、和i、ii、iii和iv酶。“逆转录酶”不仅包括天然存在的酶，而且包括其所有此类修饰衍生物，还包括天然存在的逆转录酶的衍生物。[0240]此外，可以使用m‑mlv、mulv、amv和hiv逆转录酶的序列修饰衍生物或突变体来进行逆转录，包括保留野生型序列的至少一些功能性(例如逆转录酶)活性的突变体。所述逆转录酶可作为包含其他组分的组合物的部分提供，例如增强或改善所述逆转录酶活性的稳定组分，例如rna酶抑制剂、dna依赖性dna合成的抑制剂，例如，放线菌素d。许多逆转录酶的序列修饰衍生物或突变体，例如m‑mlv，以及包括未修饰和修饰酶的组合物，例如arrayscripttm、multiscribetm、thermoscripttm、和i、ii、iii和iv酶是市售可得的。[0241]某些逆转录酶(例如禽成髓细胞增多症病毒(amv)逆转录酶和莫罗尼鼠白血病病毒(m‑mulv，mmlv)逆转录酶)可以使用rna(cdna合成)和单链dna(ssdna)作为模板来合成互补dna链。因此，在一些实施方式中，逆转录反应可使用能够使用rna和ssdna两者作为延伸反应模板的酶(逆转录酶)，例如amv或mmlv逆转录酶。[0242]在一些实施方式中，rna和/或dna的定量通过实时pcr(也称为定量pcr或qpcr)，使用本领域众所周知的技术进行，例如但不限于“taqmantm”或或在毛细管上(“毛细管”)。在一些实施方式中，通过光吸收率和实时pcr来确定遗传物质的定量。在一些实施方式中，通过数字pcr来确定遗传物质的定量。在一些实施方式中，所分析的基因可对应于表达(mrna)和数量(dna)与参考核酸提取物(dna和rna)进行比较，以便比较靶核酸的表达水平。[0243](xiv)抗体[0244]“抗体”是一种多肽分子，其识别并结合互补的靶抗原。抗体通常具有类似y形的分子结构形状。自然产生的抗体，被称为免疫球蛋白，属于免疫球蛋白类igg、igm、iga、igd和ige之一。抗体也可以人工合成。例如，作为单克隆抗体的重组抗体可以通过从源细胞中回收抗体基因、扩增到适当的载体中并将载体引入宿主以使宿主表达重组抗体来使用合成基因来合成。一般来说，可以使用合适的寡核苷酸引物和/或杂交探针从任何抗体产生动物物种中克隆重组抗体。重组技术可用于生成抗体和抗体片段，包括非内源性物质。[0245]合成抗体可以从非免疫球蛋白来源获得。例如，抗体可由核酸(例如适配子)和非免疫球蛋白支架(例如肽适配子)产生，其中插入高变环以形成抗原结合位点。基于核酸或肽结构的合成抗体可以比免疫球蛋白衍生的抗体小，从而导致更大的组织透化。[0246]抗体还可以包括亲和体蛋白(affimerprotein)，亲和体蛋白是通常具有约12‑14kda分子量的亲和试剂。亲和体蛋白通常以高亲和力和特异性结合靶标(例如，靶蛋白)。此类靶标的示例包括但不限于泛素链、免疫球蛋白和c‑反应蛋白。在一些实施方式中，亲和体蛋白衍生自半胱氨酸蛋白酶抑制剂，并且包括肽环和提供结合位点的可变n‑末端序列。[0247]抗体还可以包括单域抗体(vhh结构域和vnar结构域)、scfv和fab片段。[0248](xv)亲和基团[0249]“亲和基团”是具有与另一特定或具体分子或部分缔合或结合的高亲和性或偏好的分子或分子部分。与另一特定或具体分子或部分的缔合或结合可以通过非共价相互作用，例如氢键、离子力和范德华相互作用。例如，亲和基团可以是生物素，其具有与蛋白亲和素或链霉亲和素缔合或结合的高亲和性或偏好。例如，亲和基团也可指与生物素具有亲和性的亲和素或链霉亲和素。亲和基团及其结合或缔合的特定或具体分子或部分的其它示例包括但不限于抗体或抗体片段及其各自的抗原，例如地高辛和抗地高辛抗体、凝集素和碳水合合物(例如，糖、单糖、双糖或多糖)，以及受体和受体配体。[0250]任何一对亲和基团及其与之结合或缔合的特定或具体分子或部分可使其作用逆转，例如，在第一分子和第二分子之间，在第一示例中，第一分子被表征为第二分子的亲和基团，在第二示例中，第二分子被表征为第一分子的亲和基团。[0251](xvi)标记物，可检测标记物和光学标记物[0252]术语“可检测标记物”、“光学标记物”和“标记物”在本文中可互换使用以指与待检测分子(例如，捕获探针或分析物)相关联(例如，偶联)的直接或间接可检测部分。可检测标记物可由其自身而可直接检测(例如，放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者，在酶标记物的情况下，可以是可间接检测的，例如，通过催化化学底物化合物或组合物的化学改变，该化学底物化合物或组合物可直接检测。可检测标记物可适于小规模检测和/或适于高通量筛选。因此，合适的可检测标记物包括但不限于放射性同位素、荧光团、化学发光化合物、生物发光化合物和染料。[0253]可检测标记物可被定性检测(例如，光学或光谱)，或可被定量。定性检测通常包括确认可检测标记物的存在或出现的检测方法，而可定量检测通常包括具有可定量(例如，数字可报告)值的检测方法，例如强度、持续时间、偏振和/或其他性质。在一些实施方式中，可检测标记物被结合到特征或与特征相关联的捕获探针。例如，被可检测标记的特征可包括附接于珠的荧光、比色或化学发光标记物(参见例如，rajeswari等，j.microbiolmethods139：22‑28，2017，和forcucci等，j.biomedopt.10：105010，2015，其全部内容通过引用纳入本文)。[0254]在一些实施方式中，可将多个可检测标记物附接到待检测的特征、捕获探针或组合物。例如，可检测标记物可在核酸聚合或扩增期间纳入(例如，可检测标记物可在核酸聚合或扩增期间纳入(例如，例如)。可以使用任何合适的可检测标记物。在一些实施方式中，可检测标记物是荧光团。例如，荧光团可来自以下组：7‑aad(7‑氨基放线菌素d)、吖啶橙( dna)、吖啶橙( rna)、rna)、rna)、rna)、alexaalexaalexaalexa别藻蓝蛋白(apc)、amca/amca‑x、7‑氨基放线菌素d(7‑aad)、7‑氨基‑4‑甲基香豆素、6‑氨基喹啉、苯胺蓝、ans、apc‑cy7、atto‑tagtmcbqca，atto‑tagtmfq、金胺o‑feulgen、bcecf(高ph)、bfp(蓝色荧光蛋白)、bfp/gfpfret、bobotm‑1/bo‑protm‑1、bobotm‑3/bo‑protm‑3、3、3、btc、钙黄绿素、钙黄绿素蓝、calciumcrimsontm，calciumgreen‑1tm，calciumorangetm，白，5‑羧基荧光素(5‑fam)，5‑羧基萘荧光素，6‑羧基罗丹明6g，5‑羧基四甲基罗丹明(5‑tamra)，羧基‑x‑罗丹明(5‑rox)，cascadecascadeyellowtm，ccf2(geneblazertm)、cfp(青色荧光蛋白)、cfp/yfpfret、色霉素a3、cl‑nerf(低ph)、cpm、6‑cr6g、ctc‑甲cychrome(pe‑cy5)、丹磺酰胺、丹磺酰尸胺、丹氨酰氯、dapi、达考氧基(dapoxyl)、dcfh、dhr、dia(4‑di‑16‑asp)、did(dilc18(5))、dids、dil(dilc18(3))、dio(dioc18(3))、dir(dilc18(7))、di‑4anepps、di‑8anepps、dm‑nerf(4.5‑6.5ph)、dsred(红色荧光蛋白)、ebfp、ecfp、egfp、醇、曙红、红霉素、溴化乙锭、乙锭同二聚体‑1(ethd‑1)、氯化铕(iii)、5‑fam(5‑羧基荧光素)、快蓝、荧光素dt磷酰胺、fitc、f1uo‑3、fluo‑4、fluoro‑goldtm(高ph)，fluoro‑goldtm(低ph)、f1uoro‑jade、1‑43、fura‑2(高钙)、fura‑2/bcecf、furaredtm(高钙)，furaredtm/fluo‑3，geneblazertm(ccf2)，gfp红移(rsgfp)，gfp野生型，gfp/bfp‑fret，gfp/dsred‑fret，hoechst33342&33258，7‑羟基‑4‑甲基香豆素(ph9)，1，5‑吲哚乙酸，indo‑1(高钙)，indo‑1(低钙)，吲哚二碳菁，吲哚三碳菁，jc‑1，6‑joe，jojotm‑1/jo‑protm‑1，lds751( dna)，lds751( rna)，lolotm‑1/lo‑protm‑1，路西法黄，lysosensortm蓝(ph5)，lysosensortm绿(ph5)，lysosensortm黄/蓝(ph4.2)、绿、红、黄、mag‑fura‑2、mag‑indo‑1、magnesiumgreentm，marina4‑甲基伞形酮，米特拉霉素，绿，橙，红，nbd(胺)，尼罗红，oregonoregonoregon太平洋蓝，pbf1，pe(r‑藻红蛋白)，pe‑cy5，pe‑cy7，pe‑德州红，percp(多甲藻黄素叶绿素蛋白质)，percp‑cy5.5(trured)，pharred(apc‑cy7)，c‑藻蓝蛋白、r‑藻蓝蛋白、r‑藻红蛋白(pe)、pi(碘化丙啶)、pkh26、pkh67、popotm‑1/po‑protm‑1，popotm‑3/po‑protm‑3，碘化丙啶(pi)，pympo，芘，吡咯啉y，量子红(pe‑cy5)，喹吖因氮芥，r670(pe‑cy5)，red613(pe‑德州红)，红色荧光蛋白(dsred)，试卤灵，rh414，rhod‑2，罗丹明b，rhodaminegreentm，rhodamineredtm，罗丹明鬼笔环肽，罗丹明110，罗丹明123，5‑rox(羧基‑x‑罗丹明)，s65a，s65c，s65l，s65t，sbfi，sits，(高ph)，(高ph)，(低ph)，sodiumgreentm，，蓝，绿，橙，5‑tamra(5‑羧基四甲基罗丹明)，四甲基罗丹明(tritc)，texastexas(nhs酯)，硫杂二羰花青，噻唑橙，噻唑橙，三色(pe‑cy5)、tritc(四甲基罗丹明)、trured(percp‑cy5.5)、ww781、x‑罗丹明(xritc)、y66f、y66h、y66w、yfp(黄色荧光蛋白)、6‑fam(荧光素)、6‑fam(nhs酯)、6‑fam(叠氮化物)、hex、tamra(nhs酯)，yakima黄，max，tet，tex615，atto488，atto532，atto550，atto565，attorho101，atto590，atto633，atto647n，tye563，tye665，tye705，(nhs酯)，wellredd4染料，wellredd3染料，wellredd2染料，(nhs酯)和dy750(nhs酯)。[0255]如上所述，在一些实施方式中，可检测标记物是或包括发光或化学发光部分。常见的发光/化学发光部分包括但不限于过氧化物酶，例如辣根过氧化物酶(hrp)、大豆过氧化物酶(sp)、碱性磷酸酶和荧光素酶。这些蛋白质部分可在给定适当化学底物(例如氧化试剂加化学发光化合物)的情况下催化化学发光反应。许多化合物家族已知在各种条件下提供化学发光。化学发光化合物家族的非限制性示例包括2，3‑二氢‑1，4‑酞嗪二酮鲁米那，5‑氨基‑6，7，8‑三甲氧基‑和二甲氨基[ca]苯类似物。这些化合物在碱性过氧化氢或次氯酸钙和碱存在下能发光。化学发光化合物家族的其它示例包括(例如)2，4，5‑三苯基咪唑、对二甲氨基和‑甲氧基取代基、草酸盐(例如草酰基活性酯)、对硝基苯基、n‑烷基吖啶酯、荧光素、光泽精或吖啶酯。[0256](xvii)模板转换寡核苷酸[0257]“模板转换寡核苷酸”是一种寡核苷酸，在逆转录过程中与通过逆转录酶(例如，具有末端转移酶活性的酶)添加的未模板化的核苷酸杂交。在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸与通过逆转录酶添加的未模板化的多聚(c)核苷酸杂交。在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸向用于cdna扩增的全长cdna添加共同5′序列。[0258]在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸将共同序列添加到正被逆转录的rna的5′端。例如，模板转换寡核苷酸可与添加到cdna分子末端的未模板化的多聚(c)核苷酸杂交，并为逆转录酶提供模板以继续复制到模板转换寡核苷酸的5′末端，从而生成能够进行进一步扩增的全长cdna。在一些实施方式中，一旦生成全长cdna分子，模板转换寡核苷酸可作为cdna扩增反应中的引物。[0259]在一些实施方式中，在逆转录或其他基于末端转移酶的反应之前、同时或之后添加模板转换寡核苷酸。在一些实施方式中，捕获探针中包括模板转换寡核苷酸。在某些实施方式中，使用模板转换寡核苷酸的样品分析方法可涉及从组织样品的分析物生成核酸产物，随后使用模板转换寡核苷酸进一步处理核酸产物。[0260]模板转换寡核苷酸可以包括杂交区和模板区。杂交区可以包括能够与靶标杂交的任何序列。在一些实施方式中，杂交区例如可包括连续g碱基以与cdna分子3′端的突出端c碱基互补。连续g碱基可包括1个g碱基、2个g碱基、3个g碱基、4个g碱基、5个g碱基或超过5个g碱基。模板序列可以包括待纳入cdna的任何序列。在其它实施方式中，除了至少一个g碱基之外，杂交区可包括至少一个碱基。在其它实施方式中，杂交可包括非g碱基的碱基。在一些实施方式中，模板区包括至少1个(例如，至少2个、3个、4个、5个或更多)标签序列和/或功能序列。在一些实施方式中，模板区和杂交区由间隔子分开。[0261]在一些实施方式中，模板区包括条形码序列。条形码序列可以作为空间条形码和/或作为独特分子标识符发挥作用。模板转换寡核苷酸可包括脱氧核糖核酸；核糖核酸；修饰的核酸，包括2‑氨基嘌呤、2，6‑二氨基嘌呤(2‑氨基‑da)、反向dt、5‑甲基dc、2′‑脱氧肌苷、超t(5‑羟基丁基‑2′‑脱氧尿苷)、超g(8‑氮杂‑7‑脱氮鸟苷)、锁核酸(lna)、解锁核酸(una，例如，una‑a、una‑u、una‑c、una‑g)、iso‑dg、iso‑dc、2′氟碱基(例如，氟c、氟u、氟a和氟g)或上述的任何组合。[0262]在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸的长度可至少为约1、2、10、20、50、75、100、150、200或250个核苷酸或更长。在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸的长度最多可为约2、10、20、50、100、150、200或250个核苷酸或更长。[0263](xviii)夹板寡核苷酸[0264]“夹板寡核苷酸”是一种寡核苷酸，当与其他多核苷酸杂交时，它起到“夹板”的作用，使多核苷酸彼此相邻，以便它们可以连接在一起。在一些实施方式中，夹板寡核苷酸是dna或rna。夹板寡核苷酸可以包括与来自两个或更多个不同寡核苷酸的核苷酸序列部分互补的核苷酸序列。在一些实施方式中，夹板寡核苷酸协助连接“供体”寡核苷酸和“受体”寡核苷酸。一般来说，rna连接酶、dna连接酶或其他种类的连接酶用于将两个核苷酸序列连接在一起。[0265]在一些实施方式中，夹板寡核苷酸的长度在10到50个寡核苷酸之间，例如，长度在10到45个、10到40个、10到35个、10到30个、10到25个或10到20个寡核苷酸之间。在一些实施方式中，夹板寡核苷酸的长度介于15和50、15和45、15和40、15和35、15和30、15和30或15和25个核苷酸之间。[0266](c)分析物[0267]本公开中描述的设备、系统、方法和组合物可用于检测和分析多种不同的分析物。就本发明而言，“分析物”可包括任何待分析的生物物质、结构、部分或组分。术语“靶标”可以类似地指感兴趣的分析物。[0268]分析物可大致分为两类：核酸分析物和非核酸分析物。非核酸分析物的示例包括但不限于脂质、碳水合合物、肽、蛋白质、糖蛋白(n‑连接或o‑连接)、脂蛋白、磷蛋白、蛋白质的特定磷酸化或乙酰化变体、蛋白质的酰胺化变体、蛋白质的羟基化变体、蛋白质的甲基化变体，蛋白质泛素化变体、蛋白质硫酸化变体、病毒外壳蛋白、胞外和胞内蛋白质、抗体和抗原结合片段。在一些实施方式中，分析物可以是细胞器(例如，细胞核或线粒体)。[0269]对应于分析物的细胞表面特征可包括但不限于受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白通道、蛋白泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞‑细胞相互作用蛋白复合物，抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化t细胞受体、t细胞受体、b细胞受体、嵌合抗原受体、胞外基质蛋白、细胞表面蛋白的翻译后修饰(例如，磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝化、甲基化、乙酰化或脂质化)状态、间隙连接和粘附连接。[0270]分析物可来自特定类型的细胞和/或特定的亚细胞区。例如，分析物可以来自细胞质、细胞核、线粒体、微粒体，更一般地说，来自细胞的任何其他隔室、细胞器或部分。特定靶向某些细胞室和细胞器的透化剂可用于选择性地从细胞释放分析物以进行分析。[0271]核酸分析物的示例包括dna分析物，例如基因组dna、甲基化dna、特定甲基化dna序列、片段化dna、线粒体dna、原位合成pcr产物和rna/dna杂合体。[0272]核酸分析物的示例还包括rna分析物，例如各种类型的编码和非编码rna。不同类型的rna分析物包括信使rna(mrna)、核糖体rna(rrna)、转移rna(trna)、小rna(mirna)和病毒rna。rna可以是转录物(例如，存在于组织切片中)。rna可以是小的(例如，长度小于200个核酸碱基)或大的(例如，长度大于200个核酸碱基的rna)。小rna主要包括5.8s核糖体rna(rrna)、5srrna、转移rna(trna)、微小rna(mirna)、小干扰rna(sirna)、小核仁rna(snrna)、piwi相互作用rna(pirna)、trna衍生的小rna(tsrna)和小rdna衍生的rna(srrna)。rna可以是双链rna或单链rna。rna可以是环状rna。rna可以是细菌rrna(例如，16srrna或23srrna)。[0273]分析物的其他示例包括mrna和细胞表面特征(例如，使用本文所述的标记剂)、mrna和胞内蛋白质(例如，转录因子)、mrna和细胞甲基化状态、mrna和可获得的染色质(例如，atac‑seq、dna酶‑seq和/或微球菌酶‑seq)、mrna和代谢物(例如，使用本文所述的标记剂)、条码化的标记剂(例如，本文所述的寡核苷酸标记抗体)和免疫细胞受体(例如，t细胞受体)的v(d)j序列、mrna和扰动剂(例如，crisprcrrna/sgrna、talen、锌指核酸酶、和/或如本文所述的反义寡核苷酸)。在一些实施方式中，扰动剂可以是小分子、抗体、药物、适体、mirna、物理环境(例如，温度变化)，或任何其它已知扰动剂。[0274]分析物可包括具有编码免疫细胞受体(例如tcr或bcr)的v(d)j序列的至少部分的核酸序列的核酸分子。在一些实施方式中，核酸分子是首先使用含多聚(t)的引物从相应mrna的逆转录生成的cdna。然后可以使用捕获探针对生成的cdna进行条码化，该捕获探针具有与所生成的cdna的至少部分杂交的条形码序列(和可选的umi序列)。在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸与通过逆转录酶添加到cdna3′端的多聚(c)尾杂交。原始的mrna模板和模板转换寡核苷酸可以从cdna中变性，然后条码化捕获探针可以与cdna杂交并生成cdna的互补物。在2017年10月18日提交的pct专利申请pct/us2017/057269和2017年11月29日提交的美国专利申请序列号15/825,740中描述了适用于对从mrna转录物生成的cdna进行条码化的其他方法和组合物，所述mrna转录物包括编码免疫细胞受体的v(d)j区域的那些，和/或包括模板转换寡核苷酸的组合物和条码化方法，二者均通过引用全文纳入本文。v(d)j分析也可以通过使用一种或多种与免疫细胞特定表面特征结合并与条形码序列相关联的标记剂来完成。一种或多种标记剂可包括mhc或mhc多聚体。[0275]如上所述，所述分析物可包括能够作为基因编辑反应的组分发挥作用的核酸，例如，基于规律成簇的间隔短回文重复序列(crispr)的基因编辑。因此，捕获探针可包括与分析物互补的核酸序列(例如，可与crisprrna(crrna)、单向导rna(sgrna)杂交的序列，或工程化到crrna或sgrna中的衔接子序列)。[0276]在某些实施方式中，可从活细胞中提取分析物。可以调整加工条件，以确保生物样品在分析过程中保持活性，并从样品的活细胞中提取(或释放)分析物。活细胞衍生的分析物只能从样品中获得一次，或者可以从继续保持存活状态的样品中每隔一段时间获得。[0277]一般而言，所述系统、设备、方法和组合物可用于分析任意数量的分析物。例如，所分析的分析物的数量可为至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约20，至少约25、至少约30、至少约40、至少约50、至少约100、至少约1000、至少约10000、至少约100000或更多种不同分析物存在于样品区域中或基材的个体特征内。用于进行多重分析以分析两个或更多不同分析物的方法将在本发明的后续部分中讨论。[0278](d)生物样品[0279](i)生物样品的类型[0280]从对象处获取“生物样品”，以使用各种技术中的任一种进行分析，包括但不限于活检、手术和激光捕获显微镜(lcm)，并且通常包括来自对象的细胞和/或其他生物材料。除上述对象之外，生物样品可获自非哺乳动物生物体(例如，植物、昆虫、蜘蛛、线虫(例如，秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans))、真菌、两栖动物或鱼(例如，斑马鱼))。生物样品还可获自原核生物，例如细菌，例如大肠杆菌(escherichiacoli)、葡萄球菌(staphylococci)或肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)；古细菌；病毒，例如丙型肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒；或类病毒。生物样品可获自真核生物，例如患者来源的类器官(pdo)或患者来源的异种移植物(pdx)。生物样本可以包括类器官，一种在体外产生的器官的微型化和简化版本，可在三个维度上显示出逼真的显微解剖结构。类器官可产生自组织的一种或多种细胞、胚胎干细胞和/或诱导多能干细胞，由于它们的自我更新和分化能力，它们可以在三维培养中自我组织(self‑organize)。在一些实施方式中，类器官是脑类器官、肠类器官、胃类器官、舌类器官、甲状腺类器官、胸腺类器官、睾丸类器官、肝类器官、胰腺类器官、上皮类器官、肺类器官、肾类器官、原肠胚、心脏类器官或视网膜类器官。可从中获得生物样品的对象可以是健康或无症状的个体、患有或怀疑患有疾病(例如，癌症)的个体或对疾病有预处置的个体，和/或需要治疗或怀疑需要治疗的个体。[0281]生物样品可来自本文所述的对象或生物体的同质培养物或群体，或可替代地来自例如群落或生态系统中的若干不同生物体的集合。[0282]生物样品可以包括一个或多个病变细胞。病变细胞可以具有改变代谢特性、基因表达、蛋白质表达和/或形态特征。疾病的例子包括炎症紊乱、代谢紊乱、神经系统紊乱和癌症。癌细胞可以来源于实体瘤、血液系统恶性肿瘤、细胞系，也可以以循环肿瘤细胞形式获得。[0283]生物样品也可以包括胎儿细胞。例如，可以进行例如羊膜穿刺术之类的操作以从母体循环获得胎儿细胞样品。胎儿细胞测序可用于鉴定许多遗传疾病中的任何一种，包括例如非整倍体，例如唐氏综合征、爱德华兹综合征和帕陶综合征。此外，胎儿细胞的细胞表面特征可用于识别多种疾病或病症中的任一种。[0284]生物样品也可以包括免疫细胞。对这类细胞的免疫功能进行序列分析，包括基因组学、蛋白质组学和细胞表面特征，可以提供丰富的信息，有助于了解免疫系统的状态和功能。举例来说，在自体干细胞移植后确定多发性骨髓瘤(mm)患者中最小残留病(mrd)的状态(例如阴性或阳性)被认为是mm患者中mrd的预测因素(参见，例如，美国专利申请公开号2018/0156784，其通过引用全文纳入本文)。[0285]生物样品中的免疫细胞的示例包括但不限于b细胞、t细胞(例如，细胞毒性t细胞、自然杀伤性t细胞、调节性t细胞和辅助性t细胞)、自然杀伤细胞、细胞因子诱导的杀伤(cik)细胞、髓样细胞，例如粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞/多节核中性粒细胞)、单核细胞/巨噬细胞、肥大细胞、血小板/巨核细胞和树突状细胞。[0286]生物样品可以包括任何数量的大分子，例如细胞大分子和细胞器(例如线粒体和细胞核)。生物样品可以是核酸样品和/或蛋白质样品。生物样品可以是碳水合合物样品或脂质样品。生物样品可以作为组织样品获得，例如组织切片、活检、核心活检、针吸或细针吸。样品可以是液体样品，例如血液样品、尿液样品或唾液样品。样品可以是皮肤样品、结肠样品、颊拭子、组织学样品、组织病理学样品、血浆或血清样品、肿瘤样品、活细胞、培养细胞、临床样品，例如全血或血液衍生产品、血细胞或培养组织或细胞，包括细胞悬浮液。[0287]无细胞生物样品可包括胞外多核苷酸。胞外多核苷酸可以从身体样品，例如血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜排泄物、痰、粪便和眼泪中分离出来。[0288]如上所述，生物样品可包括单个感兴趣的分析物或多个感兴趣的分析物。在本发明的后续部分中讨论用于进行多重分析以分析单个生物样品中的两个或更多个不同分析物的方法。[0289](ii)生物样品的制备[0290]可以进行各种步骤来制备用于分析的生物样品。除非另有说明，以下描述的制备步骤通常可以以任何方式组合以适当地制备用于分析的特定样品。[0291](1)组织切片[0292]生物样品可以从对象身上获取(例如，通过外科活检、整个对象切片)，作为细胞群在生长基材或培养皿上体外生长，或作为组织薄片或组织切片制备。生长的样品可以足够薄，无需进一步的处理步骤即可进行分析。或者，生长的样品和通过活检或切片获得的样品可以使用机械切割设备(例如振动刀片切片机)制备为薄组织切片。作为另一替代方案，在一些实施方式中，可以通过向合适的基材材料施用生物样品印片(toughimprint)来制备薄组织切片。[0293]组织切片的厚度可以是细胞最大截面尺寸的分数(例如，小于0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1)。然而，也可以使用厚度大于最大截面细胞尺寸的组织切片。例如，可以使用例如10‑20微米厚的低温恒温切片。[0294]更一般地，组织切片的厚度通常取决于用于制备切片的方法和组织的物理特性，因此可以制备和使用具有多种不同厚度的切片。例如，组织切片的厚度可以为至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、1.0、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、20、30、40或50微米。如果需要或方便，也可以使用更厚的切片，例如，至少70、80、90或100微米或更大。通常，组织切片的厚度在1‑100微米、1‑50微米、1‑30微米、1‑25微米、1‑20微米、1‑15微米、1‑10微米、2‑8微米、3‑7微米或4‑6微米之间，但是如上所述，也可以分析厚度大于或小于这些范围的切片。[0295]也可以从单个生物样品中获得多个切片。例如，通过使用切片刀片对活检样品进行连续切片，可以从外科活检样品获得多个组织切片。以这种方式可以保存连续切片之间的空间信息，并且可以连续分析切片以获得关于生物样品的三维信息。[0296](2)冷冻[0297]在一些实施方式中，生物样品(例如，如上所述的组织切片)可通过在适合于维持或保持组织结构的完整性(例如，物理特性)的温度下的深度冷冻来制备。例如，该温度可低于‑20℃，或低于‑25℃、‑30℃、‑40℃、‑50℃、‑60℃、‑70℃、‑80℃、‑90℃、‑100℃、‑110℃、‑120℃、‑130℃、‑140℃、‑150℃、‑160℃、‑170℃、‑180℃、‑190℃或‑200℃。冷冻组织样品可使用任何数量的合适方法切(例如，薄切)到基材表面上。例如，可使用冷冻切片机(例如，低温恒温器)制备组织样品，所述冷冻切片机设置在适于维持组织样品的结构完整性和样品中核酸的化学性质的温度。例如，这种温度可以低于‑15℃、低于‑20℃或低于‑25℃。样品可以在异戊烷和液氮中速冻。冷冻样品可以在包埋之前储存在密封容器中。[0298](3)甲醛固定和石蜡包埋[0299]在一些实施方式中，可以使用甲醛固定和石蜡包埋(ffpe)来制备生物样品，这是已确立的方法。在一些实施方式中，可以使用甲醛固定和石蜡包埋制备细胞悬浮液和其他非组织样品。固定样品并将其包埋在石蜡或树脂块中后，样品可按上述方法进行切片。在分析之前，石蜡包埋材料可通过在适当溶剂(例如二甲苯)中孵育组织切片并随后冲洗(例如99.5％乙醇2分钟、96％乙醇2分钟和70％乙醇2分钟)从组织切片中移除(例如，脱石蜡)。[0300](4)固定[0301]作为上述甲醛固定的替代方法，可以将生物样品固定在各种其他固定剂中的任一种中，以在分析之前保持样品的生物结构。例如，可以通过浸入乙醇、甲醇、丙酮、甲醛(例如，2％甲醛)、多聚甲醛‑曲通、戊二醛或它们的组合来固定样品。[0302]在一些实施方式中，丙酮固定与新鲜冷冻样品一起使用，新鲜冷冻样品可包括但不限于皮质组织、小鼠嗅球、人脑肿瘤、人死后大脑和乳腺癌样品。在一些实施方式中，基于期望的工作流程选择和/或优化相容的固定方法。例如，可以选择甲醛固定为与使用ihc/if方案进行蛋白质可视化的工作流程相容。作为另一个示例，可以为重视rna/dna文库质量的工作流程选择甲醇固定。在一些应用中可以选择丙酮固定来透过组织。当进行丙酮固定时，可以不进行预透化步骤(如下所述)。或者，丙酮固定可结合透化步骤进行。[0303](5)包埋[0304]作为上述石蜡包埋的替代方法，生物样品可以包埋在各种其他包埋材料中的任一种中，以便在切片和其他处理步骤之前为样品提供基材。一般来说，在分析从样品中获得的组织切片之前，先移除包埋材料。合适的包埋材料包括但不限于蜡、树脂(例如甲基丙烯酸树脂)、环氧树脂和琼脂。[0305](6)染色[0306]为了便于可视化，生物样品可以使用多种染色剂和染色技术进行染色。在一些实施方式中，可使用任意数量的生物染色剂对样品进行染色，包括但不限于吖啶橙、俾斯麦棕、胭脂红、考马斯蓝、甲酚紫、dapi、曙红、溴化乙锭、酸性品红、苏木精、霍氏染色剂、碘、甲基绿、亚甲基蓝、中性红、尼罗蓝、尼罗红、四氧化锇、碘化丙啶、罗丹明或藏红。[0307]样品可以使用已知的染色技术染色，包括坎格伦瓦染色(can‑grunwald)、姬姆萨染色(giemsa)、苏木精和伊红(h&e)、哲纳尔氏染色(jenner′s)、利什曼染色(leishman)、马松(masson′s)三色、巴氏(papanicolaou)、罗曼落司基染色(romanowsky)、银染(silver)、苏丹(sudan)、瑞氏染色(wright′s)和/或pas染色法染色技术。pas染色通常在甲醛或丙酮固定后进行。[0308]在一些实施方式中，可以使用如本文他处所述的可检测标记物(例如，放射性同位素、荧光团、化学发光化合物、生物发光化合物和染料)对生物样品进行染色。在一些实施方式中，仅使用一种类型的染色剂或一种技术对生物样品进行染色。在一些实施方式中，染色包括生物染色技术，例如h&e染色。在一些实施方式中，染色包括使用荧光偶联抗体鉴定分析物。在一些实施方式中，使用两种或更多种不同类型的染色剂或两种或更多种不同的染色技术对生物样品进行染色。例如，可以通过使用一种技术(例如，h&e染色和明场成像)进行染色和成像，然后使用另一种技术(例如，ihc/if染色和荧光显微镜)对同一生物样品进行染色和成像，来制备生物样品。[0309]在一些实施方式中，生物样品可以脱色。生物样品的去污或脱色方法在本领域是已知的，并且通常取决于应用于样品的染色剂的性质。例如，h&e染色可以通过在hcl中清洗样品来脱色。在一些实施方式中，脱色可以包括在hcl中的1、2、3或更多次洗涤。在一些实施方式中，脱色可包括将hcl添加到下游溶液(例如透化溶液)中。作为另一个示例，在一些实施方式中，通过抗体偶联将一种或多种免疫荧光染色剂施用于样品。这些染色剂可以使用例如通过还原剂和洗涤剂洗涤处理的二硫键的裂解、潮变性盐处理、抗原回收溶液处理和酸性甘氨酸缓冲液处理等技术移除。例如，bolognesi等，j.histochem.cytochem.2017；65(8)：431‑444，lin等，natcommun.2015；6：8390，pirici等，j.histochem.cytochem.2009；57：567‑75，和glass等，j.histochem.cytochem.2009；57：899‑905中描述了多重染色和脱色的方法，其全部内容通过引用纳入本文。[0310](7)水凝胶包埋[0311]在一些实施方式中，水凝胶形成发生在生物样品内。在一些实施方式中，生物样品(例如，组织切片)包埋在水凝胶中。在一些实施方式中，将水凝胶亚基注入生物样品中，并且水凝胶的聚合由外部或内部刺激引发。如本文所述的“水凝胶”可包括亲水聚合物链的交联3d网络。″水凝胶亚基″可以是可聚合(例如交联)以形成三维(3d)水凝胶网络的亲水单体、分子前体或聚合物。[0312]水凝胶可以在有水的情况下溶胀。在一些实施方式中，水凝胶包含天然材料。在一些实施方式中，水凝胶包含合成材料。在一些实施方式中，水凝胶包括杂化材料，例如，水凝胶材料包括同时具有合成聚合物和天然聚合物的成分。可以使用在水凝胶或包含本文所述的基于多肽的材料的水凝胶中使用的任何材料。以这种方式包埋样品通常涉及将生物样品与水凝胶接触，使得生物样品被水凝胶包围。例如，可以通过将样品与合适的聚合物材料接触并活化聚合物材料以形成水凝胶来包埋样品。在一些实施方式中，形成水凝胶，使得水凝胶在生物样品内被内化。[0313]在一些实施方式中，通过形成水凝胶的聚合物材料的交联将生物样品固定在水凝胶中。交联可以通过化学和/或光化学方式进行，或者通过本领域已知的任何其他水凝胶形成方法进行。例如，生物样品可以通过聚丙烯酰胺交联固定在水凝胶中。此外，生物样品的分析物可以通过交联(例如聚丙烯酰胺交联)固定在水凝胶中。[0314]水凝胶的组成和对生物样品的应用通常取决于生物样品的性质和制备(例如，切片的、非切片的、新鲜冷冻组织、固定的类型)。水凝胶可以是任何合适的水凝胶，其中在生物样品上形成水凝胶后，生物样品变得锚固或包埋水凝胶中。水凝胶的非限制性示例在本文中描述或在本领域中是已知的。作为一个示例，其中生物样品是组织切片，水凝胶可包括单体溶液和过硫酸铵(aps)引发剂/四甲基乙二胺(temed)促进剂溶液。作为另一个例子，当生物样品由细胞(例如，培养细胞或与组织样品分离的细胞)组成时，细胞可与单体溶液和aps/temed溶液一起孵育。对于细胞，水凝胶形成于隔室中，包括但不限于用于培养、维持或运输细胞的装置。例如，水凝胶可以使用单体溶液加上aps/temed形成，其添加到隔室中的深度在约0.1μm到约5mm之间。[0315]在一些实施方式中，水凝胶包括允许将生物样品锚固至水凝胶的接头。在一些实施方式中，水凝胶包括允许将生物分析物锚固到水凝胶的接头。在这种情况下，可以在水凝胶形成之前、同时或之后将接头添加到水凝胶中。将核酸锚固至水凝胶的接头的非限制性示例可包括6‑((丙烯酰基)氨基)己酸(丙烯酰基‑xse)(可获自赛默飞世尔公司(thermofisher)，马萨诸塞州沃尔瑟姆)、label‑it胺(可获自mirusbio公司，威斯康星州麦迪逊)和labelx)。[0316]在一些实施方式中，可以使用官能化化学。在一些实施方式中，官能化化学包括水凝胶组织化学(htc)。适用于htc的任何水凝胶组织骨架(例如，合成的或天然的)可用于锚定生物大分子和调节官能化。使用htc骨架变体的方法的非限制性示例包括clarity、pact、exm、switch和epact。在一些实施方式中，生物样品内的水凝胶形成是永久的。例如，生物大分子可以永久地粘附在水凝胶上，从而使进行多轮询查。在一些实施方式中，生物样品内的水凝胶形成是可逆的。[0317]在一些实施方式中，在聚合之前、同时和/或之后向水凝胶亚基添加其它试剂。例如，其它试剂可包括但不限于寡核苷酸(例如，捕获探针)、用于片段化dna的核酸内切酶、用于dna的片段化缓冲液、dna聚合酶、用于扩增核酸和将条形码附接到扩增片段上的dntp。可以使用其他酶，包括但不限于rna聚合酶、转座酶、连接酶、蛋白酶k和dna酶。其它试剂还可以包括逆转录酶，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和转换寡核苷酸。在一些实施方式中，在聚合之前、同时和/或之后向水凝胶亚基添加光学标记。[0318]在一些实施方式中，在聚合之前、同时和/或之后向水凝胶添加htc试剂。在一些实施方式中，在聚合之前、同时和/或之后将细胞加标剂添加到水凝胶中。在一些实施方式中，在聚合之前、同时和/或之后将细胞穿透剂添加到水凝胶中。[0319]在一些实施方式中，生物样品被嵌入水凝胶中以促进样品转移至另一个位置(例如，到阵列)。例如，存档的生物样品(例如，ffpe组织切片)可以从存储转移至空间阵列以进行空间分析。在一些实施方式中，基材上的生物样品可以用本文所述的任何预聚物溶液覆盖。在一些实施方式中，可以聚合预聚物溶液，从而在生物样品的上方和/或周围形成水凝胶。水凝胶形成可以以足以将生物样品锚固(例如，包埋进入)到水凝胶的方式发生。在水凝胶形成之后，生物样品被锚固到(例如，包埋进入)水凝胶，其中将水凝胶与基材(例如，载玻片)分离导致生物样品与水凝胶一起从基材中分离。然后可以将包含在水凝胶中的生物样品与空间阵列接触，并对生物样品进行空间分析。[0320]任何种类的特性都可以确定给定生物样品所需的转移条件。可能影响转移条件的特点的非限制性示例包括样品(例如，厚度、固定和交联)和/或感兴趣的分析物(用于保存和/或转移不同分析物(例如dna、rna和蛋白质)的不同条件)。[0321]在一些实施方式中，在生物样品与空间阵列接触之后移除水凝胶。例如，本文所述的方法可包括事件依赖性(例如，光或化学)解聚性水凝胶，其中在施加事件(例如，外部刺激)时，水凝胶解聚。在一个示例中，生物样品可以锚固在dtt敏感型水凝胶上，其中加入dtt可以导致水凝胶解聚并释放锚固的生物样品。[0322]包埋在生物样品中的水凝胶可以用任何合适的方法清除。例如，电泳组织清除方法可用于移除水凝胶包埋样品中的生物大分子。在一些实施方式中，水凝胶包埋的样品在水凝胶清除之前或之后存储在介质(例如，固定介质、甲基纤维素或其他半固体介质)中。[0323]在一些实施方式中，可以调整水凝胶化学以特异性结合(例如，保留)特定种类的分析物(例如，rna、dna、蛋白质等)。在一些实施方式中，水凝胶包括允许将生物样品锚固至水凝胶的接头。在一些实施方式中，水凝胶包括允许将生物分析物锚固到水凝胶的接头。在这种情况下，可以在水凝胶形成之前、同时或之后将接头添加到水凝胶中。将核酸锚固至水凝胶的接头的非限制性示例可包括6‑((丙烯酰)氨基)己酸(丙烯酰‑xse)，label‑it胺和labelx。可能影响转移条件的特点的非限制性示例包括样品(例如，厚度、固定和交联)和/或感兴趣的分析物(用于保存和/或转移不同分析物(例如dna、rna和蛋白质)的不同条件)。[0324]生物样品的水凝胶包埋的其他方法和方面例如在chen等，science347(6221)：543‑548，2015中描述，其全部内容通过引用纳入本文。[0325](8)生物样品转移[0326]在一些实施方式中，使用水凝胶将固定在基材上的生物样品(例如，利用甲醇固定或福尔马林固定和石蜡包埋(ffpe)制备的生物样品)转移至空间阵列。在一些实施方式中，水凝胶形成在基材(例如，载玻片)上的生物样品的上方。例如，水凝胶形成可以以足以将生物样品锚固(例如，嵌入)到水凝胶的方式发生。在水凝胶形成之后，生物样品被锚固到(例如，包埋进入)水凝胶，其中将水凝胶与基材分离导致生物样品与水凝胶一起从基材中分离。然后可以使生物样品与空间阵列接触，从而允许对生物样品进行空间分析。在一些实施方式中，在生物样品与空间阵列接触后移除水凝胶。例如，本文所述的方法可包括事件依赖性(例如，光或化学)解聚性水凝胶，其中在施加事件(例如，外部刺激)时，水凝胶解聚。在一个示例中，生物样品可以锚固在dtt敏感型水凝胶上，其中加入dtt可以导致水凝胶解聚并释放锚固的生物样品。水凝胶可以是任何合适的水凝胶，其中在生物样品上形成水凝胶后，生物样品变得锚固或包埋水凝胶中。水凝胶的非限制性示例在本文中描述或在本领域中是已知的。在一些实施方式中，水凝胶包括允许将生物样品锚固至水凝胶的接头。在一些实施方式中，水凝胶包括允许将生物分析物锚固到水凝胶的接头。在这种情况下，可以在水凝胶形成之前、同时或之后将接头添加到水凝胶中。将核酸锚固至水凝胶的接头的非限制性示例可包括6‑((丙烯酰基)氨基)己酸(丙烯酰基‑xse)(可获自赛默飞世尔公司(thermofisher)，马萨诸塞州沃尔瑟姆)、label‑it胺(可获自mirusbio公司，威斯康星州麦迪逊)和labelx)。任何种类的特性都可以确定给定生物样品所需的转移条件。可能影响转移条件的特点的非限制性示例包括样品(例如，厚度、固定和交联)和/或感兴趣的分析物(用于保存和/或转移不同分析物(例如dna、rna和蛋白质)的不同条件)。在一些实施方式中，水凝胶形成可以以足以将生物样品中的分析物锚固(例如，包埋)到水凝胶的方式发生。在一些实施方式中，水凝胶可以与存在于生物样品中的锚固的分析物(例如，包埋在水凝胶中)一起内陷(例如，收缩)。在一些实施方式中，水凝胶可以与存在于生物样品中的锚固的分析物(例如，包埋在水凝胶中)一起扩展(例如，等距扩展)。在一些实施方式中，水凝胶可以被内陷(例如，收缩)并且随后随着生物样品中存在的锚固的分析物(例如，包埋入水凝胶中)而扩展。[0327](9)等距扩展(isometricexpansion)[0328]在一些实施方式中，包埋在水凝胶中的生物样品可以等距扩展。可用的等距扩展方法包括水合，这是扩展显微镜检中的一个制备步骤，如以下文献中所述，chen等，science347(6221)：543‑548，2015；asano等.currentprotocols.2018，80：1，doi：10.1002/cpcb.56和gao等.bmcbiology.2017，15：50，doi：10.1186/s12915‑017‑0393‑3，wassie，a.t.等，扩展显微镜检：生物研究原理及应用(expansionmicroscopy：principlesandusesinbiologicalresearch)，naturemethods，16(1)：33‑41(2018)，其各自通过引用其全文方式纳入本文。[0329]一般而言，用于进行生物样品等距扩展的步骤可取决于样品的特性(例如，组织切片的厚度、固定、交联)和/或感兴趣的分析物(例如，将rna、dna和蛋白质锚定到凝胶的不同条件)。[0330]等距扩展可以通过将生物样品的一个或多个组分锚定到凝胶上，然后进行凝胶形成、蛋白质水解和溶胀来实现。生物样品的等距扩展可以在生物样品固定在基材上之前发生，或者在生物样品固定在基材上之后发生。在一些实施方式中，可在使扩展的生物样品与空间条形码阵列(例如，基材上的空间条码化的捕获探针)接触之前，从基材移除等距扩展的生物样品。[0331]在一些实施方式中，生物样品中的蛋白质锚定在可溶胀凝胶(例如聚电解质凝胶)上。抗体可在锚定到可溶胀凝胶之前、之后或结合锚定到可溶胀凝胶时定向到蛋白质。生物样品中的dna和/或rna也可以通过合适的接头锚定在可溶胀凝胶上。此类接头的示例包括但不限于6‑((丙烯酰基)氨基)己酸(丙烯酰基‑x‑se)(可从马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞(thermofisher)获得)、labelit胺(可从威斯康辛州麦迪逊的mirusbio获得)和labelx(例如在chen等，nat.methods13：679‑684，2016中描述，其全部内容通过引用纳入本文)。[0332]样品的等距扩展可以提高样品后续分析的空间分辨率。例如，生物样品的等距扩展可导致空间分析(例如，单细胞分析)的分辨率增加。在空间剖面图中增加的分辨率可以通过比较等距扩展的样品和未等距扩展的样品来确定。[0333]在一些实施方式中，生物样品等距扩展至其非扩展的量的至少2x、2.1x、2.2x、2.3x、2.4x、2.5x、2.6x、2.7x、2.8x、2.9x、3x、3.1x、3.2x、3.3x、3.4x、3.5x、3.6x、3.7x、3.8x、3.9x、4x、4.1x、4.2x、4.4x、4.5x、4.6x、4.7x、4.8x或4.9x。在一些实施方式中，样品等距扩展至其非扩展的量的至少2倍且小于20倍。[0334]在一些实施方式中，包埋进入水凝胶的生物样品等距扩展至其非扩展的量的至少2x，2.1x，2.2x，2.3x，2.4x，2.5x，2.6x，2.7x，2.8x，2.9x，3x，3.1x，3.2x，3.3x，3.4x，3.5x，3.6x，3.7x，3.8x，3.9x，4x，4.1x，4.2x，4.3x，4.4x，4.5x，4.6x，4.7x，4.8x，或4.9x。在一些实施方式中，包埋在水凝胶中的生物样品等距扩展至其非扩展的量的至少2x且小于20x。[0335](10)基材附接[0336]在一些实施方式中，生物样品可附接至水凝胶基材。下面详细描述适用于此目的的基材的示例。生物样品的附接可以是不可逆的或可逆的，这取决于样品的性质和分析方法中的后续步骤。[0337]在某些实施方式中，可通过将适当的聚合物覆层施加到基材上并使样品与聚合物覆层接触，将样品可逆地附接到基材上。然后可以使用至少部分溶解聚合物覆层的有机溶剂将样品从基材上分离。水凝胶是适用于此目的的聚合物的例子。[0338]更一般地，在一些实施方式中，可以用一种或多种物质涂覆或官能化基材以促进样品附接到基材上。可用于涂覆基材或使基材功能化的合适物质包括但不限于凝集素、聚赖氨酸、抗体和多糖。[0339](11)未聚集的细胞[0340]在一些实施方式中，生物样品对应于细胞(例如，来自细胞培养物或组织样品)。在具有多个细胞的细胞样品中，多个个体细胞可以自然地不聚集的。例如，细胞可来自细胞悬浮液和/或来自组织或组织切片的分离或解聚的细胞。[0341]或者，样品中的细胞可以聚集，并且可以使用例如酶或机械技术解聚成多个个体细胞。用于酶解聚的酶的示例包括但不限于分散酶、胶原酶、胰蛋白酶或其组合。例如，可以使用组织匀浆器来进行机械解聚。[0342]在未聚集的细胞或解聚的细胞的一些实施方式中，细胞分布在基材上，从而至少一个细胞占据基材上的不同空间特征。细胞可以固定在基材上(例如，以防止细胞的横向扩散)。在一些实施方式中，细胞固定剂可用于在分析物捕获之前将非聚集或解聚的样品固定在空间条码化阵列上。“细胞固定剂”可以指附着于基材的抗体，其可以结合至细胞表面标志物。在一些实施方式中，基材上的多个细胞的分布遵循泊松统计。[0343]在一些实施方式中，来自多个细胞的细胞被固定在基材上。在一些实施方式中，细胞被固定以防止横向扩散，例如通过添加水凝胶和/或通过施加电场。[0344](12)悬浮和贴壁细胞[0345]在一些实施方式中，生物样品可从体外生长的细胞培养物中获得。来自细胞培养物的样品可包括一个或多个悬浮细胞，其在细胞培养物内是锚定独立的。此类细胞的示例包括但不限于衍生自造血细胞及衍生自以下细胞系的细胞系：colo205、ccrf‑cem、hl‑60、k562、molt‑4、rpmi‑8226、sr、hop‑92、nci‑h322m及malme‑3m。[0346]来自细胞培养物的样品可以包括生长在含有培养基的容器表面上的一个或多个贴壁细胞。贴壁细胞的非限制性示例包括du145(前列腺癌)细胞、h295r(肾上腺皮质癌)细胞、hela(宫颈癌)细胞、kbm‑7(慢性粒细胞白血病)细胞、lncap(前列腺癌)细胞、mcf‑7(乳腺癌)细胞、mda‑mb‑468(乳腺癌)细胞、pc3(前列腺癌)细胞、saos‑2(骨癌)细胞、sh‑sy5y(神经母细胞瘤，克隆自骨髓瘤)细胞、t‑47d(乳腺癌)细胞、thp‑1(急性髓系白血病)细胞、u87(胶质母细胞瘤)细胞、国家癌症研究所60癌细胞系小组(nci60)、vero(非洲绿猴肾上皮细胞系)细胞、mc3t3(胚胎颅骨)细胞、gh3(垂体瘤)细胞，pc12(嗜铬细胞瘤)细胞、狗mdck肾上皮细胞、爪蟾a6肾上皮细胞、斑马鱼ab9细胞和sf9昆虫上皮细胞。[0347]贴壁细胞的其他示例如表1所示，并在例如“体外细胞系、可移植动物和人类肿瘤及酵母目录(acatalogofinvitrocelllines，transplantableanimalandhumantumorsandyeast)”，美国国家癌症研究所癌症治疗与诊断司(dctd)(2013年)和abaan等的“nci‑60小组的外显子组：一种用于研究的基因组资源(theexomesofthenci‑60panel：agenomicresourceforcancerbiologyandsystemspharmacology)”，cancerresearch73(14)：4372‑82，2013中进行了分类，其全部内容通过引用纳入本文。[0348]表1：贴壁细胞的示例[0349][0350][0351]在一些实施方式中，贴壁细胞是对应于以下一个或多个细胞系的细胞：bt549、hs578t、mcf7、mda‑mb‑231、mda‑mb‑468、t‑47d、sf268、sf295、sf539、snb‑19、snb‑75、u251、colo205、hcc2998、hct‑116、hct‑15、ht29、km12、sw620、786‑o、a498、achn、caki、rxf393、sn12c、tk‑10、uo‑31、a549、ekvx、hop‑62、hop‑92，nci‑h226、nci‑h23、nci‑h460、nci‑h522、loximvi、m14、malme‑3m、mda‑mb‑435、sk‑、el‑2、sk‑mel‑28、sk‑mel‑5、uacc‑257、uacc‑62、igrov1、ovcar‑3、ovcar‑4、ovcar‑5、ovcar‑8、sk‑ov‑3、nci‑adr‑res、du145、pc‑3、du145、h295r、hela、kbm‑7、lncap、mcf‑7、mda‑mb‑468、pc3、saos‑2、sh‑sy5y、t‑47d、thp‑1、u87、vero、mc3t3、gh3、pc12、狗mdck肾上皮、爪蟾a6肾上皮、斑马鱼ab9和sf9昆虫上皮细胞系。[0352](13)组织透化[0353]在一些实施方式中，生物样品可被透化以促进分析物从样品转移出去，和/或促进物质(例如捕获探针)转移到样品中。如果样品透化不够，则从样品中捕获的分析物量可能过低，无法进行充分的分析。相反，如果组织样品透化性太强，则组织样品内分析物的相对空间关系可能会丢失。因此，在充分透化组织样品以获得良好信号强度同时仍保持样品中分析物分布的空间分辨率之间的平衡是理想的。[0354]一般来说，生物样品可通过将样品暴露于一种或多种透化剂来透化。用于此目的的合适试剂包括但不限于有机溶剂(例如丙酮、乙醇和甲醇)、交联剂(例如多聚甲醛)、洗涤剂(例如皂甙、tritonx‑100tm或tween‑20tm)，或十二烷基硫酸钠(sds)，和酶(如胰蛋白酶、蛋白酶(例如，蛋白酶k))。在一些实施方式中，去污剂是阴离子去污剂(例如sds或n‑月桂酰肌氨酸钠盐溶液)。在一些实施方式中，在酶处理(例如，用本文所述的任何酶，例如胰蛋白酶、蛋白酶(例如胃蛋白酶和/或蛋白酶k)处理)之前或之后，可以使用本文描述的任何方法(例如，使用本文描述的任何去污剂，例如sds和/或n‑月桂酰肌氨酸钠盐溶液)对生物样品进行透化。[0355]在一些实施方式中，生物样品可通过如下方式透化：将样品暴露于大于约1.0w/v％(例如，大于约2.0w/v％、大于约3.0w/v％、大于约4.0w/v％，大于约5.0w/v％，大于约6.0w/v％，大于约7.0w/v％，大于约8.0w/v％，大于约9.0w/v％，大于约10.0w/v％，大于约11.0w/v％，大于约12.0w/v％，或大于约13.0w/v％)十二烷基硫酸钠(sds)和/或n‑月桂酰肌氨酸或n‑月桂酰肌氨酸钠盐。在一些实施方式中，生物样品可通过如下方式透化：(例如，在约4％至约35℃，约4℃至约25℃，约4℃至约20℃，约4℃至约10℃，约10℃至约25℃，约10℃至约20℃，约10℃至约15℃，约35℃至约50℃，约35℃至约45℃，约35℃至约40℃，约40℃至约50℃，约40℃至约45℃，或约45℃至约50℃的温度下)，使所述样品暴露于约1.0w/v％至约14.0w/v％(例如，约2.0w/v％至约14.0w/v％，约2.0w/v％至约12.0w/v％，约2.0w/v％至约10.0w/v％，约4.0w/v％至约14.0w/v％，约4.0w/v％至约12.0w/v％，约4.0w/v％至约10.0w/v％，约6.0w/v％至约14.0w/v％，约6.0w/v％至约12.0w/v％，约6.0w/v％至约10.0w/v％，约8.0w/v％至约14.0w/v％，约8.0w/v％至约12.0w/v％，约8.0w/v％至约10.0w/v％，约10.0％w/v％至约14.0w/v％，约10.0w/v％至约12.0w/v％，或约12.0w/v％至约14.0w/v％)的sds和/或n‑月桂酰肌氨酸盐溶液和/或蛋白酶k(例如，持续约5分钟至约1小时，约5分钟至约40分钟，约5分钟至约30分钟，约5分钟至约20分钟，或约5分钟至约10分钟)。[0356]在一些实施方式中，生物样品可与透化剂一起孵育以促进样品的透化。例如，在jamur等，methodmol.biol.588：63‑66，2010中描述了样品透化的其他方法，其全部内容通过引用纳入本文。[0357]裂解试剂[0358]在一些实施方式中，可通过向样品中添加一种或多种裂解剂使生物样品透化。合适的裂解剂的示例包括但不限于生物活性试剂，例如用于裂解不同细胞类型的裂解酶，例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物，例如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌素、labiase酶、基他酶(kitalase)、溶细胞酶和多种其它市售的裂解酶。[0359]其他裂解剂可另外或替代地添加到生物样品中以促进透化。例如，基于表面活性剂的裂解溶液可用于裂解样品细胞。裂解溶液可包括离子表面活性剂，例如肌氨酰和十二烷基硫酸钠(sds)。更一般而言，化学裂解剂可包括但不限于有机溶剂、螯合剂、洗涤剂、表面活性剂和离液剂。[0360]在一些实施方式中，生物样品可通过非化学透化方法进行透化。本领域已知非化学透化方法。例如，可使用的非化学透化方法包括但不限于物理溶解技术，例如电穿孔、机械透化方法(例如，使用均质器和研磨球机械破坏样品组织结构的珠磨)、声学透化(例如，超声)和热分解技术，例如加热以诱导样品的热透化。[0361]蛋白酶[0362]在一些实施方式中，培养基、溶液或透化溶液可含有一种或多种蛋白酶。在一些实施方式中，用能够降解组蛋白的蛋白酶处理的生物样品可导致产生片段化的基因组dna。可以使用用于捕获mrna的相同捕获域(例如，具有多聚(t)序列的捕获域)来捕获片段化的基因组dna。在一些实施方式中，在空间概况分析之前用能够降解组蛋白的蛋白酶和rna保护剂处理生物样品，以促进基因组dna和mrna的捕获。[0363]在一些实施方式中，通过将样品暴露于能够降解组蛋白的蛋白酶来透化生物样品。如本文所用，术语“组蛋白”通常是指接头组蛋白(例如，h1)和/或核心组蛋白(例如，h2a、h2b、h3和h4)。在一些实施方式中，蛋白酶能降解接头组蛋白、核心组蛋白或接头组蛋白和核心组蛋白。可以使用能够降解生物样品中的组蛋白的任何合适的蛋白酶。能够降解组蛋白的蛋白酶的非限制性示例包括被亮抑酶肽和tlck(甲苯磺酰‑l‑赖氨酰‑氯甲烷盐酸盐)抑制的蛋白酶，由来自沙眼衣原体血清型a(chlamydiatrachomatisserovara)的euo基因编码的蛋白酶，颗粒酶a，丝氨酸蛋白酶(例如，胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶，中性丝氨酸蛋白酶，弹性蛋白酶，组织蛋白酶g)，天冬氨酰蛋白酶(例如，组织蛋白酶d)，肽酶家族c1酶(例如，组织蛋白酶l)，胃蛋白酶，蛋白酶k，被重氮甲烷抑制剂z‑phe‑phe‑chn(2)或环氧化物抑制剂e‑64抑制的蛋白酶，溶酶体蛋白酶或嗜天青酶(例如组织蛋白酶g、弹性蛋白酶、蛋白酶3，中性丝氨酸蛋白酶)。在一些实施方式中，丝氨酸蛋白酶是胰蛋白酶、胰蛋白酶样酶或其功能变体或衍生物(例如，p00761；c0hk48；q8iyp2；q8bw11；q6ie06；p35035；p00760；p06871；q90627；p16049；p07477；p00762；p35031；p19799；p35036；q29463；p06872；q90628；p07478；p07146；p00763；p35032；p70059；p29786；p35037；q90629；p35030；p08426；p35033；p35038；p12788；p29787；p35039；p35040；q8nhm4；p35041；p35043；p35044；p54624；p04814；p35045；p32821；p54625；p35004；p35046；p32822；p35047；c0hka5；c0hka2；p54627；p35005；c0hka6；c0hka3；p52905；p83348；p00765；p35042；p81071；p35049；p51588；p35050；p35034；p35051；p24664；p35048；p00764；p00775；p54628；p42278；p54629；p42279；q91041；p54630；p42280；c0hka4)，或其组合。在一些实施方式中，胰蛋白酶是p00761、p00760、q29463或其组合。在一些实施方式中，能够降解一种或多种组蛋白的蛋白酶包含与p00761、p00760或q29463具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，能够降解一种或多种组蛋白的蛋白酶包含与p00761、p00760或q29463具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。如果蛋白酶相对处于该酶最佳条件下的蛋白酶的活性而言具有至少50％，例如至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性，则认为该蛋白酶是功能性变体。在一些实施方式中，用胃蛋白酶或胃蛋白酶样酶的酶处理可包括：p03954/pepa1_macfu；p28712/pepa1_rabit；p27677/pepa2_macfu；p27821/pepa2_rabit；p0djd8/pepa3_human；p27822/pepa3_rabit；p0djd7/pepa4_human；p27678/pepa4_macfu；p28713/pepa4_rabit；p0djd9/pepa5_human；q9d106/pepa5_mouse；p27823/pepaf_rabit；p00792/pepa_bovin；q9n2d4/pepa_calja；q9gmy6/pepa_canlf；p00793/pepa_chick；p11489/pepa_macmu；p00791/pepa_pig；q9gmy7/pepa_rhife；q9gmy8/pepa_sorun；p81497/pepa_sunmu；p13636/pepa_ursth及其功能性变体和衍生物，或其组合。在一些实施方式中，胃蛋白酶可包括：p00791/pepa_pig；p00792/pepa_bovin，功能性变体，衍生物或其组合。[0364]此外，蛋白酶可以包含在反应混合物(溶液)中，其还包括其它成分(例如缓冲液、盐、螯合剂(例如edta)和/或去污剂(例如sds、n‑月桂酰肌氨酸钠盐溶液))。反应混合物可以带缓冲，具有约6.5‑8.5，例如约7.0‑8.0的ph。此外，反应混合物可以在任何合适的温度下使用，例如约10至50℃，例如约10至44℃、11至43℃、12至42℃、13至41℃、14至40℃、15至39℃、16至38℃、17至37℃，例如约10℃、12℃、15℃、18℃、20℃、22℃，25℃、28℃、30℃、33℃、35℃或37℃，优选约35至45℃，例如约37℃。[0365]其它试剂[0366]在一些实施方式中，透化溶液可以包含其它试剂或者可以用其它试剂处理生物样品以优化生物样品的透化。在一些实施方式中，其它试剂是rna保护剂。如本文所用，术语“rna保护剂”通常是指保护rna免受rna核酸酶(例如，rna酶)影响的试剂。可以使用保护rna免于降解的任何合适的rna保护剂。rna保护剂的非限制性示例包括有机溶剂(例如，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％v/v有机溶剂)，其包括但不限于，乙醇、甲醇、丙‑2‑醇、丙酮、三氯乙酸、丙醇、聚乙二醇、乙酸或它们的组合。在一些实施方式中，rna保护剂包括乙醇、甲醇和/或丙‑2‑醇，或其组合。在一些实施方式中，rna保护剂包括rnalaterice(赛墨飞世尔科学公司(thermofisherscientific))。在一些实施方式中，rna保护剂包含至少约60％的乙醇。在一些实施方式中，rna保护剂包含约60‑95％的乙醇、约0‑35％的甲醇和约0‑35％的丙‑2‑醇，其中培养基中有机溶剂的总量不超过约95％.在一些实施方式中，rna保护剂包含约60‑95％的乙醇、约5‑20％的甲醇和约5‑20％的丙‑2‑醇，其中培养基中有机溶剂的总量不超过约95％.[0367]在一些实施方式中，rna保护剂包括盐。所述盐可包括硫酸铵、硫酸氢铵、氯化铵、乙酸铵、硫酸铯、硫酸镉、硫酸铯铁(ii)、硫酸铬(iii)、硫酸钴(ii)、硫酸铜(ii)、氯化锂、醋酸锂、硫酸锂、硫酸镁、氯化镁、硫酸锰、氯化锰、氯化钾、硫酸钾、氯化钠、醋酸钠、硫酸钠、氯化锌、醋酸锌和硫酸锌。在一些实施方式中，盐是硫酸盐，例如硫酸铵、硫酸氢铵、硫酸铯、硫酸镉、硫酸铯铁(ii)、硫酸铬(iii)、硫酸钴(ii)、硫酸铜(ii)、硫酸锂、硫酸镁、硫酸锰、硫酸钾、硫酸钠，或硫酸锌。在一些实施方式中，盐是硫酸铵。盐可以约20g/100ml培养基或更低的浓度存在，例如约15g/100ml、10g/100ml、9g/100ml、8g/100ml、7g/100ml、6g/100ml、5g/100ml或更低，例如约4g、3g、2g或1g/100ml。[0368]此外，rna保护剂可被包含在还包含螯合剂(例如，edta)、缓冲液(例如，柠檬酸钠、乙酸钠、柠檬酸钾或乙酸钾，优选乙酸钠)和/或缓冲至ph在约4‑8之间(例如，约5)的培养基中。[0369]在一些实施方式中，在透化之前、同时或之后用一种或多种rna保护剂处理生物样品。例如，在用一种或多种透化试剂(例如，一种或多种蛋白酶)处理之前，用一种或多种rna保护剂处理生物样品。在另一个示例中，用包含一种或多种rna保护剂和一种或多种透化试剂(例如，一种或多种蛋白酶)的溶液处理生物样品。在又一个示例中，在生物样品已经用一种或多种透化试剂(例如，一种或多种蛋白酶)处理之后，用一种或多种rna保护剂处理生物样品。在一些实施方式中，生物样品在固定之前用一种或多种rna保护剂处理。[0370]在一些实施方式中，识别生物样品中捕获的分析物的位置包括核酸延伸反应。在捕获探针捕获片段化基因组dna分子的一些实施方式中，核酸延伸反应包括dna聚合酶。例如，核酸延伸反应包括用捕获的分析物(例如，片段化的基因组dna)作为模板，利用dna聚合酶来延伸与捕获的分析物(例如，片段化的基因组dna)杂交的捕获探针。延伸反应的产物包括空间条码化分析物(例如，空间条码化的片段化的基因组dna)。空间条码化分析物(例如，空间条码化的片段化的基因组dna)可用于识别分析物在生物样品中的空间位置。能够使用捕获的分析物作为模板来延伸捕获探针的任何dna聚合酶都可用于本文所述的方法。dna聚合酶的非限制性示例包括t7dna聚合酶；bsudna聚合酶；和大肠杆菌dna聚合酶poli。[0371]防扩散介质[0372]在一些实施方式中，通常用于限制分析物扩散的抗扩散介质可以包括至少一种透化试剂。例如，抗扩散介质(例如，水凝胶)可以包括含有透化缓冲液或试剂的孔(例如，微孔、纳米孔或皮孔或孔)。在一些实施方式中，在将水凝胶与样品接触之前，将抗扩散介质(例如，水凝胶)浸泡在透化缓冲液中。在一些实施方式中，当抗扩散介质应用于生物样品时，水凝胶或其他抗扩散介质可包含干燥试剂或单体以递送透化试剂。在一些实施方式中，抗扩散介质(例如，水凝胶)共价地附接到固体基材(例如，丙烯酸玻璃载玻片)。[0373]在一些实施方式中，水凝胶可以被改性为既递送透化试剂又包含捕获物。例如，水凝胶膜可经改性以包括空间条码化捕获探针。然后在将空间条码化水凝胶膜与样品接触之前，将空间条码化水凝胶膜浸泡在透化缓冲液中。在另一个示例中，水凝胶可以被改性为包括空间条码化捕获探针，并被设计成当暴露于透化缓冲液或任何其它生物样品制备试剂时用作多孔膜(例如，可透过水凝胶)。透化试剂通过空间条码化可透过水凝胶扩散，并使水凝胶另一侧的生物样品透化。在暴露于透化试剂后，随后分析物扩散到空间条码化水凝胶中。在这种情况下，空间条码化水凝胶(例如，多孔膜)促进生物样品中的生物分析物扩散到水凝胶中。在一些实施方式中，生物分析物先扩散到水凝胶中，然后暴露于透化试剂(例如，当分泌的分析物存在于生物样品之外时，或者在加入透化试剂之前通过其它方式溶解或透化生物样品的情况下)。在一些实施方式中，透化试剂以可变流速(例如，促进透化试剂扩散穿过空间条码化水凝胶的任何流速)流过水凝胶。在一些实施方式中，透化试剂流过空间条码化水凝胶上的微流体室或通道。在一些实施方式中，在利用流动将透化试剂引入生物样品之后，可以使生物样品制备试剂流过水凝胶以进一步促进生物分析物扩散到空间条码化的水凝胶中。因此，空间条码化水凝胶膜将透化试剂输送到与空间条码化水凝胶接触的样品表面，增强分析物迁移和捕获。在一些实施方式中，将空间条码化水凝胶应用于样品并放置在大量透化溶液中。在一些实施方式中，浸泡在透化试剂中的水凝胶膜夹在样品和空间条码化阵列之间。在一些实施方式中，目标分析物能够扩散穿过透化试剂浸泡的水凝胶，并在水凝胶的另一侧杂交或结合捕获探针。在一些实施方式中，水凝胶的厚度与分辨率损失成比例。在一些实施方式中，孔(例如，微米孔、纳米孔或皮米孔)可包含空间条码化捕获探针和透化试剂和/或缓冲液。在一些实施方式中，空间条码化捕获探针和透化试剂保持在间隔物之间。在一些实施方式中，样品被打孔、切割或转移到孔中，其中目标分析物通过透化试剂/缓冲液扩散到空间条形化捕获探针。在一些实施方式中，分辨率损失可与间隙厚度成比例(例如，样品和捕获探针之间的透化缓冲液的量)。在一些实施方式中，抗扩散介质(例如水凝胶)的厚度在约50‑500微米之间，包括500、450、400、350、300、250、200、150、100或50微米的厚度，或在50和500微米内的任何厚度。[0374]在一些实施方式中，使生物样品暴露于多孔膜(例如，可透化水凝胶)以帮助透化并限制扩散分析物损失，同时允许透化试剂到达样品。膜化学和孔体积可以控制，以尽量减少分析物损失。在一些实施方式中，多孔膜可由玻璃、硅、纸、水凝胶、聚合物整体或其他材料制成。在一些实施方式中，材料可以是天然多孔的。在一些实施方式中，该材料可具有蚀刻到固体材料中的孔或洞。在一些实施方式中，透化试剂流过多孔膜上的微流体腔室或通道。在一些实施方式中，流控制样品对透化试剂的可及性。在一些实施方式中，多孔膜是可透过的水凝胶。例如，当透化试剂和/或生物样品制备试剂可以利用扩散穿过水凝胶时，水凝胶是可透化的。本文所述的任何合适的透化试剂和/或生物样品制备试剂可以在足以从生物样品中释放分析物(例如，核酸、蛋白质、代谢物、脂质等)的条件下使用。在一些实施方式中，水凝胶在一侧暴露于生物样品而在另一侧暴露于透化试剂。透化试剂扩散通过可透过水凝胶并使水凝胶另一侧的生物样品透化。在一些实施方式中，使透化试剂以可变流速(例如，促进透化试剂穿过水凝胶扩散的任何流速)流过水凝胶。在一些实施方式中，透化试剂流过水凝胶上方的微流体腔室或通道。使透化试剂流经水凝胶的操作允许控制试剂的浓度。在一些实施方式中，可以调整水凝胶化学和孔体积以增强透化并限制扩散分析物损失。[0375]在一些实施方式中，多孔膜夹在空间条码化阵列和样品之间，其中透化溶液施加在多孔膜上。透化试剂通过膜孔扩散进入生物样品。在一些实施方式中，生物样品可以放置在基材(例如，载玻片)上。然后生物分析物通过多孔膜扩散并进入包含捕获探针的空间。在一些实施方式中，多孔膜被改性为包括捕获探针。例如，可以使用本文所述的任何方法将捕获探针连接到多孔膜的表面。在另一个示例中，捕获探针可以以允许与生物分析物相互作用的任何深度嵌入多孔膜中。在一些实施方式中，多孔膜以允许多孔膜上的捕获探针与来自生物样品的生物分析物之间相互作用的构造放置在生物样品上。例如，捕获探针位于多孔膜靠近生物样品的一侧。在这种情况下，多孔膜另一侧的透化试剂通过多孔膜扩散到包含生物样品和捕获探针的位置，以促进生物样品的透化(例如，也促进捕获探针对生物分析物的捕获)。在一些实施方式中，多孔膜位于样品和捕获探针之间。在一些实施方式中，透化试剂流过多孔膜上的微流体腔室或通道。[0376]选择性透化/选择性裂解[0377]在一些实施方式中，可根据已建立的方法处理生物样品以从细胞的亚细胞区选择性地释放分析物。在一些实施方式中，本文提供的方法可包括检测生物样品中细胞的亚细胞区中存在的至少一种生物分析物。如本文所用，“亚细胞区”可指任何亚细胞区。例如，亚细胞区可以指细胞质、线粒体、细胞核、核仁、内质网、溶酶体、囊泡、高尔基体、质体、液泡、核糖体、细胞骨架或其组合。在一些实施方式中，亚细胞区包含胞质溶胶、细胞核、线粒体和微粒体中的至少一种。在一些实施方式中，亚细胞区是胞质溶胶。在一些实施方式中，亚细胞区是细胞核。在一些实施方式中，亚细胞区是线粒体。在一些实施方式中，亚细胞区是微粒体。[0378]例如，生物分析物可以通过选择性透化或选择性裂解从细胞的亚细胞区选择性释放。在一些实施方式中，“选择性透化”可以指可以透化亚细胞区的膜同时保持不同亚细胞区基本完整的透化方法(例如，生物分析物不会因所应用的透化方法而从亚细胞区释放)。选择性透化方法的非限制性示例包括使用电泳和/或应用透化试剂。在一些实施方式中，“选择性裂解”可以指可以裂解亚细胞区的膜同时保持不同亚细胞区基本完整的裂解方法(例如，生物分析物不会因所应用的裂解方法而从亚细胞区释放)。用于选择性透化或裂解的几种方法是本领域技术人员已知的，包括以下所述的方法：lu等.labchip.2005年1月；5(1)：23‑9；niklas等.analbiochem.2011年9月15日；416(2)：218‑27；cox和emili.natprotoc.2006；1(4)：1872‑8；chiang等.jbiochem.biophys.methods.2000年11月20日；46(1‑2)：53‑68；和yamauchi和herr等.microsyst.nanoeng.2017；3.pii：16079；其各自通过引用其全文的方式纳入本文。[0379]在一些实施方式中，“选择性透化”或“选择性裂解”是指特定细胞类型的选择性透化或选择性裂解。例如，“选择性透化”或“选择性裂解”可以指裂解一种细胞类型同时保持不同细胞类型基本完整(例如，生物分析物不会因应用的透化或裂解方法而从细胞中释放)。与另一细胞“不同的细胞类型”的细胞可以指来自不同分类界的细胞、原核细胞对比真核细胞、来自不同组织类型的细胞等。本领域技术人员已知用于选择性透化或裂解不同细胞类型的许多方法。非限制性示例包括应用透化试剂、电穿孔和/或超声处理。参见例如，国际申请号wo2012/168003；han等，microsystnanoeng.2019年6月17日；5：30；gould等.oncotarget.2018年3月20日；9(21)：15606‑15615；oren和shai.biochemistry.1997年2月18日；36(7)：1826‑35；algayer等.molecules.2019年5月31日；24(11).pii：e2079；hipp等.leukemia.2017年10月；31(10)：2278；国际申请号wo2012/168003；和，美国专利号7,785,869；它们均通过引用其全文的方式纳入本文。[0380]在一些实施方式中，应用选择性透化或裂解试剂包括使生物样品与包含透化或裂解试剂的水凝胶接触。[0381]在一些实施方式中，生物样品与两个或更多个阵列(例如，如本文所述的柔性阵列)接触。例如，在亚细胞区被透化并且来自亚细胞区的生物分析物被第一阵列捕获之后，可以移除第一阵列，并且可以在第二阵列上捕获来自不同亚细胞区的生物分析物。[0382](14)rna物质的选择性富集[0383]在其中rna是分析物的一些实施方式中，可以选择性地富集一种或多种感兴趣的rna分析物种类(例如，adiconis等，用于降解和低输入样品的rna测序方法的比较分析(comparativeanalysisofrnasequencingmethodsfordegradedandlow‑inputsamples)，nature，第10卷，2013年7月，623‑632，通过引用其全文纳入本文)。例如，可以通过向样品中添加一个或多个寡核苷酸来选择一种或多种rna。在一些实施方式中，其它寡核苷酸是用于通过聚合酶引发反应的序列。例如，与一种或多种感兴趣的rna具有序列互补性的一种或多种引物序列可用于扩增一种或多种感兴趣的rna，从而选择性地富集这些rna。在一些实施方式中，与捕获的rna(例如cdna)的互补链具有序列互补性的寡核苷酸可结合到cdna。例如，具有与一种或多种感兴趣的cdna互补的序列的生物素化寡核苷酸能够结合到cdna并且可以利用生物素化‑链霉亲和素亲和力，使用本领域已知的各种方法中的任何一种(例如，链霉亲和素珠)来选择。[0384]或者，可以使用多种方法中的任一种来向下选择(例如，移除、消耗)一种或多种rna(例如，核糖体和/或线粒体rna)。核糖体rna消耗的杂交和捕获方法的非限制性示例包括ribominustm、ribocoptm和ribo‑zerotm。另一种非限制性rna消耗方法包括，将互补dna寡核苷酸与不需要的rna杂交，然后使用rna酶h降解rna/dna杂交体。杂交和降解方法的非限制性示例包括消耗、nugenanydeplete、truseqtm。另一种非限制性核糖体rna消耗方法包括zaprtm消化，例如smarter。在smarter方法中，随机核酸接合物与rna杂交，用于通过逆转录酶进行第一链合成和加尾，然后通过逆转录酶进行模板转换和延伸。此外，第一轮pcr扩增添加全长illumina测序接合物(sequencingadapter)(例如，illumina索引)。核糖体rna被zaprv2和r探针v2裂解。进行第二轮pcr，扩增非rrna分子(例如，cdna)。这些核糖体消耗方案/试剂盒的部分或步骤可以进一步与本文所述的方法组合以优化用于特定生物样品的方案。[0385]在消耗方案中，可以将探针给予选择性地与核糖体rna(rrna)杂交的样品，从而减少样品中rrna的汇集(pool)和浓度。可以将探针施用于与线粒体rna(mtrna)选择性杂交的生物样品，从而减少样品中mtrna的汇集和浓度。在一些实施方式中，可以在cdna合成过程中添加与线粒体rna互补的探针，或者可以在cdna合成过程中添加与核糖体和线粒体rna两者均互补的探针。随后将捕获探针应用于样品可能会导致由于样品中存在的非特异性rna(例如，向下选择的rna)的减少所致的对其他类型rna的捕获的改善。另外或者，双链特异性核酸酶(dsn)处理可移除rrna(参见，例如，archer等，在cdna阶段从rna‑seq文库选择性和灵活移除有问题的序列(selectiveandflexibledepletionofproblematicsequencesfromrna‑seqlibrariesatthecdnastage)，bmcgenomics，15401，(2014)，其全部内容通过引用纳入本文)。此外，羟基磷灰石色谱法可移除丰富的物质(例如，rrna)(参见，例如，vandernoot，v.a.，羟基磷灰石色谱法cdna标准化以丰富rna‑seq应用中的转录组多样性(cdnanormalizationbyhydroxyapatitechromatographytoenrichtranscriptomediversityinrna‑seqapplications)，biotechniques，53(6)373‑80，(2012)，其全部内容通过引用纳入本文)。[0386](15)其他试剂[0387]在分析样品之前，可以向生物样品中添加其它试剂以进行各种功能。在一些实施方式中，可以将核酸酶抑制剂例如dna酶和rna酶失活剂或蛋白酶抑制剂和/或螯合剂例如edta添加到生物样品中。在其它实施方式中，向样品中加入核酸酶，例如dna酶或rna酶，或蛋白酶，例如胃蛋白酶或蛋白酶k。在一些实施方式中，可将其它试剂溶解在溶液中或作为介质施用于样品。在一些实施方式中，其它试剂(例如胃蛋白酶)可以在施用于样品之前溶解在hcl中。[0388]在一些实施方式中，生物样品可以用一种或多种酶处理。例如，可以添加一种或多种用于片段化dna的核酸内切酶、dna聚合酶和用于扩增核酸的dntp。也可添加到生物样品中的其他酶包括但不限于聚合酶、转座酶、连接酶、dna酶和rna酶。[0389]在一些实施方式中，可将逆转录酶添加到样品中，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和模板转换寡核苷酸(tso)。模板转换可用于增加cdna的长度，例如，通过将预定义的核酸序列附加到cdna。在一些实施方式中，附加的核酸序列包含一个或多个核糖核苷酸。[0390]在一些实施方式中，可以添加其它试剂以提高一种或多种靶分子(例如，edna分子、mrna转录物)的回收率。例如，在rna样品工作流程中添加运载体rna可以提高从生物样品中提取的rna/dna杂交体的产量。在一些实施方式中，当输入或目标分子的浓度与剩余分子相比较低时，运载体分子是有用的。通常，单个目标分子无法形成沉淀，加入运载体分子有助于形成沉淀。一些目标分子回收方案使用运载体rna来防止样品中存在的少量目标核酸不可逆地结合。在一些实施方式中，运载体rna可以在紧接在第二链合成步骤之前添加。在一些实施方式中，在从阵列释放的寡核苷酸上合成第二链edna之前，可以立即添加运载体rna。在一些实施方式中，可以在体外转录后净化步骤之前立即添加运载体rna。在一些实施方式中，可以在扩增的rna纯化和定量之前添加运载体rna。在一些实施方式中，可以在rna定量之前添加运载体rna。在一些实施方式中，运载体rna可以在第二链edna合成和体外转录后净化步骤之前立即添加。[0391](16)用于捕获探针相互作用的预处理[0392]在一些实施方式中，生物样品中的分析物可在与捕获探针相互作用之前进行预处理。例如，在与捕获探针相互作用之前，在生物样品中进行由聚合酶(例如dna聚合酶或逆转录酶)催化的聚合反应。在一些实施方式中，用于聚合反应的引物包括增强与捕获探针杂交的官能团。捕获探针可包括适当的捕获域以捕获感兴趣的生物分析物(例如，多聚(dt)序列以捕获多聚(a)mrna)。[0393]在一些实施方式中，通过下一代测序对生物分析物进行预处理以产生文库。例如，可以通过添加修饰物(例如，连接使与捕获探针相互作用的序列)来预处理分析物。在一些实施方式中，使用片段化技术(例如，使用转座酶和/或片段化缓冲液)片段化分析物(例如，dna或rna)。[0394]片段化后可对分析物进行修饰。例如，修饰可以是通过连接使与捕获探针杂交的衔接子序列来添加。在一些实施方式中，其中感兴趣的分析物是rna，进行多聚(a)加尾。将多聚(a)尾添加到不包含多聚(a)尾的rna可促进与包含具有功能量的多聚(dt)序列的捕获域的捕获探针的杂交。[0395]在一些实施方式中，在与捕获探针相互作用之前，在生物样品中进行由连接酶催化的连接反应。在一些实施方式中，可以通过化学连接来进行连接。在一些实施方式中，可以使用点击化学来进行连接，如下所述。在一些实施方式中，捕获域包括与rna分子具有互补性的dna序列，其中rna分子与第二dna序列具有互补性，并且其中rna‑dna序列互补性用于将第二dna序列连接到捕获域中的dna序列。在这些实施方式中，可以直接检测rna分子。[0396]在一些实施方式中，在与捕获探针相互作用之前，在生物样品中进行靶特异性反应。靶特异性反应的示例包括但不限于靶向特异性衔接子、探针和/或其他寡核苷酸的连接、使用对一种或多种分析物特异性引物的靶特异性扩增、以及使用原位杂交、dna显微镜和/或抗体检测的靶特异性检测。在一些实施方式中，捕获探针包括被靶向到靶特异性产物的捕获域(例如，扩增或连接)。[0397]ii.一般基于空间阵列的分析方法[0398]本文提供用于生物样品的基于空间阵列的分析的方法、装置、系统和组合物。[0399](a)空间分析方法[0400]基于阵列的空间分析方法涉及将一种或多种分析物从生物样品转移到基材上的特征阵列，其中各特征与阵列上的独特空间位置相关。转移分析物的后续分析包括确定分析物的相同性以及生物样品中每种分析物的空间位置。每种分析物在生物样品中的空间位置是基于阵列中每个分析物所结合的特征以及特征在阵列上的相对空间位置来确定的。[0401]存在至少两种将空间条形码与一个或多个相邻细胞相关联的一般方法，使得空间条形码将一个或多个细胞和/或一个或多个细胞的内容标识为与特定空间位置相关联。一种一般方法是促进分析物出细胞并朝向空间条码化阵列。图1描绘了该一般方法的示例性实施方式。在图1中，使聚集有捕获探针(如本文进一步描述)的空间条码化阵列与生物样品101接触，并且生物样品被透化，使分析物从样品迁移到阵列。分析物与空间条码化阵列102上的捕获探针相互作用。一旦分析物杂交/结合到捕获探针，则任选地从阵列移出样品并且分析捕获探针以获得空间解析的分析物信息103。[0402]另一种一般方法是从阵列裂解空间条码化捕获探针，并促进空间条码化捕获探针朝向生物样品和/或至生物样品中或至生物样品上。图2描绘了该一般方法的示例性实施方式，使聚集有捕获探针(如本文进一步描述的)的空间条码化阵列可以与样品201接触。空间条码化捕获探针被裂解，然后与所提供生物样品202内的细胞相互作用。这种相互作用可以是共价或非共价的细胞表面相互作用。该相互作用可以是由递送系统或细胞穿透肽促进的细胞内相互作用。一旦空间条码化捕获探针与特定细胞相关联，就可以任选地移出样品以进行分析。样品在分析前可以选择性地分离。一旦标记的细胞与空间条码化捕获探针相关联，就可以分析捕获探针以获得关于标记的细胞203的空间解析信息。[0403]图3示出了包括在空间条码化阵列301上制备生物样品的示例性工作流。样品制备可包括将样品放置在载玻片上、固定样品和/或染色生物样品以供成像。然后可使用亮场(对样品苏木精和伊红染色成像)和荧光(对特征成像)模式在阵列302上对染色样品成像。可选地，样品可以在透化之前脱色。在一些实施方式中，然后从样品中释放分析物，并且形成空间条码化阵列的捕获探针杂交或结合释放的分析物303。然后从阵列304移出样品，并且从阵列305中裂解捕获探针。然后在两种模式305b中任选地对生物样品和阵列进行第二成像，同时将分析物反向转录成cdna，并且制备扩增子文库306并测序307。这两组图像随后在空间上重叠，以便关联在空间上识别的生物样品信息308。当样品和阵列没有第二成像305b时，换而提供点坐标文件。点坐标文件替换第二成像步骤305b。此外，可以使用独特pcr衔接子和测序307来进行扩增子文库制备306。[0404]图4显示了另一个示例性工作流程，其利用基材上的空间条码化阵列，其中空间条码化捕获探针聚集在称为特征的区域。空间条码化捕获探针可以包括裂解结构域、一个或多个功能结构域、空间条形码、独特分子标识符和捕获域。空间条码化捕获探针还可以包括5′端修饰，用于可逆地附接到基材。空间条码化阵列与生物样品401接触，并且通过应用透化试剂402使样品透化。透化试剂可通过将阵列/样品组件放置在大量溶液中来给予。或者，可经由抗扩散介质和/或物理屏障(例如盖)向样品给予透化试剂，其中样品夹在抗扩散介质和/或屏障与包含阵列的基材之间。使用本文公开的任何数量的技术将分析物迁移到空间条码化捕获阵列。例如，分析物迁移可以使用抗扩散介质盖和被动迁移进行。作为另一示例，例如，使用电泳转移系统，分析物迁移可以是主动迁移。一旦分析物接近空间条码化捕获探针，捕获探针可杂交或以其他方式结合目标分析物403。可以任选地从阵列404移出生物样品。[0405]捕获探针可任选地从阵列405裂解，并且捕获的分析物可通过进行逆转录酶第一链cdna反应来被空间条码化。第一链cdna反应可任选地使用模板转换寡核苷酸来进行。例如，模板转换寡核苷酸可与通过逆转录酶添加到cdna3′端的多聚(c)尾以模板非依赖方式杂交。原始的mrna模板和模板转换寡核苷酸可以从cdna中变性，然后空间条码化捕获探针可以与cdna杂交并可生成cdna的互补物。然后可以纯化第一链cdna并收集用于下游扩增步骤。可使用pcr406扩增第一链cdna，其中正向和反向引物侧接感兴趣的空间条形码和分析物区域，产生与特定空间条形码相关联的文库。在一些实施方式中，cdna包含合成测序(sbs)引物序列。对文库扩增子进行测序和分析以解码空间信息407。[0406]使用本文所述的方法、组合物、系统、试剂盒和装置，生物样品(例如，组织样品)中存在的rna转录物可用于空间转录组分析。特别地，在一些情况下，条码化寡核苷酸可被设置为从rna模板或其衍生物引发、复制并因此产生条码化延伸产物。例如，在一些情况下，条码化的寡核苷酸可以包括mrna特异性引发序列，例如允许在逆转录反应中引发和复制mrna的聚‑t引物片段或其它靶向引发序列。或者或另外，随机rna引发可使用条码化寡核苷酸的随机n‑聚物(n‑mer)引物区段进行。逆转录酶(rt)可以使用rna模板和与rna模板3′端互补的引物来指导第一链互补dna(cdna)的合成。许多rt可用于该逆转录反应，包括例如禽成髓细胞瘤病毒(amv)逆转录酶、莫洛尼鼠白血病病毒(m‑mulv或mmlv)及其其它变体。一些重组m‑mulv逆转录酶，例如逆转录酶，与其野生型对应物相比可能会具有降低的rna酶h活性和增加的热稳定性，并提供更高的特异性、更高的cdna产量和更完整的长度可达12千碱基(kb)的cdna产物。在一些实施方式中，逆转录酶是突变逆转录酶，例如，但不限于，突变的mmlv逆转录酶。在另一个实施方式中，逆转录酶是突变的mmlv逆转录酶，例如但不限于美国专利公开号20180312822中描述的一种或多种变体，其通过引用其全文方式纳入本文。[0407]图5描述了一个示例性工作流，其中生物样品从空间条码化阵列移出，并且空间条码化捕获探针从阵列移出，用于条码化分析物扩增和文库制备。另一实施方式包括在空间条码化阵列上使用模板转换寡核苷酸进行第一链合成而不切割捕获探针。在本实施方式中，样品制备501和透化502如本文别处所述进行。一旦捕获探针捕获分析物，通过模板转换和逆转录酶503产生的第一链edna随后被变性，并且第二链随后被延伸504。然后将第二链edna从第一链edna变性、中和并转移到管505。edna定量和扩增可以使用本文讨论的标准技术来进行。然后，edna可经历文库制备506和索引化507，包括片段化、末端修复和a‑加尾以及索引化pcr步骤。[0408]在上述工作流程的非限制性示例中，生物样品(例如，组织切片)可以用甲醇固定、用苏木精和伊红染色并成像。可选地，样品可以在透化之前脱色。这些图像可用于将空间基因表达模式映射回生物样品。透化酶可用于直接在载玻片上透化生物样品。从生物样品的上覆细胞(overlyingcell)释放的分析物(例如，聚腺苷酸化的mrna)可以被基材上的捕获区域内的捕获探针捕获。可以将逆转录(rt)试剂添加到透化的生物样品中。与rt试剂一起孵育可以从捕获的分析物(例如，聚腺苷酸化的mrna)产生空间条码化的全长edna。第二链试剂(例如，第二链引物、酶)可被添加到载玻片上的生物样品中以起始第二链合成。所得的cdna可以从捕获探针模板变性并转移(例如，转移至干净的管中)用于扩增和/或文库构建。空间条码化的全长cdna可以在文库构建之前通过pcr进行扩增。然后可以对cdna进行酶促片段化和大小选择，以优化cdna扩增子的大小。p5、p7、i7和i5可作为样品索引(sampleindex)，truseqread2可通过末端修复(endrepair)、a‑加尾、衔接子延长(adapterligation)、pcr等方式添加。然后可以使用truseqread1和truseqread2作为测序引物位点，使用双端测序(paired‑endedsequencing)对cdna片段进行测序。[0409]在一些实施方式中，对由该工作流和本文描述的其他工作流产生的数据进行相关分析可以产生跨两个捕获区域表达的基因的95％以上的相关性(例如，95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)。当使用细胞核的单细胞rna测序来进行所述工作流时，在一些实施方式中，数据的相关分析可产生跨两个捕获区域表达的基因的超过90％(例如超过90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的相关性。[0410]在一些实施方式中，在(例如，通过逆转录)产生cdna之后，可以直接在基材表面上扩增所述cdna。通过直接在基材表面上扩增来生成cdna(例如，从捕获的分析物合成的cdna)的多个拷贝可以提高最终测序文库的复杂性。因此，在一些实施方式中，cdna可以通过等温核酸扩增直接在基材表面上扩增。在一些实施方式中，等温核酸扩增可扩增rna或dna。[0411]在一些实施方式中，等温扩增可以比标准pcr反应更快。在一些实施方式中，等温扩增可以是线性扩增(例如，与单个引物不对称)或指数扩增(例如，与两个引物)。在一些实施方式中，等温核酸扩增可以通过模板转换寡核苷酸引物进行。在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸将共同序列添加到正被逆转录的rna的5′端。例如，在捕获探针与分析物(例如，mrna)相互作用并进行逆转录后，将其它核苷酸添加到cdna的末端，产生如本文所述的3′突出端。在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸与逆转录酶添加的非模板化多聚(c)核苷酸杂交，以继续向模板转换寡核苷酸的5′端的复制，从而生成准备用于进一步扩增的全长cdna。在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸向用于cdna扩增的全长cdna添加共同的5′序列(例如，模板转换寡核苷酸的反向互补物)。[0412]在一些实施方式中，一旦生成全长cdna分子，模板转换寡核苷酸可作为cdna扩增反应(例如，采用dna聚合酶)中的引物。在一些实施方式中，双链cdna(例如，第一链cdna和第二链反向互补cdna)可以通过用解旋酶或重组酶，然后是链置换dna聚合酶等温扩增。链置换dna聚合酶可产生置换的第二条链，从而产生扩增产物。[0413]在本文所述的任何等温扩增方法中，条形码交换(例如，空间条形码)可在第一扩增循环之后发生，其中在基材表面上存在未使用的捕获探针。在一些实施方式中，未使用的捕获探针的游离3′oh末端可以通过任何合适的3′oh封闭方法封闭。在一些实施方式中，可以通过发夹连接封闭3′oh。[0414]等温核酸扩增可用作标准pcr反应的补充或替代(例如，需要加热至约95℃以使双链dna变性的pcr反应)。等温核酸扩增通常不需要使用热循环仪，然而在一些实施方式中，等温扩增可以在热循环仪中进行。在一些实施方式中，等温扩增可在约35℃至75℃进行。在一些实施方式中，等温扩增可在约40℃，约45℃，约50℃，约55℃，约60℃，约65℃，或约70℃，或介于两者之间的任何温度进行，这取决于使用的聚合酶和辅助酶。[0415]等温核酸扩增技术是本领域已知的，并且可以单独使用或与本文所述的任何空间方法联合使用。例如，合适的等温核酸扩增技术的非限制性示例包括：转录介导的扩增，基于核酸序列的扩增，信号介导的rna扩增技术，链置换扩增，滚环扩增，环介导的dna等温扩增(lamp)，等温多重置换扩增，重组酶聚合酶扩增，解旋酶依赖性扩增，单引物等温扩增和环状解旋酶依赖性扩增(参见，例如，gill和ghaemi，核酸等温扩增技术：综述(nucleicacidisothermalamplificationtechnologies：areview)，nucleosides，nucleotides，&nucleicacids，27(3)，224‑43，doi：10.1080/15257770701845204(2008)，其通过引用其全文的方式纳入本文。[0416]在一些实施方式中，等温核酸扩增是解旋酶依赖性核酸扩增。解旋酶依赖性等温核酸扩增描述于，vincent等，解旋酶依赖性等温dna扩增(helicase‑dependentisothermaldnaamplification)，emborep.，795‑800(2004)和美国专利号7,282,328，这两者通过引用其全文的方式纳入本文。基质上(例如芯片上)的解旋酶依赖性核酸扩增描述于andresen等，解旋酶依赖性扩增：用于onchip扩增和床旁诊断的潜力(helicase‑dependentamplification：useinonchipamplificationandpotentialforpoint‑of‑carediagnostics)，expertrevmoldiagn.，9，645‑650，doi：10.1586/erm.09.46(2009)，其通过引用其全文方式纳入本文。在一些实施方式中，等温核酸扩增是重组酶聚合酶核酸扩增。重组酶聚合酶核酸扩增描述于piepenburg等，采用重组蛋白的dna检测(dnadetectionusingrecombinantproteins)，plosbiol.，4，7e204(2006)和li等，综述：十年发展的重组酶聚合酶扩增的综合性概述(review：acomprehensivesummaryofadecadedevelopmentoftherecombinasepolymeraseamplification)，analyst，144，31‑67，doi：10.1039/c8an01621f(2019)，两者均通过引用其全文方式纳入本文。[0417]通常，等温扩增技术使用本领域已知的标准pcr试剂(例如缓冲液、dntp等)。一些等温扩增技术可能需要其它试剂。例如，解旋酶依赖性核酸扩增使用单链结合蛋白和辅助蛋白。在另一个示例中，重组酶聚合酶核酸扩增使用重组酶(例如，t4uvsx)、重组酶加载因子(例如，tfuvsy)、单链结合蛋白(例如，t4gp32)、拥挤剂(例如，peg‑35k)和atp。[0418]在通过本文中的任何方法描述的全长cdna的等温核酸扩增后，等温扩增的cdna(例如，单链或双链)可以从基材回收，并且任选地随后在微量离心管中进行采用典型cdnapcr的扩增。然后可以将样品与本文所述的任何空间方法一起使用。[0419](i)免疫组织化学和免疫荧光[0420]在一些实施方式中，免疫荧光或免疫组织化学方案(直接和间接染色技术)可以作为本文呈现的示例性空间工作流程的部分或附加部分来执行。例如，可以根据本文所述的方法固定组织切片。可以将生物样品转移至阵列(例如，捕获探针阵列)，其中使用免疫荧光方案探测分析物(例如，蛋白质)。例如，可以对样品进行再水合、封闭和透化(3xssc、2％bsa、0.1％tritonx、1u/μlrna酶抑制剂，4℃持续10分钟)，然后用荧光一抗染色(1∶100于3xssc，2％bsa、0.1％tritonx、1u/μlrna酶抑制剂，4℃持续30分钟)。可对生物样品进行洗涤、加盖玻片(在甘油 1u/μlrna酶抑制剂中)、成像(例如，使用共聚焦显微镜或其他能够进行荧光检测的装置)、洗涤和处理(根据本文所述的分析物捕获或空间工作流程)。[0421]如本文所用，“抗原修复缓冲液”可改善if/ihc方案中的抗体捕获。抗原修复的示例性方案可以是预热抗原修复缓冲液(例如，至95℃)，将生物样品浸入加热的抗原修复缓冲液中持续预定时间，然后从抗原修复缓冲液中取出生物样品并洗涤生物样品。[0422]在一些实施方式中，优化透化对于鉴定细胞内分析物可能是有用的。透化优化可以包括选择透化剂、透化剂的浓度和透化持续时间。组织透化在本文别处讨论。[0423]在一些实施方式中，在标记(1abeling)生物样品的准备过程中封闭阵列和/或生物样品能降低抗体与阵列和/或生物样品的非特异性结合(减低背景)。一些实施方式提供了可以在施用标记物之前和/或期间施加的封闭缓冲液/封闭溶液，其中封闭缓冲液可以包括封闭剂和任选的表面活性剂和/或盐溶液。在一些实施方式中，封闭剂可以是牛血清白蛋白(bsa)、血清、明胶(例如鱼明胶)、牛奶(例如脱脂奶粉)、酪蛋白、聚乙二醇(peg)、聚乙烯醇(pva)，或聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、生物素封闭剂、过氧化物酶封闭剂、左旋咪唑、卡诺伊溶液(carnoy′ssolution)、甘氨酸、赖氨酸、硼氢化钠、泮胺天蓝(pontamineskyblue)、苏丹黑、台盼蓝、fitc封闭剂和/或醋酸。封闭缓冲液/封闭溶液可以在对生物样品进行标记(例如，应用偶联了荧光团的抗体)之前和/或期间施用于阵列和/或生物样品。[0424]在一些实施方式中，在联合空间阵列进行if/ihc方案中可以包括其它步骤或优化。在进行本文讨论的空间加标的分析物捕获剂工作流程中可以包括其它步骤或优化。[0425]在一些实施方式中，本文提供用于对来自生物样品(例如，存在于生物样品，例如组织切片中的分析物)的分析物(例如，检测分析物，例如生物分析物)进行空间检测的方法，所述方法包括：(a)在基材上提供生物样品；(b)对基材上的生物样品进行染色，对染色后的生物样品进行成像，和选择生物样品或生物样品的亚区(subsection)(例如感兴趣的区域)进行分析；(c)提供在基材上包含一组或多组多个捕获探针的阵列；(d)使生物样品与阵列接触，从而允许一组或多组多个捕获探针中的捕获探针捕获感兴趣的分析物；和(e)分析捕获的分析物，从而对感兴趣的分析物进行空间分析。可根据本文所述的方法使用本文所述的或本领域已知的任何种类的染色和成像技术。在一些实施方式中，染色包括如本文所述的光学标记物，包括但不限于荧光标记物、放射性标记物、化学发光标记物、量热或比色可检测标记物。在一些实施方式中，染色包括针对生物样品中的目标分析物(例如，细胞表面或细胞内蛋白质)的荧光抗体。在一些实施方式中，染色包括针对生物样品中的目标分析物(例如，细胞表面或细胞内蛋白质)的免疫组织化学染色。在一些实施方式中，染色包括化学染剂，例如苏木精和伊红(h&e)或高碘酸希夫(pas)。在一些实施方式中，在对生物样品进行染色和/或成像与进行分析之间可以相隔相当长的时间(例如，数天、数月或数年)。在一些实施方式中，在阵列与生物样品接触之前、同时或之后，将用于进行分析的试剂添加到生物样品中。在一些实施方式中，步骤(d)包括将阵列放置在生物样品上。在一些实施方式中，阵列是柔性阵列，其中多个空间条码化特征(例如，具有捕获探针的基材、具有捕获探针的珠)附接到柔性基材。在一些实施方式中，在阵列与生物样品接触之前，采取措施以减慢反应(例如，降低生物样品的温度或使用优先在与其最佳功能温度相比更低或更高温度下进行其主要功能的酶)。在一些实施方式中，在不使生物样品与阵列脱离接触的情况下进行步骤(e)。在一些实施方式中，在生物样品不再与阵列接触之后进行步骤(e)。在一些实施方式中，在生物样品的染色和/或成像之前、同时或之后用分析物捕获剂对生物样品加标。在这种情况下，在染色和/或成像与进行分析之间可相隔相当长的时间(例如，数天、数月或数年)。在一些实施方式中，阵列适于促进生物分析物从染色和/或成像的生物样品迁移到阵列上(例如，使用本文所述的任何材料或方法)。在一些实施方式中，生物样品在与阵列接触之前被透化。在一些实施方式中，在生物样品与阵列接触之前减慢透化速率(例如，以限制分析物从其在生物样品中的原始位置扩散)。在一些实施方式中，调节透化速率(例如调节透化试剂的活性)可以通过调节生物样品所暴露的条件(例如调节温度、ph和/或光)来实现。在一些实施方式中，调节透化速率包括使用外部刺激(例如，小分子、酶和/或活化试剂)来调节透化速率。例如，可以在与阵列接触之前向生物样品提供透化试剂，该透化试剂在条件(例如，温度、ph和/或光)改变或提供外部刺激(例如，小分子、酶和/或活化剂)之前无活性。[0426]在一些实施方式中，本文提供用于对来自生物样品(例如，存在于生物样品，例如组织切片中的分析物)的分析物(例如，检测分析物，例如生物分析物)进行空间检测的方法，所述方法包括：(a)在基材上提供生物样品；(b)对基材上的生物样品进行染色，对染色后的生物样品进行成像，和选择生物样品或生物样品的亚区(subsection)(例如感兴趣的区域)进行空间转录组学分析；(c)提供在基材上包含一组或多组多个捕获探针的阵列；(d)使生物样品与阵列接触，从而允许一组或多组多个捕获探针中的捕获探针捕获感兴趣的生物分析物；和(e)分析捕获的生物分析物，从而对感兴趣的生物分析物进行空间分析。[0427](b)捕获探针[0428]“捕获探针”是指能够捕获(直接或间接)和/或标记生物样品中的分析物(例如，感兴趣的分析物)的任何分子。在一些实施方式中，捕获探针是核酸或多肽。在一些实施方式中，捕获探针是偶联物(例如，寡核苷酸‑抗体偶联物)。在一些实施方式中，捕获探针包括条形码(例如，空间条形码和/或独特分子标识符(umi))和捕获域。[0429]图6是示出如本文所述的捕获探针的示例的示意图。如图所示，捕获探针602任选地通过例如二硫键接头的裂解域603耦合到特征601。捕获探针可包括对后续处理有用的功能性序列，例如功能性序列604，其可包括测序仪特异性流动池附接序列，例如p5序列，以及功能性序列606，其可包括测序引物序列，例如r1引物结合位点。在一些实施方式中，序列604是p7序列，序列606是r2引物结合位点。空间条形码605可包括在捕获探针内以用于对目标分析物条码化。通常可选择功能性序列以与各种不同测序系统中的任何一种兼容，例如454测序、离子激流质子(iontorrentproton)或pgm、illuminax10、pacbio、纳米孔(nanopore)等及其要求。在一些实施方式中，可选择功能性序列以与非商业化测序系统兼容。可使用适当功能性序列的此类测序系统和技术的示例包括(但不限于)roche454测序、离子激流质子或pgm测序、illuminax10测序、pacbiosmrt测序和oxford纳米孔测序。此外，在一些实施方式中，可以选择功能性序列以与其他测序系统(包括非商业化测序系统)兼容。[0430]在一些实施方式中，空间条形码605、功能性序列604(例如，流动池附接序列)和606(例如，测序引物序列)可以是附接到给定特征的所有探针所共用的。空间条形码还可包括捕获域607以促进目标分析物的捕获。[0431](i)捕获域[0432]如上所述，每个捕获探针包括至少一个捕获域。“捕获域”可以是寡核苷酸、多肽、小分子或其任何组合，其特异性结合到所需分析物。在一些实施方式中，捕获域可用于捕获或检测所需分析物。[0433]在一些实施方式中，捕获域是配置成与一种或多种分析物，例如一种或多种不同类型的核酸(例如，rna分子和dna分子)相互作用的功能性核酸序列。在一些实施方式中，功能性核酸序列可包括n‑聚体序列(例如，随机n‑聚体序列)，其中n‑聚体序列经配置以与多个dna分子相互作用。在一些实施方式中，功能性序列可包括多聚(t)序列，其多聚(t)序列经配置以经由mrna转录物的多聚(a)尾与信使rna(mrna)分子相互作用。在一些实施方式中，功能性核酸序列是蛋白质(例如，转录因子、dna结合蛋白质或rna结合蛋白质)的结合靶标，其中感兴趣的分析物是蛋白质。[0434]捕获探针可以包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸以及能够参与watson‑crick型或类似碱基对相互作用的合成核苷酸残基。在一些实施方式中，捕获域能够引发逆转录反应以产生与捕获的rna分子互补的cdna。在一些实施方式中，捕获探针的捕获域可引发dna延伸(聚合酶)反应以产生与捕获的dna分子互补的dna。在一些实施方式中，捕获域可以作为捕获的dna分子和直接或间接固定在基材上的表面探针之间的连接反应的模板。在一些实施方式中，捕获域可连接到捕获的dna分子的一条链。例如，splintr连接酶连同rna或dna序列(例如，简并rna)一起可用于将单链dna或rna连接到捕获域。在一些实施方式中，具有rna模板化连接酶活性的连接酶(例如，splintr连接酶、t4rna连接酶2或kod连接酶)可用于将单链dna或rna连接到捕获域。在一些实施方式中，捕获域包括夹板寡核苷酸。在一些实施方式中，捕获域捕获夹板寡核苷酸。[0435]在一些实施方式中，捕获域位于捕获探针的3′端并且包括自由的3′端，其可例如通过模板依赖聚合来延伸以形成如本文所述的延伸的捕获探针。在一些实施方式中，捕获域包括能够与存在于与阵列接触的生物样品的细胞中的核酸(例如rna或其他分析物)杂交的核苷酸序列。在一些实施方式中，捕获域可被选择或设计为选择性地或特异地结合到靶核酸。例如，捕获域可被选择或设计成通过与mrna多聚(a)尾杂交的方式捕获mrna。因此，在一些实施方式中，捕获域包括多聚(t)dna寡核苷酸，例如，通过磷酸二酯键连接的一系列连续脱氧胸苷残基，其能够与mrna的多聚(a)尾杂交。在一些实施方式中，捕获域可包括在功能上或结构上类似于多聚(t)尾的核苷酸。例如，多聚(u)寡核苷酸或包含脱氧胸苷类似物的寡核苷酸。在一些实施方式中，捕获域包括至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方式中，捕获域包括至少25、30或35个核苷酸。[0436]在一些实施方式中，捕获探针包括具有能够结合mrna和/或基因组dna的序列的捕获域。例如，捕获探针可以包括捕获域，其包括能够结合到mrna的多聚(a)尾和/或基因组dna中存在的多聚(a)均聚序列的核酸序列(例如，多聚(t)序列)。在一些实施方式中，利用末端转移酶将均聚序列添加至mrna分子或基因组dna分子，以产生具有多聚(a)或多聚(t)序列的分析物。例如，可以将多聚(a)序列添加到分析物(例如基因组dna的片段)，从而使分析物能够被多聚(t)捕获域捕获。[0437]在一些实施方式中，随机序列(例如，随机六聚体或类似序列)可用于形成捕获域的全部或部分。例如，随机序列可以与多聚(t)(或多聚(t)类似物)序列一起使用。因此，在捕获域包括多聚(t)(或“多聚(t)‑样”)寡核苷酸的情况下，其还可以包括随机寡核苷酸序列(例如，“多聚(t)‑随机序列”探针)。例如，这可以位于多聚(t)序列的5′或3′处，例如在捕获域的3′端。多聚(t)‑随机序列探针可促进mrna多聚(a)尾的捕获。在一些实施方式中，捕获域可以是完全随机的序列。在一些实施方式中，可以使用简并捕获域。[0438]在一些实施方式中，两个或更多个捕获探针的集形成混合物，其中一个或多个捕获探针的捕获域包括多聚(t)序列，并且一个或多个捕获探针的捕获域包括随机序列。在一些实施方式中，两个或更多个捕获探针的集形成混合物，其中一个或多个捕获探针的捕获域包括多聚(t)样序列，并且一个或多个捕获探针的捕获域包括随机序列。在一些实施方式中，两个或更多个捕获探针的集形成混合物，其中一个或多个捕获探针的捕获域包括多聚(t)随机序列，并且一个或多个捕获探针的捕获域包括随机序列。在一些实施方式中，具有简并捕获域的探针可以添加到本文所列的任何前述组合中。在一些实施方式中，具有简并捕获域的探针可以替换本文所描述的每对中的探针之一。[0439]捕获域可基于其被设计以捕获的特定基因序列或特定基序序列或共同/保守序列(即，序列特异性捕获域)。因此，在一些实施方式中，捕获域能够选择性地结合到期望的核酸亚型或子集，例如特定类型的rna，例如mrna、rrna、trna、srprna、trna、snrna、snrna、smyrna、sarna、grna、rna酶p、rna酶mrp、terc、slrna、arna、cis‑nat、crrna、lncrna、mirna、pirna、sirna、shrna、tasirna，rasirna、7sk、erna、ncrna或其他类型的rna。在非限制性示例中，捕获域能够选择性地结合到核糖核酸的所需子集，例如微生物组rna，例如16srrna。[0440]在一些实施方式中，捕获域包括“锚定物(anchor)”或“锚定序列(anchoringsequence)”，其是设计用于确保捕获域与预期生物分析物杂交的核苷酸序列。在一些实施方式中，锚定序列包括核苷酸序列，包括1‑聚体、2‑聚体、3‑聚体或更长的序列。在一些实施方式中，短序列是随机的。例如，可以设计包括多聚(t)序列的捕获域来捕获mrna。在此类实施方式中，锚定序列可包括有助于确保多聚(t)捕获域与mrna杂交的随机3‑聚体(例如，ggg)。在一些实施方式中，锚定序列可以是vn、n或nn。或者，可以使用特定的核苷酸序列来设计序列。在一些实施方式中，锚定序列位于捕获域的3′端。在一些实施方式中，锚定序列位于捕获域的5′端。[0441]在一些实施方式中，捕获探针的捕获域在生物样品与阵列接触之前被阻断，并且当生物样品中的核酸在其被捕获到阵列上之前被修饰时，使用阻断性探针。在一些实施方式中，阻断性探针用于阻断或修饰捕获域的游离3′端。在一些实施方式中，阻断性探针可与捕获探针杂交以遮蔽捕获域的游离3′端，例如发夹探针，部分双链探针或互补性序列。在一些实施方式中，捕获域的游离3′端可以通过化学修饰来阻断，例如，添加叠氮甲基作为化学可逆的加帽部分，使得捕获探针不包括游离3′端。在生物样品与阵列接触之前，阻断或修饰捕获探针，特别是在捕获域的游离3′端，防止捕获探针的修饰，例如，防止将多聚(a)尾添加到捕获探针的游离3′端。[0442]3′修饰的非限制性示例包括双脱氧c‑3′(3′‑ddc)、3′倒dt、3′c3间隔子、3′氨基和3′磷酸化。在一些实施方式中，可修饰生物样品中的核酸，使得其可被捕获域捕获。例如，衔接子序列(包括能够结合到捕获探针的捕获域的结合域)可以添加到核酸(例如片段化基因组dna)的末端。在一些实施方式中，这是通过连接衔接子序列或核酸延伸来实现的。在一些实施方式中，酶用于在核酸序列末端纳入其它核苷酸，例如多聚(a)尾。在一些实施方式中，捕获探针可以可逆地遮蔽或修饰，使得捕获探针的捕获域不包括游离3′端。在一些实施方式中，移出、修饰或使3′端不可接近，使得捕获域不易受用于修饰生物样品的核酸的过程(例如，连接或延伸)的影响。[0443]在一些实施方式中，修饰捕获探针的捕获域以移除在修饰生物样品的核酸分子期间发生的捕获探针的任何修饰。在一些实施方式中，捕获探针可以包括捕获域下游的附加序列，例如捕获域的3′，即阻断域(blockingdomain)。[0444]在一些实施方式中，捕获探针的捕获域可以是非核酸域。不仅包括基于核酸的合适捕获域的示例包括但不限于蛋白质、肽、适体、抗原、抗体和模拟本文所述的任何捕获域的功能的分子类似物。[0445](ii)裂解域[0446]每个捕获探针可任选地包括至少一个裂解域。裂解域表示用于将探针可逆地附接到阵列特征的探针部分，如本文所述。此外，捕获探针的一个或多个区段或区域可任选地通过裂解域的裂解而从阵列特征中释放。例如，空间条形码和/或通用分子标识符(umi)可以通过裂解域的裂解来释放。[0447]图7是说明可裂解捕获探针的示意图，其中裂解的捕获探针可进入非透化细胞并结合到样品内的分析物。捕获探针701包含裂解域702、细胞穿透肽703、报告分子704和二硫键(‑s‑s‑)。705表示捕获探针的所有其他部分，例如，空间条形码和捕获域。[0448]在一些实施方式中，将捕获探针连接到特征的裂解域是二硫键。可以添加还原剂来破坏二硫键，从而使捕获探针从特征中释放出来。作为另一个例子，加热也可以导致裂解域的降解和从阵列特征中释放附接的捕获探针。在一些实施方式中，激光辐射用于在特定位置加热和降解捕获探针的裂解域。在一些实施方式中，裂解域是光敏化学键(例如，当暴露于例如紫外光的光时解离的化学键)。[0449]具有光敏化学键的寡核苷酸(例如光可裂解接头)具有多种优势。它们可以被高效且快速地裂解(例如，以纳秒和毫秒为单位)。在一些情况下，可以使用光掩模使得仅阵列的特定区域暴露于可裂解刺激(例如暴露于紫外光、暴露于光、暴露于激光诱导的热)。当使用光可裂解接头时，可裂解反应由光触发，并且对接头具有高度选择性，结果是双正交的。通常，光可裂解接头的波长吸收位于光谱的近紫外范围内。在一些实施方式中，光可裂解接头的λ最大为约300nm至约400nm，或约310nm至约365nm。在一些实施方式中，光可裂解接头的λ最大为约300nm、约312nm、约325nm、约330nm、约340nm、约345nm、约355nm、约365nm或约400nm。[0450]可以用于裂解域的光敏化学键的非限制性示例包括描述于以下的那些：leriche等.bioorgmedchem.2012年1月15日；20(2)：571‑82和美国公开号2017/0275669，这两者均通过引用其全文方式纳入本文。例如，包含光敏化学键的接头包括：3‑氨基‑3‑(2‑硝基苯基)丙酸(anp)、苯甲酰酯衍生物、8‑喹啉苯磺酸酯、双香豆素、6‑溴‑7‑烷基香豆素‑4‑基甲氧基羰基、基于双烷的(bimane‑based)接头和基于双芳基腙的接头。在一些实施方式中，光敏键是可裂解接头的部分，例如以下邻硝基苄基(onb)接头：[0451][0452]其中：[0453]x选自o和nh；[0454]r1选自h和c1‑3烷基；[0455]r2选自h和c1‑3烷氧基；[0456]n是1、2或3；和[0457]a和b分别代表接头与基材的连接点，或接头与捕获探针的连接点。[0458]在一些实施方式中，至少一个间隔物包含在基材和邻硝基苄基(onb)接头之间，并且至少一个间隔物包含在邻硝基苄基(onb)接头和捕获探针之间。在这些实施方式的一些方面，间隔物包含选自以下的至少一种基团：c1‑6亚烷基、c2‑6亚烯基、c2‑6亚炔基、c＝o、o、s、nh、‑(c＝o)o‑、‑(c＝o)nh‑、‑ss‑、乙二醇、聚乙二醇、丙二醇和聚丙二醇，或它们的任何组合。在一些实施方式中，x是o。在一些实施方式中，x是nh。在一些实施方式中，r1为h。在一些实施方式中，r1为c1‑3烷基。在一些实施方式中，r1是甲基。在一些实施方式中，r2是h。在一些实施方式中，r2是c1‑3烷氧基。在一些实施方式中，r2是甲氧基。在一些实施方式中，r1为h且r2为h。在一些实施方式中，r1为h且r2为甲氧基。在一些实施方式中，r1为甲基且r2为h。在一些实施方式中，r1为甲基且r2为甲氧基。[0459]在一些实施方式中，光可裂解接头具有下式：[0460][0461]在一些实施方式中，光可裂解接头具有下式：[0462][0463]在一些实施方式中，光可裂解接头具有下式：[0464][0465]在一些实施方式中，光可裂解接头具有下式：[0466][0467]在一些实施方式中，光可裂解接头具有下式：[0468][0469]不受任何特定理论的束缚，据信邻硝基苄基(onb)接头的激发会导致γ位的norrish型夺氢，随后形成具有高度反应性并重排成亚硝基化合物的吖嗪酸，导致接头完全裂解，如下图所示：[0470][0471]在一些实施方式中，光可裂解接头是3‑氨基‑3‑(2‑硝基苯基)丙酸(anp)接头：[0472][0473]其中x、r2、n、a和b如本文对于邻硝基苄基(onb)接头所述。[0474]在一些实施方式中，光可裂解接头具有下式：[0475][0476]在一些实施方式中，光可裂解接头是苯甲酰酯接头：[0477][0478]其中a和b如本文对于邻硝基苄基(onb)接头所述。[0479]可用于裂解域的光敏化学键的其它示例包括卤化核苷，例如溴脱氧尿苷(brdu)。brdu是胸苷的类似物，可以很容易地掺入寡核苷酸中(例如，在捕获探针的裂解域中)，并且对uvb光(280‑320nm范围)敏感。在暴露于uvb光时，会发生光裂解反应(例如，在紧邻brdu掺入位点5′处的核苷处(doddridge等.chem.comm.，1998，18：1997‑1998和cook等.chemistryandbiology.1999，6：451‑459))，导致捕获探针从特征释放。[0480]裂解域的其它示例包括不稳定化学键，例如但不限于酯键(例如，可与酸、碱或羟胺裂解)、邻二醇键(例如，可通过高碘酸钠裂解)、狄尔斯‑阿尔德键(例如，可通过热裂解)、砜键(例如，可通过碱裂解)、硅基醚键(例如，可通过酸裂解)、糖苷键(例如，可通过淀粉酶裂解)、肽键(例如，可通过蛋白酶裂解)、无碱基或无嘌呤/无嘧啶(ap)位点(例如，可用碱或ap核酸内切酶裂解)，或磷酸二酯键(例如，可通过核酸酶(例如，dna酶)裂解)。[0481]在一些实施方式中，裂解域包括由一个或多个能够裂解核酸分子，例如，能够破坏两个或更多个核苷酸之间的磷酸二酯键的酶识别的序列。键可以通过其他核酸分子靶向酶，如限制性酶(如限制性内切酶)进行裂解。例如，裂解域可以包括限制性内切酶(限制性酶)识别序列。限制性内切酶在被称为限制性位点的特定识别核苷酸序列上切开双链或单链dna。在一些实施方式中，使用罕切限制性酶，例如，具有长识别位点(长度至少为8个碱基对)的酶，以减少在捕获探针中其他位置裂解的可能性。[0482]在一些实施方式中，裂解域包括多聚(u)序列，其可由尿嘧啶dna糖基化酶(udg)和dna糖基化酶‑裂解酶内切酶viii(商业上称为usertm酶)的混合物裂解。一旦释放，可释放的捕获探针可用于反应。因此，例如，可以通过从特征释放捕获探针来活化可活化的捕获探针。[0483]在一些实施方式中，当捕获探针例如经由表面探针间接地附接到基材时，裂解域包括一个或多个错配核苷酸，使得表面探针和捕获探针的互补部分不是100％互补(例如，错配碱基对的数目可以是一个、两个或三个碱基对)。例如，通过muty和t7核酸内切酶i酶识别这种错配，其导致错配位置处的核酸分子的裂解。如本文所述，“表面探针”可以是存在于基材表面上的、能够连接至试剂(例如，捕获探针)的任何部分。在一些实施方式中，表面探针是寡核苷酸。在一些实施方式中，表面探针是捕获探针的部分。[0484]在其中捕获探针间接地(例如通过表面探针)附接(例如固定)到特征上的一些实施方式中，裂解域包括切口酶识别位点或序列。切口酶是一种仅能切割dna双链体的单链的核酸内切酶。因此，裂解域可以包括靠近表面探针的5′端(和/或捕获探针的5′端)的切口酶识别位点，使得表面探针或捕获探针的裂解使表面探针和捕获探针之间的双链体失稳，从而从特征中释放捕获探针。[0485]切口酶也可用于捕获探针直接附接(例如，固定)到特征的一些实施方式中。例如，基材可与杂交到捕获探针的裂解域的核酸分子接触以提供或重组切口酶识别位点，例如裂解辅助探针。因此，与切口酶接触将导致裂解域的裂解，从而从特征中释放捕获探针。这种裂解辅助探针还可用于为其他裂解酶(例如限制性内切酶)提供或重组裂解识别位点。[0486]有些切口酶通过结合和识别特定的核苷酸识别序列，只在dna分子的特定位点引入单链切口。已经发现了许多天然切口酶，目前已经确定了至少四个切口酶的序列识别特性。切口酶在美国专利号6,867,028中描述，其通过引用整体纳入本文。一般来说，任何合适的切口酶都可用于结合到裂解域的互补切口酶识别位点。使用后，可以从分析中移除切口酶，或在释放捕获探针后使其失活，以防止捕获探针的不必要裂解。[0487]不仅包括基于核酸的合适捕获域的示例包括但不限于蛋白质、肽、适体、抗原、抗体和模拟本文所述的任何捕获域的功能的分子类似物。[0488]在一些实施方式中，捕获探针中不存在裂解域。例如在macosko等，(2015)cell161，1202‑1214中描述了具有缺乏裂解域的附接捕获探针的基材的示例，其全部内容通过引用纳入本文中。[0489]在一些实施方式中，与裂解域相对应的捕获探针区域可用于某些其它功能。例如，用于核酸延伸或扩增的其它区域可以包括在通常将定位裂解域的位置处。在这样的实施方式中，该区域可以补充功能域或者甚至作为其它功能域存在。在一些实施方式中，存在裂解域，但其用途是可选的。[0490](iii)功能域[0491]每个捕获探针可任选地包括至少一个功能域。每个功能域通常包括用于整个分析程序中的下游分析步骤的功能核苷酸序列。[0492]在一些实施方式中，捕获探针可包括用于附接到测序流动池的功能域，例如，用于测序的p5序列。在一些实施方式中，捕获探针或其衍生物可包括另一功能域，例如用于附接到用于测序的测序流动池的p7序列。可选择功能域以与各种不同测序系统中的任何一种兼容，例如454测序、离子激流质子或pgm、illuminax10等及其要求。[0493]在一些实施方式中，功能域包括引物。引物可以包括用于测序的r1引物序列，并且在一些实施方式中，包括用于测序的r2引物序列。美国专利公开号2014/0378345和2015/0376609中描述了此类捕获探针的示例及其用途，其全部内容通过引用纳入本文。[0494](iv)空间条形码[0495]如上所述，捕获探针可包括一个或多个空间条形码(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个)空间条形码。“空间条形码”是一个连续的核酸区段或两个或更多个非连续的核酸区段，用作传递或能够传递空间信息的标签或标识符。在一些实施方式中，捕获探针包括具有空间方面的空间条形码，其中条形码与阵列内的特定位置或基材上的特定位置相关联。[0496]空间条形码可以是分析物的部分，也可以独立于分析物(例如，捕获探针的部分)。空间条形码可以是附接在分析物(例如，核酸分子)上的标签，或者除了分析物的内源性特征(例如，分析物的大小或末端序列)之外的标签的组合。空间条形码可以是独特的。在空间条形码是独特的一些实施方式中，空间条形码既作为空间条形码又作为与一个特定捕获探针相关联的独特分子标识符(umi)起作用。[0497]空间条形码可以有多种不同的格式。例如，空间条形码可以包括多核苷酸空间条形码、随机核酸和/或氨基酸序列以及合成核酸和/或氨基酸序列。在一些实施方式中，空间条形码以可逆或不可逆的方式附接到分析物。在一些实施方式中，在样品测序之前、期间和/或之后将空间条形码添加到例如dna或rna样品的片段。在一些实施方式中，空间条形码使识别和/或定量个体序列读取结果。在一些实施方式中，空间条形码用作荧光条形码，其中荧光标记的寡核苷酸探针与空间条形码杂交。[0498]在一些实施方式中，空间条形码是基本上不与生物样品中的分析物核酸分子杂交的核酸序列。在一些实施方式中，空间条形码在生物样品中的核酸分子的实质部分(例如80％或更多)上对核酸序列具有小于80％的序列相同性(例如，小于70％、60％、50％或小于40％的序列相同性)。[0499]空间条形码序列可在捕获探针序列内包括约6至约20或更多核苷酸。在一些实施方式中，空间条形码序列的长度可以是约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些实施方式中，空间条形码序列的长度可以是至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些实施方式中，空间条形码序列的长度可以是至多约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更短。[0500]这些核苷酸可以是完全连续的，例如在邻近核苷酸的单个序列段中，或者它们可以被分成两个或多个单独的子序列，这些子序列由1个或多个核苷酸分开。分离的空间条形码子序列的长度约为4到16个核苷酸。在一些实施方式中，空间条形码子序列可以是约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些实施方式中，空间条形码子序列可以是至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些实施方式中，空间条形码子序列可以是至多约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更短。[0501]对于附接到共同阵列特征的多个捕获探针，多个捕获探针的一个或多个空间条形码序列可以包括对于耦合到特征的所有捕获探针相同的序列和/或在耦合到特征的所有捕获探针之间不同的序列。[0502]图8是示例性多重空间条码化特征的示意图。在图8中，特征801可耦合到空间条码化捕获探针，其中特定特征的空间条码化探针可具有相同的空间条形码，但具有设计成将特征的空间条形码与多个目标分析物相关联的不同捕获域。例如，特征可以耦合到四种不同类型的空间条码化捕获探针，每种类型的空间条码化捕获探针具有空间条形码802。与该特征相关联的一种类型捕获探针包括空间条形码802与多聚(t)捕获域803的组合，其设计用于捕获mrna目标分析物。与该特征相关联的第二类型捕获探针包括空间条形码802与用于gdna分析的随机n‑聚体捕获域804的组合。与该特征相关联的第三类型捕获探针包括空间条形码802与与分析物捕获剂捕获剂条形码结构域805上的捕获域互补的捕获域组合。与该特征相关联的第四类型捕获探针包括空间条形码802与捕获探针组合，该捕获探针可特异性结合可在crispr分析(例如crispr/cas9)中起作用的核酸分子806。虽然图8中仅示出了四种不同的捕获探针条码化构建体，但是捕获探针条码化构建体可被定制用于与核酸相关的任何给定分析物的分析，并且能够与这种构建体结合。例如，图8中所示的方案也可用于本文中所公开的其它分析物的同时分析，包括但不限于：(a)mrna，谱系追踪构建体，细胞表面或细胞内蛋白质和代谢物，以及gdna；(b)mrna，可获得的染色质(例如，atac‑seq，dna酶‑seq，和/或mna酶‑seq)细胞表面或细胞内蛋白质和代谢物，以及扰动剂(例如，crispr‑crrna/sgrna、talen、锌指核酸酶和/或如本文所述的反义寡核苷酸)；(c)mrna、细胞表面或细胞内蛋白质和/或代谢物，条码化标记剂(例如，本文所述的mhc多聚体)和免疫细胞受体(例如，t细胞受体)的v(d)j序列。在一些实施方式中，扰动剂可以是小分子、抗体、药物、适体、mirna、物理环境(例如，温度变化)，或任何其它已知扰动剂。[0503]附接到单个阵列特征的捕获探针可以包括相同(或共同)的空间条形码序列、不同的空间条形码序列或两者的组合。附接到特征的捕获探测可以包括多组捕获探针。给定组的捕获探针可以包括相同的空间条形码序列。相同的空间条形码序列可以不同于另一组捕获探针的空间条形码序列。[0504]多个捕获探针可以包括与空间阵列上的特定位置相关联的空间条形码序列(例如，核酸条形码序列)。例如，第一多个捕获探针可以基于与第一区域内的捕获探针共同的空间条形码序列与第一区域相关联，并且第二多个捕获探针可以基于与第二区域内的捕获探针共同的空间条形码序列与第二区域相关联。第二区域可以与第一区域相关联，也可以不与第一区域相关联。其它多个捕获探针可以与其他区域内的捕获探针共用的空间条形码序列相关联。在一些实施方式中，空间条形码序列可以在多个捕获探针分子之间相同。[0505]在一些实施方式中，将多个不同的空间条形码合并到单个阵列捕获探针中。例如，混合但已知的一组空间条形码序列可以通过提供对位置特性的重复或独立确认，来提供空间条形码到给定点或位置的更强的寻址(address)或属性。在一些实施方式中，多个空间条形码表示特定阵列点的位置的增加的特异性。[0506](v)独特分子标识符[0507]捕获探针可包括一个或多个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个)独特分子标识符(umi)。独特分子标识符是作为特定分析物或结合特定分析物的捕获探针(例如，通过捕获域)的标签或标识符的连续核酸区段或两个或更多个非连续核酸区段。[0508]umi可以是独特的。umi可包括一个或多个特异性多核苷酸序列，一个或多个随机核酸和/或氨基酸序列，和/或一个或多个合成核酸和/或氨基酸序列。[0509]在一些实施方式中，umi是基本上不与生物样品中的分析物核酸分子杂交的核酸序列。在一些实施方式中，umi在生物样品中的核酸分子的实质部分(例如80％或更多)上对核酸序列具有小于80％的序列相同性(例如，小于70％、60％、50％或小于40％的序列相同性)。[0510]umi可在捕获探针序列内包括约6至约20或更多核苷酸。在一些实施方式中，umi的长度可以是约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些实施方式中，umi的长度可以是至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些实施方式中，umi的长度可以是至多约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更短。[0511]这些核苷酸可以是完全连续的，即在邻近核苷酸的单个序列段中，或者它们可以被分成两个或多个单独的子序列，这些子序列由1个或多个核苷酸分开。分离的umi子序列的长度约为4到16个核苷酸。在一些实施方式中，umi子序列可以是约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些实施方式中，umi子序列可以是至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些实施方式中，umi子序列可以是至多约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更短。[0512]在一些实施方式中，umi以可逆或不可逆的方式附接到分析物。在一些实施方式中，在分析物测序之前、期间和/或之后将umi添加到例如dna或rna样品的片段。在一些实施方式中，umi使识别和/或定量个体序列读取结果(sequencing‑read)。在一些实施方式中，umi用作荧光条形码，其中荧光标记的寡核苷酸探针与umi杂交。[0513](vi)捕获探针的其他方面[0514]对于附接到阵列特征的捕获探针，个体阵列特征可以包括一个或多个捕获探针。在一些实施方式中，个体阵列特征包括数百或数千个捕获探针。在一些实施方式中，捕获探针与特定的个体特征相关联，其中个体特征包含捕获探针，该捕获探针包括对于阵列上限定的区域或位置独特的空间条形码。[0515]在一些实施方式中，特定特征可以包含包括一个以上空间条形码的捕获探针(例如，特定特征处的一个捕获探针可以包括与相同特定特征处的另一个捕获探针中包括的空间条形码不同的空间条形码，而两个捕获探针都包括第二共同空间条形码)，其中每个空间条形码对应于阵列上特定的限定区域或位置。例如，与阵列上的一个特定特征相关联的多个空间条形码序列可以通过提供位置的重复或独立确认来向给定位置提供更强的地址或属性。在一些实施方式中，多个空间条形码表示特定阵列点的位置的增加的特异性。在非限制性示例中，可以使用两个不同的空间条形码对特定阵列点进行编码，其中每个空间条形码标识阵列内的特定限定区域，并且具有两个空间条形码的阵列点标识两个限定区域交叠的子区域，例如，比如维恩图的重叠部分。[0516]在另一非限制性示例中，特定阵列点可以用三个不同的空间条码化，其中第一空间条形码标识阵列内的第一区域，第二空间条形码标识第二区域，其中第二区域是完全在第一区域内的子区域，以及第三空间条形码标识第三区域，其中第三区域是完全在第一和第二子区域内的子区域。[0517]在一些实施方式中，附接到阵列特征的捕获探针从阵列特征中释放以进行测序。或者，在一些实施方式中，捕获探针保持附接到阵列特征，并且探针被测序，同时保持附接到阵列特征(例如，通过原位测序)。捕获探针的测序的其他方面在本发明的后续部分中描述。[0518]在一些实施方式中，阵列特征可以包括附接到特征的不同类型的捕获探针。例如，阵列特征可以包括第一类捕获探针和第二类捕获探针，第一类捕获探针具有设计为结合到一类分析物的捕获域，第二类捕获探针具有设计为结合到第二类分析物的捕获域。通常，阵列特征可以包括附接到单个阵列特征的一个或多个(例如，两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个、八个或多个、十个或多个、12个或多个、15个或多个、20个或多个、30个或多个、50个或多个)不同类型的捕获探针。[0519]在一些实施方式中，捕获探针是核酸。在一些实施方式中，捕获探针通过其5′端附接到阵列特征。在一些实施方式中，捕获探针从5′端到3′端包括：一个或多个条形码(例如，空间条形码和/或umi)和一个或多个捕获域。在一些实施方式中，捕获探针从5′端到3′端包括：一个条形码(例如，空间条形码或umi)和一个捕获域。在一些实施方式中，捕获探针从5′端到3′端包括：裂解域、功能域、一个或多个条形码(例如，空间条形码和/或umi)和捕获域。在一些实施方式中，捕获探针从5′端到3′端包括：裂解域、功能域、一个或多个条形码(例如，空间条形码和/或umi)、第二功能域和捕获域。在一些实施方式中，捕获探针从5′端到3′端包括：裂解域、功能域、空间条形码、umi和捕获域。在一些实施方式中，捕获探针不包括空间条形码。在一些实施方式中，捕获探针不包括umi。在一些实施方式中，捕获探针包括用于起始测序反应的序列。[0520]在一些实施方式中，捕获探针通过其3′端固定在特征上。在一些实施方式中，捕获探针从3′端到5′端包括：一个或多个条形码(例如，空间条形码和/或umi)和一个或多个捕获域。在一些实施方式中，捕获探针从3′端到5′端包括：一个条形码(例如，空间条形码或umi)和一个捕获域。在一些实施方式中，捕获探针从3′端到5′端包括：裂解域、功能域、一个或多个条形码(例如，空间条形码和/或umi)和捕获域。在一些实施方式中，捕获探针从3′端到5′端包括：裂解域、功能域、空间条形码、umi和捕获域。[0521]在一些实施方式中，捕获探针包括原位合成的寡核苷酸。原位合成的寡核苷酸可以附连到基材上，或附连到基材上的特征上。在一些实施方式中，原位合成的寡核苷酸包括一个或多个恒定序列，其中一个或多个用作引发序列(例如，用于扩增靶核酸的引物)。原位合成的寡核苷酸可以例如包括位于3′端的恒定序列，该序列与基材附连，或与基材上的特征附连。此外或或者，原位合成的寡核苷酸可在游离5′端包括恒定序列。在一些实施方式中，一个或多个恒定序列可以是可裂解的序列。在一些实施方式中，原位合成的寡核苷酸包括条形码序列，例如可变条形码序列。条形码可以是本文所述的任何条形码。条形码的长度可以是约8至16个核苷酸(例如，8、9、10、11、12、13、14、15或16个核苷酸)。原位合成的寡核苷酸的长度可以小于100个核苷酸(例如，小于90、80、75、70、60、50、45、40、35、30、25或20个核苷酸)。在一些情况下，原位合成的寡核苷酸的长度为约20至约40个核苷酸。示例性的原位合成寡核苷酸由affymetrix生产。在一些实施方式中，原位合成的寡核苷酸附接到阵列的特征。[0522]可以将其它寡核苷酸连接到原位合成的寡核苷酸以产生捕获探针。例如，与原位合成的寡核苷酸的部分(例如，寡核苷酸中的恒定序列)互补的引物可用于杂交其它寡核苷酸并延伸(使用原位合成的寡核苷酸作为模板，例如引物延伸反应)，以形成双链寡核苷酸并进一步产生3′突出端。在一些实施方式中，3′突出端可以通过模板非依赖性连接酶(例如末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)或多聚(a)聚合酶)产生。可以使用合适的酶(例如，连接酶)和夹板寡核苷酸将包含一个或多个捕获域的附加寡核苷酸连接到3′突出端，以产生捕获探针。因此，在一些实施方式中，捕获探针是连接在一起的两个或更多个寡核苷酸序列(例如，原位合成的寡核苷酸和其它寡核苷酸)的产物。在一些实施方式中，寡核苷酸序列之一是原位合成的寡核苷酸。[0523]在一些实施方式中，可以使用夹板寡核苷酸(例如，本文所述的任何夹板寡核苷酸)来制备捕获探针。可以使用夹板寡核苷酸和本领域已知或本文所述的任何种类的连接酶(例如夹板连接酶)将两个或更多个寡核苷酸连接在一起。[0524]寡核苷酸之一可包括：例如，恒定序列(例如，与夹板寡核苷酸的部分互补的序列)、简并序列和/或捕获域(例如，如本文所述)。寡核苷酸之一还可以包括与生物样品中感兴趣的分析物连接或杂交相容的序列。感兴趣的分析物(例如，mrna)也可以作为夹板寡核苷酸使用，以将更多的寡核苷酸连接到捕获探针上。在一些实施方式中，捕获探针通过使酶在寡核苷酸序列末端添加多核苷酸来产生。捕获探针可以包括简并序列，该简并序列可以用作独特分子标识符。[0525]简并序列，它是其中核苷酸序列的某些位置包含许多可能的碱基的序列。简并序列可以是简并核苷酸序列，包括约或至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。在一些实施方式中，核苷酸序列包含核苷酸序列内的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多简并位置。在一些实施方式中，简并序列用作umi。[0526]在一些实施方式中，捕获探针包括限制性内切酶识别序列或可被特定酶活性切割的核苷酸序列。例如，可以使用尿嘧啶dna糖基化酶(udg)或尿嘧啶特异性切除试剂(user)从核苷酸序列中酶促切割尿嘧啶序列。作为另一示例，其它经修饰的碱基(例如，经甲基化修饰)可被特异性核酸内切酶识别和切割。捕获探针可经受酶切，其移出阻断域和在修饰过程中添加到捕获探针3′端的任何其它核苷酸。阻断域的移除将暴露和/或恢复捕获探针的捕获域的游离3′端。在一些实施方式中，可移除其它核苷酸以显示和/或恢复捕获探针的捕获域的3′端。[0527]在一些实施方式中，阻断域可在其合成时或在其合成之后纳入捕获探针中。捕获域的末端核苷酸是可逆终止子核苷酸(例如，3′‑o‑阻断可逆终止子和3′‑未阻断可逆终止子)，并且可以在探针合成期间或之后包含在捕获探针中。[0528](vii)延伸的捕获探针[0529]“延伸的捕获探针”是具有扩大的核酸序列的捕获探针。例如，在捕获探针包括核酸的情况下，延伸的“3′末端”表示其他核苷酸被添加到捕获探针的最末端3′核苷酸以延伸捕获探针的长度，例如，通过标准聚合反应来延伸核酸分子，包括由聚合酶(例如，dna聚合酶或逆转录酶)催化的模板聚合。[0530]在一些实施方式中，延伸捕获探针包括从捕获的(杂交的)rna产生cdna。该过程涉及合成杂交核酸的互补链，例如，基于捕获的rna模板(与捕获探针的捕获域杂交的rna)生成cdna。因此，在延伸捕获探针的初始步骤(例如cdna生成)中，捕获的(杂交的)核酸(例如rna)充当延伸的模板(例如逆转录步骤)。[0531]在一些实施方式中，捕获探针使用逆转录延伸。例如，逆转录包括使用逆转录酶从rna(例如信使rna)合成cdna(互补或拷贝dna)。在一些实施方式中，当组织仍在原位时进行逆转录，产生分析物文库，其中分析物文库包括来自邻近捕获探针的空间条形码。在一些实施方式中，捕获探针使用一种或多种dna聚合酶延伸。[0532]在一些实施方式中，捕获探针的捕获域包括用于产生与捕获探针杂交的核酸互补链的引物，例如，用于dna聚合酶和/或逆转录的引物。由延伸反应产生的核酸(例如dna和/或cdna)分子包含捕获探针的序列。捕获探针的延伸，例如dna聚合酶和/或逆转录反应，可以使用各种合适的酶和方案来进行。[0533]在一些实施方式中，产生全长dna(例如cdna)分子。在一些实施方式中，“全长”dna分子是指整个捕获的核酸分子。然而，如果核酸(例如rna)在组织样品中部分降解，则捕获的核酸分子将与组织样品中的初始rna长度不同。在一些实施方式中，延伸的探针的3′端(例如第一链cdna分子)被修饰。例如，接头或衔接子可以连接到延伸的探针的3′端。这可以通过使用单链连接酶如t4rna连接酶或circlegasetm(可从威斯康星州麦迪逊的艾匹森特生物技术公司(epicentrebiotechnologies)购得)来实现。在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸用于延伸cdna以产生全长cdna(或尽可能接近全长cdna)。在一些实施方式中，第二链合成辅助探针(能够与延伸的捕获探针的3′端杂交的部分双链dna分子)可以使用双链连接酶(例如t4dna连接酶)连接到延伸的探针的3′端，例如第一链cdna分子。适用于连接步骤的其他酶的其他酶在本领域中是已知的，并且包括例如tthdna连接酶、taqdna连接酶、热球菌属(菌株9°n)dna连接酶(9°ntmdna连接酶，新英格兰生物实验室(newenglandbiolabs))、ampligasetm(可从威斯康星州麦迪逊的艾匹森特生物技术公司(epicentrebiotechnologies)获得)和splintr(可从马萨诸塞州伊普斯维奇的新英格兰生物实验室获得)。在一些实施方式中，多核苷酸尾(例如多聚(a)尾)纳入延伸的探针分子的3′端。在一些实施方式中，使用末端转移酶活性酶纳入多核苷酸尾。[0534]在一些实施方式中，处理双链延伸的捕获探针以在扩增和/或分析(例如序列分析)之前移除任何未延伸的捕获探针。这可以通过多种方法实现，例如，使用酶降解未延伸的探针，例如核酸外切酶或纯化柱。[0535]在一些实施方式中，延伸的捕获探针被扩增以产生足以进行分析的量，例如通过dna测序。在一些实施方式中，延伸的捕获探针的第一链(例如，dna和/或cdna分子)用作扩增反应(例如，聚合酶链反应)的模板。[0536]在一些实施方式中，扩增反应使用包括亲和力基团的引物将亲和力基团纳入延伸的捕获探针(例如，rna‑cdna杂交)上。在一些实施方式中，所述引物包括亲和基团，所述延伸的捕获探针包括亲和基团。亲和基团可以对应于前面描述的任何亲和基团。[0537]在一些实施方式中，包括亲和基团的延伸的捕获探针可以耦合到亲和基团特异性的阵列特征。在一些实施方式中，基材可包括抗体或抗体片段。在一些实施方式中，阵列特征包括亲和素或链霉亲和素，并且亲和基团包括生物素。在一些实施方式中，阵列特征包括麦芽糖，亲和基团包括麦芽糖结合蛋白。在一些实施方式中，阵列特征包括麦芽糖结合蛋白，亲和基团包括麦芽糖。在一些实施方式中，只要延伸的探针的拷贝未附接到阵列特征，则扩增延伸的捕获探针可以起到从阵列特征释放扩增的探针的作用。[0538]在一些实施方式中，从阵列特征释放延伸的捕获探针或其互补物或扩增子。从阵列特征释放延伸的捕获探针或其互补物或扩增子的步骤可以通过多种方式实现。在一些实施方式中，通过核酸裂解和/或变性(例如通过加热使双链分子变性)从特征释放延伸的捕获探针或其互补物。[0539]在一些实施方式中，通过物理手段从阵列特征释放延伸的捕获探针或其互补物或扩增子。例如，诱导物理释放的方法包括变性双链核酸分子。另一种释放延伸的捕获探针的方法是使用干扰双链分子氢键的溶液。在一些实施方式中，通过施加加热的水(例如至少85℃的水或缓冲液，例如至少90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或99℃的水)来释放延伸的捕获探针。在一些实施方式中，添加包括盐、表面活性剂等可以进一步使核酸分子之间的相互作用不稳定的溶液以从阵列特征释放延伸的捕获探针。在一些实施方式中，甲酰胺溶液可用于使核酸分子之间的相互作用不稳定以从阵列特征中释放延伸的捕获探针。[0540](viii)分析物捕获剂[0541]本发明还提供用于使用分析物捕获剂对生物分析物(例如，mrna、基因组dna、可接近染色质和细胞表面或细胞内蛋白质和/或代谢物)进行空间概况分析的方法和材料。如本文所用，“分析物捕获剂”(以前有时也称为“细胞加标剂”)是指与分析物(例如，样品中的分析物)和捕获探针(例如，附接到基材的捕获探针)相互作用以识别分析物的物质。在一些实施方式中，分析物捕获剂包括分析物结合部分和捕获剂条形码结构域。[0542]图9是由分析物结合部分904和捕获剂条形码结构域908组成的示例性分析物捕获剂902的示意图。分析物结合部分904是能够结合到分析物906并与空间条码化捕获探针相互作用的分子。分析物结合部分可以高亲和力和/或高特异性结合到分析物906。分析物捕获剂可包括捕获剂条形码结构域908、核苷酸序列(例如，寡核苷酸)，其可与捕获探针的捕获域的至少部分或全部杂交。分析物结合部分904可包括多肽和/或适体(例如，结合到特定目标分析物的寡核苷酸或肽分子)。分析物结合部分904可包括抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。[0543]如本文所用，术语“分析物结合部分”是指能够结合到大分子成分(例如，分析物，例如，生物分析物)的分子或部分。在本文所述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，结合到生物分析物的分析物捕获剂的分析物结合部分可包括但不限于抗体或其表位结合片段、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子，双特异性抗体、双特异性t细胞接合物、t细胞受体接合物、b细胞受体接合物、前体、适体、单体、粘合素、darpin和蛋白质支架，或其任何组合。分析物结合部分可以高亲和力和/或高特异性结合到大分子成分(例如，分析物)。分析物结合部分可包括核苷酸序列(例如，寡核苷酸)，其可对应于分析物结合部分的至少部分或全部。分析物结合部分可包括多肽和/或适体(例如，结合到特定靶分子的多肽和/或适体，例如，分析物)。分析物结合部分可包括结合到特定分析物(例如，多肽)的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。[0544]在一些实施方式中，分析物捕获剂的分析物结合部分包括一个或多个抗体或其抗原结合片段。包括分析物结合部分的抗体或抗原结合片段可特异性结合到目标分析物。在一些实施方式中，分析物是蛋白质(例如，生物样品(例如，细胞)表面上的蛋白质或胞内蛋白质)。在一些实施方式中，包含多个分析物结合部分的多个分析物捕获剂结合存在于生物样品中的多个分析物。在一些实施方式中，多个分析物包括单一种类的分析物(例如，单一种类的多肽)。在多个分析物包括单一种类的分析物的一些实施方式中，多个分析物捕获剂的分析物结合部分相同。在多个分析物包括单一种类的分析物的一些实施方式中，多个分析物捕获剂的分析物结合部分是不同的(例如，多个分析物捕获剂的成员可以具有两个或更多个分析物结合部分，其中两个或更多个分析物结合部分中的每一个结合单一种类的分析物(例如，在不同的结合位点))。在一些实施方式中，多个分析物包括多个不同种类的分析物(例如，多个不同种类的多肽)。[0545]分析物捕获剂可以包括分析物结合部分。分析物结合部分可以是抗体。可用作分析物捕获剂中的分析物结合部分或可用于本文公开的ihc/if应用的示例性非限制性抗体包括以下任何一种，包括它们的变体：a‑act，a‑at，acth，肌动蛋白‑肌肉特异性，肌动蛋白‑平滑肌(sma)，ae1，ae1/ae3，ae3，afp，akt磷酸盐，alk‑1，淀粉样蛋白a，雄激素受体，膜联蛋白a1，b72.3，bca‑225，bcl‑1(细胞周期蛋白d1)，bcl‑1/cd20，bcl‑2，bcl‑2/bcl‑6，bcl‑6，ber‑ep4，β‑淀粉样蛋白，β‑连环蛋白，bg8(lewisy)，bob‑1，ca19.9，ca125，caix，降钙素，钙调素结合蛋白，钙调理蛋白，钙网膜蛋白，cam5.2，cam5.2/ae1，cd1a，cd2，cd3(m)，cd3(p)，cd3/cd20，cd4，cd5，cd7，cd8，cd10，cd14，cd15，cd20，cd21，cd22，cd23，cd25，cd30，cd31，cd33，cd34，cd35，cd43，cd45(lca)，cd45ra，cd56，cd57，cd61，cd68，cd71，cd74，cd79a，cd99，cd117(c‑kit)，cd123，cd138，cd163，cdx‑2，cdx‑2/ck‑7，cea(m)，cea(p)，嗜铬粒蛋白a，胰凝乳蛋白酶，ck‑5，ck‑5/6，ck‑7，ck‑7/ttf‑1，ck‑14，ck‑17，ck‑18，ck‑19，ck‑20，ck‑hmw，ck‑lmw，cmv‑ih，coll‑iv，cox‑2，d2‑40，dba44，肌间线蛋白，dog1，eber‑ish，ebv(lmp1)，e‑钙粘素，egfr，ema，er，ercc1，因子viii(vwf)，因子xiiia，肌成束蛋白，fli‑1，fhs，半乳凝素‑3，胃泌激素，gcdfp‑15，gfap，胰高血糖素，血型糖蛋白a，磷脂酰肌醇聚糖‑3，颗粒酶b，生长激素(gh)，gst，ham56，hmbe‑1，hbp，hcag，hcg，血红蛋白a，hepbcore(hbcag)，hepbsurf，(hbsag)，heppar1，her2，疱疹i，疱疹ii，hhv‑8，hla‑dr，hmb45，hpl，hpv‑ihc，hpv(6/11)‑ish，hpv(16/18)‑ish，hpv(31/33)‑ish，hpvwss‑ish，hpv高‑ish，hpv低‑ish，hpv高与低‑ish，iga，igd，igg，igg4，igm，抑制素，胰岛素，jc病毒‑ish，κ‑ish，kerpan，ki‑67，λ‑ihc，λ‑ish，lh，脂肪酶，溶菌酶(mura)，乳腺珠蛋白，mart‑1，mbp，m‑细胞类胰蛋白酶，mel‑5，melan‑a，，melan‑a/ki‑67，间皮素，mitf，mlh‑1，moc‑31，mpo，msh‑2，msh‑6，muc1，muc2，muc4，muc5ac，mum‑1，myod1，肌细胞生成素，肌红蛋白，myoin重链，新天冬氨酸蛋白酶a，nb84a，new‑n，nf，nk1‑c3，npm，nse，oct‑2，oct‑3/4，oscar，p16，p21，p27/kip1，p53，p57，p63，p120，p504s，泛黑色素瘤，panc.poly，细小病毒b19，pax‑2，pax‑5，pax‑5/cd43，pax＝5/cd5，pax‑8，pc，pd1，穿孔素，pgp9.5，plap，pms‑2，pr，催乳激素，psa，psap，psma，pten，pth，pts，rb，rcc，s6，s100，血清素，生长激素抑制素，表面活性剂(sp‑a)，突触小泡蛋白，突触核蛋白，tau，tcl‑1，tcrβ，tdt，血栓调节蛋白，甲状腺球蛋白，tia‑1，toxo，trap，triviewtm胸，triviewtm前列腺，胰蛋白酶，ts，tsh，ttf‑1，酪氨酸酶，遍在蛋白，尿蛋白，vegf，绒毛蛋白，波形蛋白(vim)，vip，vzv，wt1(m)n‑末端，wt1(p)c‑末端，zap‑70。[0546]此外，可用作分析物捕获剂中的分析物结合部分或可用于本文公开的ihc/if应用的示例性非限制性抗体包括以下抗体中的任一种(及其变体)：细胞表面蛋白，胞内蛋白，激酶(例如，agc激酶家族(例如，akt1，akt2，pdk1，蛋白激酶c，rock1，rock2，sgk3)，camk激酶家族(例如，ampk1，ampk2，camk，chk1，chk2，zip)，ck1激酶家族，tk激酶家族(例如，abl2，axl，cd167，cd246/alk，c‑met，csk，c‑src，egfr，erbb2(her2/neu)，erbb3，erbb4，fak，fyn，lck，lyn，pkt7，syk，zap70)，ste激酶家族(例如，ask1，mapk，mek1，mek2，mek3mek4，mek5，pak1，pak2，pak4，pak6)，cmgc激酶家族(例如，cdk2，cdk4，cdk5，cdk6，cdk7，cdk9，erk1，gsk3，jnk/mapk8，jnk2/mapk9，jnk3/mapk10，p38/mapk)，和tkl激酶家族(例如，alk1，ilk1，irak1，irak2，irak3，irak4，limk1，limk2，m3k11，raf1，rip1，rip3，vegfr1，vegfr2，vegfr3)，auroraa激酶，aurorab激酶，ikk，nemo样激酶，pink，plk3，ulk2，wee1，转录因子(例如，foxp3，atf3，bach1，egr，elf3，foxa1，foxa2，fox01，gata)，生长因子受体，肿瘤遏制剂(例如，抗p53，抗blm，抗cdk2，抗chk2，抗brca‑1，抗nbs1，抗brca‑2，抗wrn，抗pten，抗wt1，抗p38)。[0547]在一些实施方式中，分析物捕获剂能够结合存在于细胞内的分析物。在一些实施方式中，分析物捕获剂能够结合细胞表面分析物，其可包括但不限于受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白通道、蛋白泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞‑细胞相互作用蛋白复合物，抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化t细胞受体、t细胞受体、b细胞受体、嵌合抗原受体、胞外基质蛋白、细胞表面蛋白的翻译后修饰(例如，磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝化、甲基化、乙酰化或脂质化)状态、间隙连接和粘附连接。在一些实施方式中，分析物捕获剂能够结合到翻译后修饰的细胞表面分析物。在此类实施方式中，分析物捕获剂可基于翻译后修饰的给定状态(例如，磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化或脂质化)对细胞表面分析物特异性，使得细胞表面分析物概况可包括一种或多种分析物的翻译后修饰信息。[0548]在一些实施方式中，分析物捕获剂包括与分析物结合部分偶联或以其他方式附接到分析物结合部分的捕获剂条形码结构域。在一些实施方式中，捕获剂条形码结构域共价连接到分析物结合部分。在一些实施方式中，捕获剂条形码结构域是核酸序列。在一些实施方式中，捕获剂条形码结构域包括分析物结合部分条形码和分析物捕获序列。[0549]如本文所用，术语“分析物结合部分条形码”是指与分析物结合部分相关联或以其他方式识别分析物结合部分的条形码。在一些实施方式中，通过识别分析物结合部分和与其相关联的分析物结合部分条形码，与分析物结合部分结合的分析物也可被识别。分析物结合部分条形码可以是给定长度的核酸序列和/或与分析物结合部分相关联的序列。分析物结合部分条形码通常可包括本文所述条形码的各种方面中的任一方面。例如，一种类型的分析物特异性的分析物捕获剂可具有耦合到其上的第一捕获剂条形码结构域(例如，其包括第一分析物结合部分条形码)，而不同分析物特异性的分析物捕获剂可具有耦合到其上的不同的捕获剂条形码结构域(例如，其包括第二条形码分析物结合部分条形码)。在一些方面中，这种捕获剂条形码结构域可包括使识别捕获剂条形码结构域耦合到的分析物结合部分的分析物结合部分条形码。捕获剂条形码结构域的选择可得到序列方面的显著多样性，同时也可容易地附接到大多数分析物结合部分(例如，抗体或适体)以及容易地检测(例如，使用测序或阵列技术)。[0550]在一些实施方式中，分析物捕获剂的捕获剂条形码结构域包括分析物捕获序列。如本文所用，术语“分析物捕获序列”是指被配置为杂交到捕获探针的捕获域、结合到捕获探针的捕获域、耦合到捕获探针的捕获域或以其他方式与捕获探针的捕获域相互作用的区域或部分。在一些实施方式中，分析物捕获序列包括与捕获探针的捕获域互补或基本互补的核酸序列，使得分析物捕获序列与捕获探针的捕获域杂交。在一些实施方式中，分析物捕获序列包含与包含多聚(t)核酸序列的捕获域杂交的多聚(a)核酸序列。在一些实施方式中，分析物捕获序列包含与包含多聚(a)核酸序列的捕获域杂交的多聚(t)核酸序列。在一些实施方式中，分析物捕获序列包含与捕获域杂交的非均聚核酸序列，该捕获域包含与分析物捕获区域的非均聚核酸序列互补(或基本互补)的非均聚核酸序列。[0551]在使用分析物捕获剂的本文所述的任何空间分析方法的一些实施方式中，捕获剂条形码结构域可以直接耦合到分析物结合部分，或者它们可以附接到珠、分子晶格，例如线性、球状、交联或其他聚合物，或与分析物结合部分附接或以其他方式相关联的其他框架，其使将多个捕获剂条形码结构域附接到单个分析物结合部分。捕获剂条形码结构域到分析物结合部分的附接(耦合)可通过各种直接或间接、共价或非共价结合或附接中的任何一种来实现。例如，在捕获剂条形码结构域耦合到包括抗体或抗原结合片段的分析物结合部分的情况下，可以使用化学偶联技术(例如，可从银诺瓦生物科学有限公司(innovabiosciences)获得的lightning抗体标记试剂盒)将这些捕获剂条形码结构域共价附接到抗体或抗原结合片段的部分。在一些实施方式中，捕获剂条形码结构域可使用非共价附接机制(例如，使用生物素化抗体和包括一个或多个生物素化接头的寡核苷酸或珠，用亲和素或链霉亲和素接头耦合到寡核苷酸)耦合到抗体或抗原结合片段。可使用抗体和寡核苷酸生物素化技术，并且其例如在fang等，nucleicacidsres.(2003)，31(2)：708‑715中描述，其全部内容通过引用纳入本文中。同样地，蛋白质和肽生物素化技术已被开发并可被使用，并且例如在美国专利号6,265,552中描述，其全部内容通过引用纳入本文。此外，点击反应化学(例如甲基四嗪‑peg5‑nhs酯反应、tco‑peg4‑nhs酯反应等)可用于将捕获剂条形码结构域耦合到分析物结合部分。分析物结合部分上的反应部分还可包括用于靶向醛类的胺、用于靶向马来酰亚胺(例如，游离巯基)的胺、用于靶向点击化学化合物(例如，炔烃)的叠氮化物、用于靶向链霉亲和素的生物素、用于靶向edc的磷酸盐，其反过来靶向活性酯(例如，nh2)。分析物结合部分上的反应部分可以是与分析物结合部分上的反应部分结合的化合物或基团。将分析物结合部分偶联到捕获剂条形码结构域的示例性策略包括使用商业试剂盒(例如，solulink、thunderlink)、铰接器区的轻微还原和马来酰亚胺标记的结合、对标记的酰胺(例如，无铜)的染色促进的点击化学反应，糖链的高碘酸盐氧化的偶联和胺的偶联。在分析物结合部分是抗体的情况下，抗体可以在寡核苷酸偶联之前或同时进行修饰。例如，抗体可用β‑1，4‑半乳糖基转移酶的化学基材相容的(chemicalsubstrate‑permissive)突变体，galt(y289l)和含叠氮化物的尿苷二磷酸‑n‑乙酰半乳糖胺类似物尿苷二磷酸‑galnaz进行糖基化。修饰后的抗体可与具有二苯并环辛炔‑peg4‑nhs基团的寡核苷酸偶联。在一些实施方式中，可以避免某些步骤(例如，cooh活化(例如，edc)和同双功能交联剂)以防止分析物结合部分与其自身偶联。在本文所述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，分析物捕获剂(例如，耦合到寡核苷酸的分析物结合部分)可通过转染(例如，使用转染胺、阳离子聚合物、磷酸钙或电穿孔)、转导(例如，使用噬菌体或重组病毒载体)，通过机械递送(例如，磁珠)，通过脂质(例如，1，2‑二油酸‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(dopc))，或通过转运蛋白递送至细胞内。分析物捕获剂可以通过外来体被递送至细胞内。例如，可产生释放包含分析物捕获剂的外来体的第一细胞。分析物捕获剂可以附接在外来体膜上。分析物捕获剂可以包含在外来体的胞浆中。释放的外来体可被收获并提供给第二细胞，从而将分析物捕获剂递送到第二细胞中。分析物捕获剂可在递送到细胞之前、期间或之后从外来体膜释放。在一些实施方式中，使细胞透化以使分析物捕获剂与胞内成分(例如但不限于细胞内蛋白质、代谢物和核膜蛋白质)耦合。在细胞内递送之后，可使用分析物捕获剂来分析如本文所述的胞内成分。[0552]在本文描述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，耦合到分析物捕捉剂的捕捉剂条形码结构域可包括使其不可由聚合酶扩增的修饰。在一些实施方式中，当结合到用于引物延伸反应的样品中的核酸或捕获探针的捕获域时，捕获剂条形码结构域可以用作模板而不是引物。当捕获剂条形码结构域还包括条形码(例如，分析物结合部分条形码)时，这样的设计可以通过增加捕获剂条形码结构域和未编码样品核酸之间的亲和力来提高分子条码化的效率，并且消除衔接子伪影的潜在形成。在一些实施方式中，捕获剂条形码结构域可包括随机n‑聚体序列，该随机n‑聚体序列被使其不可由聚合酶延伸的修饰所加帽。在某些情况下，随机n‑聚体序列的组成可以被设计成最大化与游离的、未编码的ssdna分子的结合效率。设计可包括具有较高gc含量的随机序列组合物、在特定位置具有固定g或c的部分随机序列、鸟苷的使用、锁核酸的使用或其任何组合。[0553]通过聚合酶阻断引物延伸的修饰可以是不同长度的碳间隔子基团或双脱氧核苷酸。在一些实施方式中，修饰可为具有无嘌呤或无嘧啶结构的无碱位点、碱基类似物或磷酸盐主链的类似物，例如通过酰胺键连接的n‑(2‑氨基乙基)‑甘氨酸主链、四氢呋喃或1’，2’‑二脱氧核糖。修饰还可以是尿嘧啶碱、2’ome修饰rna、c3‑18间隔子(例如，具有3‑18个连续碳原子的结构，例如c3间隔子)、乙二醇多聚体间隔子(例如，间隔子18(六乙二醇间隔子))、生物素、二脱氧核苷酸三磷酸酯、乙二醇、胺或磷酸盐。[0554]在本文描述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，耦合到分析物结合部分的捕获剂条形码结构域包括可裂解结构域。例如，在分析物捕获剂结合到分析物(例如，细胞表面分析物)之后，可以根据本文所述的方法裂解和收集捕获剂条形码结构域以用于下游分析。在一些实施方式中，捕获剂条形码结构域的可裂解结构域包括使物质从珠释放的u‑切除元件。在一些实施方式中，u‑切除元件可包括包含至少一种尿嘧啶的单链dna(ssdna)序列。该物质可以通过ssdna序列附接到珠上。该物质可通过尿嘧啶‑dna糖基化酶(例如，移除尿嘧啶)和核酸内切酶(例如，诱导ssdna断裂)的组合释放。如果核酸内切酶从裂解产生5′磷酸基团，则可在下游加工中包括其它酶处理以消除磷酸基团，例如，在连接其它测序手柄元件(例如，illumina全p5序列、部分p5序列、全r1序列和/或部分r1序列)之前。[0555]在一些实施方式中，来自生物样品的多种不同种类的分析物(例如，多肽)可随后与生物样品的一个或多个物理性质相关联。例如，多种不同种类的分析物可与分析物在生物样品中的位置相关联。此类信息(例如，当分析物结合部分识别多肽时的蛋白质组学信息)可与其它空间信息(例如，来自生物样品的遗传信息，例如dna序列信息、转录组信息(即转录物序列)或两者)联用。例如，细胞的细胞表面蛋白质可与细胞的一个或多个物理性质(例如，细胞的形状、大小、活性或类型)相关联。一个或多个物理性质可以通过对细胞成像来表征。细胞可由分析物捕获剂结合，该分析物捕获剂包含结合到细胞表面蛋白质的分析物结合部分和识别该分析物结合部分的分析物结合部分条形码，并且细胞可经空间分析(例如，本文所述的各种空间分析方法中的任何一种)。例如，结合到细胞表面蛋白质的分析物捕获剂可结合到捕获探针(例如，阵列上的捕获探针)，该捕获探针包括与存在于分析物捕获剂的捕获剂条形码结构域上的分析物捕获序列相互作用的捕获域。所有或部分捕获剂条形码结构域(包括分析物结合部分条形码)可使用聚合酶复制，使用捕获域的3′末端作为引发位点，生成延伸的捕获探针，其包括对应于捕获探针的互补序列的全部或部分(包括捕获探针上存在的空间条形码)和分析物结合部分条形码的拷贝。在一些实施方式中，具有延伸的捕获剂条形码结构域(其包括与捕获探针的空间条形码互补的序列)的分析物捕获剂被称为“空间加标的分析物捕获剂”。[0556]在一些实施方式中，可使具有空间加标的分析物捕获剂的空间阵列与样品接触，其中与空间阵列相关联的分析物捕获剂捕获目标分析物。包含延伸的捕获探针(其包括分析物结合部分条形码和捕获探针的空间条形码的互补序列)的分析物捕获剂随后可从空间阵列的捕获探针变性。这样就可以重复使用空间阵列。样品可分离成非聚集细胞(例如单细胞)并通过本文所述的单细胞/液滴方法进行分析。可以对空间加标的分析物捕获剂进行测序以获得捕获探针的空间条形码和分析物捕获剂的分析物结合部分条形码的核酸序列。因此，延伸的捕获探针的核酸序列可与分析物(例如，细胞表面蛋白质)相关联，并反过来与细胞的一个或多个物理性质(例如，形状或细胞类型)相关联。在一些实施方式中，延伸的捕获探针的核酸序列可与附近细胞的细胞内分析物相关联，其中使用本文所述的任何细胞透化或分析物迁移技术释放细胞内分析物。[0557]在本文所描述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，然后可以对从分析物捕获剂释放的捕获剂条形码结构域进行序列分析，以识别哪些分析物捕获剂与分析物结合。基于与空间阵列上的特征(例如，特定位置的特征)相关联的捕获剂条形码结构域和分析物结合部分条形码序列的存在，可以为生物样品创建分析物文件。个体细胞或细胞群的文件可与其他细胞(例如，“正常”细胞)的文件进行比较，以确定分析物的变化，从而提供诊断相关信息。在一些实施方式中，这些文件可用于诊断以细胞表面受体的变化为特征的各种疾病，例如癌症和其他疾病。[0558]图10是描绘特征固定的(feature‑immobilized)捕获探针1024和分析物捕获剂1026之间的示例性相互作用的示意图。特征固定的捕获探针1024可以包括空间条形码1008以及一个或多个功能序列1006和1010，如本文别处所述。捕获探针还可以包括能够结合到分析物捕获剂1026的捕获域1012。分析物捕获剂1026可以包括功能序列1018、捕获剂条形码结构域1016和能够结合到捕获探针1024的捕获域1012的分析物捕获序列1014。分析物捕获剂还可以包括接头1020，其使捕获剂条形码结构域1016耦合到分析物结合部分1022。[0559]在本文所描述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，所述方法用于识别免疫细胞文件。免疫细胞表达与免疫功能相关的各种适应性免疫受体，如t细胞受体(tcr)和b细胞受体(bcr)。t细胞受体和b细胞受体通过特异性识别和结合抗原并协助其破坏而在免疫应答中发挥作用。[0560]t细胞受体(tcr)是一种存在于t细胞表面的分子，通常负责将抗原片段识别为与主要组织相容性复合物(mhc)分子结合的肽。tcr通常是两条链的异二聚体，每条链都是免疫球蛋白超家族的成员，具有n末端可变(v)结构域和c末端恒定结构域。在人类，95％的t细胞中，tcr由α和β链组成，而在5％的t细胞中，tcr由γ和δ(γ/8)链组成。这一比例在个体发育过程中、疾病状态下以及不同物种中都会发生变化。当tcr与抗原肽和mhc(肽/mhc或pmhc)结合时，t淋巴细胞通过信号转导被活化。[0561]tcr的两条链中的每一条都包含基因区段的多个拷贝——可变的“v”基因区段、多样性的“d”基因区段和连接的“j”基因区段。tcrα链(tcra)由v、j区段重组产生，而β链(tcrb)由v、d、j区段重组产生。类似地，tcrγ链的产生涉及v和j基因区段的重组，而tcrδ链的产生是通过v、d和j基因区段的重组来实现的。这些特定区域的交叉点(α链或γ链的v和j，β链或δ链的v、d和j)对应于对抗原mhc识别很重要的cdr3区域。互补决定区(例如，cdr1、cdr2和cdr3)或高变区是抗原受体(例如，t细胞受体和免疫球蛋白)可变域中可与抗原互补的序列。cdr的大部分多样性存在于cdr3中，这种多样性是由t淋巴细胞发育过程中的体细胞重组事件产生的。在基因排列过程中产生的独特核苷酸序列可以称为克隆型。[0562]b细胞受体(bcr)是一种存在于b细胞表面的分子。bcr的抗原结合部分由膜结合抗体组成，与大多数抗体(例如免疫球蛋白)一样，膜结合抗体具有独特且随机确定的抗原结合位点。bcr的抗原结合部分包括一种同种型(例如igd、igm、iga、igg或ige)的膜结合免疫球蛋白分子。当b细胞被它第一次遇到的同源抗原活化时，该细胞增殖和分化产生抗体分泌型浆b细胞和记忆b细胞群体。不同的免疫球蛋白同种型在生物学特性、结构、靶特异性和分布上存在差异。存在多种分子机制来产生初始多样性，包括多个位点的基因重组。[0563]bcr由编码抗体重链和轻链的igh和igk(或igl)两个基因组成。免疫球蛋白是通过基因区段间的重组、这些区段连接处的序列多样化以及整个基因的点突变形成的。每个重链基因包含三个不同基因区段的多个拷贝——可变的“v”基因区段、多样性的“d”基因区段和连接的“j”基因区段。每个轻链基因包含蛋白质可变区的两个不同基因区段的多个拷贝‑可变的“v”基因区段和连接的“j”基因区段。[0564]重组可以产生一个v、d和j段各有一个的分子。此外，在两个连接的每个连接处可以删除几个碱基，并添加其他碱基(称为n和p核苷酸)，从而产生进一步的多样性。b细胞活化后，通过体细胞超突变发生亲和成熟过程。在这个过程中，活化的b细胞的子代细胞在整个基因中积累不同的体细胞突变，在cdr区域具有更高的突变浓度，从而产生对抗原具有更高亲和力的抗体。[0565]除了体细胞超突变外，活化的b细胞也经历了同种型转换的过程。具有相同可变区段的抗体根据恒定区段可以具有不同的形式(同种型)。而所有的原始b细胞都表达igm(或igd)，活化的b细胞大多数表达igg，但也表达igm、iga和ige。这种从igm(和/或igd)到igg、iga或ige的表达转换通过重组事件发生，该事件导致一个细胞专一产生特定的同种型。在基因排列过程中产生的独特核苷酸序列可以类似地称为克隆型。[0566]本文所描述的某些方法用于分析来自免疫细胞的tcr和bcr的各种序列，例如各种克隆型。在一些实施方式中，所述方法用于分析tcrα链、tcrβ链、tcrδ链、tcrγ链或其任何片段(例如，包括v(d)j或vj区的可变区、恒定区、跨膜区、其片段、其组合和其片段组合)的序列。在一些实施方式中，本文所述的方法可用于分析b细胞受体重链、b细胞受体轻链或其任何片段(例如，包括v(d)j或vj区的可变区、恒定区、跨膜区、其片段、其组合和其片段组合)的序列。[0567]在将要分析免疫细胞的情况下，用于附接条形码序列和/或扩增反应的各种操作中的任何一种的引物序列可包括靶向免疫细胞蛋白质(例如免疫受体)的基因或基因区域的基因特异性序列。这些基因序列包括但不限于各种t细胞受体α可变基因(trav基因)、t细胞受体α连接基因(traj基因)、t细胞受体α恒定基因(trac基因)、t细胞受体β可变基因(trbv基因)、t细胞受体β多样性基因(trbd基因)的序列，t细胞受体β连接基因(trbj基因)、t细胞受体β恒定基因(trbc基因)、t细胞受体γ可变基因(trgv基因)、t细胞受体γ连接基因(trgj基因)、t细胞受体γ恒定基因(trgc基因)、t细胞受体δ可变基因(trdv基因)，t细胞受体δ多样性基因(trdd基因)、t细胞受体δ连接基因(trdj基因)和t细胞受体δ恒定基因(trdc基因)的序列。[0568]在一些实施方式中，分析物结合部分基于i类或ii类主要组织相容性复合物(mhc)。在一些实施方式中，分析物结合部分是mhc多聚体，包括但不限于mhc右旋体、mhc四聚体和mhc五聚体(例如，参见美国专利申请公开号us2018/0180601和us2017/0343545，其全部内容通过引用纳入本文中)。包括全部或部分mhc肽的mhc(例如可溶性mhc单体分子)可用作分析物捕获剂的分析物结合部分，所述分析物捕获剂耦合到捕获剂条形码结构域，所述捕获剂条形码结构域包括识别其相关mhc的分析物结合部分条形码(因此，例如mhc的tcr结合伴侣)。在一些实施方式中，mhc用于分析t细胞的一个或多个细胞表面特征，例如tcr。在某些情况下，多个mhc以更大的复合物(mhc多聚体)结合在一起，通过多配体结合协同作用提高mhc与tcr的结合亲和力。[0569]图11a、11b和11c是图示如何在基于阵列的系统中利用链霉亲和素细胞标签来产生空间条码化的细胞或细胞内容物的示意图。例如，如图11所示，肽结合的主要组织相容性复合物(pmhc)可单独与生物素结合并结合到链霉亲和素部分，使得链霉亲和素部分包含多个pmhc部分。这些部分中的每一个可结合到tcr，使得链霉亲和素通过多个mch/tcr结合相互作用结合到靶t细胞。多个相互作用协同作用，可以大大提高结合亲和力。这种改进的亲和力可以改善t细胞的标记，也可以降低标记从t细胞表面解离的可能性。如图11b所示，捕获剂条形码结构域1101可由链霉亲和素1102修饰并与生物素化mhc1103的多个分子(例如pmhc)接触，使得生物素化mhc1103分子与链霉亲和素偶联的捕获剂条形码结构域1101耦合。结果是条码化的mhc多聚体复合物1105。如图11b所示，捕获剂条形码结构域序列1101可以将mhc识别为其相关联的标签，并且还包括可选的功能序列，例如用于与其他寡核苷酸杂交的序列。如图11c所示，一个示例寡核苷酸是捕获探针1106，其包括互补序列(例如，与ccc相对应的rgrgrg)、条形码序列和其他功能序列，例如，umi、衔接子序列(例如，包括测序引物序列(例如，r1或部分r1(“pr1”))、流动池附接序列(例如，p5或p7或其部分序列)等。在某些情况下，捕获探针1106可首先与特征(例如，凝胶珠)相关联并从特征中释放。在其它实施方式中，捕获探针1106可与mhc‑寡核苷酸复合物1105的捕获剂条形码结构域1101杂交。杂交的寡核苷酸(间隔子ccc和间隔子rgrgrg)随后可在引物延伸反应中延伸，使得生成包含对应于两个空间条形码序列(与捕获探针相关联的空间条形码，与mhc‑寡核苷酸复合物相关联的条形码)中的每一个的序列的构建物。在一些情况下，这些对应序列中的一个或两个可以是捕获探针1106或捕获剂条形码结构域1101中的原始序列的互补物。在其他实施方式中，捕获探针和捕获剂条形码结构域连接在一起。所得到的构建体可以任选地进一步加工(例如，以添加任何其它序列和/或用于清理)并进行测序。如本文别处所述，源自捕获探针1106空间条形码序列的序列可用于识别特征，并且源自捕获剂条形码结构域1101上的空间条形码序列的序列可用于识别结合在细胞表面上的特定肽mhc复合物1104(例如，当使用用于筛选免疫细胞或免疫细胞群的mhc肽库时)。[0570](c)基材[0571]对于本文中描述的基于空间阵列的分析方法，基材起到了支持捕获探针直接或间接附接到阵列特征的作用。此外，在一些实施方式中，基材(例如，相同的基材或不同的基材)可用于为生物样品，特别是，例如薄组织切片提供支持。因此，“基材(substrate)”是不溶于水性溶液的支持物，其使生物样品、分析物、特征和/或捕获探针定位在基材上。[0572]此外，如本文所用的“基材”，当前面没有修饰语“化学”时，是指具有至少一个表面的构件，该表面通常起到为本文所述的生物样品、分析物和/或任何其它化学和/或物理部分、试剂和结构提供物理支持。基材可由多种固体材料、凝胶基材料、胶体材料、半固体材料(例如，至少部分交联的材料)、完全或部分固化的材料和经历相变或过渡的材料形成以提供物理支持。可用于本文所述的方法和系统的基材的示例包括但不限于载玻片(例如由各种玻璃形成的载玻片、由各种聚合物形成的载玻片)、水凝胶、层和/或薄膜，膜(例如多孔膜)、流动池、比色皿、晶片、板或它们的组合。在一些实施方式中，基材可以任选地包括功能元件，例如凹槽、突出结构、微流体元件(例如，通道、储器、电极、阀、密封件)和各种标识，如下文将进一步详细讨论的那些。[0573](i)基材属性[0574]基材通常可以具有任何合适的形式或形态。例如，基材可以是平坦的、弯曲的，例如向生物样品(例如组织样品)和基材之间发生相互作用的区域呈凸形或凹形弯曲。在一些实施方式中，基材是平坦的，例如，平面、芯片或载玻片。基材可包含基材内的一个或多个图案化表面(例如，通道、孔、凸起、脊、凹坑等)。[0575]基材可以是任何期望的形状。例如，基材通常可以是薄的扁平形状(例如，正方形或矩形)。在一些实施方式中，基材结构具有圆角(例如，为了增加安全性或稳健性)。在一些实施方式中，基材结构具有一个或多个截止角(例如，用于滑动夹或交叉台)。在一些实施方式中，当基材结构是平坦的时，基材结构可以是具有平坦表面的任何适当类型的支持物(例如，芯片或载玻片，例如显微镜载玻片)。[0576]基材可任选地包括各种结构，例如但不限于凸起、脊和通道。基材可以被微图案化以限制横向扩散(例如，防止空间条形码的重叠)。用这种结构修饰的基材可以被修饰以使分析物、特征物(例如，珠)或探针在各个位置的结合。例如，用各种结构修饰基材的位点可以与其他位点连续或不连续。[0577]在一些实施方式中，基材的表面可以被修饰，以便形成只能具有或容纳单个特征的离散位置。在一些实施方式中，基材的表面可以被修饰，使得特征粘附到随机位点。[0578]在一些实施方式中，使用例如(但不限于)冲压、微蚀或模制技术等技术来修饰基材的表面以包含一个或多个孔。在基材包括一个或多个孔的一些实施方式中，基材可以是凹陷表面载玻片或凹穴载玻片。例如，孔可以由基材表面上的一个或多个浅凹陷形成。在一些实施方式中，在基材包括一个或多个孔的情况下，可以通过将盒(例如，包含一个或多个腔室的盒)附接到基材结构的表面来形成孔。[0579]在一些实施方式中，基材(例如，孔或特征)的结构可各自承载不同的捕获探针。可以根据结构在基材表面中或基材表面上的位置来识别附接在每个结构上的不同捕获探针。示例性基材包括阵列，其中分开的结构位于基材上，包括例如具有容纳特征的孔的阵列。[0580]在一些实施方式中，其中基材被修饰以包含一个或多个结构，包括但不限于孔、凸起、脊、特征或标识，所述结构可包括物理改变的位点。例如，用各种结构修饰的基材可包括物理性质，包括但不限于物理构型、磁力或压缩力、化学官能化位点、化学改变位点和/或静电改变位点。在一些实施方式中，其中基材被修饰以包含各种结构，包括但不限于孔、凸起、脊、特征或标识，所述结构以图案施加。或者，结构可以随机分布。[0581]基材(例如，或珠或阵列上的特征)可包括几万到几十万或数百万个个体寡核苷酸分子(例如，至少约10000、50000、100000、500000、1000000、10000000、10000000、100000000、100000000、100000000或1000000000个寡核苷酸分子)。[0582]在一些实施方式中，基材包括基材表面上的一个或多个标识，例如，以提供将空间信息与感兴趣的分析物的表征相关联的指引。例如，可以用线的网格来对基材提供标志物(例如，允许容易地估计在放大率下看到的对象的大小和/或提供用于计数对象的参考区域)。在一些实施方式中，基材上可以包括基准标志物。此类标识可使用包括但不限于印刷、喷砂和表面沉积等技术制作。[0583]在一些实施方式中，可以使用一个或多个基准标志物来进行成像，即，放置在成像系统的视野中的对象，其出现在所产生的图像中。基准标志物通常用作参考点或测量标度。基准标志物可以包括但不限于可检测的标记物，例如荧光、放射性、化学发光和比色标记物。例如，在carter等，appliedoptics46：421‑427，2007中描述了使用基准标志物来稳定化和定向生物样品，其全部内容通过引用纳入本文。在一些实施方式中，基准标志物可以是物理颗粒(例如，纳米颗粒、微球、纳米球、珠或本文所述或本领域已知的任何其他示例性物理颗粒)。[0584]在一些实施方式中，基准标志物可存在于基材上以提供生物样品的取向。在一些实施方式中，微球可耦合至基材以帮助生物样品的定向。在一些示例中，耦合至基材的微球可产生光信号(例如，荧光)。在另一示例中，微球可以特定图案或设计(例如六角形设计)附接于阵列的部分(例如角部)，以帮助生物样品在基材上的特征阵列上的定向。在一些实施方式中，量子点可耦合到基材以帮助生物样品的定向。在一些例子中，耦合到基材的量子点可以产生光信号。[0585]在一些实施方式中，基准标志物可为固定化分子，可检测信号分子可与之相互作用以产生信号。例如，标志物核酸可连接或耦合到当接受特定波长(或波长范围)的光时能够发出荧光的化学部分。这种标志物核酸分子可以在组织样品染色之前、同时或之后与阵列接触，以使组织切片可视化或成像。尽管不是必需的，但是使用可使用用于检测标记的cdna的相同条件(例如成像条件)来检测的标志物可能是有利的。[0586]在一些实施方式中，包括基准标志物以促进组织样品或其图像相对于固定在基材上的捕获探针的定向。可以使用任何数量的用于对阵列进行标识的方法，使得仅当对组织切片成像时才可检测到标志物。例如，分子，例如产生信号的荧光分子，可以直接或间接地固定在基材的表面上。可以在基材上以图案(例如，边缘、一行或多行、一条或多条线等)提供标志物。[0587]在一些实施方式中，基准标志物可以随机放置在视野中。例如，含有荧光团的寡核苷酸可在基材上的随机位置随机印刷、压印、合成或附接到基材(例如载玻片)上。组织切片可与基材接触，使得含有荧光团的寡核苷酸接触或接近来自组织切片的细胞或细胞的组分(例如，mrna或dna分子)。可以获得基材和组织切片的图像，并且可以确定荧光团在组织切片图像中的位置(例如，通过回顾覆盖有荧光团检测的组织切片的光学图像)。在一些实施方式中，基准标志物可以精确地放置在视野中(例如，在基材上的已知位置)。在这种情况下，基准标志物可以压印、附着或合成在基材上并与生物样品接触。通常，拍摄样品和基准标志物的图像，并且可以通过观看图像来确认基准标志物在基材上的位置。[0588]在一些实施方式中，基准标志物可以是附着到基材的固定化分子(例如，物理颗粒)。例如，基准标志物可以是纳米颗粒，例如纳米棒、纳米线、纳米立方体、纳米金字塔或球形纳米颗粒。在一些例子中，纳米颗粒可以由重金属(例如金)制成。在一些实施方式中，纳米颗粒可由金刚石制成。在一些实施方式中，基准标志物可以通过眼睛看到。[0589]如本文所述，本文所述的任何基准标志物(例如，微球、珠或本文所述的任何其他物理颗粒)可以以特定图案或设计(例如，六边形设计)位于阵列的部分(例如，角)，以帮助生物样品在基材上的特征阵列上的定向。在一些实施方式中，位于阵列(例如，基材上的阵列)的部分(例如，角部)的基准标志物可以被图案化或设计于至少1个、至少2个、至少3个或至少4个独特的图案。在一些示例中，位于阵列(例如，基材上的阵列)角部的基准标志物可以具有四种独特的基准标志物图案。[0590]在某些示例中，基准标志物可以环绕阵列。在一些实施方式中，基准标志物能够实现例如镜像的检测。在一些实施方式中，基准标志物可以完全包围阵列。在一些实施方式中，基准标志物可以不完全包围阵列。在一些实施方式中，基准标志物识别阵列的角。在一些实施方式中，一个或多个基准标志物标识阵列的中心。在一些实施方式中，基准标志物包括图案化点，其中一个或多个图案化点基准标志物的直径约为100微米。基准标志物的直径可以是任何有用的直径，包括但不限于50微米到500微米的直径。基准标志物可以这样布置，使得一个基准标志物的中心距阵列周围的一个或多个其他基准标志物的中心在100微米到200微米之间。在一些实施方式中，具有周围基准标志物的阵列约为8mm×8mm。在一些实施方式中，没有周围基准标志物的阵列小于8mm×50mm。[0591]在一些实施方式中，可以将阵列封闭在框架内。换句话说，阵列的周界可以有基准标志物，这样阵列就被封闭或基本封闭。在一些实施方式中，阵列的周界可以是基准标志物(例如，本文描述的任何基准标志物)。在一些实施方式中，阵列的周界可以是均匀的。例如，基准标识(fiducialmarking)可以以这样的方式连接或基本上连接阵列的连续角，使得阵列周界的非角部分在阵列的所有侧面(例如，四个侧面)上是相同的。在一些实施方式中，附接到周界的非角部分的基准标志物可以被图案化或设计成有助于生物样品在阵列上的定向。在一些实施方式中，附接到周界的非角部分的颗粒可以至少1个、至少2个、至少3个或至少4个图案来图案化或设计。在一些实施方式中，在阵列周界的非角部分上，所述图案可以具有基准标识的至少2个、至少3个或至少4个独特图案。[0592]在一些实施方式中，阵列在基材表面上的不同位置可包括至少两个基准标志物(例如，至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100或更多(例如，几百、几千或几万个基准标志物)。可以在基材上以图案(例如，边缘、一行或多行、一条或多条线等)提供基准标志物。[0593]多种不同的基材可用于上述目的。通常，基材可以是任何合适的支持材料。示例性基材包括但不限于玻璃、改性和/或功能化玻璃、水凝胶、膜、薄膜、塑料(包括例如丙烯酸、聚苯乙烯、苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、teflontm、环烯烃、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、树脂，zeonor、二氧化硅或二氧化硅基材料，包括硅和改性硅、碳、金属、无机玻璃、光纤束和聚合物，例如聚苯乙烯、环烯烃共聚物(coc)、环烯烃聚合物(cop)、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯或其组合。[0594]在上面讨论的基材材料的示例中，聚苯乙烯是适于结合带负电大分子的疏水性材料，因为它通常几乎不包含亲水性基团。对于固定在玻片上的核酸，通过增加玻璃表面的疏水性，可以增加核酸的固定。这种增强可以使相对更密集的堆叠形成(例如，提供改进的特异性和分辨率)。[0595]在另一个示例中，基材可以是流动池。流动池可以由上述任何材料形成，并且可以包括使试剂、溶剂、特征和分析物通过流动池的通道。在一些实施方式中，嵌入水凝胶的生物样品组装在流动池中(例如，流动池用于将水凝胶引入生物样品)。在一些实施方式中，嵌入水凝胶的生物样品未组装在流动池中。在一些实施方式中，然后嵌入水凝胶的生物样品可以如本文所述被制备和/或等距扩展。[0596](ii)导电基材[0597]如本文所述产生的导电基材(例如，电泳相容阵列)可用于分析物的空间检测。例如，可以应用电泳场以促进分析物向阵列上的条码化寡核苷酸(例如捕获探针)(例如，固定在纸上的捕获探针、固定在水凝胶膜中的捕获探针或固定在具有导电覆层的载玻片上的捕获探针)迁移。在一些实施方式中，可以布置电泳组件。例如，阳极和阴极可以布置成使得捕获探针阵列(例如固定在纸上的捕获探针、固定在水凝胶膜中的捕获探针，或固定在具有导电覆层的载玻片上的捕获探针)和生物样品位于阳极和阴极之间。在这样的实施方式中，使生物样品中的分析物主动迁移到导电基材上的捕获探针并被捕获。可以根据本文所述的任何方法制备(例如，透化)生物样品。在一些实施方式中，在电泳辅助捕获分析物之后，可以使用本文所述的任何方法来收集、处理和/或分析(例如，测序)条码化的寡核苷酸(例如，捕获探针)和捕获的分析物。[0598]在一些实施方式中，导电基材可包括玻璃(例如，载玻片)，其已被覆有某物质或以其它方式改性以赋予玻璃导电性质。在一些实施方式中，载玻片可以被覆有导电覆层。在一些实施方式中，导电覆层包括氧化锡(to)或氧化铟锡(ito)。在一些实施方式中，导电覆层包括透明导电氧化物(tco)。在一些实施方式中，导电覆层包括铝掺杂氧化锌(azo)。在一些实施方式中，导电覆层包括掺氟氧化锡(fto)。[0599]在一些实施方式中，可以在导电基材(例如，本文所述的任何导电基材)上产生用寡核苷酸(例如，捕获探针，例如，本文所述的多种捕获探针中的任一种)点样或印刷的阵列。例如，本文所述的阵列可与主动分析物捕获方法(例如，本文所述的任何分析物捕获方法，包括但不限于电泳捕获方法)相容。在一些实施方式中，导电基材是多孔介质。可用于本文所述的使用主动分析物捕获的方法中的多孔介质的非限制性示例包括硝化纤维素或尼龙膜。在一些实施方式中，可用于本文所述的使用主动分析物捕获的方法中的多孔介质包括纸。在一些实施方式中，寡核苷酸可以印刷在纸基材上。在一些实施方式中，印刷的寡核苷酸可以与基材相互作用(例如，与纸的纤维相互作用)。在一些实施方式中，印刷的寡核苷酸可以共价结合基材(例如，结合到纸的纤维)。在一些实施方式中，分子前体溶液中的寡核苷酸可以印刷在导电基材(例如，纸)上。在一些实施方式中，分子前体溶液可以聚合，从而在导电基材(例如，纸)上产生凝胶垫。在一些实施方式中，分子前体溶液可通过光聚合(例如，光固化)。在一些实施方式中，含有寡核苷酸(例如，条码化寡核苷酸(例如捕获探针))的凝胶珠(例如，本文所述各种凝胶珠中的任一种)可以印刷在导电基材(例如纸)上。在一些实施方式中，印刷的寡核苷酸可以共价连接到凝胶基质中。[0600](iii)覆层[0601]在一些实施方式中，基材的表面可被覆有细胞受纳覆层以使活细胞粘附。“细胞受纳覆层(cell‑permissivecoating)”是使细胞或帮助细胞在基材上维持细胞活力(例如保持活力)的覆层。例如，细胞受纳覆层可增强细胞附接、细胞生长和/或细胞分化，例如，细胞受纳覆层可向活细胞提供营养。细胞受纳覆层可以包括生物材料和/或合成材料。细胞受纳覆层的非限制性示例包括特征在于具有一个或多个细胞外基质(ecm)成分(例如蛋白聚糖和纤维蛋白，例如胶原、弹性蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白)、聚赖氨酸、聚(l)‑鸟氨酸和/或生物相容性硅酮(例如)的覆层。例如，包括一种或多种细胞外基材成分的细胞受纳覆层可包括i型胶原、ii型胶原、iv型胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和/或玻连蛋白。在一些实施方式中，细胞受纳覆层包括从engelbreth‑holm‑swarm(ehs)小鼠肉瘤(例如，)中提取的可溶性基膜制剂。在一些实施方式中，细胞受纳覆层包括胶原。细胞受纳覆层可用于在空间条码化阵列上培养贴壁细胞，或在与空间条码化阵列接触时维持组织样品或切片的细胞活力。[0602]在一些实施方式中，用表面处理剂(例如聚(l)‑赖氨酸)被覆基材。另外或可选择地，可通过硅烷化(例如采用环氧硅烷、氨基硅烷)和/或通过聚丙烯酰胺处理来处理基材。[0603]在一些实施方式中，处理基材以最小化或减少特征内或特征之间的非特异性分析物杂交。例如，处理可包括用水凝胶、膜和/或薄膜涂覆基材，其对非特异性杂交形成物理屏障。可以使用任何合适的水凝胶。例如，可以使用根据美国专利号6,391,937、9,512,422和9,889,422以及美国专利申请公开号u.s.2017/0253918和u.s.2018/0052081中所述方法制备的水凝胶基材。上述各文件的全部内容通过引用纳入本文。[0604]处理可包括添加具有反应性或能够被活化的官能团，使得其在刺激(例如，光活性官能团)的施用后变得具有反应性。处理可包括使用具有一种或多种物理性质(例如，机械、电气、磁性和/或热)的聚合物进行处理，以最小化非特异性结合(例如，在某些位置活化基材以使在这些位置进行分析物杂交)。[0605]“可条件性移出覆层”是指在应用释放剂后可从基材表面移出的覆层。在一些实施方式中，可条件性移出覆层包括如本文所述的水凝胶，例如，包括基于多肽的材料的水凝胶。具有基于多肽的材料的水凝胶的非限制性示例包括具有蜘蛛丝和人类肌肉l型钙通道的跨膜区段(例如，)的组合的基于合成肽的材料，含有重复的精氨酸‑丙氨酸‑天冬氨酸‑丙氨酸序列(radaradaradarada)(例如)、eak16(aeaeakakaeaeakak)、kld12(kldlkldlkldl)和pgmatrixtm的两亲性16残基肽。[0606]在一些实施方式中，条件可移出覆层中的水凝胶是刺激响应性水凝胶。刺激响应性水凝胶可在施加一个或多个外部触发物(例如释放剂)时经历凝胶到溶液和/或凝胶到固体的转变。参见，例如，willner，acc.chem.res.50：657‑658，2017，其全文通过引用纳入本文。刺激响应性水凝胶的非限制性示例包括热响应性水凝胶、ph响应性水凝胶、光响应性水凝胶、氧化还原响应性水凝胶、分析物响应性水凝胶或其组合。在一些实施方式中，刺激响应性水凝胶可以是多刺激响应性水凝胶。[0607]“释放剂”或“外部触发物”是当释放剂施加到可条件性移出覆层上时，使从基材移出可条件性移出覆层的试剂。外部触发物或释放剂可包括物理触发物，例如热、磁、超声、电化学和/或光刺激，以及化学触发物，例如ph、氧化还原反应、超分子复合物和/或生物催化驱动反应。参见例如echeverria等，gels(2018)，4，54；doi：10.3390/gels4020054，其全文通过引用纳入本文。“释放剂”或“外部触发物”的类型可取决于可条件性移出覆层的类型。例如，特征在于具有氧化还原响应性水凝胶的可条件性移出覆层可在施用包括还原剂(例如二硫苏糖醇(dtt))的释放剂时移出。作为另一个例子，ph响应性水凝胶可在施加改变ph的释放剂时移除。[0608](iv)凝胶基材[0609]在一些实施方式中，水凝胶可形成基材。本文中的术语“水凝胶”是指包括网络的高分子聚合物凝胶。在网络中，一些聚合物链可以选择性地交联，尽管交联并不总是发生。在一些实施方式中，基材包括水凝胶和一种或多种第二材料。在一些实施方式中，将水凝胶放置在一种或多种第二材料的顶部。例如，水凝胶可以预先形成，然后用一种或多种第二材料放置在顶部、底部或以任何其他构造放置中。在一些实施方式中，水凝胶形成发生在于基材形成期间接触一种或多种第二材料之后。水凝胶形成也可以发生在位于基材上的结构(例如，孔、脊、特征、凸起和/或标识)内。当基材包括凝胶(例如，水凝胶或凝胶基材)时，凝胶内的寡核苷酸可附接于基材。[0610]在一些实施方式中，水凝胶可包括水凝胶亚基。水凝胶亚基可包括任何方便的水凝胶亚基，例如但不限于丙烯酰胺、双丙烯酰胺、聚丙烯酰胺及其衍生物、聚乙二醇及其衍生物(例如peg‑丙烯酸酯(peg‑da)、peg‑rgd)、明胶‑甲基丙烯酰(gelma)、甲基丙烯酸化透明质酸(meha)、聚脂肪族聚氨酯，聚醚型聚氨酯、聚酯型聚氨酯、聚乙烯共聚物、聚酰胺、聚乙烯醇、聚丙二醇、聚氧丁撑、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸羟乙酯和聚甲基丙烯酸羟乙酯、胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖、琼脂糖、明胶、海藻酸盐、蛋白质聚合物、甲基纤维素等或其组合。[0611]在一些实施方式中，水凝胶包括杂化材料，例如，水凝胶材料包括合成聚合物和天然聚合物的元素。例如，在美国专利号6,391,937、9,512,422和9,889,422以及美国专利申请公开号2017/0253918、2018/0052081和2010/0055733中描述了合适水凝胶的示例，其全部内容通过引用纳入本文中。[0612]在一些实施方式中，将交联剂和/或引发剂添加到水凝胶亚基。交联剂的示例包括但不限于双丙烯酰胺和双吖丙啶。引发剂的示例包括但不限于偶氮二异丁腈(aibn)、核黄素和l‑精氨酸。包含交联剂和/或引发剂可导致在后期聚合步骤中相互作用的生物大分子之间共价键合增加。[0613]在一些实施方式中，水凝胶可具有胶体结构(例如琼脂糖)或聚合物网状结构(例如明胶)。在一些实施方式中，水凝胶是均聚水凝胶。在一些实施方式中，水凝胶是共聚水凝胶。在一些实施方式中，水凝胶是多聚物互穿聚合物水凝胶。[0614]在一些实施方式中，一些水凝胶亚基共价或物理交联聚合(例如经历“形成”)，以形成水凝胶网络。例如，水凝胶亚基可以通过任何方法聚合，包括但不限于，热交联、化学交联、物理交联、离子交联、光交联、自由基引发交联、加成反应、缩合反应、水溶性交联反应、辐照交联(例如，x射线、电子束)或其组合。光刻聚合等技术也可用于形成水凝胶。[0615]在一些实施方式中，可以将含有寡核苷酸(例如，条码化的寡核苷酸，例如捕获探针)的凝胶珠沉积在基材(例如，载玻片)上。在一些实施方式中，凝胶垫可以沉积在基材(例如，载玻片)上。在一些实施方式中，凝胶垫或凝胶珠以阵列形式沉积在基材上。在凝胶垫或凝胶珠以阵列形式沉积在基材上的一些实施方式中，可将水凝胶分子前体溶液施加在阵列(例如，载玻片上的凝胶垫或凝胶珠的阵列)的顶部。在一些实施方式中，可以使水凝胶分子前体溶液聚合，使得沉积的凝胶垫或凝胶珠固定在聚合的水凝胶内。可以使用任何合适的聚合方法或(例如，本文描述的各种方法中的任何一种)。在一些实施方式中，包括凝胶垫或凝胶珠的聚合水凝胶可以从基材(例如，载玻片)移除(例如，剥离)，使得凝胶珠或凝胶垫固定在水凝胶中。在一些实施方式中，包括凝胶垫或凝胶珠的聚合水凝胶是导电基材(如本文所述)，其可根据本文所述的多种分析物捕获方法(例如，用于捕获的分析物的电泳迁移)中的任一种使用。[0616]阵列可以通过在基材表面上沉积特征(例如，液滴、珠)以产生空间条码化阵列来制备。用于沉积(例如，液滴操作)特征的方法是本领域已知的(参见，美国专利申请公开号2008/0132429，rubina，a.y.等，biotechniques.2003年5月；34(5)：1008‑14，1016‑20，1022和vasiliskov等.biotechniques.1999年9月；27(3)：592‑4，596‑8，600各处，其各自通过引用其全文的方式纳入本文)。可以在基材上的特定位置印刷或沉积特征(例如，喷墨印刷)。在一些实施方式中，每个特征可具有用作空间条形码的独特寡核苷酸。在一些实施方式中，每个特征可以具有用于多重化(例如，捕获多种分析物或多种类型的分析物，例如蛋白质和核酸)的捕获探针。在一些实施方式中，可以使用电场在特定位置印刷或沉积特征。特征可以包含可光交联的聚合物前体和寡核苷酸。在一些实施方式中，可光交联的聚合物前体可以沉积到基材(例如，孔)上的图案化特征中。[0617]“可光交联的聚合物前体”是指在曝光时交联和/或聚合的化合物。在一些实施方式中，还可包括一种或多种光引发剂以诱导和/或促进聚合和/或交联。参见，例如，choi等.biotechniques.2019年1月；66(1)：40‑53，其通过引用其全文的方式纳入本文。[0618]可光交联聚合物前体的非限制性示例包括聚(乙二醇)二丙烯酸酯(pegda)、明胶‑甲基丙烯酰(gelma)和甲基丙烯酸化透明质酸(meha)。在一些实施方式中，可光交联的聚合物前体包括聚(乙二醇)二丙烯酸酯(pegda)、明胶‑甲基丙烯酰(gelma)、甲基丙烯酸化透明质酸(meha)或其组合。在一些实施方式中，可光交联的聚合物前体(例如，pazam)可以共价连接(例如，交联)至基材。在一些实施方式中，可光交联的聚合物前体不与基材表面共价连接。例如，可以使用不含硅烷的丙烯酰胺(参见美国专利申请公开号2011/0059865，通过引用其全文方式纳入本文)。特征中的可光交联聚合物前体(例如、液滴或珠)可以通过任何已知的方法聚合。寡核苷酸可以在交联凝胶基质中聚合(例如，共聚或同时聚合)。在一些实施方式中，可以将包含沉积在基材表面上的可光交联聚合物前体的特征暴露于紫外光。紫外光可诱导可光交联聚合物前体的聚合并导致特征变成基材表面(例如，阵列)上的凝胶基质(例如，凝胶垫)。[0619]可选择水凝胶亚基的聚合方法以形成具有不同性质(例如，水凝胶的孔体积、溶胀性质、生物降解性、导电性、透明度和/或透化性)的水凝胶。例如，水凝胶可包括足够体积的孔，以使大分子(例如，核酸、蛋白质、染色质、代谢物、grna、抗体、碳水合合物、肽、代谢物和/或小分子)通过至/自样品(例如，组织切片)。众所周知，孔体积通常随着水凝胶亚基浓度的增加而减小，并且通常随着水凝胶亚基与交联剂的比例的增加而增大。因此，可制备包含一定浓度的使此类生物大分子通过的水凝胶亚基的水凝胶组合物。[0620]在一些实施方式中，基材上的水凝胶形成发生在特征(例如，珠)附接到基材之前、同时或之后。例如，当捕获探针附接(例如，直接或间接)至基材时，可在已包含捕获探针的基材上进行水凝胶形成。[0621](d)阵列[0622]在本文描述的许多方法中，特征(如下面进一步描述的)被集体地定位在基材上。“阵列”是不规则或形成规则图案的多个特征的特定排列。阵列中的各个特征基于其相对空间位置而彼此不同。一般而言，阵列中的多个特征中的至少两个包括不同的捕获探针(例如，本文描述的捕获探针的任何示例)。[0623]阵列可用于同时测量大量分析物。在一些实施方式中，至少部分地使用寡核苷酸来创建阵列。例如，单一种类的寡核苷酸(例如，捕获探针)的一个或多个拷贝可对应于或直接或间接地附接到阵列中的给定特征。在一些实施方式中，阵列中的给定特征包括两种或更多种寡核苷酸(例如，捕获探针)。在一些实施方式中，直接或间接连接到阵列上给定特征的两种或更多种寡核苷酸(例如，捕获探针)包括共同(例如，相同)空间条形码。[0624](i)用于分析物捕获的阵列[0625]在一些实施方式中，阵列可包括直接或间接附接至基材的捕获探针。捕获探针可包括捕获域(例如，核苷酸序列)，其可以特异性地结合(例如，杂交)到样品内的目标分析物(例如，mrna、dna或蛋白质)。在一些实施方式中，捕获探针与靶标的结合(例如杂交)可通过检测已纳入靶标中的视觉信号(例如荧光团、重金属(例如银离子)或化学发光标记)来检测和定量。在一些实施方式中，视觉信号的强度与生物样品中每个分析物的相对丰度相关。由于阵列可以包含数千或数百万个捕获探针(或更多)，因此阵列可以并行询问许多分析物。[0626]在一些实施方式中，基材包括一个或多个捕获探针，其设计用于捕获来自一个或多个生物体的分析物。在非限制性示例中，基材可包含设计用于捕获来自一个生物体(例如，人类)的mrna的一个或多个捕获探针和设计用于捕获来自第二生物体(例如，细菌)的dna的一个或多个捕获探针。[0627]捕获探针可以使用多种技术附接到基材或特征。在一些实施方式中，捕获探针直接附接到固定在阵列上的特征。在一些实施方式中，捕获探针通过化学固定固定到基材上。例如，在基材上的官能团和捕获探针上的相应功能元件之间可以发生化学固定。捕获探针中的示例性对应功能元件可以是捕获探针的固有化学基团，例如羟基，或者可以将功能元件引入到捕获探针上。基材上官能团的示例为胺基。在一些实施方式中，要固定的捕获探针包括官能胺基或经化学修饰以包括官能胺基。用于这种化学改性的手段和方法在本领域是众所周知的。[0628]在一些实施方式中，捕获探针是核酸。在一些实施方式中，捕获探针通过其5′端固定在基材或特征上。在一些实施方式中，捕获探针通过其5′端固定在基材或特征上，并且从5′端到3′端包括：一个或多个条形码(例如，空间条形码和/或umi)和一个或多个捕获域。在一些实施方式中，捕获探针通过其5′端固定在基材或特征上，并且从5′端到3′端包括：一个条形码(例如，空间条形码或umi)和一个捕获域。在一些实施方式中，捕获探针通过其5′端固定在基材或特征上，并且从5′端到3′端包括：裂解域、功能域、一个或多个条形码(例如，空间条形码和/或umi)和捕获域。[0629]在一些实施方式中，捕获探针通过其5′端固定在基材或特征上，并且从5′端到3′端包括：裂解域、功能域、一个或多个条形码(例如，空间条形码和/或umi)、第二功能域和捕获域。在一些实施方式中，捕获探针通过其5′端固定在基材或特征上，并且从5′端到3′端包括：裂解域、功能域、空间条形码、umi和捕获域。在一些实施方式中，捕获探针通过其5′端固定在基材或特征上，并且不包括空间条形码。在一些实施方式中，捕获探针通过其5′端固定在基材或特征上，并且不包括umi。在一些实施方式中，捕获探针包括用于起始测序反应的序列。[0630]在一些实施方式中，捕获探针通过其3′端固定在基材或特征上。在一些实施方式中，捕获探针通过其3′端固定在基材或特征上，并且从3′端到5′端包括：一个或多个条形码(例如，空间条形码和/或umi)和一个或多个捕获域。在一些实施方式中，捕获探针通过其3′端固定在基材或特征上，并且从3′端到5′端包括：一个条形码(例如，空间条形码或umi)和一个捕获域。在一些实施方式中，捕获探针通过其3′端固定在基材或特征上，并且从3′端到5′端包括：裂解域、功能域、一个或多个条形码(例如，空间条形码和/或umi)和捕获域。在一些实施方式中，捕获探针通过其3′端固定在基材或特征上，并且从3′端到5′端包括：裂解域、功能域、空间条形码、umi和捕获域。[0631]待固定的捕获探针内的官能团的定位可用于控制和塑造捕获探针的结合行为和/或取向，例如，官能团可放置在捕获探针的5′或3′端部或捕获探针的序列内。在一些实施方式中，捕获探针还可包括基材。待固定的捕获探针的典型基材包括能够结合到所述捕获探针(例如，结合到胺官能化核酸)的部分。此类基材的示例为羧基、醛基或环氧基基材。[0632]在一些实施方式中，可将捕获探针固定在其上的基材可被化学活化，例如通过活化基材上可用的官能团。术语“活化(的)基材”涉及其中通过化学修饰程序建立或实现相互作用或反应性化学官能团的材料。例如，包括羧基的基材可在使用前活化。此外，某些基材含有能与捕获探针中已有的特定部分反应的官能团。[0633]在一些实施方式中，共价键用于将捕获探针直接耦合到基材。在一些实施方式中，捕获探针通过将捕获探针的“第一”核苷酸与基材分离的接头(例如，化学接头)间接耦合到基材。在一些实施方式中，捕获探针不直接结合到基材，而是间接地相互作用，例如通过结合到本身直接或间接结合到基材的分子。在一些实施方式中，捕获探针间接地附接到基材(例如，经由包括聚合物的溶液附接至基材)。[0634]在捕获探针间接固定在阵列特征上的一些实施方式中，例如通过与能够结合捕获探针的表面探针杂交，捕获探针还可以包括能够与表面探针的5′端杂交的上游序列(与杂交到核酸，例如，组织样品的rna的序列的5′方向上)。单独地，捕获探针的捕获域可被视为捕获域寡核苷酸，其可在捕获探针间接固定在阵列上的实施方式中用于捕获探针的合成。[0635]在一些实施方式中，基材由惰性材料或基质(例如，载玻片)组成，所述惰性材料或基质已通过例如用包含能够固定捕获探针的反应基团的材料处理基材而官能化。例如，参见wo2017/019456，其全部内容通过引用纳入本文。非限制性示例包括惰性基材上支持的聚丙烯酰胺水凝胶(例如，载玻片；参见wo2005/065814和美国专利申请号2008/0280773，其全部内容通过引用纳入本文)。[0636]在一些实施方式中，使用共价方法将官能化生物分子(例如，捕获探针)固定在官能化基材上。共价附接的方法包括，例如胺和活化的羧酸酯(例如，n‑羟基琥珀酰亚胺酯)的缩合；胺和醛在还原胺化条件下的缩合；以及环加成反应，例如diels‑alder[4 2]反应、1，3‑偶极环加成反应，和[2 2]环加成反应。共价附接的方法还包括，例如点击化学反应，包括[3 2]环加成反应(例如，huisgen1，3‑偶极环加成反应和铜(i)催化的叠氮炔环加成反应(cuaac))；巯基‑烯反应；diels‑alder反应和逆电子需求diels‑alder反应；[4 1]异腈和四嗪的环加成；小碳环的亲核开环(例如，氨基寡核苷酸的环氧化物开环)。共价附接的方法还包括例如马来酰亚胺和硫醇；以及对硝基苯酯‑官能化寡核苷酸和聚赖氨酸‑官能化基材。共价附接的方法还包括，例如，二硫键反应；自由基反应(参见，例如，美国专利号5919626，其全部内容通过引用纳入本文)；和酰肼‑官能化基材(例如，其中酰肼官能团直接或间接附接到基材)和醛‑官能化寡核苷酸(参见例如yershov等，(1996)proc.natl.acad.sci.usa93，4913‑4918，其全部内容通过引用纳入本文)。[0637]在一些实施方式中，使用光化学共价方法将官能化的生物分子(例如，捕获探针)固定在官能化的基材上。光化学共价连接的方法包括，例如，安曲酮‑偶联寡核苷酸的固定(参见，例如，koch等，(2000)bioconjugatechem.11，474‑483，其全部内容通过引用纳入本文)。[0638]在一些实施方式中，使用非共价方法将官能化生物分子(例如，捕获探针)固定在官能化基材上。用于非共价附接的方法包括例如生物素‑官能化的寡核苷酸和链霉亲和素‑处理的基材(参见例如等，(1993)analyticalbiochemistry209，278‑283和gilles等，(1999)naturebiotechnology17，365‑370，其全部内容通过引用纳入本文)。[0639]在一些实施方式中，寡核苷酸(例如，捕获探针)可根据以下所述的方法附接到基材或特征：美国专利号6737236、7259258、7375234、7427678、5610287、5807522、5837860和5472881；美国专利申请公开号2008/0280773和2011/0059865；shalon等，(1996)genomeresearch，639‑645；rogers等，(1999)analyticalbiochemistry266，23‑30；stimpson等，(1995)proc.natl.acad.sci.usa92，6379‑6383；beattie等，(1995)clin.chem.45，700‑706；lamture等，(1994)nucleicacidsresearch22，2121‑2125；beier等，(1999)nucleicacidsresearch27，1970‑1977；joos等，(1997)analyticalbiochemistry247，96‑101；nikiforov等，(1995)analyticalbiochemistry227，201‑209；timofeev等，(1996)nucleicacidsresearch24，3142‑3148；chrisey等，(1996)nucleicacidsresearch24，3031‑3039；guo等，(1994)nucleicacidsresearch22，5456‑5465；running和urdea(1990)biotechniques8，276‑279；fahy等，(1993)nucleicacidsresearch21，1819‑1826；zhang等，(1991)19，3929‑3933；和rogers等，(1997)genetherapy4，1387‑1392。上述各文件的全部内容通过引用纳入本文。[0640](ii)以阵列形式生成捕获探针[0641]阵列可以通过多种方法制备。在一些实施方式中，通过在阵列上合成(例如，原位合成)寡核苷酸或通过喷墨印刷或平版印刷来制备阵列。例如，高密度dna寡核苷酸的光定向合成可以通过光刻或固相dna合成来实现。为了实现光刻合成，可以将用光化学保护基团修饰的合成接头附接到基材上，并且可以使用光刻掩模(应用于基材的特定区域)和光来修饰光化学保护基团，从而产生具有局部光脱保护作用的阵列。这些方法中的许多在本领域中是已知的，并且在例如miller等的“微阵列的基本概念和临床微生物学中的潜在应用(basicconceptsofmicroarraysandpotentialapplicationsinclinicalmicrobiology)”，clinicalmicrobiologyreviews22.4(2009)：611‑633；us201314111482a；us9593365b2；us2019203275；和wo2018091676中描述，其全部通过引用纳入本文。[0642](1)点样或印刷[0643]在一些实施方式中，寡核苷酸(例如，捕获探针)可以被“点样”或“印刷”到基材上以形成阵列。寡核苷酸可以通过非接触或接触印刷来施加。非接触式打印机可以使用与计算机打印机相同的方法(例如，气泡喷射或喷墨)将探针溶液的小液滴喷射到基材上。这种专用的喷墨式打印机可以将纳升到皮升体积的寡核苷酸溶液滴(而不是墨水)喷射到基材上。在接触印刷中，每个印刷针直接将寡核苷酸溶液施涂在表面的特定位置上。寡核苷酸可通过dna磷酸主链的负电荷与基材表面的带正电覆层的静电相互作用或通过dna中的胸腺嘧啶碱与处理过的基材表面上的胺基之间的紫外光交联共价键附接到基材表面。在一些实施方式中，所述基材是载玻片。在一些实施方式中，寡核苷酸(例如，捕获探针)通过共价键附接到化学基材，例如环氧硅烷、氨基硅烷、赖氨酸、聚丙烯酰胺等。[0644](2)原位合成[0645]捕获探针阵列可以通过原位合成来制备。在一些实施方式中，可以使用光刻法制备捕获探针阵列。光刻法通常依赖于在基材上的紫外光掩蔽和光定向的组合化学合成来直接在阵列表面选择性地合成探针，每个点一次一个核苷酸，同时用于多个点。在一些实施方式中，基材包含共价接头分子，其在游离端上具有可被光移除的保护基团。紫外光通过光刻掩模被引导以去保护和活化带有羟基的选定位点，其起始与附接到活化的位点的进入的受保护核苷酸的耦合。掩模的设计方式是可以选择暴露位点，从而指定每个核苷酸可以附接的阵列上的坐标。这个过程可以重复，一个新的掩膜被应用于活化不同的位点集和耦合不同的碱基，使在每个位点构建不同的寡核苷酸。这个过程可以用来合成成千上万种不同的寡核苷酸。在一些实施方式中，可以使用无掩模阵列合成器技术。可编程微镜能够创建数字掩模，所述数字掩模能反射所需的紫外光图案，以对特征进行去保护。[0646]在一些实施方式中，喷墨点蚀工艺还可用于原位寡核苷酸合成。不同的核苷酸前体加催化剂可以印在基材上，然后结合耦合和去保护步骤。该方法依赖于在阵列表面以重复轮次的逐个碱基印刷方式印刷皮升体积的核苷酸，其延长阵列上寡核苷酸探针的长度。[0647](3)电场[0648]阵列也可以通过电场主动杂交来制备，以控制核酸的转运。当正电流施加到阵列上的一个或多个测试位点时，带负电荷的核酸可以被转运到特定的位点或特征。阵列的表面可包含结合分子，例如链霉亲和素，其使在电子寻址的生物素化探针到达其靶向的位置时形成键(例如链霉亲和素‑生物素键)。然后从活化的特征移除正电流，新的测试位点可以通过正电流的靶向应用被活化。重复此过程，直到阵列上的所有位点都被覆盖。[0649](4)连接[0650]在一些实施方式中，可通过连接多个寡核苷酸来产生包含条码化的探针的阵列。在一些示例中，所述多个寡核苷酸包含条形码的部分，并且在连接所述多个寡核苷酸时生成完整的条形码。例如，包含条形码的第一部分的第一寡核苷酸可附接到基材(例如，使用本文所述的将寡核苷酸附接到基材的任何方法)，然后，包含条形码的第二部分的第二寡核苷酸可以连接到第一寡核苷酸上以生成完整的条形码。条形码的第一、第二和任何其它部分的不同组合可用于增加条形码的多样性。在第二寡核苷酸在连接之前也附接于基材的示例中，第一和/或第二寡核苷酸可经由包含裂解位点的表面接头附接于基材。连接后，可通过在裂解位点裂解将连接的寡核苷酸线性化。[0651]为了增加条形码的多样性，包含两个或更多个不同条形码序列的多个第二寡核苷酸可以连接到包含相同条形码序列的多个第一寡核苷酸上，从而产生两个或更多个不同种类的条形码。为了实现选择性连接，附接到包含条形码的第一部分的基材的第一寡核苷酸最初可以用保护基团(例如，光可裂解保护基团)保护，并且在第一寡核苷酸和第二寡核苷酸之间连接之前可以移除保护基团。在阵列上的条码化的探针通过连接两个或更多个寡核苷酸产生的情况下，寡核苷酸的浓度梯度可应用于基材，使得寡核苷酸的不同组合根据其在基材上的位置纳入条码化的探针中。[0652]探针可以通过夹板寡核苷酸将其它寡核苷酸直接连接到现有的寡核苷酸上来产生。在一些实施方式中，现有阵列上的寡核苷酸可包括可与夹板寡核苷酸杂交的识别序列(recognitionsequence)。识别序列可以位于现有阵列上寡核苷酸的游离5′端或游离3′端。对本发明方法有用的识别序列可以不包含限制性酶识别位点或二级结构(例如发夹)，并且可以包括高含量的鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸。[0653](5)聚合酶[0654]阵列上的条形码探针也可以通过将单个核苷酸添加到阵列上现有的寡核苷酸来生成，例如，使用以模板独立方式起作用的聚合酶。单个核苷酸可以以浓度梯度添加到现有的寡核苷酸中，从而产生具有不同长度的探针，这取决于探针在阵列上的位置。[0655](6)现有捕获探针的修饰[0656]也可以通过修饰现有的阵列来制备阵列，例如，通过修饰已附接到阵列的寡核苷酸。例如，可以在已包含寡核苷酸的阵列上生成捕获探针，所述寡核苷酸在3′端附接到阵列(或阵列上的特征)并且具有游离的5′端。在一些情况下，阵列是任何可商购的阵列(例如，如本文所述的任何可商购的阵列)。可以使用本文所述的任何原位合成方法来原位合成寡核苷酸。寡核苷酸可以包含条形码和一个或多个恒定序列。在一些情况下，恒定序列是可切割的序列。连接到基材(例如，阵列)的寡核苷酸的长度可以小于100个核苷酸(例如，小于90、80、75、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸)。为了使用寡核苷酸产生探针，与寡核苷酸的部分(例如寡核苷酸共有的恒定序列)互补的引物可以与寡核苷酸杂交并延伸该寡核苷酸(使用寡核苷酸作为模板)以形成双链体并产生3′突出端。所述3′突出端可以通过模板非依赖性连接酶(例如末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)或多聚(a)聚合酶)产生。3′突出端允许其它核苷酸或寡核苷酸添加到双链体中，例如，通过酶。例如，可以通过向3′突出端的末端添加其它寡核苷酸(例如，通过夹板寡核苷酸介导的连接)来产生捕获探针，其中其它寡核苷酸可以包括一个或多个捕获域的序列或序列的部分，或其互补物。[0657]其它寡核苷酸(例如，捕获域的序列或序列的部分)可以包括简并序列(例如，如本文所述的任何简并序列)。其它寡核苷酸(例如，捕获域的序列或序列的部分)可以包括与生物样品中感兴趣的分析物杂交或连接相容的序列。感兴趣的分析物也可以用作夹板寡核苷酸以将其它寡核苷酸连接到探针上。当使用夹板寡核苷酸帮助连接其它寡核苷酸时，其它寡核苷酸可包括与夹板寡核苷酸的序列互补的序列。寡核苷酸的连接可涉及使用酶，例如但不限于连接酶。合适连接酶的非限制性示例包括tthdna连接酶、taqdna连接酶、高温球菌属的种(thermococcussp.)(菌株9on)dna连接酶(9ontmdna连接酶，新英格兰生物实验室公司(newenglandbiolabs))，ampligasetm(获自生物技术中心(epicentrebiotechnologies)，威斯康星州麦迪逊)，和splintr(获自新英格兰生物实验室公司，马萨诸塞州伊普斯维奇)。如上所述生成的阵列可用于生物样品的空间分析。例如，一个或多个捕获域可用于与mrna分子的多聚(a)尾杂交。可以使用逆转录酶进行逆转录，以生成与捕获的mrna互补的cdna。然后可以确定捕获的mrna的序列和位置(例如，通过对包含条形码以及互补cdna的捕获探针进行测序)。[0658]可通过如本文所述的各种方法来生成用于空间分析的阵列。在一些实施方式中，阵列具有多个包含空间条形码的捕获探针。可以确定这些空间条形码及其与阵列上位置的关系。在某些情况下，这样的信息很容易获得，因为寡核苷酸是以预先确定的图案在阵列上被点样、印刷或合成的。在一些情况下，可以通过本文描述的方法(例如，通过原位测序、通过与空间条形码相关联的各种标签等)对空间条形码进行解码。在一些实施方式中，可以使用阵列作为模板来生成子阵列。因此，可以将空间条形码转移到具有已知图案的子阵列。[0659](iii)特征[0660]“特征”是一个实体，作为样品分析中使用的各种分子实体的支持或存储库。在一些实施方式中，阵列中的一些或全部特征被功能化以用于分析物捕获。在一些实施方式中，功能化特征包括一个或多个捕获探针。特征的示例包括但不限于珠、任何二维或三维几何形状的点(例如，喷墨点、掩模点、网格上的正方形)、孔和水凝胶垫。在一些实施方式中，特征直接或间接地附接或固定到基材。在一些实施方式中，所述特征不直接或间接地附接或固定到基材，而是例如布置在封闭或部分封闭的三维空间(例如，孔或凹坑)内。[0661]除上述特征外，还可以使用多种其他特征来形成本文所述的阵列。例如，在一些实施方式中，由喷墨印刷、丝网印刷或静电沉积在基材上的聚合物和/或生物聚合物形成的特征可用于形成阵列。例如，在pct专利申请公开号wo2014/085725中描述了生物聚合物的喷墨印刷。例如，在degans等，advmater.16(3)：203‑213(2004)中描述了聚合物的喷墨印刷。聚合物和生物聚合物的静电沉积方法被描述于，例如，hoyer等，anal.chem.68(21)：3840‑3844(1996)。上述各参考文献的全部内容通过引用纳入本文。[0662]作为另一示例，在一些实施方式中，特征由金属微颗粒或纳米颗粒形成。例如，lee等，beilsteinj.nanotechnol.8：1049‑1055(2017)中描述了沉积此类颗粒以形成阵列的合适方法，其全部内容通过引用纳入本文。[0663]作为另一示例，在一些实施方式中，特征由组装在基材上的磁性颗粒形成。ye等，scientificreports6：23145(2016)中描述了此类组装阵列的方法和颗粒的示例，其全部内容通过引用纳入本文。[0664]作为另一示例，在一些实施方式中，特征对应于其中已纳入一个或多个光学标记物和/或已通过例如永久性光漂白的过程改变的基材区域。以这种方式实施特征的合适基材包括例如多种聚合物。例如，在moshrefzadeh等，appl.phys.lett.62：16(1993)中描述了形成这种特征的方法，其全部内容通过引用纳入本文。[0665]作为又一示例，在一些实施方式中，特征可对应于组装(例如，经由自组装)以形成阵列的胶体颗粒。合适的胶体颗粒例如在sharma，resonance23(3)：263‑275(2018)中描述，其全部内容通过引用纳入本文。[0666]作为另一示例，在一些实施方式中，可以通过单体溶液在基材上的点阵列光聚合来形成特征。特别地，双光子和三光子聚合可用于制造相对较小(例如，亚微米)尺寸的特征。nguyen等，materialstoday20(6)：314‑322(2017)中描述了以这种方式在基材上制备特征的合适方法，其全部内容通过引用纳入本文。[0667]在一些实施方式中，特征直接或间接地附接或固定到液体可透化的基材。在一些实施方式中，特征直接或间接地附接或固定到生物相容性基材。在一些实施方式中，特征直接或间接地附接或固定到基材，该基材是水凝胶。[0668]图12描述了阵列中条码化特征的示例性排列。从左到右，图12示出了(l)包括六个空间条码化阵列的载玻片，(c)六个空间条码化阵列中的一个的放大示意图，显示了与生物样品有关的条码化特征的网格，以及(r)阵列的一个部分的放大示意图，显示阵列中多个特征的特定标识(标记为id578、id579、id560等)。[0669](1)珠[0670]“珠”可以是颗粒。珠可以是多孔的、无孔的、固体的、半固体的和/或其组合。在一些实施方式中，珠可溶解、可破裂和/或可降解，而在某些实施方式中，珠不可降解。半固体珠可以是脂质体珠。固体珠可包括金属，包括但不限于氧化铁、金和银。在一些实施方式中，珠可以是二氧化硅珠。在一些实施方式中，珠可以是刚性的。在一些实施方式中，珠可以是柔性的和/或可压缩的。[0671]珠可以是大分子。珠可以由结合在一起的核酸分子形成。珠可以通过分子(例如大分子)的共价或非共价组装形成，例如单体或聚合物。聚合物或单体可以是天然的或合成的。聚合物或单体可以是或包括例如，核酸分子(例如dna或rna)。[0672]珠可以是刚性的，或可以是柔性的和/或可压缩的。珠可以包括包括一种或多种聚合物的覆层。这种覆层可以被破坏或溶解。在一些实施方式中，珠包括直接或间接(例如，通过接头)附接到珠的光谱或光学标记物(例如，染料)。例如，珠可制备为有色制剂(例如，在可见光谱内表现出不同颜色的珠)，其可在施加所需刺激(例如，热和/或化学反应)时改变颜色(例如，比色珠)以形成不同颜色的珠(例如，不透明和/或透明珠)。[0673]珠可包括天然和/或合成材料。例如，珠可包括天然聚合物、合成聚合物或天然聚合物和合成聚合物两者。天然聚合物的示例包括但不限于蛋白质、例如脱氧核糖核酸的糖、橡胶、纤维素、淀粉(例如直链淀粉、支链淀粉)、酶、多糖、丝、聚羟基烷酸酯、壳聚糖、葡聚糖、胶原、卡拉胶、依巴瓜胶、阿拉伯胶、琼脂、明胶、虫胶、梧桐胶、黄原胶、玉米糖胶、瓜尔胶、卡拉亚胶、琼脂糖、海藻酸、海藻酸钠或其天然聚合物。合成聚合物的示例包括但不限于丙烯酸、树脂、尼龙、硅酮、氨纶、粘胶人造丝、聚羧酸、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙二醇、聚氨酯、聚乳酸、二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚三氟氯乙烯、聚环氧乙烷、聚对苯二甲酸乙二酯、聚乙烯、聚异丁烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲醛、聚丙烯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚偏二氟乙烯、聚氟乙烯和/或其组合(例如共聚合物)。珠也可以由聚合物以外的材料形成，包括例如脂类、胶束、陶瓷、玻璃陶瓷、材料复合物、金属和/或其他无机材料。[0674]在一些实施方式中，珠是可降解珠。可降解珠可包括具有不稳定键的一种或多种物质(例如，二硫键接头、引物、其他寡核苷酸等)，使得当珠/物质暴露于适当的刺激物时，不稳定键被破坏并且珠降解。不稳定键可以是化学键(例如，共价键、离子键)或者可以是另一种类型的物理相互作用(例如，范德华相互作用、偶极‑偶极相互作用等)。在一些实施方式中，用于生成珠的交联剂可包括不稳定键。当暴露在适当的条件下时，不稳定的键会断裂，珠会降解。例如，当将包含半胱胺交联剂的聚丙烯酰胺凝胶珠暴露于还原剂时，胱胺的二硫键可被破坏且珠降解。[0675]降解可指结合或夹带物质(例如，二硫键接头、引物、其他寡核苷酸等)与珠的解离，无论是否在结构上降解物理珠本身。例如，由于化学环境的变化，夹带的物质可以通过渗透压差从珠中释放出来。举例来说，由于渗透压差引起的珠孔体积的改变通常可以在珠本身没有结构降解的情况下发生。在一些实施方式中，由于珠的透化溶胀导致的孔体积增大可使珠内夹带的物质释放。在一些实施方式中，由于孔体积收缩，珠的透化收缩可导致珠更好地保留夹带的物质。[0676]可使用任何可降解珠的合适试剂。在一些实施方式中，温度或ph值的变化可用于降解珠内的热敏或ph敏感键。在一些实施方式中，化学降解剂可用于通过氧化、还原或其他化学变化降解珠内的化学键。例如，化学降解剂可以是还原剂，例如dtt，其中dtt可以降解交联剂和凝胶前体之间形成的二硫键，从而降解珠。在一些实施方式中，可添加还原剂以降解珠，其可导致珠释放其内容物。还原剂的示例可包括但不限于二硫苏糖醇(dtt)、β‑巯基乙醇、(2s)‑2‑氨基‑1，4‑二巯基丁烷(二硫丁胺或dtba)、三(2‑羧乙基)膦(tcep)或其组合。[0677]任何一种化学试剂都可以用来引发珠的降解。化学试剂的示例包括但不限于ph介导的珠内组分完整性的改变、通过交联键的裂解降解珠的组分以及珠的组分的解聚。[0678]在一些实施方式中，珠可由包括可降解化学交联剂(例如n，n’‑双‑(丙烯酰)胱胺(bac)或胱胺)的材料形成。这种可降解交联剂的降解可以通过任何各种机制来实现。在一些示例中，珠可与可引起氧化、还原或其它化学变化的化学降解剂接触。例如，化学降解剂可以是还原剂，例如二硫苏糖醇(dtt)。还原剂的其他示例可包括β‑巯基乙醇、(2s)‑2‑氨基‑1，4‑二巯基丁烷(二硫丁胺或dtba)、三(2‑羧乙基)膦(tcep)或其组合。[0679]在一些实施方式中，暴露于水性溶液(例如水)可触发水解降解，从而引发珠的降解。在应用热刺激时，也可以诱导珠释放其内容物。温度的变化会引起珠的各种变化。例如，热会使固体珠液化。热的变化会导致珠熔化，使珠的部分降解。在一些实施方式中，热可增加珠组分的内部压力，使得珠破裂或爆炸。热也可以作用于热敏聚合物作为材料来构建珠。[0680]在使用可降解珠的情况下，避免在给定时间之前将所述珠暴露于引起所述降解的一个或多个刺激物是有益的，以便例如避免珠过早降解和由此降解引起的问题，包括例如不良流动特性和聚集。举例来说，在珠包括可还原交联基团(例如二硫化物基团)的情况下，将期望避免将所述珠与还原剂(例如dtt或其它二硫化物裂解试剂)接触。在这些实施方式中，在一些实施方式中，本文所述的珠的处理将不含还原剂，例如dtt。由于还原剂通常在商业酶制剂中提供，因此在处理本文所述的珠时希望提供不含还原剂(或不含dtt)的酶制剂。此类酶的示例包括例如聚合酶制剂、逆转录酶制剂、连接酶制剂以及可用于处理本文所述珠的许多其它酶制剂。术语“无还原剂”或“无dtt”制剂是指具有小于此类用于降解珠的材料的较低范围的约1/10、约1/50或约1/100的制剂。例如，对于dtt，无还原剂制剂可具有小于约0.01毫摩尔(mm)、0.005mm、0.001mmdtt、0.0005mmdtt或小于约0.0001mmdtt。在一些实施方式中，dtt的量可以是不可检测的。[0681]与不降解的珠相比，当对珠施加适当的刺激时，可降解珠可用于更快速地从珠释放附接的捕获探针(例如，核酸分子、空间条形码序列和/或引物)。例如，对于结合到多孔珠的内表面的物质或在包封的物质的情况下，在珠降解时，该物质可对溶液中的其他物质具有更大的移动性和可及性。在一些实施方式中，物质还可经由可降解接头(例如，二硫键接头)附接到可降解珠。所述可降解接头可对与所述可降解珠相同的刺激作出响应，或者所述两种可降解物质可对不同的刺激作出响应。例如，可以通过二硫键将具有一个或多个空间条形码的捕获探针附接到包括胱胺的聚丙烯酰胺珠。当空间条码化珠暴露于还原剂时，珠降解并且在捕获探针和珠之间的二硫键和珠内胱胺的二硫键断裂时释放具有一个或多个空间条形码序列的捕获探针。[0682]向珠中添加多种类型的不稳定键可以产生能够响应各种刺激的珠。每种类型的不稳定键可对相关刺激(例如，化学刺激、光、温度、ph、酶等)敏感，使得通过每种不稳定键附接到珠上的试剂的释放可通过施加适当的刺激来控制。可耦合至前体或珠的不稳定键的一些非限制性示例包括酯键(例如，可与酸、碱或羟胺裂解)、邻二醇键(例如，可通过高碘酸钠裂解)、diels‑alder键(例如，可通过热裂解)、砜键(例如，可通过碱裂解)、硅基醚键(例如，可通过酸裂解)、糖苷键(例如，可通过淀粉酶裂解)、肽键(例如，可通过蛋白酶裂解)或磷酸二酯键(例如，可通过核酸酶裂解(例如，dna酶))。键可以通过其他核酸分子靶向酶，如限制性酶(如限制性内切酶)进行裂解。这种功能性可用于控制从珠中释放试剂。在一些实施方式中，包括不稳定键的另一试剂可在凝胶珠形成后经由例如上述珠的活化官能团连接到珠。在一些实施方式中，包括不稳定键的凝胶珠是可逆的。在一些实施方式中，使用具有可逆不稳定键的凝胶珠来捕获生物样品的一个或多个感兴趣区域。例如，但不限于，包括不耐热键的珠可由光源(例如，激光)加热，所述光源使凝胶珠中的变化有助于捕获与凝胶珠接触的生物样品。具有一个或多个可释放、可裂解或可逆地附接到本文所述珠的空间条形码的捕获探针包括通过捕获探针和珠之间的连接的裂解而释放或可释放的捕获探针，或通过底层珠本身的降解而释放的捕获探针，使具有一个或多个空间条形码的捕获探针待被其他试剂触及或变得可被其他试剂触及，或两者。[0683]珠可以有不同的物理性质。珠的物理性质可以用来表征珠。珠的物理性质的非限制性例子包括尺寸、形状、圆度、密度、对称性和硬度。例如，珠可以有不同的尺寸。可以通过使用微流体通道网络来获得不同直径的珠，该网络被设置为提供特定体积的珠(例如，基于通道尺寸、流速等)。在一些实施方式中，珠具有不同的硬度值，其可通过改变用于生成珠的聚合物浓度来获得。在一些实施方式中，可以使用捕获探针的物理性质使附接到珠的空间条形码在光学上可检测。例如，核酸折纸，例如脱氧核糖核酸(dna)折纸，可用于产生光学可检测的空间条形码。为此，可以折叠一个核酸分子或多个核酸分子以形成二维和/或三维几何形状。不同的几何形状可以通过光学检测。[0684]在一些实施方式中，具有一种以上不同物理性质的特殊类型的纳米颗粒可用于使珠在物理上可区分。例如，具有亲水和疏水表面的janus颗粒可用于提供独特的物理性质。[0685]珠通常可以是任何合适的形状。珠形状的示例包括但不限于球形、非球形、椭圆形、长方形、无定形、圆形、圆柱形、立方形、六边形及其变体。在一些实施方式中，非球形(例如，六边形、立方形、异形珠可以比球形珠组装得更紧密(例如，更紧密)。在一些实施方式中，珠可以自组装成单层。截面(例如，第一截面)可对应于珠的直径或最大截面尺寸。在一些实施方式中，珠可以是近似球形的。在这些实施方式中，第一截面可对应于珠的直径。在一些实施方式中，珠可以是近似圆柱形的。在这样的实施方式中，第一截面可对应于沿近似圆柱形珠的直径、长度或宽度。[0686]珠可以是均匀尺寸或不均匀尺寸。“多分散性”一般是指分子或颗粒大小的不均匀性。珠的多分散性指数(pdi)可使用方程式pdi＝mw/mn计算，其中mw是重均摩尔质量，mn是数均摩尔质量。在某些实施方式中，可将珠提供为具有相对单分散尺寸分布的多个珠或珠群。当需要提供相对一致的试剂量时，保持相对一致的珠特征(例如尺寸)有助于整体一致性。[0687]在一些实施方式中，本文提供的珠可具有尺寸分布，其截面尺寸的变化系数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或更低。在一些实施方式中，本文提供的多个珠具有小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或更低的多分散性指数。[0688]在一些实施方式中，珠的直径或最大尺寸可不大于100μm(例如，不大于95μm、90μm、85μm、80μm、75μm、70μm、65μm、60μm、55μm、50μm、45μm、40μm、35μm、30μm、25μm、20μm、15μm、14μm、13μm、12μm、11μm、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm，或1μm)。[0689]在一些实施方式中，多个珠的平均直径不大于100μm。在一些实施方式中，多个珠的平均直径或最大尺寸不大于95μm、90μm、85μm、80μm、75μm、70μm、65μm、60μm、55μm、50μm、45μm、40μm、35μm、30μm、25μm、20μm、15μm、14μm、13μm，12μm、11μm、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm或1μm。[0690]在一些实施方式中，珠的体积可为至少约1μm3，例如至少1μm3、2μm3、3μm3、4μm3、5μm3、6μm3、7μm3、8μm3、9μm3、10μm3、12μm3、14μm3、16μm3、18μm3、20μm3、25μm3、30μm3、35μm3、40μm3、45μm3、50μm3、55μm3、60μm3、65μm3、70μm3、75μm3、80μm3、85μm3、90μm3、95μm3、100μm3、125μm3、150μm3、175μm3、200μm3、250μm3、300μm3、350μm3、400μm3、450μm3、μm3、500μm3、550μm3、600μm3、650μm3、700μm3、750μm3、800μm3、850μm3、900μm3、950μm3、1000μm3、1200μm3、1400μm3、1600μm3、1800μm3、2000μm3、2200μm3、2400μm3、2600μm3、2800μm3、3000μm3或更大。[0691]在一些实施方式中，珠可具有约1μm3与100μm3之间的体积，例如约1μm3与10μm3之间、约10μm3与50μm3之间或约50μm3与100μm3之间的体积。在一些实施方式中，珠可包括约100μm3与1000μm3之间的体积，例如约100μm3与500μm3之间或约500μm3与1000μm3之间的体积。在一些实施方式中，珠可包括约1000μm3与3000μm3之间的体积，例如约1000μm3与2000μm3之间或约2000μm3与3000μm3之间的体积。在一些实施方式中，珠可包括约1μm3与3000μm3之间的体积，例如约1μm3与2000μm3之间、约1μm3与1000μm3之间、约1μm3与500μm3之间或约1μm3与250μm3之间的体积。[0692]珠可以包括一个或多个相同或不同的截面。在一些实施方式中，珠可具有不同于第二截面的第一截面。该珠可具有至少约为0.0001微米、0.001微米、0.01微米、0.1微米或1微米的第一截面。在一些实施方式中，珠可包括至少约1微米(μm)、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、100μm、120μm、140μm、160μm、180μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1毫米(mm)或更大的截面(例如，第一截面)。在一些实施方式中，珠可包括约1μm与500μm之间的截面(例如，第一截面)，例如约1μm与100μm之间、约100μm与200μm之间、约200μm与300μm之间、约300μm与400μm之间或约400μm与500μm之间。例如，珠可包括约1μm与100μm之间的截面(例如，第一截面)。在一些实施方式中，珠可具有至少约1μm的第二截面。例如，珠可包括至少约1微米(μm)、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、100μm、120μm、140μm、160μm、180μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1毫米(mm)或更大的第二截面。在一些实施方式中，珠可包括约1μm与500μm之间的第二截面，例如约1μm与100μm之间、约100μm与200μm之间、约200μm与300μm之间、约300μm与400μm之间或约400μm与500μm之间。例如，珠可包括约1μm与100μm之间的第二截面。[0693]在一些实施方式中，珠可以是纳米级的(例如，珠可以具有约100纳米(nm)到约900纳米(nm)的直径或最大截面尺寸)(例如，850纳米或更小、800纳米或更小、750纳米或更小、700纳米或更小、650纳米或更小、600纳米或更小、550纳米或更小、500纳米或更小、450纳米或更小、400纳米或更小，350纳米或更小、300纳米或更小、250纳米或更小、200纳米或更小、150纳米或更小)。多个珠可具有约100纳米(nm)到约900纳米(nm)的平均直径或平均最大截面尺寸(例如，850纳米或更小、800纳米或更小、750纳米或更小、700纳米或更小、650纳米或更小、600纳米或更小、550纳米或更小、500纳米或更小、450纳米或更小、400纳米或更小、350纳米或更小，300纳米或更小、250纳米或更小、200纳米或更小、150纳米或更小)。在一些实施方式中，珠的直径或体积约为单个细胞(例如，被评估的单个细胞)的直径。[0694]在一些实施方式中，珠能够识别来自单个细胞的多种分析物(例如，核酸、蛋白质、染色质、代谢物、药物、grna和脂质)。在一些实施方式中，珠能够识别来自单个细胞的单个分析物(例如，mrna)。[0695]珠的孔体积可以调节。例如，可以选择孔体积以保留变性核酸。可选择孔体积以维持对例如氢氧化钠(naoh)的外源性化学品和/或例如抑制剂的内源性化学品的扩散透化性。珠可由生物相容性和/或生物化学相容性材料和/或维持或增强细胞活力的材料形成。珠可由可热解聚、化学解聚、酶解聚和/或光学解聚的材料形成。[0696]在一些实施方式中，珠可非共价地加载一种或多种试剂。可通过(例如)使珠经受足以使珠溶胀的条件、使试剂扩散到珠内部的足够时间以及使珠经受足以使珠去溶胀的条件来非共价地加载珠。可通过例如将珠置于热力学有利溶剂中、使珠经受较高或较低温度、使珠经受较高或较低离子浓度和/或使珠经受电场来实现珠的溶胀。[0697]珠的溶胀可以通过各种溶胀方法来实现。在一些实施方式中，溶胀是可逆的(例如，通过使珠经受促进去溶胀的条件)。在一些实施方式中，例如通过在热力学不利的溶剂中转移珠、使珠经受更低或更高的温度、使珠经受更低或更高的离子浓度和/或添加或移除电场来实现珠的去溶胀。珠的去溶胀可以通过各种去溶胀方法来实现。在一些实施方式中，去溶胀是可逆的(例如，通过使珠经受促进溶胀的条件)。在一些实施方式中，珠的去膨胀可包括转移珠以使珠中的孔收缩。收缩会阻碍珠内的试剂扩散出珠内部。所产生的阻碍可能是由于试剂和珠内部之间的空间相互作用造成的。这种转移可以通过微流体来完成。例如，可以通过将珠从一个同流溶剂流移动到不同的同流溶剂流来实现转移。可通过改变珠的聚合物组成来调节珠的可溶胀性和/或孔体积。[0698]珠可以包括对温度有响应的聚合物，以便当珠被加热或冷却时，珠的特性或尺寸可以改变。例如，聚合物可包括聚(n‑异丙基丙烯酰胺)。凝胶珠可包括聚(n‑异丙基丙烯酰胺)，并且当加热时，凝胶珠可在一个或多个尺寸上减小(例如，截面直径、多个截面直径)。足以改变凝胶珠的一个或多个特性的温度可为例如至少约0摄氏度(℃)、1摄氏度、2摄氏度、3摄氏度、4摄氏度、5摄氏度、10摄氏度或更高。例如，温度可为约4℃。在一些实施方式中，足以改变凝胶珠的一个或多个特性的温度可为(例如)至少约25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃或更高。例如，温度可为约37℃。[0699]用于附接捕获探针的珠的官能化可以通过多种不同的方法来实现，包括但不限于在聚合物内活化化学基团，在聚合物结构中引入活性或可活化的官能团，或在珠生产的预聚物或单体阶段的附接。珠可被官能化以结合到目标分析物，例如核酸、蛋白质、碳水合合物、脂质、代谢物、肽或其它分析物。[0700]在一些实施方式中，珠可包含分子前体(例如，单体或聚合物)，其可通过分子前体的聚合形成聚合物网络。在一些实施方式中，前体可以是能够经由例如化学交联经历进一步聚合的已聚合物质。在一些实施方式中，前体可包括丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺单体、低聚物或聚合物中的一种或多种。在一些实施方式中，珠可包括预聚物，其为能够进一步聚合的低聚物。例如，可以使用预聚物制备聚氨酯珠。在一些实施方式中，珠可包含可进一步聚合在一起(例如，形成共聚物)的单个聚合物。在一些实施方式中，可以通过不同前体的聚合来生成珠，使得它们包括混合的聚合物、共聚物和/或嵌段共聚物。在一些实施方式中，珠可包括聚合物前体(例如，单体、低聚物和线性聚合物)、核酸分子(例如，寡核苷酸)、引物和其他实体之间的共价键或离子键。在一些实施方式中，共价键可以是碳碳键或硫醚键。[0701]聚合物的交联可以是永久性的，也可以是可逆的，这取决于所使用的特定交联剂。可逆交联可使聚合物在适当条件下线性化或解离。在一些实施方式中，可逆交联还可允许结合到珠表面的材料的可逆附接。在一些实施方式中，交联剂可形成二硫键。在一些实施方式中，形成二硫键的化学交联剂可以是胱胺或改性胱胺。[0702]例如，在聚合物前体材料包括线性聚合物材料(例如线性聚丙烯酰胺、peg或其他线性聚合物材料)的情况下，活化剂可包括交联剂或活化形成的液滴内的交联剂的化学品。同样，对于包括可聚合单体的聚合物前体，活化剂可包括聚合引发剂。例如，在某些实施方式中，其中聚合物前体包括丙烯酰胺单体与n，n’‑双‑(丙烯酰)胱胺(bac)共聚单体的混合物，可提供例如四乙基甲二胺(temed)的试剂，其可引发丙烯酰胺和bac共聚成交联的聚合物网络，或其他足以使前体聚合或凝胶化的条件。足以使前体聚合或凝胶化的条件可包括暴露于加热、冷却、电磁辐射和/或光下。[0703]在聚合或凝胶化之后，可以形成聚合物或凝胶。聚合物或凝胶对于化学或生化试剂可以是可扩散透化的。聚合物或凝胶可对大分子组分不可扩散透化。所述聚合物或凝胶可包括二硫化物交联聚丙烯酰胺、琼脂糖、海藻酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇(peg)‑二丙烯酸酯、peg丙烯酸酯、peg巯基、peg叠氮化物、peg炔烃、其他丙烯酸酯、壳聚糖、透明质酸、胶原、纤维蛋白、明胶或弹性蛋白中的一种或多种。聚合物或凝胶可以包括任何其他聚合物或凝胶。[0704]在一些实施方式中，可在分子前体单元(例如，单体、低聚物或线性聚合物)或纳入珠中的前体与核酸分子(例如，寡核苷酸、捕获探针)之间形成二硫键。例如，胱胺(包括改性胱胺)是包括二硫键的有机试剂，其可用作珠的个体单体或聚合前体之间的交联剂。聚丙烯酰胺可在胱胺或包括胱胺的物质(例如，改性胱胺)存在下聚合以产生包括二硫键的聚丙烯酰胺凝胶珠(例如，包括化学可还原交联剂的化学可降解珠)。二硫键可使珠在暴露于还原剂时降解(或溶解)。[0705]在一些实施方式中，线性多糖聚合物壳聚糖可通过亲水链与戊二醛交联以形成珠。壳聚糖聚合物的交联可以通过热、压力、ph值变化和/或辐射引发的化学反应来实现。[0706]在一些实施方式中，珠可包括丙烯酸亚磷酰胺部分，其在某些方面可用于将一个或多个捕获探针附接到珠。在一些实施方式中，丙烯酸亚磷酰胺(acrydite)部分可指由丙烯酸亚磷酰胺与一种或多种物质(例如，二硫键接头、引物、其他寡核苷酸等)的反应生成的丙烯酸亚磷酰胺类似物，例如但不限于在聚合反应期间丙烯酸亚磷酰胺与其他单体和交联剂的反应。丙烯酸亚磷酰胺部分可以被修饰以形成与待附接物质(例如捕获探针)的化学键。丙烯酸亚磷酰胺部分可以用能够形成二硫键的巯基修饰，或者可以用已经包括二硫键的基团修饰。巯基或二硫化物(通过二硫化物交换)可用作将要附接的物质的锚定点，或可使用丙烯酸亚磷酰胺部分的另一部分来附接。在一些实施方式中，附接可以是可逆的，使得当二硫键断裂时(例如，在存在还原剂的情况下)，附接的物质从珠中释放。在一些实施方式中，丙烯酸亚磷酰胺部分可包括可用于物质附接的反应性羟基。[0707]在一些实施方式中，聚合以形成珠的前体(例如，单体或交联剂)可包括丙烯酸亚磷酰胺部分，使得当产生珠时，珠还包括丙烯酸亚磷酰胺部分。丙烯酸亚磷酰胺部分可附接于核酸分子(例如，寡核苷酸)，其可包括引发序列(例如，用于扩增靶核酸的引物、随机引物、信使rna的引物序列)和/或一个或多个捕获探针。一个或多个捕获探针可以包括对于耦合到给定珠的所有捕获探针相同的序列和/或对于耦合到给定珠的所有捕获探针不同的序列。捕获探针可纳入珠中。在一些实施方式中，捕获探针可纳入或附接到珠上，使得捕获探针保持游离的3′端。在一些实施方式中，捕获探针可纳入或附接到珠上，使得捕获探针保持游离的5′端。在一些实施方式中，可以对珠进行官能化，使得每个珠包含多个不同的捕获探针。例如，珠可以包括多个捕获探针，例如捕获探针1、捕获探针2和捕获探针3，并且捕获探针1、捕获探针2和捕获探针3中的每一个都包含不同的捕获域(例如，捕获探针1的捕获域包括聚(dt)捕获域，捕获探针2的捕获域包括基因特异性捕获域，捕获探针3的捕获域包括crispr特异性捕获域)。通过使珠官能化以使每个珠包含多个不同捕获域，可提高用于分析物检测的复用能力的水平。[0708]在一些实施方式中，聚合以形成珠的前体(例如，单体或交联剂)可包括具有反应性或能够被活化的官能团，使得当其变得具有反应性时，其可与其它前体聚合以产生包括所述活化或可活化官能团的珠。然后可以使用官能团将其它物质(例如，二硫键接头、引物、其他寡核苷酸等)附接到珠上。例如，包括羧酸(cooh)基团的一些前体可与其它前体共聚合以形成也包括cooh官能团的珠。在一些实施方式中，丙烯酸(包括游离cooh基团的物质)、丙烯酰胺和双(丙烯酰)胱胺可共聚合在一起以产生包括游离cooh基团的珠。珠的cooh基团可被活化(例如，经由1‑乙基‑3‑(3‑二甲氨基丙基)碳二亚胺(edc)和n‑羟基琥珀酰亚胺(nhs)或4‑(4，6‑二甲氧基‑1，3，5‑三嗪‑2‑基)‑4‑甲基吗啉氯化物(dmtmm))以使其具有反应性(例如，与胺官能团反应，其中edc/nhs或dmtmm用于活化)。活化的cooh基团随后可与适当的物质(例如，包括胺官能团的物质，其中羧酸基团被活化以可与胺官能团反应)反应，其作为待连接到珠的部分上的官能团。[0709]通过将一些二硫键还原为游离巯基，在其聚合物网络中包括二硫键的珠可以用其它物质(例如，二硫键接头、引物、其他寡核苷酸等)官能化。二硫键可通过例如还原剂(例如dtt、tcep等)的作用来还原以生成游离巯基，而不使珠溶解。然后，珠的游离巯基可与物质或包括另一二硫键的物质的游离巯基反应(例如，通过巯基二硫键交换)，使得物质可连接到珠(例如，通过生成的二硫键)。在一些实施方式中，珠的游离巯基可与任何其它合适基团反应。例如，珠的游离巯基可与包括丙烯酸亚磷酰胺部分的物质反应。珠的游离巯基可以通过michael加成化学与丙烯酸亚磷酰胺反应，使得包括丙烯酸亚磷酰胺的物质与珠相连。在一些实施方式中，可通过包含巯基封端剂(例如n‑乙基马来酰胺或碘乙酸盐)来防止非受控反应。[0710]可以控制珠中二硫键的活化，使得只有少量二硫键被活化。例如，可以通过控制用于生成游离巯基的还原剂的浓度和/或用于在珠聚合中形成二硫键的试剂的浓度来施加控制。在一些实施方式中，低浓度的还原剂(例如，还原剂分子∶凝胶珠比率)小于或等于约1∶10000000000，小于或等于约1∶10000000000，小于或等于约1∶1000000000，小于或等于约1∶100000000，小于或等于约1∶10000000，小于或等于约等于1∶1000000，小于或等于约1∶100000，或小于或等于约1∶10000)可用于还原。控制还原为游离巯基的二硫键的数量有助于确保官能化过程中珠结构的完整性。在一些实施方式中，光学活性剂(例如荧光染料)可经由珠的游离巯基耦合到珠并用于定量珠中存在的游离巯基的数量和/或跟踪珠。[0711]在一些实施方式中，在珠形成后向珠添加部分可能是有利的。例如，在珠形成后添加捕获探针可避免在聚合期间可能发生的链转移终止期间物质(例如，二硫键接头、引物、其他寡核苷酸等)的损失。在一些实施方式中，较小的前体(例如，不包括侧链基团和联接部分的单体或交联剂)可用于聚合，并且可由于粘性效应而最小程度地阻止链末端的生长。在一些实施方式中，珠合成后的官能化可最小化物质(例如，寡核苷酸)对于待加载的潜在破坏剂(例如，自由基)和/或化学环境的暴露。在一些实施方式中，所生成的水凝胶可具有使温度驱动的珠溶胀和崩塌的上临界溶液温度(ucst)。这种功能性可帮助寡核苷酸(例如，引物)在随后用寡核苷酸对珠进行官能化期间渗入珠。生产后官能化也可用于控制珠中物质的加载率，例如，使得加载率的可变性最小化。还可以在批次处理过程中进行物质加载，使得多个珠可以在单个批次处理中用物质官能化。[0712]试剂可在珠生成期间(例如，在前体聚合期间)包封在珠中。这些试剂可以或不能参与聚合。此类试剂可进入聚合反应混合物中，使得生成的珠在珠形成时包含试剂。在一些实施方式中，可在形成后将此类试剂添加到珠中。此类试剂可包括例如捕获探针(例如，寡核苷酸)、用于核酸扩增反应的试剂(例如，引物、聚合酶、dntp、辅因子(例如，离子辅因子)、缓冲剂)，包括本文所述的试剂、用于酶促反应的试剂(例如，酶、辅因子、基材、缓冲剂)，用于聚合、连接或消化等核酸修饰反应的试剂和/或用于一个或多个测序平台的模板制备(例如，标签化)的试剂(例如，用于的)。此类试剂可包括本文所述的一种或多种酶，包括但不限于聚合酶、逆转录酶、限制性内切酶(例如，核酸内切酶)、转座酶、连接酶、蛋白酶k、dna酶等。此类试剂还可或可选地包括一种或多种试剂，例如裂解剂、抑制剂、灭活剂，螯合剂，刺激剂。此类试剂的捕获可通过前体聚合期间产生的聚合物网络密度、珠内离子电荷的控制(例如，通过与聚合物质相连的离子物质)或其他物质的释放来控制。当珠降解和/或通过施加能够从珠中释放试剂的刺激时，可从珠中释放包封的试剂。在一些实施方式中，珠或珠的排列可以在如本文所述的透化试剂中孵育。[0713]在一些实施方式中，珠还可包括(例如，包封或在其上附接)包括空间条形码的多个捕获探针，并且空间条形码的光学特性可用于珠的光学检测。例如，空间条形码的光吸收率可以用来区分珠。在一些实施方式中，可检测标签可以直接或间接地附接到空间条形码上并提供对珠的光学检测。在一些实施方式中，一个或多个珠的组中的每个珠具有独特可检测标签，并且独特可检测标签的检测确定与珠相关联的空间条形码序列的位置。[0714]引起珠光学检测的光学特性可归因于珠表面的光学特性(例如，附接在珠上的可检测标记物)或珠的大片区域(bulkregion)的光学特性(例如，在珠形成过程中掺入的可检测标记物或珠本身的光学特性)。在一些实施方式中，可检测标记物可与珠或耦合到珠的一个或多个部分相关联。[0715]在一些实施方式中，珠包括多个可检测标记物。例如，荧光染料可附接于珠的表面和/或可纳入珠中。不同荧光染料的不同强度可用于增加可用于区分珠的光学组合的数量。例如，如果n是荧光染料的数量(例如，2到10种荧光染料，例如4种荧光染料)，m是染料的可能强度(例如，2到50种强度，例如20种强度)，那么mn是可能的不同光学组合。在一个示例中，可使用具有20种可能强度的4种荧光染料来产生160000种不同的光学组合。[0716]珠或生物内容物(例如细胞或细胞核)的一个或多个光学性质可用于将个体珠或生物内容物与其他珠或生物内容物区分开来。在一些实施方式中，通过包括具有光学特性以将珠彼此区分的可检测标签，使得珠可进行光学检测。[0717]在一些实施方式中，珠的光学性质可用于珠的光学检测。例如，但不限于，光学性质可以包括吸光度、双折射、颜色、荧光、光度、光敏性、反射率、折射率、散射或透射率。例如，珠可以基于聚合度、链长或单体化学具有不同的双折射值。[0718]在一些实施方式中，纳米珠(例如量子点或janus珠)可以用作光学标记物或其组件。例如，量子点可以附接在珠的空间条形码上。[0719]珠的光学标记物可以提供增强的光谱分辨率，以区分(例如，识别)具有独特空间条形码的珠(例如，包括独特空间条形码序列的珠)。即，珠以光学标记物和珠上的条形码(例如，空间条形码)彼此相关的方式制造。在一些方面，可以将珠加载到流动池中，使得珠以紧密堆积的方式排列(例如，单细胞分辨率)。可以进行成像，并且可以确定条形码的空间位置(例如，基于来自查找表(lut)的信息)。用于空间分析的光学标记物允许珠条形码(例如，空间条形码)识别的快速解卷积。[0720]在一些示例中，查找表(lut)可用于将珠的属性(例如，光学标记物，例如颜色和/或强度)与条形码序列相关联。该特性可以源自颗粒(例如，珠)或与珠相关联的光学标记物。可以对珠进行成像以获得珠的光学信息，包括例如珠的特性(例如，颜色和/或强度)或与珠相关联的光学标记物，以及生物样品的光学信息。例如，图像可以包括可见光谱、不可见光谱或两者中的光学信息。在一些实施方式中，可以跨越各种光学频率获得多个图像。[0721]在一些实施方式中，第一珠包括第一光学标记物和空间条形码，每个空间条形码具有第一空间条形码序列。第二珠包括第二光学标记物和空间条形码，每个空间条形码具有第二空间条形码序列。第一光学标记物和第二光学标记物可以不同(例如，由两种不同的荧光染料或两种不同强度的相同荧光染料提供)。第一和第二空间条形码序列可以是不同的核酸序列。在一些实施方式中，可以对珠成像以识别第一和第二光学标记物，然后可以使用第一和第二光学标记物将第一和第二光学标记物分别与第一和第二空间条形码序列相关联。在一些实施方式中，包含空间条形码的核酸还可具有分析物(例如，mrna)的捕获域。在一些实施方式中，核酸(例如，包含空间条形码的核酸)可具有独特的分子标识符、裂解域、功能域或其组合。[0722]在一些实施方式中，光学标记物具有特征电磁谱。如本文所用，“电磁谱”是指电磁辐射的频率范围。在一些实施方式中，光学标记物具有特征吸收谱。如本文所用，“吸收谱”是指被吸收的电磁辐射的频率范围。“电磁谱”或“吸收谱”会导致不同的特征谱。在一些实施方式中，峰值辐射或峰值吸收发生在380‑450nm(紫色)、450‑485nm(蓝色)、485‑500nm(青色)、500‑565nm(绿色)、565‑590nm(黄色)、590‑625nm(橙色)或625‑740nm(红色)。在一些实施方式中，峰值辐射或峰值吸收出现在400nm、460nm或520nm附近。[0723]珠上包含的光学标记物可以识别珠上的相关空间条形码。由于光学标记物的多样性相对有限，因此限制用于解卷积的空间阵列的大小可能是有利的。例如，基材可以被分成两个或更多个分区(例如，箱)。在一些实施方式中，基材可被分成三个或更多个分区。在一些实施方式中，基材可被分成四个或更多个分区(例如，箱)。在一些实施方式中，一组珠被沉积到分区。在各组珠内，一个或多个珠(例如，等于或多于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000或5000个珠)可以具有独特的光学标记物。[0724]在一些情况下，同一分区内的珠在基材上可能具有不同的坐标。这些坐标可以例如通过各种成像技术确定，例如在适当条件下通过显微镜观察。在一些实施方式中，同一分区内的珠可以共享相同的空间条形码。在一些实施方式中，珠(例如，具有条形码(例如，空间条形码或umi)的捕获探针的珠)对于不同的分区箱(partitionbin)而言彼此不同。在一些实施方式中，具有带有条形码(例如，空间条形码或umi)的捕获探针的珠可具有不同的条形码。例如，在某些情况下，在其珠与捕获探针相关联的各组珠中，个体珠上的捕获探针可以具有独特条形码。在一些情况中，在全部的珠中(例如，在两组或更多组珠中)，个体珠可具有含独特条形码的捕获探针。[0725]在一些方面，本公开提供了一种基材。基材可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或超过1000个分区(例如，箱或预定区域)。分区可以具有相同的形状或不同的形状。在一些实施方式中，基材仅具有一个分区(例如，箱或预定区域)。[0726]在一些实施方式中，第一分区(例如，第一预定区域，或基材上的唯一箱)可具有第一组珠。在一些实施方式中，来自第一组珠的至少一个珠包含光学标记物和含有条形码和捕获域的捕获探针(例如，寡核苷酸捕获探针)。在第一组珠中，至少一个珠可以具有独特的光学标记物。在一些实施方式中，第一组珠中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％的珠具有独特的光学标记物。在一些实施方式中，第一组珠中的每个珠具有独特的光学标记物。[0727]在一些实施方式中，基材可具有第二分区(例如，第二预定区域或第二箱)。第二分区可以具有第二组珠。在一些实施方式中，来自第二组珠的至少一个珠包含光学标记物和含有条形码和捕获域的捕获探针(例如，寡核苷酸捕获探针)。在第二组珠中，至少一个珠可以具有独特的光学标记物。在一些实施方式中，第二组珠中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％的珠具有独特的光学标记物。在一些实施方式中，第二组珠中的每个珠具有独特的光学标记物。[0728]在一些实施方式中，基材可具有第三分区、第四分区、第五分区、第六分区、第七分区、第八分区、第九分区或第十分区等。在一些实施方式中，基材可有多个分区。在一些情况下，这些分区中的每一个都具有类似于本文所述的第一或第二分区的特性。例如，来自每组珠的至少一个珠包含光学标记物和含有条形码和捕获域的捕获探针(例如，寡核苷酸捕获探针)。这些珠中的至少一个可以在每组珠中具有独特的光学标记物。在一些实施方式中，各组珠中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％的珠具有独特的光学标记物。在一些实施方式中，各组珠中的每个珠具有独特的光学标记物。[0729]在一些实施方式中，珠沉积在基材上。在一些实施方式中，珠可以直接沉积在生物样品之上或之中。因此，在一些情况下，生物样品可以在珠沉积到基材上之前固定或附着在基材上。[0730]在一些实施方式中，珠仅沉积到感兴趣的区域(例如，基材上的特定位置、特定细胞类型和特定组织结构)。因此，沉积的珠不一定覆盖整个生物样品。在一些实施方式中，可以遮蔽或修饰基材的一个或多个区域(例如加帽的捕获域)，使得遮蔽的区域不与生物样品的相应区域相互作用。[0731]在一些实施方式中，两组或更多组的珠(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10组)沉积在两个或更多个分区(例如、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个分区)。这些分区不需要彼此相邻。只要记录基材上分区的位置，就可以由光学标记物确定珠的身份。[0732]在一些实施方式中，一组珠可具有等于或多于1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，500，600，700，800，900，1000，2000，3000，4000或5000个珠。在一些实施方式中，一组25的珠可具有少于5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，500，600，700，800，900，1000，2000，3000，4000或5000个珠。[0733]生成珠时可以包括光学标记物。例如，光学标记物可以包括在凝胶珠的聚合物结构中，或者在珠生产的预聚合物或单体阶段附接。在一些实施方式中，珠包括附接到一个或多个光学标记物的部分(例如，在珠的表面和/或珠内)。在一些实施方式中，光学标记物可以用一种或多种试剂加载到珠中。例如，试剂和光学标记物可以通过试剂的扩散(例如，包括光学标记物的试剂溶液)被加载到珠中。在一些实施方式中，在制备空间条形码时可以包括光学标记物。例如，可以通过合成包括条形码序列的分子(例如，使用分离池(splitpool)或组合方法)来制备空间条形码。光学标记物可以在将空间条形码附接到珠之前附接到空间条形码。在一些实施方式中，在将空间条形码附接到珠之后可以包括光学标记物。例如，光学标记物可以附接到耦合到珠的空间条形码上。在一些实施方式中，空间条形码或其序列可以可释放地或可裂解地附接到珠。光学标记物可以可释放或不可释放形式附接到珠上。在一些实施方式中，第一珠(例如，包括多个空间条形码的珠)可耦合到包括一个或多个光学标记物的第二珠。例如，第一珠可经由化学键与第二珠共价耦合。在一些实施方式中，第一珠可与第二珠非共价结合。[0734]第一和/或第二珠可以包括多个空间条形码。耦合到给定珠的多个空间条形码可以包括相同的条形码序列。在第一和第二珠都包括空间条形码的情况下，第一和第二珠可以包括包括相同条形码序列或不同条形码序列的空间条形码。[0735]含有捕获的分析物的珠阵列可以批量处理，也可以分为液滴乳液，以制备测序文库。在一些实施方式中，下一代测序读取被聚集并与珠阵列上空间条形码的空间位置相关。例如，该信息可计算地叠加在组织切片的高分辨率图像上以识别检测到分析物的位置。[0736]在一些实施方式中，可进行解交联以说明可能与某些条码化/文库制备生物化学(例如，蛋白酶的存在)不相容的解交联化学。例如，两步过程是可能的。在第一步中，可以以液滴的形式提供珠，使得在进行常规的去交联化学后dna结合到珠上。在第二步中，将乳液破碎并收集珠，然后在洗涤后重新包封以进行进一步加工。[0737]在一些实施方式中，可使用光化学方法将珠固定或附接至基材。例如，珠可使用全氟苯基叠氮化物硅烷(pfpa硅烷)官能化，与基材接触，然后暴露于辐照(参见，例如，liu等，(2006)journaloftheamericanchemicalsociety128，14067‑14072)。例如，安曲酮官能化基材的固定(参见，例如，koch等，(2000)bioconjugatechem.11，474‑483，其全部内容通过引用纳入本文)。[0738]这些阵列也可以通过珠自组装来制备。每个珠上都覆盖着数十万个特定的寡核苷酸拷贝。在一些实施方式中，每个珠可以覆盖有约1,000至约1,000,000个寡核苷酸。在一些实施方式中，每个珠可被约1000000至约10000000个寡核苷酸覆盖。在一些实施方式中，每个珠可覆盖约2000000至约3000000、约3000000至约4000000、约4000000至约5000000、约5000000至约6000000、约6000000至约7000000、约7000000至约8000000、约8000000至约9000000或约9000000至约10000000个寡核苷酸。在一些实施方式中，每个珠可被约10,000,000至约100,000,000个寡核苷酸覆盖。在一些实施方式中，每个珠可被约100,000,000至约1,000,000,000个寡核苷酸覆盖。在一些实施方式中，每个珠可被约1,000,000,000至约10,000,000,000个寡核苷酸覆盖。在阵列生产过程中，珠可以不规则地分布在蚀刻基材上。在此过程中，珠可自组装成阵列(例如，在光纤束基材或二氧化硅载玻片基材上)。在一些实施方式中，珠不规则地到达其在阵列上的最终位置。因此，可能需要映射珠位置或者可能需要基于预定图案合成寡核苷酸。[0739]珠可以用粘合剂或其组合以共价或非共价方式固定或附接至基材。附接的珠可以例如以单层、双层、三层或簇的形式分层。如本文所定义，“单层”通常是指固定或附接于基材的一系列探针、珠、点、点、特征、微位置或岛的阵列，使得珠排列成一层单珠。在一些实施方式中，珠被紧密地包装。[0740]如本文所定义，短语“基本单层”或“基本形成单层”通常指(形成)固定或附接至基材的成阵列系列的探针、珠、微球、点、点、特征、微位置或岛，使得约50％至约99％(例如，约50％至约98％)的珠排列成一层单珠。这种排列可以使用多种方法来确定，包括显微成像。[0741]在一些实施方式中，单层珠位于基材上的预定区域中。例如，预定区域可以用物理屏障、光掩模、基材中的凹口或基材中的孔来划分。[0742]如本文所用，术语“反应性元件”通常指可与另一分子或分子部分反应以形成共价键的分子或分子部分。反应性元件包括例如胺、醛、炔烃、叠氮化物、硫醇、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、酰肼、羧酸、烷氧基胺、巯基、马来酰亚胺、迈克尔受体、羟基和活性酯。一些反应性元件，例如羧酸，可以用一种或多种活化剂(例如酰化剂、异脲形成剂)处理以增加反应性元件对亲核攻击的敏感性。活化剂的非限制性示例包括n‑羟基琥珀酰亚胺、n‑羟基磺基琥珀酰亚胺、1‑乙基‑3‑(3‑二甲氨基丙基)碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、六氟磷酸1‑羟基苯并三唑、(苯并三唑‑1‑基氧基)三吡咯烷基鏻、六氟磷酸(苯并三唑‑1‑基)‑n，n，n’，n’‑四甲基脲、4‑(n，n‑二甲氨基)吡啶和羰基二咪唑。[0743]在一些实施方式中，反应性元件直接结合到珠。例如，水凝胶珠可以用丙烯酸单体处理以形成丙烯酸官能化水凝胶珠。在某些情况下，反应性元件通过一个或多个接头间接地结合到珠。如本文所用，“接头”通常指用于偶联两个或更多化学部分的多功能(例如，双功能、三功能)试剂。接头可以是能够经历诱导离解的可裂解接头。例如，可通过溶剂(例如，水解和溶剂解)、辐照(例如，光解)、酶(例如，酶解)或用特定ph(例如，ph4、5、6、7或8)的溶液处理来诱导离解。[0744]在一些实施方式中，反应性元件直接结合到基材。例如，载玻片可涂有(3‑氨基丙基)三乙氧基硅烷。在一些实施方式中，反应性元件经由一个或多个接头间接地结合到基材。[0745]凝胶/水凝胶珠[0746]在一些实施方式中，珠可以是凝胶珠。“凝胶”是一种对液体和气体具有透化性的半刚性材料。示例性凝胶包括但不限于具有胶体结构的凝胶，例如琼脂糖；聚合物网状结构，例如明胶；水凝胶；以及交联聚合物结构，例如聚丙烯酰胺、sfa(例如，参见美国专利申请公开号2011/0059865，通过引用将其全部纳入本文)和pazam(例如，参见美国专利申请公开号2014/0079923，通过引用将其全部纳入本文)。[0747]根据预期用途的不同，凝胶可以配制成各种形状和尺寸。在一些实施方式中，制备凝胶并将其配制成凝胶珠(例如，凝胶珠，其包括附接于凝胶珠或与凝胶珠相关联的捕获探针)。凝胶珠可以是水凝胶珠。水凝胶珠可由分子前体形成，例如聚合物或单体物质。[0748]在一些情况下，珠包含聚合物或水凝胶。聚合物或水凝胶可以确定水凝胶珠的一种或多种特性，例如水凝胶珠的体积、流动性、孔隙率、刚性、组织或一种或多种其它特征。在一些实施方式中，水凝胶珠可包括聚合物基质(例如，通过聚合或交联形成的基质)。聚合物基质可包括一种或多种聚合物(例如，具有不同官能团或重复单元的聚合物)。交联可以通过共价、离子和/或诱导相互作用和/或物理缠结实现。[0749]聚合物或水凝胶可以，例如，在交联水凝胶珠内的一种或多种可交联分子时形成。例如，水凝胶可在水凝胶珠内的一种或多种分子交联时形成。水凝胶可在水凝胶珠内聚合多个单体时形成。水凝胶可在水凝胶珠内聚合多个聚合物时形成。聚合物或水凝胶前体可以提供给水凝胶珠并且在不施加刺激的情况下可能不形成聚合物或水凝胶(例如，如本文所述)。在一些情况下，水凝胶珠可被封装在聚合物或水凝胶内。水凝胶珠的形成可以在由一种或多种其它条件引起的细胞的一种或多种其它变化之后发生。[0750]本文所述的方法可施用于单个水凝胶珠或多个水凝胶珠。处理多个水凝胶珠的方法可包括在容器内提供多个水凝胶珠并使多个水凝胶珠经受足以改变水凝胶珠的一个或多个特性的条件。例如，多个水凝胶珠可以经受包括化学物质的第一条件或第一组条件，从而多个水凝胶珠中的水凝胶珠的截面可以从第一截面变为第二截面，其中第二截面小于第一截面。化学物质可以包括例如有机溶剂，例如乙醇、甲醇或丙酮。然后可以使多个水凝胶珠经受包含化学物质的第二条件或第二组条件，并且可以在每个水凝胶珠内形成交联。化学物质可以包括例如交联剂。可以在水性流体中提供多个处理过的水凝胶珠。在一些情况下，使多个水凝胶珠的第二截面基本上保持在水性流体中。多个处理过的水凝胶珠可被分配在多个分区内。分区可以是，例如，包含在油包水乳液中的水性液滴。分区可以是例如多个孔。多个固定的水凝胶珠可以与一种或多种试剂被共同分区(co‑partition)。在一些情况下，多个固定的水凝胶珠可以与一个或多个珠共同分区，其中每个珠包含与其附接的多个核酸条形码分子。附连于给定珠的核酸条形码分子可包含共有条形码序列，且附连于每个不同珠的核酸条形码分子可包含含有不同共有条形码序列的序列。然后可以将核酸条形码分子或其部分用于与和多个水凝胶珠中的水凝胶珠相关联的目标分子的反应。[0751]核/壳珠[0752]在一些实施方式中，珠是核/壳珠(core/shellbead)，其包含内核(例如，纳米球或微米球)和外壳(例如，包被纳米球或微米球的水凝胶)。在一些实施方式中，内核可以是固体纳米颗粒或固体微米颗粒。在一些实施方式中，内核可以是二氧化硅内核(例如，二氧化硅纳米颗粒或二氧化硅微米颗粒)。在一些实施方式中，核/壳珠的内核可具有约1微米的平均直径。在一些实施方式中，内核可具有约2微米的平均直径。在一些实施方式中，内核可具有约3微米的平均直径。在一些实施方式中，内核可具有约4微米的平均直径。在一些实施方式中，内核可具有约5微米的平均直径。在一些实施方式中，内核可具有约6微米的平均直径。在一些实施方式中，内核可具有约7微米的平均直径。在一些实施方式中，内核可具有约8微米的平均直径。在一些实施方式中，内核可具有约9微米的平均直径。在一些实施方式中，内核可具有约10微米的平均直径。在一些实施方式中，内核可具有约100纳米至约10微米的平均直径。[0753]在一些实施方式中，核/壳珠可通过从外壳移除溶剂、盐或水(例如，脱水的、干的、干燥的、变干的)以形成收缩的核/壳珠，来减小其外壳体积。在另一个示例中，如上所述，核/壳珠可以通过调节温度或ph来减小其外壳体积。在一些实施方式中，核/壳珠可以扩展其外壳体积，例如通过添加溶剂、盐或水(例如，再水合)以形成扩展的核/壳珠。在一些实施方式中，外壳(例如包覆内核)可具有约1微米的平均厚度。在一些实施方式中，外壳可具有约2微米的平均厚度。在一些实施方式中，外壳可具有约3微米的平均厚度。在一些实施方式中，外壳可具有约4微米的平均厚度。在一些实施方式中，外壳可具有约5微米的平均厚度。[0754]在一些实施方式中，核/壳珠可具有约1微米至约10微米的平均直径。在一些实施方式中，核/壳珠可具有约1微米的平均直径。在一些实施方式中，核/壳珠可具有约2微米的平均直径。在一些实施方式中，核/壳珠可具有约3微米的平均直径。在一些实施方式中，核/壳珠可具有约4微米的平均直径。在一些实施方式中，核/壳珠可具有约5微米的平均直径。在一些实施方式中，核/壳珠可具有约6微米的平均直径。在一些实施方式中，核/壳珠可具有约7微米的平均直径。在一些实施方式中，核/壳珠可具有约8微米的平均直径。在一些实施方式中，核/壳珠可具有约9微米的平均直径。在一些实施方式中，核/壳珠可具有约10微米的平均直径。[0755](2)将特征共价键合到基材的方法[0756]本文提供用于将特征(例如，光学标记珠、水凝胶珠、微球珠)共价键合到基材的方法。[0757]在一些实施方式中，通过第一反应性元件和第二反应性元件之间的共价键将特征(例如珠)耦合到基材。在一些实施方式中，共价结合的珠基本上在基材上形成单层特征(例如，水凝胶珠、微球珠)。[0758]在一些实施方式中，所述特征(例如珠)用第一反应性元件官能化，所述第一反应性元件直接结合到所述特征。在一些实施方式中，所述特征用第一反应性元件官能化，所述第一反应性元件通过接头间接结合到所述珠。在一些实施方式中，接头是二苯甲酮。在一些实施方式中，接头是氨基甲基丙烯酰胺。例如，接头可以是3‑氨基丙基甲基丙烯酰胺。在一些实施方式中，接头是peg接头。在一些实施方式中，接头是可裂解接头。[0759]在一些实施方式中，用直接结合到基材的第二反应性元件使基材官能化。在一些实施方式中，所述基材用第二反应性元件官能化，所述第二反应性元件通过接头间接结合到所述珠。在一些实施方式中，接头是二苯甲酮。例如，接头可以是二苯甲酮。在一些实施方式中，接头是氨基甲基丙烯酰胺。例如，接头可以是3‑氨基丙基甲基丙烯酰胺。在一些实施方式中，接头是peg接头。在一些实施方式中，接头是可裂解接头。[0760]在一些实施方式中，所述基材是载玻片。在一些实施方式中，基材是预官能化的载玻片。[0761]在一些实施方式中，约99％的共价结合珠在基材上形成单层珠。在一些实施方式中，约50％至约98％在基材上形成单层珠。例如，约50％至约95％、约50％至约90％、约50％至约85％、约50％至约80％、约50％至约75％、约50％至约70％、约50％至约65％、约50％至约60％或约50％至约55％的共价结合珠在基材上形成单层珠。在一些实施方式中，约55％至约98％、约60％至约98％、约65％至约98％、约70％至约98％、约75％至约98％、约80％至约98％、约85％至约98％、约90％至约95％或约95％至约98％的共价结合珠在基材上形成单层珠。在一些实施方式中，约55％至约95％、约60％至约90％、约65％至约95％、约70％至约95％、约75％至约90％、约75％至约95％、约80％至约90％、约80％至约95％、约85％至约90％、或约85％至约95％共价结合的珠在基材上形成单层珠。[0762]在一些实施方式中，第一反应性元件和第二反应性元件中的至少一个选自以下组：[0763][0764]其中，[0765]r1选自h，c1‑c6烷基，或‑so3；[0766]r2是c1‑c6烷基；和[0767]x是卤素部分。[0768]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括[0769]其中表示第一反应性元件或第二反应性元件与珠(例如，水凝胶珠或微球珠)或基材附接的点。[0770]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个选自以下组：[0771][0772]其中，[0773]r1选自h，c1‑c6烷基，或‑so3；[0774]r2是c1‑c6烷基；和[0775]x是卤素部分。[0776]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括其中r1选自h、c1‑c6烷基或‑so3。在一些实施方式中，r1是h。在一些实施方式中，r1是c1‑c6烷基。在一些实施方式中，r1是‑so3。[0777]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括其中r2是c1‑c6烷基。在一些实施方式中，r2是甲基。[0778]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括在一些实施方式中，可与活化剂反应形成活性酯。在一些实施方式中，活性酯为在一些实施方式中，活化剂是酰化剂(例如，n‑羟基琥珀酰亚胺和n‑羟基磺基琥珀酰亚胺)。在一些实施方式中，活化剂是o‑酰基脲形成剂(例如，1‑乙基‑3‑(3‑二甲氨基丙基)碳二亚胺(edc)、二环己基碳二亚胺和二异丙基碳二亚胺)。在一些实施方式中，活化剂是至少一种酰化剂和至少一种o‑异脲形成剂(例如，n‑羟基琥珀酰亚胺(nhs)、1‑乙基‑3‑(3‑二甲氨基丙基)碳二亚胺(edc)、n‑羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基nhs)及其组合)的组合。[0779]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括[0780]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括其中x是卤素部分。例如，x是氯、溴或碘。[0781]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括[0782]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括[0783]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括[0784]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个选自以下组：[0785][0786]其中，[0787]r3是h或c1‑c6烷基；并且[0788]r4是h或三甲基甲硅烷基。[0789]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括其中r4是h或三甲基甲硅烷基。在一些实施方式中，r4是h。[0790]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个选自以下组：[0791][0792]其中r3是h或c1‑c6烷基。在一些实施方式中，r3是h。在一些实施方式中，r3是c1‑c6烷基。[0793]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括其中r3是h或c1‑c6烷基。在一些实施方式中，r3是h。在一些实施方式中，r3是c1‑c6烷基。[0794]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括[0795]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括[0796]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的一个选自以下组：[0797][0798]其中，[0799]r1选自h，c1‑c6烷基，或‑so3；[0800]r2是c1‑c6烷基；[0801]x是卤素部分；[0802]并且第一反应性元件或第二反应性元件中的另一个选自以下组：[0803][0804]其中，[0805]r3是h或c1‑c6烷基；并且[0806]r4是h或三甲基甲硅烷基。[0807]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的一个选自以下组：其中r3是h或c1‑c6烷基；[0808]并且第一反应性元件或第二反应性元件中的另一个是其中r4是h或三甲基甲硅烷基。在一些实施方式中，r3是h。在一些实施方式中，r3是c1‑c6烷基。在一些实施方式中，r4是h。在一些实施方式中，r4是三甲基甲硅烷基。[0809]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的一个选自以下组：[0810][0811]其中，[0812]r1选自h，c1‑c6烷基，或‑so3；[0813]r2是c1‑c6烷基；[0814]x是卤素部分；[0815]并且第一反应性元件或第二反应性元件中的另一个选自以下组：[0816][0817]其中r3是h或c1‑c6烷基。在一些实施方式中，r1是h。在一些实施方式中，r1是c1‑c6烷基。在一些实施方式中，r1是‑so3。在一些实施方式中，r2是甲基。在一些实施方式中，x是碘。在一些实施方式中，r3是h。在一些实施方式中，r3是c1‑c6烷基。[0818]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的一个选自以下组：[0819][0820]其中，[0821]r1选自h，c1‑c6烷基，或‑so3；[0822]r2是c1‑c6烷基；[0823]并且第一反应性元件或第二反应性元件中的另一个包括其中r3是h或c1‑c6烷基。在一些实施方式中，r1是h。在一些实施方式中，r1是c1‑c6烷基。在一些实施方式中，r1是‑so3。在一些实施方式中，r2是甲基。在一些实施方式中，r3是h。在一些实施方式中，r3是c1‑c6烷基。[0824]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的一个选自以下组：[0825][0826]其中x是卤素部分；[0827]并且第一反应性元件或第二反应性元件中的另一个包括在一些实施方式中，x是溴。在一些实施方式中，x是碘。[0828]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的一个选自以下组：[0829]并且第一反应性元件或第二反应性元件中的另一个包括[0830]术语“卤素”是指氟(f)，氯(c1)，溴(br)或碘(i)。[0831]术语“烷基”是指可以是直链或支链的烃链，其包含所示数目的碳原子。例如，c1‑10表示该基团中可以具有1至10个(含)碳原子。非限制性示例包括甲基、乙基、异‑丙基、叔‑丁基、正‑己基。[0832]术语“卤代烷基”是指其中一个或多个氢原子被独立选择的卤素取代的烷基。[0833]术语“烷氧基”是指‑o‑烷基(例如，‑och3)。[0834]术语“亚烷基”是指二价烷基(例如，‑ch2‑)。[0835]术语“烯基”是指可以是具有一个或多个碳‑碳双键的直链或支链的烃链。烯基部分包含指定数目的碳原子。例如，c2‑6表示该基团中可以具有2至6个(含)碳原子。[0836]术语“炔基”是指可以是具有一个或多个碳‑碳三键的直链或支链的烃链。炔基部分包含指定数目的碳原子。例如，c2‑6表示该基团中可以具有2至6个(含)碳原子。[0837]术语“芳基”是指6‑20个碳的单环、双环、三环或多环基团，其中系统中的至少一个环是芳族的(例如6‑碳单环，10‑碳双环或14‑碳三环芳族环系统)；以及其中每个环的0、1、2、3或4个原子可以被取代基取代。芳基的实例还包括苯基、萘基、四氢萘基等。[0838](3)将特征非共价键合到基材的方法[0839]本文提供用于将特征(例如，光学标记珠、水凝胶珠、或微球珠)非共价键合到基材的方法。[0840]在一些实施方式中，特征(例如珠)经由第一亲合基团和第二亲合基团之间的非共价键耦合到基材。在一些实施方式中，非共价结合的特征(例如珠)基本上在基材上形成珠的单层(例如，水凝胶珠、微球珠)。[0841]在一些实施方式中，所述特征用第一亲和基团官能化，所述第一亲和基团直接结合到所述特征。在一些实施方式中，所述特征用第一亲和基团官能化，所述第一亲和基团通过接头间接结合到所述珠。在一些实施方式中，接头是二苯甲酮。在一些实施方式中，接头是氨基甲基丙烯酰胺。例如，接头可以是3‑氨基丙基甲基丙烯酰胺。在一些实施方式中，接头是peg接头。在一些实施方式中，接头是可裂解接头。[0842]在一些实施方式中，用直接结合到基材的第二亲和基团使基材官能化。在一些实施方式中，所述基材用第二亲核基团官能化，所述第二亲和基团通过接头间接结合到所述珠。在一些实施方式中，接头是二苯甲酮。在一些实施方式中，接头是氨基甲基丙烯酰胺。例如，接头可以是3‑氨基丙基甲基丙烯酰胺。在一些实施方式中，接头是peg接头。在一些实施方式中，接头是可裂解接头。[0843]在一些实施方式中，第一亲和基团或第二亲和基团是生物素，并且第一亲和基团或第二亲和基团中的另一个是链霉亲和素。[0844]在一些实施方式中，约99％的非共价结合珠在基材上形成珠单层。在一些实施方式中，约50％至约98％在基材上形成单层珠。例如，约50％至约95％、约50％至约90％、约50％至约85％、约50％至约80％、约50％至约75％、约50％至约70％、约50％至约65％、约50％至约60％或约50％至约55％的非共价结合珠在基材上形成单层珠。在一些实施方式中，约55％至约98％、约60％至约98％、约65％至约98％、约70％至约98％、约75％至约98％、约80％至约98％、约85％至约98％、约90％至约95％或约95％至约98％的非共价结合珠在基材上形成单层珠。在一些实施方式中，约55％至约95％、约60％至约90％、约65％至约95％、约70％至约95％、约75％至约90％、约75％至约95％、约80％至约90％、约80％至约95％、约85％至约90％、或约85％至约95％的非共价结合的珠在基材上形成单层珠。[0845]在一些实施方式中，珠的单层在基材上的预定区域中形成。在一些实施方式中，预定区域用物理屏障划分。例如，基材中的凹坑或孔。在一些实施方式中，使用光掩模对预定区域进行分区。例如，基材用光活化的溶液被覆，干燥，然后在光掩模下辐照。在一些实施方式中，光活化的溶液是经紫外光活化的。[0846]如本文所用，“粘合剂”通常指用于将物体或材料粘在一起的物质。粘合剂包括，例如，胶水、糊料、液体胶带、环氧树脂、生物粘合剂、凝胶和粘液。在一些实施方式中，粘合剂是液体胶带。在一些实施方式中，粘合剂是胶水。[0847]在一些实施方式中，使用粘合剂(例如，液体胶带、胶水、糊料)将珠粘附到基材上。在一些实施方式中，粘附的珠基本上在基材(例如，载玻片)上形成单层珠。在一些实施方式中，珠是水凝胶珠。在一些实施方式中，珠是微球珠。在一些实施方式中，用粘合剂涂覆珠，然后珠与基材接触。在一些实施方式中，用粘合剂涂覆基材，然后使基材与珠接触。在一些实施方式中，用粘合剂涂覆基材和用粘合剂涂覆珠，然后珠和基材彼此接触。[0848]在一些实施方式中，约99％的粘附珠在基材上形成单层珠。在一些实施方式中，约50％至约98％在基材上形成单层珠。例如，约50％至约95％、约50％至约90％、约50％至约85％、约50％至约80％、约50％至约75％、约50％至约70％、约50％至约65％、约50％至约60％或约50％至约55％的粘附的珠在基材上形成单层珠。在一些实施方式中，约55％至约98％、约60％至约98％、约65％至约98％、约70％至约98％、约75％至约98％、约80％至约98％、约85％至约98％、约90％至约95％或约95％至约98％的粘附的珠在基材上形成单层珠。在一些实施方式中，约55％至约95％、约60％至约90％、约65％至约95％、约70％至约95％、约75％至约90％、约75％至约95％、约80％至约90％、约80％至约95％、约85％至约90％、或约85％至约95％的粘附的珠在基材上形成单层珠。[0849]在一些实施方式中，可以将珠沉积到生物样品上，使得沉积的珠在生物样品上形成单层珠(例如，在生物样品上或下)。在一些实施方式中，沉积在基材上的珠可自组装成单层珠，其饱和所研究生物样品的预期表面积。在这种方法中，可以设计、配制和制备珠阵列，以评估来自任何大小或尺寸的生物样品的多种分析物。在一些实施方式中，应用于生物样品的珠(例如凝胶珠)的浓度或密度使得整个区域或生物样品中的一个或多个感兴趣区域被单层珠饱和。在一些实施方式中，通过在生物样品上浇注、移液、喷涂等方式使珠与生物样品接触。可以使用任何合适的珠沉积形式。[0850]在一些实施方式中，生物样品可限定于阵列的特定区或区域。例如，可以将生物样品固定在载玻片上，并且将腔室、垫圈或笼定位在生物样品上，以充当容纳区域或框架，在其中沉积珠。显而易见，饱和区域或生物样品所需的珠的密度或浓度可由本领域普通技术人员容易地确定(例如，通过生物样品上珠的显微可视化)。在一些实施方式中，珠阵列包含微流体通道以将试剂引导到阵列的点或珠。[0851](4)特征几何属性[0852]阵列上的特征可以有多种大小。在一些实施方式中，阵列的特征可以具有500μm到100μm之间的平均直径或最大尺寸。例如，500nm至2μm、1μm至3μm、1μm至5μm、1μm至10μm、1μm至20μm、1μm至30μm、1μm至40μm、1μm至50μm、1μm至60μm、1μm至70μm、1μm至80μm、1μm至90μm、90μm至100μm、80μm至100μm、70μm至100μm、60μm至100μm50μm至100μm、40μm至100μm、30μm至100μm、20μm至100μm、10μm至100μm、约40μm至约70μm或约50μm至约60μm。在一些实施方式中，特征具有30μm至100μm、40μm至90μm、50μm至80μm、60μm至70μm之间或所公开的子范围内的任何范围的平均直径或最大尺寸。在一些实施方式中，特征的平均直径或最大尺寸不大于95μm、90μm、85μm、80μm、75μm、70μm、65μm、60μm、55μm、50μm、45μm、40μm、35μm、30μm、25μm、20μm、15μm、14μm、13μm，12μm、11μm、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm或1μm。在一些实施方式中，特征的平均直径或最大尺寸约为65μm。在一些实施方式中，特征的平均直径或最大距离约为55μm。[0853]在一些实施方式中，阵列的多个特征的大小和/或形状大致相同。在一些实施方式中，阵列的多个特征的大小和/或形状不均匀。例如，在一些实施方式中，阵列中的特征可以具有平均截面尺寸，并且特征之间的截面尺寸的分布可以具有分布的平均截面尺寸的0％或更多(例如，5％或更多、10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、70％或更多、或100％或更多)的全宽和半最大值。[0854]在某些实施方式中，阵列中的特征可以具有约1μm到约10μm之间的平均截面尺寸。该平均特征截面尺寸的范围对应于单个哺乳动物细胞的近似直径。因此，这些特征的阵列可用于检测处于或低于哺乳动物单细胞分辨能力的分析物。[0855]在一些实施方式中，多个特征具有约0.1μm到约100μm的平均直径或平均最大尺寸(例如，约0.1μm到约5μm，约1μm到约10μm，约1μm到约20μm，约1μm到约30μm，约1μm到约40μm，约1μm到约50μm，约1μm到约60μm，约1μm至约70μm，约1μm至约80μm，约1μm至约90μm，约90μm至约100μm，约80μm至约100μm，约70μm至约100μm，约60μm至约100μm，约50μm至约100μm，约40μm至约100μm，约30μm至约100μm，约20μm至约100μm，或约10μm至约100μm)。在一些实施方式中，多个特征具有30μm至100μm、40μm至90μm、50μm至80μm、60μm至70μm之间的平均直径或平均最大尺寸，或公开的子范围内的任何范围。在一些实施方式中，多个特征的平均直径或平均最大尺寸不大于95μm、90μm、85μm、80μm、75μm、70μm、65μm、60μm、55μm、50μm、45μm、40μm、35μm、30μm、25μm、20μm、15μm、14μm、13μm，12μm、11μm、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm或1μm。在一些实施方式中，多个特征具有约65μm、约60μm、约55μm、约50μm、约45μm、约40μm、约35μm、约30μm、约25μm、约20μm、约15μm、约10μm、约5μm、约4μm、约3μm、约2μm或约1μm的均平均直径或均最大尺寸。[0856](iv)阵列几何属性[0857]在一些实施方式中，阵列包括多个特征。例如，阵列包含4000到50,000个特征，或4000到40,000个特征的任何范围内的特征。例如，阵列包括4000到35,000个特征、4000到30,000个特征、4000到25,000个特征、4000到20,000个特征、4,000到15,000个特征、4,000到10,000个特征、4,000到6000个特征或4400到6000个特征。在一些实施方式中，阵列包括4100到5900个特征、4200到5800个特征、4300到5700个特征、4400到5600个特征、4500到5500个特征、4600到5400个特征、4700到5300个特征、4800到5200个特征、4900到5100个特征，或者所公开的子范围内的任何范围。例如，阵列可包括约4,000个特征，约4,200个特征，约4,400个特征，约4,800个特征，约5,000个特征，约5,200个特征，约5,400个特征，约5,600个特征，或约6,000个特征，约10,000个特征，约20,000个特征，约30,000个特征，约40,000个特征，或约50,000个特征。在一些实施方式中，阵列包括至少4000个特征。在一些实施方式中，阵列包括大约5000个特征。[0858]在一些实施方式中，阵列内的特征彼此具有不规则的排列或关系，使得在特征之间的几何间距关系中没有明显的可辨别的图案或规则性。例如，阵列中的特征可以彼此随机定位。或者，阵列内的特征可以不规则地定位，但是可以确定地选择间隔，以确保所得到的特征排列是不规则的。[0859]在一些实施方式中，阵列内的特征相对于彼此规则地定位以形成图案。阵列中可以实现多种不同的特性模式。这种模式的示例包括但不限于特征的正方形阵列、特征的矩形阵列、特征的六边形阵列(包括六边形密排阵列)、特征的径向阵列、特征的螺旋阵列、特征的三角形阵列，以及更一般地，其中阵列中邻近特征在通过线性和/或角度坐标尺寸的规则增量彼此达到的任何阵列。[0860]在一些实施方式中，阵列内的特征以相对于彼此的一定规则度定位，使得特征阵列既不是完全规则的，也不是完全不规则的(即，阵列是″部分规则的″)。例如，在一些实施方式中，阵列中的邻近特征可以由一个或多个线性和/或角度坐标尺寸中的位移分离，该位移为阵列中邻近特征之间的平均位移或标称位移的10％或更多(例如，20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、100％或更多、110％或更多、120％或更多、130％或更多，140％或更多、150％或更多、160％或更多、170％或更多、180％或更多、190％或更多、200％或更多)。在某些实施方式中，阵列中邻近特征之间的位移分布(线性和/或角度)具有阵列中邻近特征之间的平均位移或标称位移的0％和200％之间(例如，0％和100％之间、0％和75％之间、0％和50％之间、0％和25％之间、0％和15％之间、0％和10％之间)的半最大值处的全宽。[0861]在一些实施方式中，特征阵列可以具有可变几何形状。例如，可以根据第一几何图案排列阵列中的特征的第一子集，并且可以根据与第一图案不同的第二几何图案排列阵列中的特征的第二子集。例如，上述任何图案都可以对应于第一和/或第二几何图案。[0862]通常，可以通过调整阵列中相邻特征之间的间距来制备不同特征密度的阵列。在一些实施方式中，阵列中相邻特征之间的几何中心到中心(例如，节距)间距是100nm至10μm、500nm至2μm、1μm至5μm，和20μm至200μm。例如，中心到中心间距可以是100nm至10μm，500nm至2μm，1μm至5μm，20μm至40μm，20μm至60μm，20μm至80μm，80μm至100μm，100μm至120μm，120μm至140μm，140μm至160μm，160μm至180μm，180μm至200μm，60μm至100μm，或40μm至100μm，50μm至150μm，80μm至120μm，或90μm至110μm。在一些实施方式中，邻近阵列特征之间的节距在30μm和100μm、40μm和90μm、50μm和80μm、60μm和70μm、80μm和120μm之间，或在所公开的子范围内的任何范围。在一些实施方式中，阵列的相邻阵列特征之间的节距是约65μm，约60μm，约55μm，约50μm，约45μm，约40μm，约35μm，约30μm，约25μm，约20μm，约15μm，约10μm，约5μm，约4μm，约3μm，约2μm，或约1μm。在一些实施方式中，阵列的相邻阵列特征之间的节距小于100μm。[0863]特征阵列可以具有任何适当的分辨率。在一些实施方式中，特征阵列可具有空间恒定(例如，在误差范围内)分辨率。一般而言，具有空间一致分辨率的阵列是其中阵列中相邻特征之间的节距恒定(例如，在误差范围内)的阵列。这种阵列可用于各种应用。在一些实施方式中，特征阵列可以具有空间上变化的分辨率。通常，具有空间变化分辨率的阵列是阵列中邻近特征之间的中心到中心间距(例如节距)(沿线性、角度，或线性和角度坐标尺寸)变化的阵列。这种阵列可用于各种应用。例如，在一些实施方式中，取决于要调查样品的空间分辨率，样品可以选择性地与阵列中大约对应于测量的期望空间分辨率的部分相关联。[0864]在一些实施方式中，通过功能方面来描述特征阵列的分辨率可能是有用的，例如，每个特征可以进行的读取次数(可以是测序饱和度的代表)、每个特征可以检测到的转录物的数量，或者每个特征可以检测到的基因数量。例如，在一些实施方式中，每个特征可以进行的读取次数是50,000至1,000,000。例如，每个特征可以进行的读取次数可以是50,000至100,000，50,000至150,000，50,000至200,000，50,000至250,000，50,000至300,000，50,000至350,000，50,000至400,000，50,000至500,000，50,000至550,000，50,000至600,000，50,000至650,000，50,000至700,000，50,000至750,000，50,000至800,000，50,000至850,000，50,000至900,000，50,000至950,000，50,000至1,000,000，100,000至500,000，150,000至500,000，200,000至500,000，250,000至500,000，300,000至500,000，350,000至500,000，400,000至500,000，450,000至500,000，150,000至250,000，或300,000至400,000。在一些实施方式中，每个特征可以进行的读取次数为约70,000。在一些实施方式中，每个特征可以进行的读取次数为约170,000。在一些实施方式中，每个特征可以进行的读取次数为约330,000。在一些实施方式中，每个特征可以进行的读取次数为约500,000。在一些实施方式中，每个特征可以进行的读取次数为约800,000。[0865]在一些实施方式中，每个特征可以检测的转录物数量是20,000至200,000。例如，在一些实施方式中，每个特征可以检测的转录物数量可以是20,000至30,000，20,000至40,000，20,000至50,000，30,000至60,000，40,000至60,000，50,000至60,000，20,000至100,000，30,000至100,000，40,000至200,000，50,000至200,000，或30,000至200,000。在一些实施方式中，每个特征可以检测的转录物数量是约40,000。在一些实施方式中，每个特征可以检测的转录物数量是约60,000。在一些实施方式中，每个特征可以检测的转录物数量是约80,000。在一些实施方式中，每个特征可以检测的转录物数量是约100,000。[0866]在一些实施方式中，每个特征可以检测的基因数量是1,000至5,000。例如，每个特征可以检测的基因数量可以是1,000至1,500，1,000至2,000，1,000至2,500，1,000至3,000，1,000至3,500，1,000至4,000，1,000至4,500，1,500至5,000，2,000至5,000，2,500至5,000，3,000至5,000，3,500至5,000，4,000至5,000，4,500至5,000，1,500至2,500，2,500至3,500，或3,500至4,000。在一些实施方式中，每个特征可以检测的基因数量是约2,000。在一些实施方式中，每个特征可以检测的基因数量是约3,000。在一些实施方式中，每个特征可以检测的基因数量是约4,000。[0867]在一些实施方式中，通过功能方面来描述特征阵列的分辨率可能是有用的，例如每个特征的umi计数的数量。例如，在一些实施方式中，每个特征可以进行的umi计数的数量是1,000至50,000。在一些实施方式中，可以将umi计数的数量平均以获得每个特征的平均umi。在一些实施方式中，可以将umi计数的数量平均以获得每个特征的中值umi计数。例如，每个特征的中值umi计数可以是1,000至50,000，1,000至40,000，1,000至30,000，1,000至20,000，1,000至10,000，1,000至5,000。在一些实施方式中，每个特征的中值umi计数为约5,000。在一些实施方式中，每个特征的中值umi计数为约10,000。[0868]这些组成可用于确定阵列的测序饱和度。测序饱和度可以度量文库复杂性和测序深度。例如，不同的细胞类型将具有不同数量的rna，因此不同数量的转录物会影响文库的复杂性。此外，测序深度与测序读数的数量有关。在一些实施方式中，测序饱和度的倒数是检测新转录物所需的附加读数的数量。测量阵列测序饱和度的一种方法是确定检测新umi的读取次数。例如，如果每2次读取特征就检测到一个新的umi，则测序饱和度将为50％。再举一个示例，如果每10次读取一个特征就检测到一个新的umi，那么测序饱和度将是90％。[0869]空间上不同分辨率的阵列可以以多种方式实现。例如，在一些实施方式中，阵列中相邻特征之间的节距沿着一个或多个线性和/或角坐标方向连续变化。因此，对于矩形阵列，特征的连续行之间、特征的连续列之间或特征的连续行和连续列之间的间距可以连续变化。[0870]在某些实施方式中，空间上变化的分辨率的阵列可以包括具有特征总体的离散域。在每个域内，相邻特征可以具有规则节距。因此，例如，阵列可以包括第一域，其中邻近特征沿线性和/或角度坐标维度彼此间隔第一组均匀坐标位移，以及第二域，其中邻近特征沿线性和/或角度坐标维度彼此间隔第二组均匀坐标位移。第一和第二组位移在至少一个坐标位移中不同，使得两个域中的邻近特征间隔不同，因此第一域中的阵列的分辨率不同于第二域中的阵列的分辨率。[0871]在一些实施方式中，阵列特征的节距可以足够小，使得阵列特征沿着一个或多个阵列维度有效地连续或几乎连续地定位，并且阵列特征之间沿着这些维度很少或没有位移。例如，在其中特征对应于基材的区域(即，寡核苷酸直接结合到基材)的特征阵列中，邻近寡核苷酸之间的位移可以非常小‑有效地，单个寡核苷酸的分子宽度。在这些实施方式中，每个寡核苷酸可以包括不同的空间条形码，使得可以在样品分析期间确定阵列中每个寡核苷酸的空间位置。这种类型的阵列可以具有非常高的空间分辨率，但可能仅包括对应于样品中每个不同空间位置的单个寡核苷酸。[0872]通常，阵列的大小(对应于沿一个坐标方向包围阵列中所有特征的最小边界的最大维度)可以根据需要进行选择，这是基于例如每个特征内样品大小、特征直径和捕获探针的密度等标准。例如，在一些实施方式中，阵列可以是矩形或正方形阵列，其沿每个坐标方向的最大阵列维度为10mm或更小(例如，9mm或更小、8mm或更小、7mm或更小、6mm或更小、5mm或更小、4mm或更小、3mm或更小)。因此，例如，特征的正方形阵列可以具有8mm×8mm、7mm×7mm、5mm×5mm或小于5mm×5mm的维度。[0873](v)珠阵列[0874]如本文所使用的，术语“珠阵列”是指包括多个珠作为阵列中的特征的阵列。在一些实施方式中，两个或多个珠分散在基材上以创建阵列，其中每个珠是阵列上的特征。在一些实施方式中，珠附接到基材。例如，所述珠可以任选地附接到例如显微镜载玻片之类的基材上并且靠近生物样品(例如，包括细胞的组织切片)。珠也可悬浮在溶液中并沉积在表面(例如，膜、组织切片或基材(例如，显微镜载玻片))上。可任选地将珠分散到基材上的孔中，例如，使得每个孔仅容纳单个珠。[0875]基材上或基材内珠阵列的示例包括位于孔中的珠，例如beadchip阵列(可从加利福尼亚州圣迭戈的亿明达公司(illuminainc.)获得)、454lifesciences(瑞士巴塞尔罗氏公司的子公司)测序平台中使用的阵列，以及用于离子激流测序平台的阵列(加利福尼亚州卡尔斯巴德生命科技公司的子公司)。例如，美国专利号6,266,459、6,355,431、6,770,441、6,859,570、6,210,891、6,258,568和6,274,320；美国专利申请公开号2009/0026082；2009/0127589；2010/0137143；2019/0177777；和2010/0282617；以及pct专利申请公开号wo00/063437和wo2016/162309中描述了珠阵列的示例，其全部内容通过引用纳入本文。[0876]在一些实施方式中，珠阵列包括多个珠。例如，珠阵列可以包括至少10000个珠(例如，至少100000个珠、至少1000000个珠、至少5000000个珠、至少10000000个珠)。在一些实施方式中，所述多个珠包括单一类型的珠(例如，在体积、形状和其他物理性质上基本均匀，例如半透明)。在一些实施方式中，所述多个珠包括两种或更多种类型的不同珠。[0877]可以通过将珠(例如，条码化的珠)以规则的图案或不规则的排列附接到基材来生成珠阵列。在一些实施方式中，条形码序列在将它们附接到基材之前是已知的。在一些实施方式中，条形码序列在将它们附接到基材之前是未知的。可以通过例如选择性地活化基材上的区域来将珠附接到基材上的选择性区域以使珠的附接。活化基材上的选择性区域可包括活化或降解选择性区域处的覆层(例如，如本文所述的可有条件移除的覆层)，其中覆层已施加在基材上，使得与所选区域之外的区域相比，选择区域更容易附接珠。使珠附接更容易的区域可以配置为仅适合一个珠或多个珠(例如，受限于孔尺寸或表面图案，例如制造技术)。结合到选定区域的珠可以在基材上形成二维阵列。基材可以均一或不均一地被覆有覆层。珠可以是本文所述的任何合适的珠，包括附接到一个或多个空间条形码的珠。珠可以根据适合于将珠连接到本文所述的基材的任何方法附接到所选区域，例如通过共价键、非共价键或化学接头。[0878]可以使用任何多种合适的图案化技术将珠附接到基材表面。在一些实施方式中，以非限制性方式，例如喷墨印刷、光学和光电细胞捕获、基于激光的图案化、声学图案化、介电泳或磁性技术的物理技术可用于图案化基材。或者，可以使用化学和/或物理化学技术，例如，以非限制性方式，表面化学方法、微接触印刷、微孔和过滤、duv图案化或与微接触印刷相结合的微流体装置中的图案化(参见，例如，martinez‑rivas，a.，用于生物医学应用的细胞微图案化和操作方法(methodsofmicropatterningandmanipulationofcellsforbiomedicalapplications)，micromachines(巴塞尔)8，(2017)，其通过引用方式纳入本文)。[0879]覆层可以是光反应性的，并且选择性地活化或降解覆层包括将覆层的选定区域暴露于光或辐射。选择性可以通过应用光掩模来实现。与未暴露于光的区域(例如，通过光掩模保护免受光的区域)相比，暴露于光的覆层区域可以变得更易于珠附接(例如，更多的粘合剂)。当施加到基材上时，珠因此优先附接到基材上更宽松的区域，并且可以任选地从基材上移除未附接的珠。可以调整光源和/或光掩模以允许基材上的更多位点变得更容易附接珠，从而允许在这些位点附接其它珠。或者，可以应用不同的光源或不同的光掩模。因此，光图案化过程允许珠附接在基材上的预定位置，从而产生珠阵列。[0880]珠可以迭代地附接，例如，可以一次附接一个珠子集，并且可以重复该过程以附接一个或多个其它珠子集。在一些实施方式中，活化点(例如，基材上的点)的尺寸小于珠的尺寸。例如，可以将珠附接到活化的基材(例如，点)，从而仅单个珠附接到活化的基材。在一些实施方式中，可以洗涤基材以移除未结合的珠。在一些实施方式中，基材可在第二位置被活化并且第二珠可附接到活化的基材表面。该过程可以反复进行以将珠附接到整个基材或其部分。或者，可以一步将珠全部附接到基材上。此外，将珠附接到基材的方法是本领域已知的。可以使用任何合适的方法，包括但不限于特定化学键、非特定化学键、接头、物理捕获珠(例如聚合物、水凝胶)或本文所述的任何方法。[0881]用于生成珠阵列的示例性工作流程可以包括：选择性地使被覆的基材上的第一组的一个或多个选定区域变得与选定区域之外的区域相比更容易附接珠，将多个珠施用于阵列，和允许珠附接到第一组的选定区域，任选地移除未附接的珠，使第二组的一个或多个选定区域与第二组的选定区域之外的区域相比更容易附接珠，施用多个珠，和允许珠附接到第二组选定区域，和任选地移除未附接的珠。该迭代过程可以进行任意次数以生成图案化的珠阵列。[0882]另一个示例性过程包括活化被覆的基材上的第一区域并将活化的第一区域暴露于多个条码化的珠，从而第一组的一个或多个珠结合到第一区域；和，活化被覆的基材上的第二区域并将活化的第二区域暴露于多个条码化的珠，从而第二组的一个或多个珠结合到第二区域，其中第一组的一个或多个珠包含基材表面的第一区域所独特的相同的第一寡核苷酸序列，并且第二组的一个或多个珠包含基材表面的第二区域所独特的相同的第二寡核苷酸序列，并且其中第一和第二寡核苷酸序列不同。可活化被覆基材上的其它区域并将其暴露于其它条码化的珠。每组条码化的珠可以包括不同于所有其它条码化的珠组并且对于活化区域的位置而言独特的寡核苷酸序列。此外，第一组的一个或多个珠和第二组的一个或多个珠可以不同。换言之，第一组的一个或多个珠和第二组的一个或多个珠可以具有不同的表面化学性质、不同的组成(例如，固体珠、凝胶珠、二氧化硅珠)(例如，纳米颗粒与微粒)，和/或物理体积。在一些实施方式中，第三组的一个或多个珠、第四组的一个或多个珠、第五组的一个或多个珠或更多可以具有不同的表面化学、不同的组成(例如，固体珠、凝胶珠、二氧化硅珠)(例如，纳米颗粒对微粒)和/或物理体积，可以附接到基材表面。该方法可以包括移除不与第一、第二和/或任何其它区域结合的珠。在一些实施方式中，移除珠包括将珠从基材表面上洗掉。可以在每轮或几轮区域(例如，基材表面上的第一、第二或附加区域)活化并将珠结合到活化区域之后进行移除。在一些情况下，每个珠都在单个位置结合到基材上。结合到第一、第二和其它区域的珠可以在基材上形成珠的二维阵列。[0883]光反应性覆层可包含多个光反应性分子，当暴露于特定波长或波长范围的光时，所述光反应性分子可发生化学反应(例如，水解、氧化、光解)。光反应性分子在暴露于光时会变得具有反应性，并且可以与其它分子发生反应并与其它分子形成化学键。[0884]覆层可包含聚合物，并且活化基材上的选定区域包括在相应区域处改性聚合物。改性聚合物包括例如通过将聚合物暴露于辐射或光来光化学改性聚合物。或者或另外，改性聚合物可包括通过使聚合物与一种或多种化学试剂接触来化学改性聚合物。在一些情况下，覆层是水凝胶。在一些情况下，覆层包含光反应性聚合物。示例性的光反应性聚合物包括基于聚(乙二醇)(peg)的聚合物、基于聚(l‑赖氨酸)(pll)的聚合物、包含peg和pll的官能化或未官能化单元的共聚物(例如，聚‑l‑赖氨酸‑接枝‑聚乙二醇(pll‑g‑peg))和甲基丙烯酸化明胶(gelma)聚合物。[0885]通过将珠选择性地交联到已施加到基材上的覆层，珠也可以附接到基材上的选择性区域。例如，可以将多个珠施加到具有可光交联覆层的基材上，并且在将珠的子集交联到覆层上时，可以移除未交联的珠，只留下交联的珠在基材上。该过程可以重复多次。覆层可包括可光交联的聚合物。示例性的可光交联聚合物描述于，例如，shirai，polymerjournal46：859‑865(2014)，ravve，《可光交联的聚合物》(photocrosslinkablepolymers)，合成聚合物的光相关反应(light‑associatedreactionsofsyntheticpolymers).施普林格出版社(springer)，纽约州纽约(2006)，和ferreira等.《用于生物医药应用的可光交联的聚合物》(photocrosslinkablepolymersforbiomedicalapplications)，生物医药工程——前端与挑战(biomedicalengineering‑frontiersandchallenges)，rezafazel教授(编)，isbn：978‑953‑307‑309‑5(2011)，其各自通过引用其全文的方式纳入本文。[0886]用于活化、降解或交联如本文所述的覆层的合适光源包括但不限于紫外(uv)光(例如，250‑350nm或350‑460nm的紫外光)和可见光(例如，广谱可见光)。数字微镜器件(dmd)也可用于提供光源。[0887]根据本文所述方法的第一对相邻选定区域之间的距离可以与第二对相邻选定区域相同或不同。[0888]可通过首先在基材上制备多个条码化的探针、在基材上沉积多个珠并使用基材上的探针作为模板生成附接到珠的探针来生成条码化的珠或包含多个条码化的探针的珠。[0889]大规模商业制造方法允许将数百万个寡核苷酸附接到阵列上。商用阵列包括来自rochenimblegen公司(威斯康星州)和affymetrix公司(赛默飞(thermofisherscientific))的阵列。[0890]在一些实施方式中，可根据wo2012/140224、wo2014/060483、wo2016/162309、wo2017/019456、wo2018/091676和wo2012/140224以及美国专利申请号2018/0245142中所述的方法来制备阵列。上述各文件的全部内容通过引用纳入本文。[0891]在一些实施方式中，当珠包埋在水凝胶层中时形成珠阵列，其中水凝胶聚合并固定相对珠位置。珠阵列可以预先平衡并与反应缓冲液和酶结合(例如，逆转录混合物)。在一些实施方式中，珠阵列可以在使用前长期(例如，数天)储存(例如，冷冻)。[0892](vi)柔性阵列[0893]“柔性阵列”包括附接到或嵌入到放置在生物样品上或靠近生物样品的柔性基材(例如，膜、水凝胶或胶带)中的多个空间条码化特征。在一些实施方式中，柔性阵列包括嵌入水凝胶内的多个空间条码化特征。[0894]柔性的阵列可以是高度模块化的。在一些实施方式中，空间条码化的特征(例如珠)可以加载到基材(例如载玻片)上以产生高密度自组装阵列。在一些实施方式中，特征(例如，珠)可以用流动池加载到基材上。在一些实施方式中，特征(例如，珠)被嵌入水凝胶(例如，放置在自组装特征顶部的水凝胶垫或层)中。在一些实施方式中，水凝胶可以聚合，从而固定水凝胶中的特征。在一些实施方式中，包含特征的水凝胶可从基材移除并用作柔性阵列。在一些实施方式中，柔性阵列可以通过光学测序或本文所述的任何其它方法去卷积(deconvolved)。在一些实施方式中，特征(例如，珠)的直径可以是约1μm至约25μm。在一些实施方式中，柔性阵列中约25μm直径的特征可以提供约1000dpi和约1兆像素的分辨率。在一些实施方式中，特征(例如，珠)的直径可为约13.2μm。在一些实施方式中，柔性阵列中约13.2μm的珠可提供约1920x1080的分辨率。[0895]根据本文所述的任何方法产生的柔性阵列(例如，嵌入水凝胶中的珠)可以包含不耐热聚合物。在一些实施方式中，具有不耐热珠的柔性阵列可以与生物样品接触。在一些实施方式中，可以识别生物样品中的感兴趣区域，从而可以使用红外激光来选择感兴趣区域。在一些实施方式中，红外激光可导致柔性阵列(例如，不耐热珠)变形并变得具有粘性。在一些实施方式中，柔性阵列的粘合剂部分可以粘附(例如，结合)至直接位于上方或下方的感兴趣区域(例如，细胞)。识别感兴趣区域、将红外激光施用于感兴趣区域并粘附下面的生物样品(例如，细胞)到柔性阵列的过程可以迭代重复。在一些实施方式中，柔性阵列可以被移除，从而也可以用柔性阵列仅移除来自一个或多个感兴趣区域的粘附的生物样品(例如，细胞)。在一些实施方式中，可根据本文所述的任何方法进一步处理(例如，扩增、定量和/或测序)柔性阵列和粘附的生物样品。[0896]柔性的阵列可以用反应缓冲液和功能浓度的酶(例如，逆转录混合物)进行预平衡。在一些实施方式中，柔性阵列可以储存较长时间(例如，数天)或冷冻直至准备使用。在一些实施方式中，生物样品(例如，组织切片)的透化可在与柔性阵列接触之前通过添加酶/洗涤剂来进行。在一些实施方式中，柔性阵列可以直接放置在样品上，或者放置成与样品间接接触(例如，在生物样品和柔性珠阵列之间具有中间层或物质)。在一些实施方式中，柔性阵列可以机械地施加(例如，向下按压或压缩在两个表面之间)在生物样品上以增强分析物捕获。在一些实施方式中，可将柔性阵列施用于生物样品的一侧。例如，可以在任何方向上切割(例如，切片)生物样品并且可以将柔性阵列施用于暴露的分析物。在一些实施方式中，柔性阵列可以是可溶解的(例如，通过热、化学或酶促破坏)。在一些实施方式中，一旦将柔性阵列施用于样品，分析物的逆转录和靶向捕获可以在微球体，或第一体积的珠和第二体积的珠，或本文所述的任何珠上进行。在一些实施方式中，一旦将柔性阵列施用于生物样品并允许捕获分析物，就可以从生物样品移除(例如剥离)柔性阵列，以供根据本文所述任何方法的进一步处理(例如，扩增、定量和/或测序)。[0897]柔性阵列还可以与本文所述的任何方法(例如，主动捕获方法，例如电泳)一起使用。例如，柔性阵列可以与导电基材(例如，氧化铟锡被覆的载玻片)上的生物样品接触，从而可以向导电基材施加电场，以促进分析物通过、穿过、内部或在柔性阵列方向上的迁移。另外和可选地，柔性阵列可以与电泳组件(例如，电泳室)中的生物样品接触，从而可以施加电场，以使分析物在柔性阵列的方向上或穿过、穿过或在柔性阵列内部迁移。[0898]在一些实施方式中，可在基材保持器(例如，任何阵列对准装置)的帮助下产生柔性阵列。例如，空间条码化珠阵列可以放置在基材支架的一个位置保持器(placeholder)中并且第二基材(例如，载玻片)可以放置在基材支架的第二位置保持器中。在一些实施方式中，阵列任选地被光学解码(opticallydecoded)并且凝胶预聚物溶液被引入空间条码化珠阵列和第二基材之间。在一些实施方式中，基材保持器被关闭，从而第二基材在空间条码化珠阵列的顶部(例如，在其上方，与其平行)。凝胶预聚物溶液可以通过本文所述的任何方法聚合并导致在水凝胶中交联的空间条码化特征，从而产生柔性阵列。在一些实施方式中，基材保持器可以是开放的，并且可以从基材保持器上移除具有水凝胶和空间条码化的交联特征的第二基材(柔性阵列可以任选地从第二基材移除)以用于通过本文所述的任何方法进行空间分析。[0899](vii)收缩水凝胶特征/阵列[0900]如本文所用，水凝胶的“收缩”或“减小尺寸”是指导致水凝胶物理收缩和/或水凝胶尺寸体积减小的任何过程。例如，凝胶支架可能会在溶剂移除后收缩或“内爆”(参见，例如long和williams.science.2018；362(6420)：1244‑1245，和oran等.science2018；362(6420)：1281‑1285；其各自通过引用其全文方式纳入本文)。作为另一个示例，收缩或减小水凝胶体积的过程可以是从水凝胶中移除水的过程(即，脱水过程)。有许多本领域技术人员已知的用于收缩或减小水凝胶体积的方法。收缩或减小水凝胶体积的方法的非限制性示例包括将水凝胶暴露于以下一种或多种：脱水溶剂、盐、加热、真空、冻干、干燥、过滤、风干或其组合。[0901]在一些实施方式中，水凝胶珠在附接到或嵌入水凝胶之前可以减小体积(例如，收缩的水凝胶珠)。在一些实施方式中，水凝胶珠在附接到或嵌入水凝胶之后可以减小体积(例如，收缩的水凝胶珠)。在一些实施方式中，一个或多个水凝胶珠可附接到或嵌入水凝胶中。在一些实施方式中，一个或多个水凝胶珠在附接到或嵌入水凝胶之前可减小体积(例如，一个或多个收缩的水凝胶珠)。在一些实施方式中，一个或多个水凝胶珠在附接到或嵌入水凝胶之后可减小体积(例如，一个或多个收缩的水凝胶珠)。在一些实施方式中，附接到或嵌入水凝胶中的一个或多个水凝胶珠的体积可以减小。例如，一个或多个水凝胶珠和水凝胶珠附接或嵌入的水凝胶的体积同时减少(例如，收缩的含水凝胶珠的水凝胶)。在一些实施方式中，附接到或嵌入水凝胶中的一个或多个水凝胶珠的体积可以等距减小。[0902]在一些实施方式中，附接到或嵌入水凝胶中的一个或多个水凝胶珠的体积可减少约3倍至约4倍。例如，可以通过移除或交换溶剂、盐或水(例如，脱水)来减小附接到或嵌入水凝胶中的一个或多个水凝胶珠的体积。在另一示例中，可通过控制温度或ph来减小附接于或嵌入水凝胶中的一个或多个水凝胶珠的体积。参见例如ahmed，e.m.j.ofadvancedresearch.2015年3月；6(2)：105‑121，其全部通过引用其全文的方式纳入本文。在一些实施方式中，可通过移除水来减小附接到或嵌入水凝胶中的一个或多个水凝胶珠的体积。[0903]在一些实施方式中，减少附接于或嵌入水凝胶中的一个或多个水凝胶珠的体积可增加样品的后续分析的空间分辨率。空间概况分析中增加的分辨率可以通过比较使用附接或嵌入水凝胶的一个或多个收缩水凝胶珠的样品的空间分析与附接或嵌入水凝胶的一个或多个非收缩水凝胶珠的样品的空间分析来确定。[0904]在一些实施方式中，水凝胶珠的体积没有减少。在一些实施方式中，水凝胶珠的体积可以减小(例如，收缩的水凝胶珠)。在一些实施方式中，收缩的水凝胶凝胶珠是稳定的。例如，可以通过从水凝胶珠中移除溶剂、盐或水(例如，脱水、干燥、干燥化、变干)以形成收缩的水凝胶珠来减小水凝胶珠的体积。在另一个示例中，水凝胶珠的体积可以通过控制温度或ph值来减少。参见例如ahmed，e.m.j.ofadvancedresearch.2015年3月；6(2)：105‑121，其全部通过引用其全文的方式纳入本文。可用于形成收缩水凝胶珠或收缩水凝胶珠阵列的溶剂的非限制性示例包括酮，例如甲乙酮(mek)、异丙醇(ipa)、丙酮、1‑丁醇、甲醇(meoh)、二甲亚砜(dmso)、甘油、丙二醇、乙二醇、乙醇、(k)1，4‑二噁烷、碳酸丙烯酯、糠醇、n，n‑二甲基甲酰胺(dmf)、乙腈、醛，例如甲醛或戊二醛，或其任何组合。[0905]在一些实施方式中，水凝胶珠或水凝胶珠阵列通过交联剂收缩或稳定。例如，交联剂可包括辛二酸二琥珀酰亚胺酯(dss)、二甲基琥珀酸酯(dms)、福尔马林和二甲基己二酰亚胺(dma)、二硫代‑双(‑琥珀酰亚胺丙酸酯)(dsp)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(dst)和乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(egs)。[0906]在一些实施方式中，水凝胶珠或水凝胶珠阵列用盐处理以形成收缩的水凝胶珠或收缩的水凝胶珠阵列。可用于形成收缩水凝胶珠或收缩水凝胶珠阵列的盐的非限制性示例是无机盐，包括铝盐、铵盐、钡盐、铍盐、钙盐、铯盐、锂盐、镁盐、钾盐、铷盐、钠盐和锶盐。无机盐的其他非限制性实例包括氯化钠、氯化钾、氯化锂、氯化铯、氟化钠、溴化钠、碘化钠、亚硝酸钠、硫酸钾、硝酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、硫酸钠、硝酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸钙、氯氧化铜、氯化钙、碳酸钙、碳酸氢钙、硫酸镁、硝酸镁、氯化镁、碳酸镁、碳酸氢镁、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸三钠、磷酸三钾、磷酸钙、硫酸铜(ii)、硫化钠、硫化钾、硫化钙、高锰酸钾、氯化铁(ii)、氯化铁(iii)、硫酸(2 )铁、硫酸铁(iii)、硝酸铁(ii)、硝酸铁(iii)、氯化锰(ii)、氯化锰(iii)、硫酸锰(ii)、硝酸锰(ii)、氯化锌、硝酸锌、硫酸锌、正钼酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镍(ii)、硝酸镍(ii)、偏钒酸钠、仲钒酸钠、重铬酸钾、重铬酸铵、安托霉素、亚硝酸铵、氟化钾、钠氟化物、氟化铵、氟化钙、铬明矾、钾明矾、碘化钾、次氯酸钠、硫酸锡(ii)、硝酸锡(ii)、亚硒酸金、铬酸二甲酯、高氯酸钾、高氯酸钙、硫酸铝、硫酸氢铅(ii)、磷酸钡、正磷酸氢钡、磷酸二氢钡、重铬酸银、溴酸钾、溴酸钠、碘酸钠、硅酸钠、磷酸二铵、磷酸铵、磷酸二氢铵、正磷酸铬、氯化铜(ii)、氯化铜(i)、四偏磷酸钠、七氟铌酸钾、磷酸锌、亚硫酸钠、硝酸铜(i)、硝酸铜(ii)、硅酸钾、碱式碳酸铜(ii)、丙烯酸碳酸铜(ii)盐和磺丙基丙烯酸盐。[0907]在一些实施方式中，水的移除包括酸。酸的非限制性示例包括：hcl、hi、hbr、hclo4、hclo3、hno3、h2so4、磷酸、亚磷酸、乙酸、草酸、抗坏血酸、碳酸、亚硫酸、酒石酸、柠檬酸、丙二酸、邻苯二甲酸、巴比妥酸、肉桂酸、戊二酸、己酸、苹果酸、叶酸、丙酸、硬脂酸、三氟乙酸、乙酰水杨酸、谷氨酸、壬二酸、二苯甲酸、富马酸、葡糖酸、乳酸、油酸、丙炔酸、蔷薇酸、单宁酸、尿酸、没食子酸，及其两种或更多种的组合。在一些实施方式中，水凝胶暴露于不同的ph环境。例如，水凝胶可以暴露于酸性ph值或碱性ph值。在一些实施方式中，水凝胶暴露于小于约6.5的ph，例如约6、约5.5、约5、约4.5、约4、约3.5、约3、约2.5、约2、约1.5或约1的ph。在一些实施方式中，水凝胶暴露于大于约7.5的ph，例如约8、约8.5、约9、约9.5、约10、约10.5、约11、约11.5、约12、约12.5、约13、约13.5或约14的ph。[0908]在一些实施方式中，水的移除包括脱水过程，例如加热、真空、冻干、干燥、过滤和风干。在一些实施方式中，水凝胶珠或水凝胶珠阵列经历ph变化以形成收缩水凝胶珠或收缩水凝胶珠阵列(例如，从约ph7变化至约phs，从约ph7变化至约ph5.5，约ph7至约ph6、约ph7至约ph6.5、约ph6.5至约ph5、约ph6至约ph5、约ph6至约ph5.5或包含在这些范围内的任何ph变化)。[0909]在一些实施方式中，水凝胶珠或水凝胶珠阵列经历温度变化(例如，从约37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃到约50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃或更高，或包含在这些范围内的任何温度变化)以形成收缩的水凝胶珠或收缩的水凝胶珠阵列。[0910]在一些实施方式中，水凝胶珠的线性尺寸的尺寸可减小约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或其中任何间隔。在一些实施方式中，水凝胶珠的体积可减小约1倍、约5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍、约50倍、约55倍、约60倍、约65倍、约70倍、约75倍、约80倍或其中任何间隔。在一些实施方式中，水凝胶珠的尺寸可以减小，使得水凝胶珠的平均直径为约1μm至约15μm。[0911]在一些实施方式中，多个水凝胶珠的线性尺寸的尺寸可减小约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或其中任何间隔。在一些实施方式中，多个水凝胶珠的尺寸可以减小，使得水凝胶珠的平均直径为约1μm至约15μm。在一些实施方式中，多个水凝胶珠的体积可减小约1倍、约5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍、约50倍、约55倍、约60倍、约65倍、约70倍、约75倍、约80倍或其中任何间隔。[0912]在一些实施方式中，多个水凝胶珠的体积可以减小，使得水凝胶珠的平均直径为约1μm至约15μm。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约15μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约14μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约13μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约12μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约11μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约10μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约9μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约8μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约7μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约6μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约5μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约4μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约3μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约2μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约1μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约14‑15μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约13‑15μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约12‑15μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约11‑15μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约10‑15μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约9‑15μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约8‑15μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约7‑15μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约6‑15μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约1‑10μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约1‑5μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约1‑3μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约13‑14μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约12‑14μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约11‑14μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约10‑14μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约9‑14μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约8‑14μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约7‑14μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约6‑14μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约5‑14μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约12‑13μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约11‑13μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约10‑13μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约9‑13μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约8‑13μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约7‑13μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约6‑13μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约5‑13μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约11‑12μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约10‑12μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约9‑12μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约8‑12μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约7‑12μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约6‑12μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约5‑12μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约10‑11μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约9‑11μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约8‑11μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约7‑11μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约6‑11μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约5‑11μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约9‑10μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约8‑10μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约7‑10μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约6‑10μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约5‑10μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约8‑9μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约7‑9μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约6‑9μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约5‑9μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约7‑8μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约6‑8μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约5‑8μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约6‑7μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约5‑7μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约5‑6μm的平均直径。[0913]在一些实施方式中，一个或多个水凝胶珠的体积可同时减小。在一些实施方式中，一个或多个水凝胶珠的体积可不同时减小。在一些实施方式中，一个或多个水凝胶珠可以在减小一个或多个水凝胶珠的体积之前组装成阵列。在一些实施方式中，一个或多个水凝胶珠可以在减小一个或多个水凝胶珠的体积之后组装成阵列。在一些实施方式中，一个或多个收缩的水凝胶珠可以可逆地附接到基材上。在一些实施方式中，一个或多个收缩的水凝胶珠可以不可逆地附接到基材上。在一些实施方式中，可以再扩展一个或多个收缩的水凝胶珠。在一些实施方式中，可以等距地再扩展一个或多个收缩的水凝胶珠。在一些实施方式中，一个或多个收缩的水凝胶珠可以主要在z维度上再扩展。在一些实施方式中，(例如，可逆地或不可逆地)附接到基材的一个或多个收缩的水凝胶珠可以主要在z维度上再扩展。在一些实施方式中，(例如，可逆地或不可逆地)附接到基材的一个或多个收缩的水凝胶珠可以主要在z维度上等距地再扩展。[0914]在一些实施方式中，减小水凝胶珠(例如，收缩的水凝胶珠)的体积可以增加样品的后续分析的空间分辨率。通过比较使用收缩的水凝胶珠和非收缩的水凝胶珠对样品进行的空间分析，可以确定空间分析中增加的分辨率。例如，在一些实施方式中，样品的后续分析可以包括本文公开的任何基于阵列的空间分析方法。[0915]在一些实施方式中，可以改变水凝胶珠的一种或多种物理参数或尺寸和/或一种或多种其它特性。例如，水凝胶珠的截面可以从第一截面变为第二截面。第一截面可以小于或大于第二截面。或者或另外，可以改变水凝胶珠的一个或多个其它特性。例如，水凝胶珠或其一种或多种组分的流动性、密度、刚度、孔隙率、折射率、极性和/或其它特性可以改变。在一个非限制性示例中，水凝胶珠包括水凝胶。在另一个示例中，水凝胶珠水凝胶可在珠内形成交联。相同或不同的条件可用于同时或不同时间改变或影响水凝胶珠的不同特性。在一些情况下，第一条件或条件组可用于改变水凝胶珠的第一特性或特性组(例如截面)，并且第二条件或条件组可用于改变水凝胶珠的第二特性或特性组。可以在与第二条件或条件组相同或不同的时间应用第一条件或条件组。例如，可以在第一条件或条件组下改变第一特性或特性组，之后可以在第二条件或条件组下改变第二特性或特性组。[0916]水凝胶珠的特性或特性组可以通过一个或多个条件改变。适合改变水凝胶珠的特性或特性组的条件可以是例如温度、ph、离子或盐浓度、压力、化学物质、它们的任意组合或其它条件。例如，水凝胶珠可暴露于能导致水凝胶珠的一种或多种特性发生变化的化学物质。在某些情况下，可以利用刺激来改变水凝胶珠的一种或多种特性。例如，在施加刺激时，水凝胶珠的一种或多种特性可以改变。刺激可以是例如热刺激、光刺激、化学刺激或其它刺激。足以改变水凝胶珠的一种或多种特性的温度可以是例如至少约0摄氏度(℃)、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、10℃或更高。例如，温度可以是约4℃。在其它情况下，足以改变水凝胶珠的一种或多种特性的温度可以是例如至少约25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃或更高。例如，温度可以是约37℃。足以改变水凝胶珠的一种或多种特性的ph值可以是例如约5至8，例如约6至7。[0917]在一些情况下，化学物质或化学刺激可用于改变水凝胶珠的一种或多种特性。例如，化学物质或化学刺激可用于改变水凝胶珠的尺寸(例如，截面、直径或体积)。在一些情况下，化学物质或化学刺激可用于将水凝胶珠的尺寸(例如，截面直径)从第一尺寸改变为第二尺寸(例如，第二截面直径)，其中第二尺寸与第一尺寸相比有所减小。化学物质可包括有机溶剂，例如醇、酮或醛。例如，化学物质可以包括丙酮、甲醇、乙醇、甲醛或戊二醛。化学物质可包括交联剂。例如，交联剂可包括辛二酸二琥珀酰亚胺酯(dss)、二甲基琥珀酸酯(dms)、福尔马林和二甲基己二酰亚胺(dma)、二硫代‑双(‑琥珀酰亚胺丙酸酯)(dsp)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(dst)和乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(egs)，及其任何组合。在一些情况下，交联剂可以是光可裂解交联剂。在一些情况下，化学刺激可用于改变水凝胶珠的一种或多种特性(例如，水凝胶珠的尺寸)，其中化学刺激包括一种或多种化学物质。例如，化学刺激可以包括第一化学物质和第二化学物质，其中第一化学物质是有机溶剂并且第二化学物质是交联剂。在某些情况下，化学刺激可以包括作为能够固定或保存水凝胶珠的固定剂的化学物质。例如，有机溶剂例如醇(例如乙醇或甲醇)、酮(例如丙酮)或醛(例如甲醛或戊二醛)或其任何组合可作为固定剂。或者或另外，交联剂可作为固定剂。在一些情况下，固定剂可包含辛二酸二琥珀酰亚胺酯(dss)、二甲基琥珀酸酯(dms)、福尔马林和二甲基己二酰亚胺(dma)、二硫代双(‑琥珀酰亚胺丙酸酯)(dsp)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(dst)和/或乙烯乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(egs)及其任何组合。在某些情况下，可以将第一化学物质和/或固定剂提供给水凝胶珠或使其与水凝胶珠接触以引起水凝胶珠的第一特性或特性组的变化，并且可将第二化学物质和/或固定剂提供给水凝胶珠或使其与水凝胶珠接触以引起水凝胶珠的第二特性或特性组的变化。例如，可以将第一化学物质和/或固定剂提供给水凝胶珠或使其与水凝胶珠接触以引起水凝胶珠的尺寸变化(例如，截面直径的减小)，并且可以将第二化学物质和/或固定剂提供给水凝胶珠或使其与水凝胶珠接触以因其水凝胶珠的第二特性或特性组的变化(例如，在水凝胶珠内部和/或周围形成交联)。第一和第二化学物质和/或固定剂可在相同或不同时间提供给水凝胶珠或使之与水凝胶珠接触。[0918]在一些实施方式中，固定可影响水凝胶珠的一个或多个参数或特性。例如，固定可能导致水凝胶珠的收缩或体积减少。固定可以包括水凝胶珠的脱水。向水凝胶珠提供固定剂可导致水凝胶珠的尺寸发生变化。例如，向水凝胶珠提供固定剂可能导致水凝胶珠的体积或直径发生变化。向水凝胶珠提供固定剂可导致水凝胶珠的截面(例如，截面直径)的变化。例如，固定前水凝胶珠的第一截面可以不同于(例如，更大于)固定后水凝胶珠的第二截面。在一个示例中，近似球形的水凝胶珠在固定之前可以包括第一截面(例如，截面直径)，其在固定之后尺寸减小到第二截面。向水凝胶珠提供固定剂可导致与第一截面相比减小至少约5％的第二截面。在一些情况下，第二截面可相对于第一截面减小至少6％、8％、10％、15％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。例如，第二截面可相对于第一截面减小至少约10％、15％、25％或50％。固定也可能影响水凝胶珠的其它特性。例如，固定可导致水凝胶珠的膜或壁的孔隙率发生变化，水凝胶珠的组分重组，水凝胶珠流动性或刚性的变化，或其它变化。在一个示例中，向水凝胶珠提供有机溶剂形式的第一固定剂以改变第一特性(例如，水凝胶珠体积)并且向水凝胶珠提供交联剂形式的第二固定剂以改变第二个特性(例如，水凝胶珠的流动性或刚性)。第一固定剂可以在第二固定剂之前提供给水凝胶珠。[0919]在一些情况下，近似球形的水凝胶珠可在固定(例如，通过有机溶剂固定)之前包括第一直径，其在固定之后，当维持在非水性环境中时，与第二直径相比体积减小。在固定和体积减小至所述第二直径之后，当维持在水性环境中时，水凝胶珠的体积可增加至具有与第一直径基本相似的直径。在一些情况下，近似球形的水凝胶珠在固定(例如，通过有机溶剂固定)之前可以包括与固定之后的第二直径相比体积减小的第一直径。在固定和体积减小至所述第二直径之后，水凝胶珠可以通过第二固定剂交联，其中第二直径在第二固定剂交联后于水性环境中基本维持。[0920]水凝胶珠的特性或特性组的变化可以是可逆的或不可逆的。在某些情况下，水凝胶珠的特性或特性组的变化可能是不可逆的，从而使该变化无法轻易撤消。例如，水凝胶珠的体积、形态或其它特征可能以无法轻易逆转的方式改变。在一个示例中，从水凝胶珠的第一截面到水凝胶珠的第二截面的变化是不可逆的。在某些情况下，在应用适当的条件和/或经过一段时间后，不可逆的变化可能至少部分被逆转。在其它情况下，水凝胶珠的特性或特性组的变化可能是可逆的。例如，在经受第一条件或条件组时，水凝胶珠的体积可以减小，并且在经受第二条件或条件组时，水凝胶珠的体积可以增加到约原始体积。因此，从水凝胶珠的第一截面到第二截面的变化可以是可逆的。可逆变化(例如，可逆体积减小)可用于例如将给定体积的水凝胶珠提供至给定位置，例如分区。在一些情况下，水凝胶珠的特性或特性组的变化可能只是部分可逆的。例如，可以减少水凝胶珠的体积(例如，通过脱水)，并且水凝胶珠体积的减少可能伴随着水凝胶珠内组分的重组。在水凝胶珠的体积逆转时(例如，通过再水合)，一种或多种组分的排列可能不会恢复到体积减小之前水凝胶珠的原始排列。水凝胶珠的特征或特征组(例如水凝胶珠的截面)的变化，在施加刺激时是可逆的。刺激可以是例如热刺激、光刺激或化学刺激。在一些情况下，刺激可以包括ph的变化和/或还原剂例如二硫苏糖醇的应用。刺激的施加可以完全或部分逆转从例如第一截面到第二截面的变化。[0921]在一些实施方式中，多个水凝胶珠可以是通过从多个第一水凝胶珠移除水而产生的收缩的水凝胶珠。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的平均直径不大于约15微米。例如，多个收缩的水凝胶珠的平均直径不大于约15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1微米。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的每个成员具有不大于约15微米的直径。例如，多个收缩的水凝胶珠的每个成员的直径可以不大于约15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1微米。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的平均直径不大于10微米。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的每个成员具有不大于10微米的直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的平均直径不大于5微米。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的每个成员具有不大于5微米的直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的平均直径不大于1微米。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的每个成员具有不大于1微米的直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的平均直径不大于细胞(例如，哺乳动物细胞、植物细胞或真菌细胞)的直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的每个成员的直径不大于细胞(例如，哺乳动物细胞、植物细胞或真菌细胞)的直径。[0922]在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有小于约25％的多分散指数。例如，多个收缩的水凝胶珠可具有小于约25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的多分散指数。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有小于15％的多分散指数。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约8至约13微米的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约10至约12微米的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的平均直径约为细胞(例如，哺乳动物细胞、植物细胞或真菌细胞)的直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的平均直径小于细胞(例如，哺乳动物细胞、植物细胞或真菌细胞)的直径。在一些实施方式中，多个收缩的凝胶珠上的多个捕获探针以单细胞分辨率结合细胞分析物。在一些实施方式中，多个收缩的凝胶珠上的多个捕获探针以高于单细胞分辨率(例如，以比细胞直径更高的密度的分辨率)结合细胞分析物。[0923]在一些实施方式中，具有布置在基材上的多个水凝胶珠的珠阵列通过较大凝胶珠的自组装或图案化产生，之后较大凝胶珠的阵列收缩(例如，通过本文所提供的多种方法中的任一种)。在一些实施方式中，较大的凝胶珠对于单细胞分辨率而言不够小，而收缩的凝胶珠对于单细胞分辨率而言足够小。在一些实施方式中，具有布置在基材上的多个水凝胶珠的珠阵列通过使先前通过收缩较大凝胶珠(例如，通过本文提供的多种方法中的任一种)产生的收缩的凝胶珠自组装或图案化而产生。珠可以通过多种方法中的任何一种进行空间上的限制，包括但不限于可逆或不可逆交联。[0924]在一些实施方式中，珠阵列包括具有高纵横比的空间限制的凝胶珠(例如，柱状阵列)。例如，可以通过本文所述的多种方法中的任一种来产生具有布置在基材上的多个水凝胶珠的珠阵列(例如，通过收缩凝胶珠的自组装或图案化或通过较大凝胶的自组装或图案化珠然后收缩)，然后扩展(或重新扩展)高密度珠阵列。扩展时，空间限制会引导珠主要在z维度(远离基材)扩展，从而形成柱状阵列。在一些实施方式中，柱状阵列的凝胶珠具有高纵横比。在一些实施方式中，扩展的多个空间受限的收缩水凝胶珠的纵横比为至少2。在其它实施方式中，扩展的多个空间受限的收缩水凝胶珠的纵横比为至少3。在一些实施方式中，多个空间限制的收缩的水凝胶珠的纵横比为至少4、5、6、7、8或更大。[0925]在一些实施方式中，从水凝胶移除水的方法对于每个水凝胶(例如，第一水凝胶、第二水凝胶或第三水凝胶)是相同的。在一些实施方式中，从一种水凝胶(例如，第一水凝胶)移除水的方法不同于用于至少一种其它水凝胶(例如，第二水凝胶、第三水凝胶或第四水凝胶)移除水的方法。例如，从一种水凝胶移除水的方法可以不同于用于其它水凝胶(例如，第二水凝胶、第三水凝胶或第四水凝胶)的移除水的方法。在一些实施方式中，用于移除水的方法对于每个水凝胶(例如，第一水凝胶、第二水凝胶、第三水凝胶和第四水凝胶)而言是不同的。[0926]在一些实施方式中，收缩的水凝胶在线性维度上(例如，沿一个轴)比收缩前的水凝胶小至少约2倍。例如，在线性维度上比收缩前的水凝胶小至少约2.5、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10或更多倍。[0927]在一些实施方式中，水凝胶的尺寸沿多于一个轴减小，例如沿2或3个轴。在一些实施方式中，各轴以90度与其它轴相交。在一些实施方式中，水凝胶沿第一轴的尺寸比收缩前的水凝胶小约2至约10倍或更多倍，例如比收缩前的水凝胶小约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10倍或更多倍。在一些实施方式中，水凝胶沿第二轴的尺寸比收缩前的水凝胶小约2至约10倍或更多倍，例如比收缩前的水凝胶小约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10倍或更多倍。在一些实施方式中，水凝胶沿第三轴的尺寸比收缩前的水凝胶小约2至约10倍或更多倍，例如比收缩前的水凝胶小约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10倍或更多倍。在一些实施方式中，水凝胶体积的减小是等距的。[0928]在一些实施方式中，每个水凝胶(例如，第一水凝胶、第二水凝胶、第三水凝胶或第四水凝胶)的体积是相同的。在一些实施方式中，至少一种水凝胶的体积不同。例如，在一些实施方式中，一种水凝胶的体积不同于其它水凝胶(例如，第二水凝胶、第三水凝胶或第四水凝胶)。在一些实施方式中，每个水凝胶在体积上与每个其它水凝胶不同。[0929]在一些实施方式中，多个特征的成员与水凝胶(例如，第一水凝胶、第二水凝胶、第三水凝胶或第四水凝胶)交联。[0930]在一个实施方式中，可以将阵列的特征复制到水凝胶中，并且通过移除水来减小水凝胶的体积。这些步骤可以进行多次。例如，制备高密度空间条码化柔性阵列的方法可以包括：将多个空间条码化特征从阵列复制到第一水凝胶中，其中第一水凝胶与阵列接触；通过移除水来减小包括复制的特征的第一水凝胶的体积，形成包括复制的特征的第一收缩水凝胶；将第一收缩的水凝胶中的特征复制到第二水凝胶中，其中第二水凝胶与第一水凝胶接触；和，通过移除水来减小包含复制的特征的第二水凝胶的体积，形成包含复制的特征的第二收缩水凝胶，从而生成高密度空间条码化阵列。将空间条码化特征从阵列复制到第一水凝胶、从第一水凝胶移除水以形成第一收缩水凝胶以及将空间条码化特征从第一收缩水凝胶复制到一个或多个后续水凝胶的过程可以进行多次(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10次)。结果产生包括空间条码化特征的高密度柔性阵列。[0931]在一些实施方式中，从阵列复制多个特征的成员包括通过pcr复制。在一些实施方式中，水凝胶(例如，第一水凝胶、第二水凝胶、第三水凝胶和/或第四水凝胶)包含如本文所述的pcr试剂。在一些实施方式中，使用复制镀覆技术复制多个特征的成员(参见，例如mitra和church，nucleicacidsres.1999年12月15日；27(24)：e34，其通过引用其全文方式纳入本文)。在一些实施方式中，在将多个特征从阵列复制到第一水凝胶中之后，阵列的特征在第一水凝胶中被扩增(例如，克隆扩增)。在一些实施方式中，多个特征的成员被复制到第一水凝胶中，从而使第一水凝胶的多个特征的图案与该阵列的多个特征的图案相同或基本相似(例如，至少80％)。[0932]在一些实施方式中，阵列的一个或多个多个特征被分区。例如，每个分区可以包括与其它分区的多个特征不同的多个特征。例如，多个特征的成员以相似的方式被划分至阵列的多个特征的分区。在一些实施方式中，阵列的特征被复制到第一水凝胶中，使得收缩前的第一水凝胶特征的体积或直径类似于阵列特征的体积或直径。[0933]在一些实施方式中，包括复制的特征的水凝胶的体积减小，从而增加复制的特征的密度。在一些实施方式中，水凝胶内的复制的特征的密度随着每个后续水凝胶复制和收缩而进一步增加。例如，第二收缩的水凝胶的复制的特征的密度高于第一收缩的水凝胶的复制的特征的密度。类似地，第三收缩的水凝胶的复制的特征的密度高于第二收缩的水凝胶的复制的特征的密度。类似地，第四收缩的水凝胶的复制的特征的密度高于第三收缩的水凝胶的复制的特征的密度。在一些实施方式中，当水凝胶的体积减小时，水凝胶中的多个特征的成员的分区的体积减小。[0934]在本文所述方法的一些实施方式中，阵列包含收缩的凝胶特征(例如珠)。在一些实施方式中，本文所述的方法产生收缩的凝胶珠阵列。在一些实施方式中，阵列的收缩凝胶珠是收缩的水凝胶珠。[0935]“收缩的阵列”包括附接到或嵌入在体积已经减小(例如，直径或体积减小)的基材中的多个空间条码化特征。生物样品可以与收缩的阵列接触并进一步与能够使收缩的阵列再水合的溶液接触。在一些实施方式中，分析物转移和捕获由分子扩散驱动。通过向样品提供透化溶液或组织染色剂使收缩的阵列再水合的过程可以促进生物样品中存在的分析物(例如，转录物)朝向空间条码化特征，由此提高分析物的捕获效率。参见例如，j.vlassakis，a.e.herr.“聚合物水合状态对凝胶内免疫测定的作用(effectofpolymerhydrationstateonin‑gelimmunoassays).”anal.chem.2015，87(21)：11030‑8，通过引用其全文方式纳入本文。[0936]可以使用包含来自现有阵列的空间条形码的特征(例如，珠)生成收缩的阵列。例如，通过本文任何方法描述和制备的阵列(例如，水凝胶珠阵列)可以与能够使特征(例如，珠)脱水(例如，移除水)的试剂接触以产生收缩的阵列(例如，收缩的阵列)。使特征(例如，珠)脱水的方法是本领域已知的。可以使用任何合适的脱水方法(例如，移除水)。例如，以非限制性的方式，特征(例如珠)可以通过酮脱水，例如甲乙酮(mek)、异丙醇(ipa)、丙酮、1‑丁醇、甲醇(meoh)、二甲亚砜(dmso)、甘油、丙二醇、乙二醇、乙醇、(k)1，4‑二噁烷、碳酸亚丙酯、糠醇、n，n‑二甲基甲酰胺(dmf)、乙腈、醛，例如甲醛或戊二醛，或它们的任何组合。其它脱水剂包括各种盐，包括无机盐(参见，例如ahmed，e.m.，水凝胶：制备、表征和应用：综述(hydrogel：preparation，characterization，andapplications：areview)，journalofadvancedresearch，6(2)105‑121(2015)，其通过引用其全文方式纳入本文)。[0937]在一些实施方式中，脱水特征(例如，珠)可以产生收缩的阵列(例如，收缩珠阵列或收缩水凝胶阵列)，其中脱水特征(例如，珠)的平均直径可以小于脱水前的特征的平均直径。在一些实施方式中，脱水特征(例如，珠)的平均直径可以比脱水前特征的平均直径小至少两倍。在一些实施方式中，脱水特征(例如，珠)的平均直径可以比脱水前特征的平均直径小至少三倍。在一些实施方式中，脱水特征(例如，珠)的平均直径可以比脱水前特征(例如，珠)的平均直径小至少四倍或更多。[0938]在产生收缩阵列之后，生物样品(例如，组织样品)可以与收缩阵列(例如，收缩珠阵列)接触。可以通过任何合适的方法(例如，通过移液)向生物样品和收缩的阵列提供再水合溶液。再水合溶液可以包含再水合(例如，水或缓冲液)收缩阵列的特征(例如，珠)的试剂。在一些实施方式中，再水合溶液可施用于整个生物样品。在一些实施方式中，可以选择性地施加再水合溶液(例如，施加到感兴趣的区域)。在一些实施方式中，从再水合溶液吸收水可以增加收缩阵列中至少一个特征(例如，珠)的直径。在一些实施方式中，再水合溶液可以将至少一个特征(例如，珠)的直径增加至少两倍。在一些实施方式中，再水合溶液可以将至少一个特征(例如，珠)的直径增加至少三倍。在一些实施方式中，再水合溶液可以将至少一个特征(例如，珠)的直径增加至少四倍。在一些实施方式中，再水合溶液可以将至少一个特征(例如，珠)的直径增加至少五倍或更多。[0939]在一些实施方式中，再水合溶液可包含透化试剂。可以使用本领域已知的或本文中以其它方式描述的透化试剂和技术来透化生物样品。来自不同来源(例如，脑、肝、卵巢、肾、乳房、结肠等)的生物样品可能需要不同的透化处理。例如，透化生物样品(例如，使用蛋白酶)可以促进分析物迁移到基材表面(例如，空间条码化特征)。在一些实施方式中，透化试剂可以是去污剂(例如皂苷、tritonx‑100tm、tween‑20tm)。在一些实施方式中，有机溶剂(例如，甲醇、丙酮)可透化生物样品的细胞。在一些实施方式中，酶(例如，胰蛋白酶)可以透化生物样品。在另一个实施方式中，酶(例如，胶原酶)可以透化生物样品。[0940]在一些实施方式中，该溶液可以使生物样品透化并使收缩阵列(例如，收缩水凝胶)的特征(例如，珠)再水合。在一些实施方式中，再水合溶液可以染色生物样品并且再水合收缩阵列的特征(例如，珠)。[0941]在一些实施方式中，再水合溶液(例如，透化或染色溶液)可以扩散通过生物样品。在一些实施方式中，再水合溶液可以减少分析物从基材扩散开。在一些实施方式中，当扩散通过生物样品时，再水合溶液可以将分析物迁移到基材表面并提高分析物捕获的效率。[0942](viii)微毛细管阵列[0943]“微毛细管阵列”是由微毛细管划分的一系列阵列特征。“微毛细管通道”是由微毛细管建立的个体分区。例如，微毛细管通道可以与其它微毛细管通道流体隔离，从而使阵列中一个微毛细管通道中的流体或其它内容物与阵列中相邻微毛细管通道中的流体或其它内容物分离。微毛细管通道的密度和顺序可以是任何合适的离散位点的密度或顺序。[0944]在一些实施方式中，处理微毛细管阵列以产生有助于加载的条件。一个例子是使用电晕棒(bd‑20ac，电子技术产品公司(electrotechnicproducts))以产生亲水表面。在一些实施方式中，特征(例如，附有捕获探针的珠)被加载到微毛细管阵列上，从而使特征在阵列内的准确位置是已知的。例如，可以将包含空间条形码的捕获探针置于微毛细管通道中，以便空间条形码能够识别出条码化核酸分子的来源位置。[0945]在一些实施方式中，当使用随机分布来分布特征时，可以进行经验测试以生成有助于每个微毛细管的单个特征的加载/分布条件。在一些实施方式中，可能需要实现每个微毛细管通道仅促进单个特征(例如，珠)的分布条件。在一些实施方式中，可能需要通过使特征流过微毛细管通道来实现促进每个微毛细管通道多于一个特征(例如，珠)的分布条件。[0946]在一些实施方式中，将微毛细管阵列放置在与样品接触的位置(例如，在顶部或下方)，使得包含特征的微毛细管(例如，可以包括捕获探针的珠)与生物样品接触。在一些实施方式中，将生物样品放置在微毛细管阵列的暴露侧上并且施加机械加压，将生物样品移动到微毛细管通道中以创建包含生物样品的流体隔离反应室。[0947]在一些实施方式中，通过将微毛细管阵列接触生物样品来划分生物样品，从而创建包括珠和生物样品的部分的微毛细管通道。在一些实施方式中，包含在微毛细管通道中的生物样品的部分是一个或多个细胞。在一些实施方式中，在一个或多个细胞被添加至微毛细管阵列之后，通过流动将特征引入微毛细管阵列。[0948]在一些实施方式中，将试剂添加到微毛细管阵列。试剂可以包括用于进行核酸扩增的酶试剂或试剂混合物。在一些实施方式中，试剂包括逆转录酶、连接酶、一种或多种核苷酸或其任何组合。在将试剂添加到微毛细管通道之后，例如通过使用硅油、矿物油、无孔材料或盖体，可以密封一个或多个微毛细管通道。[0949]在一些实施方式中，在孵育一定时间和一定温度或温度范围后(例如，在杂交或扩增反应后)，从每个微毛细管通道移出试剂溶液。试剂溶液可以单独处理用于测序，也可以混合用于测序分析。[0950](ix)水凝胶/孔阵列[0951]在一些实施方式中是使用孔(例如，纳米孔或微孔阵列)产生图案化水凝胶阵列的方法。在一些实施方式中，孔是三维结构。在一些实施方式中，孔的俯视图是任何合适的二维形状，当沿着z轴延伸时，其产生能够包含一个或多个特征(例如，珠)和/或试剂的三维结构。可以形成阵列的孔的非限制性示例包括三棱柱、正方形或矩形棱柱、五棱柱、六棱柱、七棱柱、八角棱柱、n边棱柱或圆柱阵列(例如，“微毛细管阵列”)。在一些实施方式中，孔阵列的孔与相邻孔共享至少一个孔壁(或孔壁的部分，如果是微毛细管阵列)。在一些实施方式中，一个孔不与阵列的另一个孔共享任何壁或壁的部分。在一些实施方式中，孔阵列附接到基材，从而使孔阵列的孔彼此流体隔离。在一些实施方式中，孔阵列的一端是开放的(例如，暴露的)，其中开放端可用于将特征或试剂分配到孔中。[0952]在一些实施方式中，该方法包括向孔阵列提供收缩的(例如，脱水的)水凝胶特征(例如，珠)。水凝胶特征可以通过本文所述的多种方法中的任一种脱水(例如，移除水)。可以提供本文他处描述的特征，从而使特征的数量小于阵列的孔的数量，可以提供特征，从而使特征的数量等于阵列的孔的数量，或者可以提供特征，其数量超过阵列的孔的数量。在一些实施方式中，孔阵列被操纵，从而使一个或多个收缩的水凝胶特征从阵列的顶面向下移动到孔中。例如，可以将孔阵列放置在振动器上一段时间，以使特征分布到孔中。可导致收缩的水凝胶特征进入孔的操作的其它非限制性示例是：物理摇动、倾斜或滚动孔阵列，或其组合；使用鼓风将特征吹入孔中，使用磁体拉下包含磁性颗粒的水凝胶特征，使用微流体系统将特征分布到孔中，使用打印机将特征沉积到孔中，或任何其它方法将特征分布到孔中。在一些实施方式中，一旦孔包含特征，则该孔就不能接受或保留另一特征。在其它实施方式中，孔可以包含多于一个特征。[0953]在一些实施方式中，该方法包括使收缩的水凝胶特征再水合(例如，加水)，其中收缩的水凝胶特征位于孔中。使收缩的水凝胶特征再水合可以通过本文所述的任何方法来实现。使孔中收缩的水凝胶特征再水合会导致收缩的水凝胶特征扩展。在一些实施方式中，收缩的水凝胶特征扩展以填充孔。在一些实施方式中，收缩的水凝胶特征在z方向上扩展，从而使该特征从孔的未封闭(即开口)端扩展出来。再水合特征的暴露区域可以产生图案化的水凝胶阵列(例如，孔阵列)。孔内包含的再水合特征可以是稳定的。在一些实施方式中，再水合特征(例如，再水合的收缩的水凝胶特征)固定在孔内，从而常规的阵列使用不会将再水合特征与孔分离。根据本文所述的方法，图案化的水凝胶阵列可用于分析物捕获。[0954](x)珠拴系[0955]“珠拴系(beadtethering)”可以指珠的排列，其中该排列可以或可以不形成阵列。拴系的珠可以与样品接触并根据本文所述的方法进行处理。此外，将生物样品与单个珠或以各种排列拴系在一起的珠接触可以允许更精确的分析物空间检测，例如感兴趣的区域。将珠拴系在一起的方法是本领域已知的。将珠拴系在一起的一些合适的非限制性方法可以是例如化学接头、邻近连接或本文所述的任何其它方法。在一些实施方式中，珠可以独立于基材而被拴系在一起。在一些实施方式中，珠可以以各种排列拴系在现有基材上。在一些实施方式中，基材(例如，水凝胶)可以围绕现有的拴系的珠形成。在一些实施方式中，珠或珠排列可以接触生物样品的部分。在一些实施方式中，珠或珠排列可以接触感兴趣的区域。在一些实施方式中，珠或珠排列可以接触整个生物样品。在一些实施方式中，珠或珠排列与生物样品上的随机位置接触。在一些实施方式中，按生物样品上的特定图案接触珠。[0956]珠可以以各种排列方式拴系在一起。在一些实施方式中，单个(例如，一个)珠可以与生物样品接触。在一些实施方式中，两个或更多个珠可以以各种排列被拴系(例如，彼此连接)。例如，以非限制性的方式，珠可以被拴系在一起以形成簇、行或布置在网格(例如，网)上。在一些实施方式中，至少三个珠可以二维(2d)阵列(例如，簇)拴系在一起。在一些实施方式中，至少两个珠可以一维(1d)阵列(例如，一行)拴系在一起。在这样的实施例中，珠以珠可以彼此直接接触的方式排列。在一些实施方式中，至少两个珠可以串状排列(stringarrangement)栓系在一起。在这样的实施例中，珠以珠可以彼此间接接触的方式排列(例如珠通过接头连接)。在一些实施方式中，至少两个珠可以网状排列(mesharrangement)(例如，网)栓系在一起。在一些实施方式中，以2d阵列、1d阵列栓系在一起的珠，串状排列上的珠，和网状排列上的珠可以在生物样品上以彼此的任何组合使用。[0957]在一些实施方式中，至少约2至约10个珠可以以各种排列栓系在一起。在一些实施方式中，至少约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个或更多个珠可以拴系在一起。在一些实施方式中，约10到约100个珠可以以各种排列被拴系在一起。在一些实施方式中，约10个、约20个、约30个、约40个、约50个、约60个、约70个、约80个、约90个或更多个珠可以以各种排列系在一起。在一些实施方式中，约100到约1,000个珠可以以各种排列被拴系在一起。在一些实施方式中，约100个、约200个、约300个、约400个、约500个、约600个、约700个、约800个，或约900个或更多个珠可以以各种排列系在一起。在一些实施方式中，约1000到约10000个珠可以以各种排列被拴系在一起。在一些实施方式中，约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000或更多个珠可被拴系在一起。[0958]在一些实施方式中，拴系的珠可具有包含空间条形码、功能域、独特分子标识符、裂解域和捕获域或其组合的捕获探针。在一些实施方式中，每个珠可以与独特的空间条形码相关联。在一些实施方式中，空间条形码在珠或珠排列接触生物样品之前是已知的。在一些实施方式中，空间条形码在珠或珠排列接触生物样品之前是未知的。阵列中每个珠(例如，空间条形码)的身份(identity)可以例如通过直接光学测序进行去卷积，如本文所讨论的。[0959](xi)在液体中打印阵列[0960]在一些实施方式中，阵列可以在液体中打印。归因于打印溶液的扩散，传统打印阵列的分辨率可能会受到限制。在高粘性液体中打印阵列可以通过防止打印溶液的扩散来提高分辨率。因此，本文公开了用于将具有条形码(例如，空间条形码)的捕获探针(例如核酸捕获探针)附接和/或引入基材(例如载玻片)的各种方法和材料，其中附接(例如，打印)在液体中进行。[0961]在一些方面，捕获探针打印在基材(例如，载玻片或珠)上。在一些方面，基材是载玻片。在一些方面，基材是96孔微量滴定板。在一些方面，本文提供的方法还可以施用于通常用于核酸分析的其它基材，包括但不限于珠、颗粒、膜、过滤器、试纸条、载玻片、板和微芯片。在一些方面，此类基材可由多种已知与核酸分析相容的材料组成，包括但不限于琼脂糖、苯乙烯、尼龙、玻璃和硅。[0962](1)第一溶液[0963]在一些实施方式中，本文提供了使用一种或多种液体溶液(例如，包括不同捕获探针的两种或更多种溶液)在基材上打印阵列的方法。在一些方面，使用一种或多种溶液在基材上打印阵列的方法可以提高打印阵列的分辨率。在一些方面，本文提供的方法包括将第一溶液(例如，大量溶液(bulksolution))分配到基材上。在一些方面，第一溶液(例如，大量溶液)相对于第二溶液(例如，包括待附接至基材的捕获探针的第二溶液)具有较低的雷诺数(reynoldsnumber)。雷诺数表示流体的密度和速度与其在给定长度的通道中的粘度之间的反比关系。粘性更大，密度更小，和/或移动速度更慢的流体将具有更低的雷诺数，并且更容易在没有湍流的情况下转向、停止、启动或反转。在一些实施方式中，第一溶液和第二溶液是不混溶的。[0964]在一些方面，第一(例如，大量)溶液是疏水的。在一些方面，在将第一(例如，大量)溶液分配到载玻片上之后，第一(例如，大量)溶液在载玻片上的离散空间区域中保留在载玻片上。在一些方面，第一(例如，大量)溶液由不使一个或多个探针变性和/或不抑制探针与基材结合的溶液制成。在一些实施方式中，大量溶液可包括水溶液、高粘度溶液或低核酸扩散性溶液。在一些方面，第一(例如，大量)溶液是凝胶。在一些方面，第一(例如，大量)溶液是水凝胶。在一些方面，第一(例如，大量)溶液包括天然聚合物，包括例如甘油、胶原蛋白、明胶、糖如淀粉、藻酸盐和琼脂糖，或其任何组合。在一些方面，第一(例如，大量)溶液包括合成聚合物。在一些方面，合成聚合物通过本领域已知的任何方法制备，包括例如化学聚合方法。在一些方面，凝胶或聚合物是疏水的。在一些方面，凝胶或聚合物是亲水的。在一些方面，凝胶或聚合物是水性的。在一些方面，凝胶或聚合物在室温下收缩。在一些方面，凝胶或聚合物在加热时收缩。在一些方面，聚合物是加热时收缩的膜。[0965]在一些方面，第一(例如，大量)溶液包括甘油。在一些方面，甘油以5‑100％的浓度存在于第一(例如，大量)溶液中。在一些方面，甘油以5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的浓度存在于溶液中。[0966]在一些方面，第一(例如，大量)溶液包括糖。在一些方面，糖是单糖、二糖、多糖或其组合。在一些方面，糖是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉纤维素或其组合。在某些方面，糖来源于复杂的化合物，例如糖蜜或来自糖精制的其它副产品。在一些方面，糖以5‑100％的浓度存在于第一(例如，大量)溶液中。在一些方面，糖以5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的浓度存在于溶液中。[0967]在一些方面，第一(例如，大量)溶液的粘度比第二溶液的粘度大约0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1.0倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍或10倍。[0968](2)第二溶液[0969]在一些实施方式中，使用两种或更多种溶液，包括使用第二溶液，在基材上打印阵列。在一些实施方式中，第二溶液可包括一个或多个捕获探针。在一些实施方式中，第二溶液以液滴的形式分配。一些实施方式包括多个第二溶液，其中所述多个中的每个成员包括一个或多个捕获探针，所述捕获探针包含该特定液滴独有的空间条形码。在一些实施方式中，第二溶液被分配到覆盖或部分覆盖有第一(例如，大量)溶液的基材上。在一些实施方式中，第一(例如，大量)溶液减少或防止一个或多个捕获探针从第二溶液扩散。在一些方面，当被打印到被覆或部分被覆有第一(例如，大量)溶液的基材上时，一个或多个捕获探针整体留存在第二溶液中。[0970]在一些方面，第二溶液包括一个或多个捕获探针(例如，本文公开的任何捕获探针)。在一些方面中，第二溶液包括一个空间条码化的捕获探针。在一些方面，第二溶液包括至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1,000、至少1,500、至少2,000、至少3,000、至少4,000或至少5,000个空间条码化捕获探针。在一些方面，第二溶液包括促进一个或多个捕获探针与基材结合的化合物。在一些方面，第二溶液不抑制一个或多个捕获探针结合基材和/或不使一个或多个捕获探针变性。在一些方面，第二溶液的粘性小于第一(例如，大量)溶液。在一些方面，第二溶液和第一(例如，大量)溶液完全或基本上不混溶(例如，它们不混合)。在一些方面，第二溶液是水性溶液。在一些方面，第二溶液是亲水溶液。[0971](3)分配[0972]在一些实施方式中，点印(spotprinting)特征的高密度图案可以包括在大量溶液的存在下以液滴的形式将寡核苷酸和/或特征分配到基材的表面上。在一些实施方式中，第二溶液液滴(例如，寡核苷酸和/或特征液滴)和第一(例如，大量)溶液基本上不彼此混合。在一些方面，包括在存在(例如，通过)第一(例如，大量)溶液的情况下将包括一个或多个空间条码化捕获探针的第二溶液分配到基材上的本文公开的打印方法导致第二溶液的点的大小(例如，在基材平面上的第二溶液的切面点大小)与第一(例如，大量)溶液不存在的情况下分配相同第二溶液至基材上所将获得的点的大小相比较小。在一些方面，第二溶液的点的大小(例如，在基材平面上的第二溶液的切面点大小)在于第一(例如，大量)溶液存在下将第二溶液打印到基材上之后不增加。在一些方面，在第一(例如，大量)溶液的存在下，在将第二溶液打印到基材上之后，第二溶液的点的面积不改变。在一些方面，在第一(例如，大量)溶液存在下，将第二溶液打印到基材上导致基材表面上的所需图案。例如，可以在第一溶液的存在下将多组第二溶液打印到基材上，从而使打印多组第二溶液的位置在基材上产生所需的图案。在一些实施方式中，打印到基材上的多组第二溶液的两个或更多个成员包括捕获探针的不同群，所述捕获探针附连至基材，从而产生捕获探针的阵列。[0973](4)密度[0974]在一些实施方式中，基材上的寡核苷酸和/或特征液滴的截面积小于通过在所述大量溶液不存在的情况下分配所述寡核苷酸和/或特征至基材表面上所将产生的寡核苷酸和/或特征液滴的对应截面积。在一些实施方式中，基材上的寡核苷酸和/或特征液滴的截面积比通过在所述大量溶液不存在的情况下分配所述寡核苷酸和/或特征液滴至基材表面上所将产生的寡核苷酸和/或特征液滴的对应截面积小约两倍。[0975]在一些方面，通过在第一溶液存在的情况下将第二溶液分配到基材表面上而产生的第二溶液在基材上的截面积小于在第一溶液不存在的情况下通过将第二溶液分配到基材表面上而产生的第二溶液的对应截面积。在一些方面，通过在第一溶液的存在下将第二溶液分配到基材的表面上而产生的基材上的第二溶液的截面积为比在第一溶液不存在的情况下将第二溶液分配至基材表面上所将产生的第二溶液的对应截面积小约2倍，约3倍，约4倍，或约5倍，约10倍，约20倍，约30倍，约40倍，约50倍，约60倍，约70倍，约80倍，约90倍，或约100倍。[0976](5)固化[0977]在将第二溶液(包括捕获探针)分配至基材上之后，可以使用任何合适的技术或条件来固化第一溶液、第二溶液和/或第二溶液形成的点。如本文所用，术语“固化”和相关术语可以指用能将溶液从液态转变为固态(例如，转化为基质)的试剂和/或条件处理溶液(例如，第一溶液、第二溶液或两者)，其中所述溶液在固化过程之后保持三维形状。固化技术和/或条件的合适示例包括紫外光(uv)辐射、红外线(ir)辐射、热辐射、微波辐射、可见光辐射、窄波长辐射、激光、自然光、湿度或其组合。固化源的合适示例包括例如紫外光、加热装置、辐射装置、微波装置、等离子体装置或它们的组合。[0978]在一些实施方式中，第一溶液和/或第二溶液被化学固化。在一些实施方式中，寡核苷酸和/或特征液滴被化学固化。在一些实施方式中，大量溶液被化学固化。在一些方面，在将第二溶液(包括捕获探针)分配到基材上之后由第二溶液形成的点被化学固化。在一些实施方式中，寡核苷酸和/或特征和大量溶液被附连至基材(例如，通过固化)，从而产生特征和大量溶液‑基质。在一些方面，基质(例如，第一和第二溶液基质)被化学固化。可以通过本领域已知的任何方式实现溶液的化学固化。例如，溶液可以包括一个或多个水凝胶亚单元，其可以经化学聚合(例如，交联)以形成三维(3d)水凝胶网络。在大量溶液的存在下，以液滴的形式分配到基材表面上的特征可以被聚合。在一些实施方式中，特征与大量溶液共聚以在水凝胶柔性阵列中产生凝胶特征，而在其它实施方式中，凝胶垫或特征被聚合并且大量溶液被移除，留下点或珠阵列。水凝胶亚基的非限制性实例包括丙烯酰胺、双丙烯酰胺、聚丙烯酰胺及其衍生物、聚(乙二醇)及其衍生物(例如peg‑丙烯酸酯(peg‑da)、peg‑rgd)、明胶‑甲基丙烯酰(gelma)、甲基丙烯酸化透明质酸(meha)、聚脂族聚氨酯、聚醚聚氨酯、聚酯聚氨酯、聚乙烯共聚物、聚酰胺、聚乙烯醇、聚丙二醇、聚四亚甲基氧、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚(丙烯酸羟乙酯)和聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖、琼脂糖、明胶、藻酸盐、蛋白质聚合物、甲基纤维素等，或它们的组合。有用于形成和/或交联水凝胶的其它材料和技术在本文中更详细地描述。[0979]在一些方面，第一溶液和/或第二溶液被光反应固化。在一些实施方式中，寡核苷酸和/或特征液滴被光反应固化。在一些实施方式中，大量溶液被光反应固化。在一些方面，在将包含捕获探针的第二溶液分配到基材上之后由第二溶液形成的点被光反应固化。在一些方面，基质(例如，第一和第二溶液基质)被光反应固化。光反应固化可以通过本领域已知的任何方式完成。[0980]在一些方面，本文公开的方法包括固化第一(例如，大量)和/或第二溶液。在一些方面，本文公开的方法包括在将第二溶液(例如，包括捕获探针的第二溶液)分配到基材上之后固化由第二溶液形成的点。在一些方面，本文公开的方法包括在将第一溶液和第二溶液分配到载玻片上之后固化它们。在一些实施方式中，固化第一和第二溶液产生第一和第二溶液基质。在一些方面，本文公开的方法包括固化第二溶液，然后从基材移除未固化的第一溶液。在一些方面，本文公开的方法包括固化基材上的第一和第二溶液，从而产生基质(例如，第一和第二溶液‑基质)。[0981](6)扩展基质[0982]在一些实施方式中，在第一(例如，大量)溶液存在的情况下将第二溶液液滴(例如，寡核苷酸和/或特征液体)分配至基材表面上之前，第一(例如，大量)溶液被固化以形成大量溶液‑基质，然后使该大量溶液基质沿一个或多个轴(例如，基质或基材表面的一个或多个轴)可逆地扩展。在一些实施方式中，可以在扩展的第一(例如，大量)溶液基质存在的情况下分配第二溶液液滴。[0983]在一些实施方式中，将多个第二溶液液滴(例如，包括具有不同空间条形码的不同捕获探针)分配到被覆有第一(例如，大量)溶液的基材上，其中第一溶液最初沿一个或多个轴拉伸。在一些实施方式中，拉伸的第一溶液被固化。在一些实施方式中，拉伸的第一溶液被部分固化。在一些实施方式中，拉伸的第一溶液未固化并且分配在其自身被拉伸的表面上。在一些方面，第二溶液液滴的体积(例如，截面积)在被分配到最初被拉伸的第一溶液中之后减小。在一些方面，本文公开了制备阵列的方法，包括(i)提供凝胶或聚合物(例如，固化或部分固化的溶液)到基材上，(2)拉伸凝胶或聚合物，(3)在凝胶或聚合物拉伸时将第二溶液的液滴分配到基材上，和(4)允许凝胶或聚合物松弛，从而减小基材上第二溶液液滴的总面积(例如，截面积)。在一些方面，拉伸步骤包括沿着与基材表面共面的一个或多个轴可逆地扩展凝胶或聚合物。[0984](7)移除溶液[0985]在一些实施方式中，可在寡核苷酸和/或特征液滴附接至基材之后从基材移除第一(例如，大量)溶液。在一些方面，在将包含一个或多个捕获探针的第二溶液(例如，包含不同捕获探针的多个第二溶液)分配到基材上之后，移除第一(例如，大量)溶液。移除第一(例如，大量)溶液的方法是本领域已知的。在一些方面，第一(例如，大量)溶液的移除导致第一溶液的完全移除，仅留下包含一个或多个捕获探针的第二溶液(例如，包含不同捕获探针的多组第二溶液)在基质上。在一些方面，移除第一(例如，大量)溶液不会改变与基材接触的第二溶液(例如，包括不同捕获探针的多组第二溶液)的表面积。在一些方面，移除第一(例如，大量)溶液不会改变与基材接触的第二溶液(例如，包括不同捕获探针的多组第二溶液)的液滴的形状。在一些方面，在移除第一(例如，大量)溶液之前，包含一个或多个探针(例如，包含不同捕获探针的多组第二溶液)的第二溶液通过本文公开的方法固化，但第一(例如，大量)溶液不被固化。例如，第一和第二溶液可以经历试剂和/或条件作用，在所述试剂和/或条件下，第二溶液(例如，包括不同捕获探针的多组第二溶液)被固化，而第一(例如，大量)溶液不被固化。在一些实施方式中，第二溶液(例如，包含不同捕获探针的多组第二溶液)包括一种或多种可以聚合(例如，交联)以形成三维(3d)水凝胶网络的水凝胶亚单元，而第一(例如，大量)溶液不包括这样的一个或多个水凝胶亚单元。在使第一和第二溶液经历固化条件时，仅第二溶液将被固化，从而允许移除第一溶液。[0986]在一些实施方式中，在寡核苷酸和/或特征附接到基材之后，不从基材移除第一(例如，大量)溶液。[0987](8)收缩液滴/特征阵列[0988]在一些实施方式中，包含第二溶液(例如，寡核苷酸和/或特征液滴)的扩展的第一(例如，大量)溶液‑基质可以沿着(例如，基质的或基材表面的)一个或多个轴收缩，从而使第二溶液液滴(例如寡核苷酸和/或特征液滴)的截面积小于在包含第二溶液液滴(例如寡核苷酸和/或特征液滴)的第一(例如，大量)溶液‑基质不沿所述一个或多个轴收缩的情况下所将产生的第二溶液液滴(例如，寡核苷酸和/或特征液滴)的对应截面积。在一些实施方式中，使基质(例如，第一和第二溶液基质)收缩能产生收缩的基质(例如，收缩的第一和第二基质)，其中，与非收缩基质中的第二溶液液滴的体积相比，该基质的第二溶液液滴(例如，多个第二溶液液滴)的体积减小。在一些方面，使两种或更多第二溶液(例如，第二溶液的液滴)收缩能导致两种或更多第二溶液的更高密度。在一些实施方式中，第二溶液液滴(例如，寡核苷酸和/或特征液滴)和第一(例如，大量)溶液‑基质可以通过本文公开的任何方法收缩。在一些实施方式中，收缩可以包括移除水。在一些方面，阵列的分辨率在液滴收缩后增加。在一些方面，使第二溶液液滴收缩导致液滴的截面积减小(例如，其上打印或分配第二溶液液滴的基材平面中的截面积)。在一些方面中，在使液滴收缩后，基材上的探针浓度会增加，从而提高灵敏度。[0989]使空间阵列与生物样品接触，其中生物样品可以是本文所述的任何样品(例如，ffpe组织切片)。一旦将空间阵列被置于生物样品上，就会发生细胞和/或核透化反应，从而生物分析物(例如，dna、rna、蛋白质、代谢物、小分子、脂质等)被释放并捕获到空间阵列上，保留其空间信息。移出空间阵列，并确定其中的分子信息(例如，通过进行用于下一代测序的文库构建)。测序之后可以是表达值(例如，分析物的基因表达)与特征的相关性。[0990]在一些方面，第二溶液液滴的截面积在收缩时相较于打印或分配到基材上的第二溶液液滴的截面积减少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。在一些方面，第二溶液液滴的截面积相较于打印或分配到基材上的第二溶液液滴的截面积减小约1.0倍、约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍或约5倍。[0991]在一些方面，本文公开了制备阵列的方法，其包括：将多个第二溶液液滴(例如，包括具有不同空间条形码的不同捕获探针)分配到被覆有第一(例如，大量)溶液的基材上，固化第一溶液和第二溶液，以产生基质(例如，第一和第二溶液基质)，其中基质中的多个第二溶液液滴的体积和形状与多个第二溶液液滴分配时基本相同，和，使基质收缩，由此减少多个第二溶液液滴的总体积(例如，截面积)。在一些方面，可以使用本文所述的各种收缩剂或条件中的任一种来实现收缩。在一些方面，收缩可通过使基质脱水来完成。[0992]在一些方面，在分配第二溶液之后，第二溶液的面积沿着与基材表面共面的一个或多个轴收缩，从而使基材(例如，载玻片)上的第二溶液的截面积小于在包含第二溶液的第一溶液基质不沿基材表面的一个或多个轴收缩的情况下所将产生的第二溶液的对应截面积。[0993]关于取向，基材上任意两个正交方向的收缩率不必相等。然而，在一些方面，第二溶液液滴的收缩在收缩上是基本均一的。在一些方面，第二溶液液滴在每个方向上以基本相同的量收缩，而不管基材平面上的位置如何。[0994]在一些方面，在用一个或多个捕获探针制备基材(例如，包括捕获探针的空间阵列)之后，本文公开了用于对生物样品中的分析物(例如，多种分析物)进行空间概况分析的方法，其包括(a)产生空间阵列，其包括结合到基材的多个捕获探针；其中(i)基材的至少部分被覆有第一溶液；和(ii)在第一溶液的存在下，将液滴形式的多组第二溶液分配到基材的表面上，其中第一溶液和多组第二溶液基本上不彼此混合，其中多组第二溶液的至少两个成员包括具有不同空间条形码的一个或多个不同捕获探针，并且其中多组第二溶液的至少两个成员的一个或多个捕获探针中的至少一个结合至基材；(b)使生物样品与空间阵列接触，从而使生物样品中存在的分析物被一个或多个捕获探针捕获；和(c)确定生物样品中捕获的分析物的空间概况。[0995](xii)阵列/特征保留[0996]在一些实施方式中，可以在具有特征或特征排列的分析完成后保存生物样品，以用于分析物的附加多轮空间检测。在一些实施方式中，生物样品、特征、阵列或其任何组合可在空间概况分析之后保存。在一些实施方式中，可以保护生物样品、特征、阵列或其组合免于脱水(例如，干燥、变干)。在一些实施方式中，可以保护生物样品、特征、阵列或其组合免于蒸发。保存和/或保护生物样品、特征或阵列的方法是本领域已知的。例如，以非限制性的方式，生物样品、特征、阵列或其组合可以被可逆密封剂覆盖。可以使用任何合适的可逆密封剂。可逆密封的方法是本领域已知的(参见例如wo2019/104337，其通过引用方式纳入本文)。以非限制性方式，合适的可逆密封剂可包括无孔材料、膜、盖或油(例如，硅油、矿物油)。在进一步的非限制性示例中，生物样品、特征、阵列或它们的组合可以保存在环境室中(例如，气密密封的)并且在之后移出用于之后附加轮次的空间分析。[0997](e)分析物捕获[0998]在本节中，描述了捕获分析物的方法和系统的一般方面。单独的方法步骤和系统特征可以组合存在于许多不同的实施方式中；本文中描述的特定组合不以任何方式限制步骤或特征的其它组合。[0999](i)捕获条件[1000]通常，当生物样品与包含捕获探针的基材(例如，具有嵌入、点样、印刷在基材上的捕获探针的基材或具有包含捕获探针的特征(例如，珠、孔)的基材)接触时，可捕获分析物。[1001]如本文所用，使生物样品“接触”包含特征的基材指任何接触(例如，直接或间接)，使得捕获探针可以与来自生物样品的分析物相互作用(例如，捕获)。例如，基材可以靠近或邻近生物样品而无直接物理接触，但能够从生物样品中捕获分析物。在一些实施方式中，生物样品与基材直接物理接触。在一些实施方式中，生物样品与基材间接物理接触。例如，液体层可以存在于生物样品和基材之间。在一些实施方式中，分析物扩散通过液体层。在一些实施方式中，捕获探针扩散通过液体层。在一些实施方式中，试剂可以通过生物样品和基材之间的液体层递送。在一些实施方式中，间接物理接触可以包括位于生物样品和包含捕获探针的第一基材之间的第二基材(例如，水凝胶、薄膜、多孔膜)。在一些实施方式中，试剂可通过第二基材递送至生物样品。[1002]在一些实施方式中，细胞固定剂可用于使生物样品与基材接触(例如，通过在分析物捕获之前将非聚集或解聚的样品固定在空间条码化阵列上)。如本文所用，“细胞固定剂”可指附接于基材的试剂(例如，抗体)，其可结合细胞表面标志物。细胞表面标志物的非限制性示例包括：cd45、cd3、cd4、cd8、cd56、cd19、cd20、cd11c、cd14、cd33、cd66b、cd34、cd41、cd61、cd235a、cd146和上皮细胞粘附分子(epcam)。细胞固定剂可包括能够结合(例如，固定)细胞或组织(在基材上时)的任何探针或组分。附接在基材表面的细胞固定剂可用于结合具有细胞表面标志物的细胞。细胞表面标志物可以是遍在的细胞表面标志物，其中细胞固定剂的目的是捕获样品中高百分比的细胞。细胞表面标志物可以是特异性的或更罕见表达的细胞表面标志物，其中细胞固定剂的目的是捕获表达靶细胞表面标志物的特定细胞群。因此，细胞固定剂可用于从不具有相同细胞表面标志物的细胞群中选择性地捕获表达靶细胞表面标志物的细胞。[1003]基材(或基材上的特征)上的捕获探针可通过捕获域与释放的分析物相互作用，如他处所述，以捕获分析物。在一些实施方式中，进行某些步骤以增强与阵列的捕获探针的分析物的转移或捕获。此类修改的实例包括但不限于调整用于使基材与生物样品接触的条件(例如，时间、温度、取向、ph水平、生物样品的预处理等)、使用力来传输分析物(例如，电泳、离心、机械等)，进行扩增反应以增加生物分析物的量(例如，pcr扩增、原位扩增、克隆扩增)，和/或使用标记的探针检测扩增子和条形码。[1004]在一些实施方式中，使阵列适应于促进生物分析物迁移。使阵列适应于促进生物分析物迁移的非限制性示例包括：具有包含纳米孔、纳米孔和/或微流体通道的基材的阵列；具有多孔膜的阵列；和具有由水凝胶制成的基材的阵列。在一些情况下，阵列基材是液体可透化的。在一些情况下，阵列是(例如，通过制造)包括纳米孔或图案的盖玻片或载玻片。在基材包括纳米洞、纳米孔和/或微流体通道的一些情况下，这些结构可以促进生物样品暴露于试剂(例如，用于透化、生物分析物捕获和/或核酸延伸反应的试剂)，从而与缺乏此类特性的基材相比，提高了分析物捕获效率。[1005]在一些实施方式中，通过用透化试剂处理生物样品来促进分析物捕获。如果生物样品透化不够，则在基材上捕获的分析物的量可能过低，无法进行充分的分析。相反，如果生物样品透化性太强，则分析物可从其在生物样品中的来源扩散出去，从而失去生物样品中分析物的相对空间关系。因此，在充分透化生物样品以获得良好信号强度同时仍保持生物样品中分析物分布的空间分辨率之间的平衡是理想的。用于制备生物样品以促进分析物捕获的方法是本领域已知的，并且可根据生物样品和生物样品如何制备(例如，新鲜冷冻、ffpe等)来改良。[1006](ii)基材保持器(substrateholder)[1007]本文描述了其中具有位于基材上的捕获探针的阵列和位于不同基材上的生物样品接触的方法，从而使阵列与生物样品接触(例如，将基材夹在一起)。在一些实施方式中，阵列和生物样品可以接触(例如，夹在中间)，而无需基材保持器的帮助。在一些实施方式中，阵列和生物样品基材可以放置在设计用于对准生物样品和阵列的基材保持器(例如，阵列对准装置)中。例如，基材保持器可以具有用于两个基材的位置保持器(placeholder)。在一些实施方式中，包括捕获探针的阵列可以定位在基材保持器的一侧上(例如，在第一基材位置保持器中)。在一些实施方式中，生物样品可以放置在第二位置保持器中的基材保持器的相邻侧上。在一些实施方式中，铰接器可以位于两个基材位置保持器之间，其允许基材保持器闭合，例如，在两个基材位置保持器之间形成夹层。在一些实施方式中，当基材保持器关闭时，生物样品和具有捕获探针的阵列在足以允许生物样品中存在的分析物与阵列的捕获探针相互作用的条件下彼此接触。例如，干燥的透化试剂可以放置在生物样品上且再水合。透化溶液可以流经基材保持器以透化生物样品并允许生物样品中的分析物与捕获探针相互作用。此外，基材或透化溶液的温度可用于启动或控制透化速率。例如，可以将包括阵列的基材、包括生物样品的基材或这两种基材保持在低温下以减慢扩散和透化效率。一旦被夹在中间，在一些实施方式中，可以加热基材以起始透化和/或增加扩散效率。从透化组织释放的转录物可扩散到阵列并被捕获探针捕获。可以打开夹层，在阵列上进行cdna合成。[1008]本文所述的多种组合中的任一种，其中包括具有捕获探针的阵列和在两个不同基材上的生物样品的夹心体可以放置在设计用于对齐生物样品和阵列的基材保持器中。例如，基材保持器可以具有用于两个基材的位置保持器(placeholder)。在一些实施方式中，包括捕获探针的阵列可以定位在基材保持器的一侧上(例如，在第一基材位置保持器中)。在一些实施方式中，生物样品可以放置在第二位置保持器中的基材保持器的相邻侧上。在一些实施方式中，铰接器可以位于两个基材位置保持器之间，其允许基材保持器闭合，例如，在两个基材位置保持器之间形成夹层。在一些实施方式中，当基材保持器关闭时，可使生物样品和具有捕获探针的阵列在足以允许生物样品中存在的分析物与阵列的捕获探针相互作用的条件下彼此接触，用于通过本文所述的任何方法进行空间分析。例如，干燥的透化试剂可以放置在生物样品上并再水合。此外，透化溶液可以流经基材保持器以透化生物样品并允许生物样品中的分析物与捕获探针相互作用。[1009]在一些实施方式中，本文所述的柔性阵列可放置在基材保持器中，并与生物样品夹在中间。在一些实施方式中，柔性阵列可包括空间条码化交联特征。在一些实施方式中，柔性阵列可以在被放置到基材保持器中之前预浸在透化试剂中。在一些实施方式中，柔性阵列可以在被放置到基材保持器中之后浸渍透化试剂。在一些实施方式中，包括一个位置保持器中的生物样品和柔性阵列的基材保持器可以闭合(例如，形成夹心体)，从而透化试剂允许生物样品中存在的分析物与柔性阵列的捕获探针(例如，空间条码化特征上的捕获探针)相互作用。[1010]在一些实施方式中，可使基材保持器升温或降温以调节透化和/或扩散效率。[1011](iii)被动捕获方法[1012]在一些实施方式中，分析物可从样品迁移到基材。促进迁移的方法可以是被动的(例如，扩散)和/或主动的(例如，核酸的电泳迁移)。被动迁移的非限制性示例可包括由脱水物体的再水合产生的简单扩散和渗透压。[1013]通过扩散进行的被动迁移利用浓度梯度。扩散是未经约束的物体向平衡方向运动。因此，当存在物体浓度高的区域和物体浓度低的区域时，物体(例如，捕获探针、分析物等)移动到较低浓度的区域。在一些实施方式中，未经约束的分析物沿着浓度梯度向下移动。[1014]在一些实施方式中，可将不同试剂添加到生物样品中，使得生物样品被再水化，同时改进分析物的捕获。在一些实施方式中，生物样品可以与如本文所述的收缩的阵列接触。在一些实施方式中，生物样品和/或收缩的阵列可以用透化试剂再水合。在一些实施方式中，生物样品和/或收缩的阵列可以用染色溶液(例如，苏木精和曙红染色剂)再水合。[1015](iv)防扩散介质/盖体[1016]为了通过鼓励分析物向空间条码化的捕获探针扩散来提高效率，可以使用抗扩散介质。通常，生物分析物的分子扩散发生在所有方向，包括朝向捕获探针(即朝向空间条码化阵列)和远离捕获探针(即进入大量溶液)。朝向空间条码化阵列的扩散增加能减少远离空间条码化阵列的分析物扩散并增加了捕获探针的捕获效率。[1017]在一些实施方式中，将生物样品放置在空间条码化基材的顶部，并且将抗扩散介质放置在生物样品的顶部。例如，可以将抗扩散介质放置在与生物样品接触的阵列上。在一些实施方式中，防扩散介质和空间条码化阵列是相同的组件。例如，抗扩散介质可以在防扩散介质(例如，盖玻片、载玻片、水凝胶或膜)之内或之上包含空间条码化捕获探针。在一些实施方式中，样品被放置在基材上，并且防扩散介质被放置在生物样品的顶部。此外，空间条码化捕获探针阵列可以放置在靠近防扩散介质的位置。例如，防扩散介质可以夹在空间条码化阵列和基材上的样品之间。在一些实施方式中，防扩散介质被布置或点在样品上。在其它实施方式中，防扩散介质放置在靠近样品的位置。[1018]一般而言，抗扩散介质可以是任何已知的限制生物分析物扩散率的材料。例如，防扩散介质可以是固态盖体(例如，盖玻片或载玻片)。在一些实施方式中，抗扩散介质可由玻璃、硅、纸、水凝胶、聚合物整材或其他材料制成。在一些实施方式中，玻璃侧可以是丙烯酸化的载玻片。在一些实施方式中，防扩散介质是多孔膜。在一些实施方式中，材料可以是天然多孔的。在一些实施方式中，该材料可具有蚀刻到固体材料中的孔或洞。在一些实施方式中，可以控制孔体积以最小化目标分析物的损失。在一些实施方式中，可以控制膜化学以最小化目标分析物的损失。在一些实施方式中，防扩散介质(例如，水凝胶)共价连接到基材(例如，载玻片)。在一些实施方式中，防扩散介质可以是任何已知的限制多聚(a)转录物扩散的材料。在一些实施方式中，防扩散介质可以是任何已知的限制蛋白质扩散的材料。在一些实施方式中，防扩散介质可以是任何已知的限制大分子成分的扩散率的材料。[1019]在一些实施方式中，抗扩散介质包括一种或多种抗扩散介质。例如，可以在将介质与生物样品接触之前以多种方式组合一种或多种防扩散介质，包括但不限于被覆、分层或点样。作为另一个示例，可以将水凝胶放置在生物样品上，然后将盖体(例如，载玻片)放置在水凝胶的顶部。[1020]在一些实施方式中，施加力(例如，流体动压、超声振动、溶质对比度、微波辐射、血管循环或其他电、机械、磁力、离心力和/或热力)以控制扩散并增强分析物捕获。在一些实施方式中，利用一种或多种力和一种或多种防扩散介质来控制扩散和增强捕获。例如，可以同时使用离心力和载玻片。力和防扩散介质的多种组合中的任何一种都可用于控制或减轻扩散并增强分析物捕获。[1021]在一些实施方式中，抗扩散介质与空间条码化阵列和样品一起浸没在大量溶液(bulksolution)中。在一些实施方式中，大量溶液包括透化试剂。在一些实施方式中，抗扩散介质包括至少一种透化试剂。在一些实施方式中，在抗扩散介质与样品接触之前，将抗扩散介质(即水凝胶)浸泡在透化试剂中。在一些实施方式中，抗扩散介质可包括含有透化缓冲液或试剂的孔(例如，微孔、纳米孔或皮孔)。在一些实施方式中，抗扩散介质可包括透化试剂。在一些实施方式中，当抗扩散介质应用于生物样品时，抗扩散介质可包含干燥试剂或单体以递送透化试剂。在一些实施方式中，在将所述组件浸入大量溶液中之前，将所述抗扩散介质添加到所述空间条码化阵列和样品组件中。在一些实施方式中，在样品暴露于透化试剂之后，将抗扩散介质添加到空间条码化阵列和样品组件中。在一些实施方式中，透化试剂流过抗扩散介质上的微流体室或通道。在一些实施方式中，流控制样品对透化试剂的可及性。在一些实施方式中，目标分析物扩散出样品并朝向大量溶液，并且包埋到空间条码化的捕获探针包埋的抗扩散介质中。在一些实施方式中，游离溶液被夹在生物样品和防扩散介质之间。[1022]图13是抗扩散介质的示例性使用的图示。防扩散介质1302可以与样品1303接触。在图13中，载玻片1304被填充有空间条码化的捕获探针1306，并且样品1303，1305与阵列1304，1306接触。可将防扩散介质1302施用于样品1303，其中样品1303夹在防扩散介质1302和捕获探针被覆的载玻片1304之间。当将透化溶液1301施加到样品时，使用抗扩散介质/盖1302通过减少分析物向外扩散到介质中来引导分析物1305向捕获探针1306的迁移。或者，盖可以包含透化试剂。[1023](v)主动捕获方法[1024]在本文所述的一些方法中，生物样品(例如，细胞或组织切片中)中的分析物可以被(例如，被动地或主动地)运输到捕获探针(例如，固定到基材(例如，基材或珠)的捕获探针)。[1025]例如，可以使用电场(例如，使用电泳)、压力、流体流动、重力、温度和/或磁场将分析物输送到捕获探针(例如，固定的捕获探针)。例如，可以使用压力梯度、化学浓度梯度、温度梯度和/或ph梯度来使分析物通过例如凝胶(例如水凝胶)、流体或透化的细胞运输至捕获探针(例如固定的捕获探针)。例如，分析物可以通过凝胶(例如，水凝胶)、流体或透化的细胞运输到捕获探针(例如，固定的捕获探针)。[1026]在一些实例中，电泳场可施加于分析物以促进分析物向捕获探针迁移。在一些示例中，使含有分析物的样品接触具有固定在基材上的捕获探针的基材(例如载玻片、盖玻片或珠)，并且施加电流以促进带电分析物朝向基材上的捕获探针的定向迁移。电泳组件(例如，电泳室)可用于施加电流，其中生物样品与阴极和捕获探针(例如，固定在基材上的捕获探针)接触，并且其中捕获探针与生物样品和阳极接触。[1027]在一些实施方式中，利用主动捕获方法的方法可以采用导电基材(例如，本文所述的任何导电基材)。在一些实施方式中，导电基材包括纸、水凝胶膜或具有导电覆层的载玻片。在一些实施方式中，导电基材(例如，本文所述的任何导电基材)包括一个或多个捕获探针。[1028]在一些实施方式中，可以进行分析物的电泳转移，同时保留分析物在生物样品中的相对空间位置，同时使分析物远离其在生物样品中的位置的被动扩散最小化。在一些实施方式中，被捕获探针(例如，基材上的捕获探针)捕获的分析物保留了该分析物存在于其来源的生物样品中的空间位置(例如，相较于分析物不主动迁移至捕获探针的情况，当分析物通过电泳转移主动迁移到捕获探针时，被基材上的捕获探针捕获的分析物的空间位置，可以更准确或更能代表分析物在该生物样品中的空间位置)。在一些实施方式中，电泳传输和结合过程由达姆科勒数(number，da)描述，它是反应和质量传输速率的比率。结合的分析物的分数和生物样品的形状将取决于da中的参数。参数包括电迁移速度ue(取决于电泳迁移率μe和电场强度e)，捕获探针(例如，条码化的寡核苷酸)的密度p0，探针和分析物的结合速率(例如，条码化寡核苷酸)kon，和捕获区域的厚度l。[1029][1030]快速迁移(例如，电迁移)可以减少测定时间并且可以最小化分析物的分子扩散。[1031]在一些实施方式中，在保持样品中分析物的相对空间排列的同时，可以进行分析物的电泳转移。因此，被捕获探针(例如，基材上的捕获探针)捕获的分析物保留了细胞或其来源的生物样品的空间信息。对分析物施加电泳场也可导致温度升高(例如，热量)。在一些实施方式中，升高的温度(例如，热量)可以促进分析物向捕获探针迁移。[1032]在一些示例中，空间可寻址的微电极阵列用于通过捕获探针来空间限制地捕获至少一种感兴趣的带电分析物。例如，空间可寻址的微电极阵列可以允许电场的离散(例如，局部)施加而不是均一电场的施加。空间可寻址的微电极阵列可以独立寻址。在一些实施方式中，可以将电场施加到生物样品中的一个或多个感兴趣区域。电极可以彼此相邻或彼此远离。微电极阵列可以被设置为包括具有小面积的高密度离散位点，用于施加电场以促进感兴趣的带电分析物的迁移。例如，可以使用空间可寻址的微电极阵列在感兴趣的区域上进行电泳捕获。[1033]可以使用微电极阵列上的高密度离散位点。表面可以包括任何合适密度(例如，适合于在给定的时间内处理导电基材上的样品的密度)的离散位点。在一个实施方式中，该表面具有大于或等于约500个位点/1mm2的离散位点密度。在一些实施方式中，表面具有每1mm2约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约40000、约60000、约80000个，约100000个，或约500000个位点的离散位点密度。在一些实施方式中，表面具有每1mm2至少约200、至少约300、至少约400、至少约500、至少约600、至少约700、至少约800、至少约900、至少约1000、至少约2000、至少约3000、至少约4000、至少约5000、至少约6000、至少约7000、至少约8000、至少约9000、至少约10000、至少约20000、至少约40000、至少约60000、至少约80000、至少约100000、或至少约500000个位点的离散位点密度。[1034]图14a和图14b说明了被设置为将核酸分析物(例如，mrna转录物)导向空间条码化捕获探针阵列的电泳转移系统的示意图。在该电泳系统的示例性设置中，样品1402夹在阴极之间1401和空间条码化捕获探针阵列1404，1405之间，且空间条码化捕获探针阵列1404，1405夹在样品1402和阳极1403之间，从而使样品1402，1406与空间条码化捕获探针1407接触。当电场被施加到电泳转移系统时，带负电荷的核酸分析物1406将朝向带正电荷的阳极1403，并且进入含有空间条码化捕获探针1407的空间条码化阵列1404，1405。空间条码化捕获探针1407与核酸分析物相互作用(例如，mrna转录物与形成dna/rna杂交体的空间条码化核酸捕获探针杂交)1406，使分析物捕获更有效。电泳系统设置可能会因目标分析物而异。例如，取决于蛋白质以及其它因素(例如，等电点、溶解度等)，蛋白质可以是正的、负的、中性的或极性的。技术从业者具有布置电泳转移系统以促进特定目标分析物的捕获的知识和经验。[1035]图15是示出利用电泳转移系统的示例性工作流方案的示意图。在该示例中，分图a描绘了与样品接触的柔性空间条码化特征阵列。样品可以是柔性阵列，其中阵列固定在水凝胶、膜或其它柔性基材上。分图b描绘了阵列与样品的接触以及阵列‑样品组件的成像。样品/阵列组件的图像可用于验证样品放置、选择感兴趣区域、或如本文所述对阵列上的样品成像的任何其他原因。分图c描述了使用电泳转移系统施加电场以帮助高效捕获目标分析物。此处，带负电的mrna目标分析物向带正电的阳极迁移。分图d描述了逆转录试剂的应用和捕获的目标分析物的第一链edna合成。分图e描述了阵列移出和文库构建准备(组图f)和下一代测序(组图g)。[1036](vi)靶向分析[1037]在一些方面，阵列(例如，载玻片)包括能与样品中的一个或多个特定生物靶标结合的多个捕获探针。捕获探针可以直接或间接附接到基材上。捕获探针可以是或包括例如dna或rna。在一些方面，取决于阵列的化学基质，阵列上的捕获探针可以通过它们的5′或3′末端固定，例如附接或结合到阵列。在一些方面，探针通过3′连接来附接，从而留下游离的5′端。在一些方面，探针通过5′连接来附接，从而留下游离的3′端。在一些方面，探针被间接固定。例如，可以将探针附接到珠上，该珠可以沉积在基材上。本节中公开的捕获探针可以包括本公开通篇提供的捕获探针的各种组分中的任一种(例如，空间条形码、umi、功能域、裂解域等)。[1038]在一些方面，一个或多个捕获探针与对特定物种或生物体(例如，宿主或病原体)具有特异性的分析物相互作用。在一些方面，探针或多个探针可用于检测病毒、细菌或植物蛋白质或核酸。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针可用于检测生物样品中病原体(例如，细菌或病毒)的存在。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针可用于检测与病原体相关的特定核酸的表达(例如，人类样品中16s核糖体rna或人类免疫缺陷病毒(hiv)rna的存在)。[1039]在一些方面，捕获探针中的捕获域可与一种或多种特定分析物(例如，总分析物池中的分析物或分析物的子集)相互作用。待检测的特定分析物可以是多种生物分子中的任一种，包括但不限于蛋白质、核酸、脂质、碳水合合物、离子、小分子、亚细胞靶标或含有上述任一种的多组分复合物。在一些实施方式中，分析物可定位于亚细胞位置，包括例如细胞器，例如线粒体、高尔基体、内质网、叶绿体、内吞囊泡、排出囊泡、液泡、溶酶体等。在一些实施方式中，分析物可以是肽或蛋白质，包括但不限于抗体和酶。[1040]在一些方面，来自生物样品的分析物与一个或多个捕获探针(例如，直接或间接固定在基材上的一个或多个捕获探针)相互作用，并且捕获探针与生物样品中的特定分析物相互作用。在一些方面，允许捕获探针与特定分析物相互作用(例如，杂交至特定分析物)，例如，在合适的条件下，其中寡核苷酸捕获探针可以与目标核酸杂交。在一些方面，不与捕获探针杂交的分析物(例如，不与捕获探针的捕获域相互作用的分析物)被移除。在一些实施方式中，不与捕获探针相互作用的分析物的移除可以通过例如洗涤样品以移除此类分析物来实现。[1041]在一些方面，捕获探针或多个捕获探针包括与生物样品中存在的一种或多种分析物相互作用的捕获域。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针包括检测特定分析物或感兴趣分析物的存在或水平量(例如，表达水平)的捕获域。捕获探针的捕获域(直接或间接固定在基材上)能够选择性地结合到所需的核酸亚型或子集。在一些方面，例如，捕获域结合基因组中的核酸子集或转录组中的核酸子集。在一些方面，分析物可包括一种或多种核酸。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针可用于检测特定转录物(例如特定mrna)的表达。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针可以对核酸或蛋白质的个体变化具有特异性(例如结合至核酸或蛋白质的个体变化)(例如，突变或单核苷酸多态性(snp))。[1042]在一些方面，生物样品包括分析物是或包含核酸。核酸可以是rna或dna。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针能够检测特定核酸分析物组的dna拷贝数。例如，本文提供的捕获探针或多个捕获探针可用于检测彼此具有同源性的核酸的dna拷贝数。[1043]在一些方面，捕获探针或多个捕获探针包括能检测一种或多种rna转录物(例如，特定rna转录物)的存在或水平量(例如，表达水平)的捕获域。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针包括能检测一种或多种非编码rna(例如，微rna、转移rna(trna)、核糖体rna、小干扰rna(sirna)和核仁小rna(snorna))的存在或量(例如，表达水平)的捕获域。在一些方面，所述探针或多个探针包括能检测一种或多种蛋白质(例如，感兴趣的核酸表达的蛋白质)的存在或水平量(例如，表达水平)的捕获域。[1044]在一些方面，捕获探针或多个捕获探针可以对特定蛋白质具有特异性。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针可用于检测特定感兴趣蛋白质的存在。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针可用于检测特定蛋白质的翻译。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针可以与酶的活性区、免疫球蛋白的结合域、蛋白质的确定域、完整蛋白质、合成肽、具有引入突变的肽、适体或其任何组合特异性地相互作用。在一些方面，分析物可包括一种或多种蛋白质。在一些方面，分析物可包括一种或多种核酸和一种或多种蛋白质。[1045]在一些方面，捕获探针或多个捕获探针可用于检测特定蛋白质的特定翻译后修饰。在此类实施方式中，分析物捕获剂可对具有翻译后修饰的给定状态(例如，磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化或脂质化)的细胞表面分析物具有特异性，使得细胞表面分析物概况可包括一种或多种分析物的翻译后修饰信息。[1046]在一些方面，捕获探针或多个捕获探针可以对一组特定的核酸(例如，与一个或多个特定细胞途径相关的核酸)具有特异性。在一些方面，该组核酸是dna。在一些方面，该组核酸是rna。在一些方面，该组核酸具有相似和/或同源序列。在一些方面，该组核酸编码在类似细胞途径中起作用的分析物。在一些方面，该组核酸编码在某种病理状态(例如，癌症、阿尔茨海默病或帕金森病)中表达的分析物。在一些方面，该组核酸编码在某种病理状态下过表达的分析物。在一些方面，该组核酸编码在某种病理状态下表达不足的分析物。[1047]在一些方面，捕获探针或多个捕获探针可以对特定核酸、或特定蛋白质组的检测或表达(例如，在类似的细胞途径中)具有特异性。在一些方面，该组蛋白质具有相似的功能域。在一些方面，该组蛋白质在相似的细胞途径中起作用。在一些方面，该组蛋白质在某种病理状态(例如，癌症、阿尔茨海默病或帕金森病)中表达。在一些方面，该组蛋白质在某种病理状态下过度表达。在一些方面，该组蛋白质在某种病理状态下表达不足。[1048]在一些实施方式中，捕获探针包括能够结合多于一种分析物的捕获域。在一些实施方式中，捕获域可结合一种或多种分析物，所述分析物与目标分析物约80％相同、约85％相同、约90％相同、约95％相同、约96％相同、约97％相同、约98％相同，约99％相同，100％相同。在一些方面，捕获探针可结合彼此约80％相同、约85％相同、约90％相同、约95％相同、约96％相同、约97％相同、约98％相同或约99％相同的分析物。在一些实施方式中，捕获域可以结合一种或多种分析物的保守区，其中保守区与目标分析物约80％相同、约85％相同、约90％相同、约95％相同、约96％相同、约97％相同、约98％相同、约99％相同，100％相同。[1049]在一些方面，捕获探针或多个捕获探针与序列不相似和/或不共享保守结构域的两种或更多种分析物(例如，核酸或蛋白质)相互作用。在一些实施方式中，捕获探针包括两个或更多个捕获域，每个捕获域与不同的分析物相互作用。在这样的实施方式中，两个或更多个捕获域的成员在捕获探针中可以彼此相邻和/或两个或更多个捕获域的成员在捕获探针中可以通过一个或多个域(例如，核酸域)彼此分开。例如，在一些方面，检测到的分析物组包括靶核酸或蛋白质的突变变化。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针能检测在致病状态期间单独突变的核酸或蛋白质组(例如，非同源核酸或蛋白质)。在一些方面，致病状态是癌症。[1050]在一些方面，捕获探针或多个捕获探针包括可用于检测通常使用诊断组检测的分析物的捕获域。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针用于检测一种或多种分析物的变化。在一些方面，分析物变化包括分析物表达增加、分析物表达减少、核酸序列突变，或其任何组合中的一种或多种。在一些方面，分析物的变化与对象的致病状态相关和/或导致其表现。在一些方面，将检测到的变化与一个或多个参考分析物进行比较。[1051](vii)多肽捕获[1052]本文提供了用于鉴定生物样品中多肽位置的方法和材料。在一些实施方式中，分析物(例如，多肽分析物)可直接捕获在基材上。例如，多肽分析物可以被官能化基材上的胺基团捕获。在其它示例中，分析物(例如，多肽分析物)可通过直接附接至基材的分析物结合部分被捕获。在一些实施方式中，基材可填入直接附连到基材的分析物关注部分(analytemindingmoiety)以及直接附连到基材的空间条码化捕获探针。在其它实施方式中，分析物(例如，多肽分析物)可通过间接附连至基材的分析物结合部分被捕获。在一个示例中，基材可填入与分析物捕获剂结合的捕获探针，其中分析物捕获剂的分析物捕获域能与捕获探针的捕获域结合，并且分析物结合部分能与多肽分析物结合。[1053]在一些实施方式中，分析物(例如，多肽分析物)可被直接捕获或固定在基材上。直接固定可以通过将多肽分析物通过c‑末端氨基酸残基的羧酸与功能化的基材表面之间的酰胺键共价偶联至基材来实现。例如，基材(例如，玻璃盖玻片或载玻片)可以通过氨基‑硅烷化用氨基丙基三乙氧基硅烷进行官能化。基材表面通过与聚乙二醇(peg)‑nhs溶液过夜孵育而进一步钝化，且功能化的载玻片可以储存在真空干燥器中直至使用。叔丁氧羰基保护基团可以通过在使用前将基材与90％tfa(v/v于水中)孵育5小时来移除，从而暴露出用于肽固定的游离胺基团。所得的功能化基材对埃德曼降解(edmandegradation)和洗涤步骤的多次循环是稳定的。[1054]在一些实施方式中，用于捕获生物样品中的多肽的方法包括提供基材，其中分析物结合部分直接固定在基材上。在一些实施方式中，直接固定是通过基材的化学修饰和/或分析物结合部分的化学修饰来实现的。例如，可以用表面上的游离胺制备基材。当暴露于在c端残基上具有游离羧酸的分析物结合部分时，游离胺可与羧酸形成酰胺键，从而将分析物结合部分共价偶联至基材。基材和/或分析物结合部分可以以促进分析物结合部分与基材共价键合的任何方式进行修饰。可用于将分析物结合部分与基材共价结合的化学修饰的非限制性示例包括在本文中。[1055]在一些实施方式中，用于捕获分析物多肽的方法包括提供基材(例如，阵列)，其中分析物结合部分间接连接至基材。例如，分析物结合部分可以通过寡核苷酸(例如，捕获剂条码域或与捕获探针杂交的捕获剂条码域)或能够同时结合基材和分析物结合域的其它结构域间接附接至基材。捕获剂条码域在本文别处描述。捕获剂条码域可被修饰以包括裂解域，其可使用本文所述的任何化学物附接至基材。在一些实施方式中，捕获剂条码域可包括如本文所述的分析物捕获序列，其中分析物捕获序列可以与捕获探针的捕获域杂交。在一些实施方式中，可以通过使分析物捕获剂的分析物捕获序列与捕获探针的捕获域杂交来修饰包含捕获探针的基材(例如阵列)以捕获多肽分析物。[1056]在一些实施方式中，用于捕获分析物多肽的方法包括提供基材(例如，阵列)和向生物样品提供分析物捕获剂。例如，在干燥和固定切片组织样品后，组织样品可以被置于基材(例如空间阵列)上、再水合、封闭和透化(例如，3xssc、2％bsa、0.1％tritonx、1u/μlrna酶抑制剂，在4℃保持10分钟)，然后用荧光一抗(1∶100)和分析物捕获剂池(于3xssc、2％bsa、0.1％tritonx、1u/μlrna酶抑制剂中，4℃保持30分钟)染色。可以洗涤生物样品，盖上盖玻片(在甘油 1u/μlrna酶抑制剂中)，对检测到的分析物进行成像(例如，使用共聚焦显微镜或其它能够进行荧光检测的设备)，然后再次洗涤。可以使结合了分析物的分析物捕获剂从生物样品中释放(例如，生物样品可以用蛋白酶，例如蛋白酶k处理)并迁移到空间阵列。结合了分析物的分析物捕获剂的分析物捕获序列可被捕获探针捕获域捕获，并且捕获剂条码域可被延伸以产生空间加标的分析物捕获剂。空间加标的分析物捕获剂可以根据本文所述的空间工作流程进行处理。[1057]在一些实施方式中，用于捕获分析物多肽的方法包括在将分析物捕获剂引入生物样品之前向分析物捕获剂提供封闭探针(blockingprobe)。在一些实施方式中，封闭探针可以替代地或另外地提供在本文提供的任何再水合或封闭缓冲液中。在一些实施方式中，可以在结合到捕获探针捕获域之前使用与分析物捕获序列互补的封闭探针序列封闭分析物捕获剂分析物捕获序列。在将分析物捕获剂与生物样品和/或基材接触之前，封闭捕获剂条码域，特别是捕获剂条码域的游离3′端(例如，分析物捕获序列)，可以防止捕获剂条码域的分析物捕获序列，例如，防止多聚(a)尾与捕获探针捕获域的结合。在一些实施方式中，封闭分析物捕获剂分析物捕获域减少了非特异性背景染色。在一些实施方式中，封闭探针是可逆的，从而使封闭探针可以在分析物捕获剂与生物样品接触期间或之后从分析物捕获序列中移除。在一些实施方式中，封闭探针可以用rna酶处理(例如，rna酶h处理)来移除。[1058]在一些实施方式中，用于捕获生物样品中的多肽的方法包括主动转移(例如，电泳)。例如，将生物样品置于导电基材上并与包含一个或多个分析物结合部分的空间阵列接触。如本文所述，可以将电场施加到导电基材以促进多肽向分析物结合部分迁移。[1059]在一些实施方式中，用于鉴定生物样品中多肽的空间位置的方法包括确定捕获的多肽的序列。在一些实施方式中，捕获的多肽的序列通过用可检测标记物(例如，荧光团的放射性标记物)检测标记的氨基酸残基来确定。可用于标记捕获的多肽的可检测标记物的非限制性示例包括荧光团和放射性标记物。在一些实施方式中，多肽仅在特定氨基酸残基处被标记(例如，并非所有氨基酸残基都被标记)。在一些实施方式中，在生物样品与基材接触之前标记多肽。在一些实施方式中，采用标准偶联方案(参见hernandez等，newj.chem.41：462‑469(2017))，用荧光团对捕获的多肽进行标记。例如，视情况而定，多肽可以通过与atto647n‑nhs、atto647n碘乙酰胺、tmr‑nhs或jf549‑nhs反应进行标记，以标记赖氨酸(通过nhs)或半胱氨酸(通过碘乙酰胺)。此外，丝氨酸或苏氨酸磷酸化位点可以通过β消除来选择性地标记，然后通过硫醇进行偶联物添加以取代硫醇连接的荧光团，代替磷酸盐(参见stevens等，rapidcommun.massspecrtom.，15：2157‑2162(2005))。掺入多肽中的荧光团的数量是可以光谱分辨的任何数量。在一些情况下，使用四个或更多个荧光团。[1060]在一些实施方式中，被捕获的多肽被放射性标记。在一些实施方式中，特定氨基酸可以用同位素标记。用于标记氨基酸的同位素的非限制性示例包括3h、14c、15n、32p和125i。在一些实施方式中，在掺入多肽之前将同位素掺入所选氨基酸。在一些实施方式中，放射性标记的氨基酸可在多肽形成后掺入多肽中。[1061]在一些实施方式中，所捕获的多肽的序列使用埃德曼降解(并且在一些实施方式中，埃德曼降解的连续轮次)确定。在这种情况下，多肽被捕获，多肽序列可以通过在重复几轮埃德曼降解后对基材进行成像来解析。例如，在每次埃德曼反应后对基材进行成像，以捕获由于移除了反应副产物氨基酸而产生的可检测标记物。通过埃德曼降解获得的信息可用于鉴定多肽。在一些实施方式中，使用光学或荧光显微术使生物样品可视化或成像。[1062](viii)捕获后捕获分析物的富集[1063]在一些方面，目标分析物的空间分析包括捕获后的一个或多个富集步骤以针对目标分析物富集捕获的分析物。例如，可以选择或设计捕获域以选择性捕获比实施人员所希望分析的更多的分析物。在一些实施方式中，包括形成全部或部分捕获域的随机序列(例如，随机六聚体或类似序列)的捕获探针可用于以无偏的(unbiased)方式从生物样品捕获核酸。例如，具有包括随机序列的捕获域的捕获探针可用于从生物样品中一般地捕获dna、rna或两者。或者，捕获探针可以包括通常捕获mrna的捕获域。如本领域公知的，这可以基于与mrna的多聚‑a尾杂交。在一些实施方式中，捕获域包括与mrna的多聚‑a尾相互作用(例如杂交)的序列。这种序列的非限制性示例包括多聚‑tdna序列和多聚‑urna序列。在一些实施方式中，随机序列可以与多聚‑t(或多聚‑t类似物等)序列结合使用。因此，在捕获域包括聚‑t(或“聚‑t‑样”)寡核苷酸的情况下，它还可以包括随机寡核苷酸序列。[1064]在一些方面，在捕获比实施人员希望分析的更多的分析物之后，本文公开的方法包括富集特定捕获的分析物。在一些方面，方法包括富集分析物，所述分析物包括感兴趣的突变(例如，snp)、感兴趣的核酸和/或感兴趣的蛋白质。[1065]在一些实施方式中，本文提供的空间分析方法包括在分析物捕获之后选择性地富集一种或多种感兴趣的分析物(例如，目标分析物)。例如，可以通过将一种或多种寡核苷酸添加到捕获的分析物库中来富集一种或多种感兴趣的分析物。在一些实施方式中，可以通过将一种或多种寡核苷酸添加到阵列上捕获的分析物库来富集一种或多种感兴趣的分析物。在一些实施方式中，可以通过将一种或多种寡核苷酸添加到捕获的分析物的库中来富集一种或多种感兴趣的分析物，其中捕获的分析物的库已经从阵列释放(例如，移出)。在一些实施方式中，当捕获的分析物已从阵列释放时，一个或多个核苷酸可以与tso的部分和r1序列或其部分互补。在一些实施方式中，其它寡核苷酸包括用于引发聚合酶反应的序列。例如，与一种或多种感兴趣的分析物具有序列互补性的一种或多种引物序列可用于扩增一种或多种感兴趣的分析物，从而选择性地富集这些分析物。在一些实施方式中，一个或多个引物序列可以与捕获探针上的其它结构域互补(例如，r1序列或其部分，如上)，而不与分析物互补。在一些实施方式中，扩增式富集(例如，pcr)通过使用与感兴趣的一种或多种分析物互补的第一引物(或tso和捕获探针中的另一个结构域)或其互补物，和与捕获探针的某一区域互补的第二引物或其互补物，而发生。在一些实施方式中，捕获探针的该区域或其互补物远离捕获域的空间条形码，从而使扩增式富集扩增被捕获的一种或多种分析物及其相关的空间条形码，从而允许空间分析富集的一种或多种分析物。[1066]在一些实施方式中，两种或更多种捕获探针捕获两种或更多种不同的分析物，这些分析物从捕获的分析物库中富集(例如，同时或顺序地)。在一些实施方式中，pcr扩增式富集包括多轮扩增。例如，pcr扩增式富集可以包括巢式pcr反应，使用不同的引物，这些引物对一个或多个感兴趣的分析物具有特异性。在一些实施方式中，可以使用非pcr式扩增方法进行扩增式富集。非pcr扩增方法的非限制性示例是滚环扩增。其它非pcr扩增方法是本领域已知的。[1067]在一些实施方式中，与捕获的一个或多个感兴趣的分析物或其互补序列具有序列互补性的寡核苷酸可用于从捕获的分析物库中富集捕获的一个或多个感兴趣的分析物。在一些实施方式中，与捕获的一个或多个感兴趣的分析物(或捕获探针的另一个结构域)或其互补物具有序列互补性的寡核苷酸可以包括可用于富集过程的一个或多个功能部分。例如，具有与一种或多种感兴趣的分析物或其互补物互补的序列的生物素化寡核苷酸可以与感兴趣的分析物结合并且可以使用本领域已知的多种方法中的任一种(例如，链酶亲和素珠)利用生物素化‑链霉亲和素亲和力进行选择。在一些实施方式中，具有与一种或多种感兴趣的分析物或其互补物互补的序列的寡核苷酸包括可用于富集过程的磁性部分(例如，磁珠)。[1068]另外或可替代地，可以使用多种方法中的任一种来向下选择(例如，移除)一种或多种分析物(例如，线粒体dna或rna)。在一些实施方式中，对不感兴趣的分析物的这种向下选择可以导致对感兴趣的其它类型的分析物的改进的捕获。例如，可以将探针给予选择性地与核糖体rna(rrna)杂交的样品，从而减少样品中rrna的集和浓度。在一些实施方式中，由于样品中存在的非特异性rna的减少，这种向下选择可能会导致对其它类型的rna的改进的捕获。另外或或者，双链特异性核酸酶(dsn)处理可去除rrna(参见，例如，archer等，在cdna阶段从rna‑seq文库选择性和灵活去除有问题的序列(selectiveandflexibledepletionofproblematicsequenceswfromrna‑seqlibrariesatthecdnastage)，bmcgenomics，15401，(2014)，其全部内容通过引用纳入本文)。在一些实施方式中，羟基磷灰石层析可用于移除丰富的物质(例如，rrna)。[1069](ix)rna模板化连接[1070]在本文提供的方法的一些实施方式中，rna模板化连接用于询问生物样品(例如ffpe组织切片)中的空间基因表达。rna模板连接能够灵敏地测量感兴趣的特定核酸分析物，否则这些分析物可能会用全转录组学方法进行分析。它具有与常见组织化学染色相容的优点，适用于分析已有十年历史的材料(例如ffpe样品)和极小的显微解剖组织碎片。[1071]在一些方面，rna模板化连接的步骤包括：(1)探针(例如dna探针)对与组织切片内的rna(例如福尔马林固定rna)的杂交；(2)相邻退火探针对的原位连接；(3)rna酶h处理，其(i)从组织中释放rna模板化连接产物(例如，释放到溶液中)用于下游分析，和(ii)破坏不需要的dna模板化连接产物；和任选地，(4)rna模板化的连接产物的扩增(例如，通过多重pcr)。[1072]在一些方面，本文公开了直接检测rna靶‑dna探针双链体而不首先通过逆转录将rna转化为cdna的方法。在一些方面，rna模板化的连接可以包括dna连接酶。在一些方面，rna模板化的连接可包括rna连接酶。在一些方面，rna模板化的连接可以包括t4rna连接酶。[1073]在一些方面，rna模板化连接用于检测rna、确定rna序列同一性和/或表达监测和转录物分析。在一些方面，rna模板化连接允许检测核酸中的特定变化(例如，突变或单核苷酸多态性(snp))、特定核酸的检测或表达、或特定核酸组的检测或表达(例如，在类似的细胞途径中或在特定病理中表达)。在一些实施方式中，包括rna模板化连接的方法用于分析核酸，例如，通过基因分型、dna拷贝数或rna转录物的定量、样品内特定转录物的定位等。在一些方面，本文提供的包括rna模板化的连接的系统和方法能鉴定单核苷酸多态性(snp)。在一些方面，此类系统和方法能识别突变。[1074]在一些方面，本文公开了检测rna表达的方法，包括使第一探针、第二探针和连接酶(例如，t4rna连接酶)接触。在一些实施方式中，第一探针和第二探针被设计为能与靶序列杂交，从而使第一探针的5′末端和第二探针的3′末端相邻并且可以连接，其中至少第一探针的5′‑末端核苷酸和至少第二探针的3′‑末端核苷酸是脱氧核糖核苷酸(dna)，并且其中靶序列包括(例如，包含)核糖核苷酸(rna)。杂交后，如果目标样品中存在靶序列，则连接酶(例如，t4rna连接酶)将第一探针和第二探针连接起来，但如果目标序列不存在于目标样品中，则连接酶(例如，t4rna连接酶)不连接第一探针和第二探针。生物样品中靶序列的存在与否可以通过确定第一和第二探针是否在连接酶存在下连接来确定。可以使用多种方法中的任一种来确定第一和第二探针是否在连接酶存在下连接，包括但不限于对连接产物测序、将连接产物与检测探针杂交(所述检测探针仅在第一和第二探针在连接酶存在下连接时杂交)、限制酶分析和本领域已知的其它方法。[1075]在一些方面，使用包括rna模板化的连接的方法分析两种或更多种rna分析物。在一些方面，当分析两种或更多种分析物时，使用对每种rna分析物具有特异性(例如，特异性杂交)的第一和第二探针。[1076]在一些方面，在本文提供的rna模板化的连接方法中使用三种或更多种探针。在一些实施方式中，三种或更多种探针被设计为能与靶序列杂交，从而使三种或更多种探针彼此相邻杂交，从而可以连接相邻探针的5′和3′末端。在一些实施方式中，生物样品中靶序列的存在与否可以通过确定三种或更多种探针是否在连接酶存在下连接来确定。[1077]在一些方面，第一探针是dna探针。在一些方面，第一探针是嵌合dna/rna探针。在一些方面，第二探针是dna探针。在一些方面，第二探针是嵌合dna/rna探针。[1078]在某些方面，rna模板化的连接方法利用t4rna连接酶2有效地接合在固定rna目标序列上原位杂交的相邻嵌合rna‑dna探针对。随后用rna酶h处理释放rna模板化的连接产物(例如，进入溶液)用于下游分析。[1079](x)感兴趣的区域[1080]生物样品可能会具有显示可能指示疾病的存在或疾病表型的发展的形态特征的区域。例如，肿瘤活检样品内特定部位的形态学特征可以指示对象癌症的侵袭性、治疗抗性、转移潜力、迁移、阶段、诊断和/或预后。肿瘤活检样品中特定部位形态学特征的变化通常与特定部位细胞中分析物水平或表达的变化相关，这反过来又可用于提供有关对象中侵袭性、癌症的治疗抗性、转移潜能、迁移、分期、诊断和/或预后的信息。被选择用于特定分析的生物样品内的区(region)或区域(area)(例如，生物样品中具有感兴趣的形态特征的区域)通常被描述为“感兴趣的区域”。[1081]生物样品中的感兴趣区域可用于分析生物样品中的特定感兴趣区域，从而将实验和数据收集集中到生物样品的特定区域(而不是整个生物样品)。这导致生物样品分析的时间效率提高。[1082]可以使用各种不同的技术在生物样品中识别感兴趣的区域，例如扩展显微镜、亮场显微镜、暗场显微镜、相衬显微镜、电子显微镜、荧光显微镜、反射显微镜、干涉显微镜、共焦显微镜、以及视觉识别(例如，通过眼睛)及其组合。例如，可以对生物样品进行染色和成像以识别感兴趣的区域。在一些示例中，感兴趣区域可以对应于细胞结构的特定结构。在一些实施方式中，可以在可视化之前对生物样品进行染色以提供生物样品的不同区域之间的对比度。可以根据生物样品的类型和要染色的细胞区域来选择染色剂的类型。在一些实施方式中，可以使用多于一种染色剂来显现生物样品的不同方面，例如样品的不同区域、特定细胞结构(例如细胞器)或不同细胞类型。在其它实施方式中，可以在不染色生物样品的情况下使生物样品可视化或成像。[1083]在一些实施方式中，在生物样品与空间阵列接触之前对生物样品进行染色和成像以选择用于空间分析的样品。在一些实施方式中，染色包括应用如本文所述的基准标志物，包括荧光、放射性、化学发光或比色可检测标志物。在一些实施方式中，生物样品的染色和成像允许用户识别用户希望评估的特定样品(或感兴趣区域)。[1084]在一些示例中，阵列(例如，本文所述的任何示例性阵列)可仅与生物样品的部分(例如，细胞、组织区段或感兴趣区域)接触。在一些示例中，生物样品仅与阵列的部分接触(例如，本文所述的任何示例性阵列)。在一些实施方式中，可以选择性地裂解和分析与生物样品的感兴趣区域(例如，感兴趣区域的近端)对应的阵列上的捕获探针。例如，阵列上的捕获探针可以在对应于生物样品的感兴趣区域的区域之外被去活化或消除。在一些实施方式中，可以通过使用光选择性地裂解包括光可裂解键和在对应于生物样品的感兴趣区域的区域中的阵列上的捕获探针。反射镜、反射镜阵列、透镜、移动台和/或光掩模可用于将光引导至阵列的区域，其对应于生物样品中一个或多个感兴趣区域之外的区域。一些实施方式包括利用光使捕获探针(例如包含如本文所述的光可裂解键的捕获探针)失活或消除。在一些实施方式中，可以使用激光，例如扫描激光，来停用或消除捕获探针。在一些实施方式中，多个捕获探针中被消除的成员可以被洗掉。在一些实施方式中，感兴趣的区域可以用不同的重金属标记，并且在质谱鉴定之前，激光可以顺序地烧蚀这些感兴趣的区域。例如，激光可以通过紫外光破坏dna、加热、诱导防止捕获探针移动到下一步的化学反应、诱导光可裂解键的光裂解或其组合来使捕获探针失活或消除。在一些实例中，阵列的部分可失活以使其不与生物样品中的分析物相互作用(例如，光学失活、化学失活、热失活或阵列中捕获探针的阻断(例如，使用阻断性探针))。在一些示例中，可以从生物样品移出感兴趣区域，然后可以将感兴趣区域接触到阵列(例如，本文所述的任何阵列)。可以使用显微手术、激光捕获显微切割、分块、切片机、切割、胰蛋白酶消化、标记和/或荧光辅助细胞分选等从生物样品中移出感兴趣区域。[1085]在一些示例中，感兴趣区域可以被透化或裂解，而感兴趣区域之外的区域不被透化或裂解(例如，kashyap等.scirep.2016；6：29579，通过引用其全文方式纳入本文)。例如，在一些实施方式中，感兴趣的区域可以与包含透化或裂解试剂的水凝胶接触。在一些实施方式中，感兴趣区域之外的区域不与包含透化或裂解试剂的水凝胶接触。[1086](f)分区[1087]如上所述，在一些实施方式中，可任选地将样品分离成单细胞、细胞群或比原始未破碎样品小的其他片段/碎片。可以分析样品的这些较小部分中的每一个以获得样品的空间分辨分析物信息。[1088]对于已被分离成更小片段的样品‑特别是对于已被分解、解离或以其他方式分离成个体细胞的样品‑分析片段的一种方法涉及将片段分隔进入个体分区(例如液滴)，然后分析分区的内容物。通常，每个分区都保持其自身内容物与其他分区的内容物的分离。例如，分区可以是乳液中的液滴。[1089]分区可以在流体流中流动。所述分区可包括例如具有围绕内部流体中心或核心的外部屏障的微泡。在某些情况下，分区可包括多孔基材，其能够在其基材内夹带和/或保持材料。所述分区可以是第二相内第一相的液滴，其中所述第一相和第二相是不混溶的。例如，分区可以是非水性连续相(例如油相)内的水性流体液滴。在另一实例中，该分区可为水相中非水性流体的液滴。在一些示例中，分区可以在油包水乳液或水包油乳液中提供。各种不同的容器在例如美国专利申请公开号2014/0155295中描述，其全部内容通过引用纳入本文。例如，在美国专利申请公开号2010/0105112中描述了用于在非水或油连续相中产生稳定液滴的乳液系统，其全部内容通过引用纳入本文。[1090]对于乳液中的液滴，可通过例如将水性流体中的颗粒流动流引入非水性流体的流动流，使得液滴在两个流的接合部产生来实现将个体颗粒分配到离散分区。可对流体特性(例如，流体流速、流体粘度等)、颗粒特性(例如，体积分数、颗粒体积、颗粒浓度等)、微流体结构(例如，通道几何形状等)和其它参数进行调整以控制所得分区的占用率(例如，每个分区的分析物数量、每个分区的珠数量等)。例如，可以通过以分析物的特定浓度和/或流速提供水性流来控制分区占用率。[1091]为了生成单个分析物分区，可以选择不混溶流体的相对流速，使得平均而言，分区每个分区可以包含少于一个分析物，以确保被占用的分区主要是单独占用的。在某些情况下，多个分区中的分区最多可包含一个分析物。在一些实施方式中，可以选择或调整各种参数(例如，流体性质、颗粒性质、微流体结构等)，使得大多数分区被占用，例如，仅有小百分比的未占用分区。可以控制流和信道架构以确保给定数量的单占用分区、小于某一水平的未占用分区和/或小于某一水平的多占用分区。[1092]本文所述的通道段可以耦合到各种不同的流体源或接收部件中的任何一个，包括储层、管道、歧管或其他系统的流体部件。如将理解的，微流体通道结构可以具有各种几何形状。例如，微流体通道结构可以具有一个或多个通道连接。作为另一实例，微流体通道结构可具有2、3、4或5个通道段，每个通道段携带在通道接合部相遇的颗粒。流体可以通过一个或多个流体流动单元被引导沿着一个或多个通道或储层流动。流体流动单元可包括压缩机(例如，提供正压力)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。流体也可以通过施加的压差、离心力、电动泵、真空、毛细管和/或重力流来控制。[1093]除了细胞和/或分析物之外，分区可以包括其它成分，特别是一个或多个珠。分区可以包括单个凝胶珠、单个细胞珠或单个细胞珠和单个凝胶珠两者。可以将各种不同的珠纳入分区中。在一些实施方式中，例如，可以将非条码化珠纳入分区中。例如，在纳入分区中的生物颗粒(例如，细胞)携带一个或多个条形码(例如，空间条形码、umi及其组合)的情况下，珠可以是非条码化珠。[1094]在一些实施方式中，携带条形码的珠可以纳入分区中。一般来说，个体珠可以耦合到任意数量的个体核酸分子，例如，从一个到几十个到几十万个甚至数百万个个体核酸分子。个体核酸分子的相应条形码可以包括共同序列段或相对共同序列段以及耦合到同一珠的不同个体核酸分子之间的可变或独特序列段。例如，核酸分子(例如，寡核苷酸)可以通过可释放的键(例如，二硫键)与珠偶联，其中核酸分子可以是或包括条形码。例如，条形码可以在液滴生成之前、之后或同时注入液滴。将条形码传递到特定分区使稍后将个体生物颗粒的特性归因于特定分区。条形码可以例如在核酸分子(例如寡核苷酸)上通过任何合适的机制传递到分区。条码化核酸分子可以通过微胶囊传递到分区。在一些情况中，微胶囊可包括珠。同一珠可与一个或多个其它核酸分子耦合(例如，通过可释放连接)。[1095]所述核酸分子可包括可用于后续加工的功能域。例如，功能域可包括测序仪特异性流动池附接序列(例如，用于测序系统的p5序列)和测序引物序列(例如，用于测序系统的r1引物)中的一个或多个。核酸分子可包括用于对样品(例如dna、rna、蛋白质等)进行条码化的条形码序列。在某些情况下，条形码序列可以是珠特异性的，使得条形码序列对于耦合到同一珠的所有核酸分子是共同的。可选地或另外，条形码序列可以是分区特异性的，使得条形码序列对于耦合到被划分到相同分区中的一个或多个珠的所有核酸分子是共同的。核酸分子可包括特定引发序列，例如mrna特定引发序列(例如，多聚(t)序列)、靶向的引发序列和/或随机引发序列。核酸分子可包括锚定序列以确保特定引发序列在序列末端(例如，mrna的)杂交。例如，锚定序列可包括核苷酸的随机短序列，例如1‑聚体、2‑聚体、3‑聚体或更长的序列，其可确保多聚(t)片段更有可能在mrna的多聚(a)尾的序列末端杂交。[1096]核酸分子可包括独特分子识别序列(例如，独特分子标识符(umi))。在一些实施方式中，独特分子识别序列可包括约5至约8个核苷酸。或者，独特分子识别序列可包括少于约5个或多于约8个核苷酸。独特分子识别序列可以是在耦合到单个珠的个体核酸分子之间变化的独特序列。在一些实施方式中，独特分子识别序列可以是随机序列(例如，随机n‑聚体序列)。例如，umi可以提供捕获的起始mrna分子的独特标识符，以便能够对原始表达rna的数量进行定量。[1097]分区还可以包括一种或多种试剂。例如条形码之类的独特标识符可在液滴生成之前、之后或与液滴生成同时注入到液滴中，例如经由微胶囊(例如，珠)。微流体通道网络(例如，在芯片上)可用于生成分区。替代机制也可用于个体生物颗粒的划分，包括多孔膜，通过多孔膜，细胞的水性混合物被挤压成非水流体。[1098]在一些实施方式中，条形码核酸分子最初可与微胶囊结合，然后从微胶囊释放。条形码核酸分子的释放可以是被动的(例如，通过扩散出微胶囊)。另外或可选择地，可在施加使条码化核酸分子离解或从微胶囊释放的刺激物时从微胶囊释放。这种刺激可以破坏微胶囊，这种相互作用使条码化核酸分子与微胶囊或在微胶囊内耦合，或两者结合。这种刺激可以包括，例如，热刺激、光刺激、化学刺激(例如，ph值的改变或还原剂的使用)、机械刺激、辐射刺激、生物刺激(例如，酶)或其任何组合。[1099]在一些实施方式中，一个或多个条形码(例如，空间条形码、umi或其组合)可作为分析物的部分引入到分区中。如前所述，条形码可直接结合到分析物，或可形成捕获探针或分析物捕获剂的部分，所述捕获探针或分析物捕获剂与分析物杂交、偶联或以其他方式关联，使得当分析物被引入分区时，条形码也被引入。如上所述，图16示出了用于将个体分析物(例如，细胞)划分进入离散分区的微流体通道结构的示例。[1100]图16示出了用于将个体分析物(例如，细胞)划分进入离散分区的微流体通道结构的示例。通道结构可以包括在通道接合点1605处连通的通道段1601、1602、1603和1604。在操作中，包括悬浮的生物颗粒(或细胞)1607的第一水性流体1606可以沿着通道段1601输送到接合部1605中，而与水性流体1606不混溶的第二流体1608被输送到来自每个通道段的1602和1603的接合部1605来建立流入通道段1604并流离接合部1605的第一水性流体1606的离散液滴1609，1610。通道段1604可以流体耦合到出口储器，其中可以存储和/或收获离散的液滴。产生的离散液滴可包括个体生物颗粒1607(例如液滴1609)。产生的离散液滴可包括超过一个的个体生物颗粒1607。产生的离散液滴可不包括生物颗粒1607(例如，液滴1610)。每个离散分区可保持其自身内容物(例如，个体生物颗粒1607)与其他分区的内容物的分离。[1101]图17a示出了微流体通道结构1700的另一个示例，该微流体通道结构1700用于将珠递送到液滴。通道结构包括通道段1701，1702，1703，1704和1705，其在通道接合部1706处连通。在操作期间，通道段1701可以将包括多个珠1708的水性流体1707沿着通道段1701输送到接合部1706中。多个珠1708可以来自珠的悬浮液。例如，通道段1701可以连接到包括珠1708的水性悬浮液的储器。通道段1702可以将包括多个颗粒1709(例如，细胞)的水性流体1707沿着通道段1702输送到接合部1706中。在一些实施方式中，第一通道段1701或第二通道段1702中或两段中的水性流体1707可包括一种或多种试剂，如下所述。[1102]与水性流体1707(例如，油)不混溶的第二流体1710可以从通道段1703和1704中的每一个被递送到接合部1706。当来自通道段1701和1702中的每一个的水性流体1707和来自通道段1703和1704中的每一个的第二流体1710在通道接合部1706处相遇时，水性流体1707可以在第二流体1710中被分配为离散的液滴1711并沿着通道段1705流离接合部1706。通道段1705可以将离散的液滴输送到与通道段1705流体耦合的出口储器，在那里可以收集液滴。[1103]作为替代方案，通道段1701和1702可以在接合点1706的上游的另一个接合点处相遇。在这样的接合部，珠和生物颗粒可形成混合物，该混合物沿着另一个通道被引导到接合部1706以产生液滴1711。该混合物可以以交替的方式提供珠和生物颗粒，从而使例如液滴包括单个珠和单个生物颗粒。[1104]第二流体1710可包括油，例如氟化油，其包括用于稳定所得液滴的含氟表面活性剂，例如，用于抑制所得液滴1711的随后聚结。[1105]本文描述的分区可以包括小体积，例如，小于约10微升(μl)、5μl、1μl、900皮升(pl)、800pl、700pl、600pl、500pl、400pl、300pl、200pl、100pl、50pl、20pl、10pl、1pl、500纳升(nl)、100nl、50nl或更小。[1106]在前面的讨论中，在不同流体流的接合点处形成了带有珠的液滴。在一些实施方式中，液滴可以通过基于重力的划分方法形成。[1107]图17b示出了具有用于受控划分的几何特征的微流体通道结构1750的另一示例的截面图。通道结构1750可以包括在通道接合部1758(或交叉点)处与储器1754连通的通道段1752。在一些情况下，通道结构1750及其组件中的一个或多个可对应于通道结构1700及其组件中的一个或多个。[1108]包含多个颗粒1756的水性流体1760可沿通道段1752输送至接合点1758以与储器1754中与水性流体1760不混溶的第二流体1762(例如，油等)相遇，从而产生流入储器1754的水性流体1760的液滴1764。在水性流体1760和第二流体1762相遇的接合部1758处，可以基于某些因素，例如接合部1758处的流体动力，两种流体1760，1762的相对流速，流体性质，以及通道结构1750的某些几何参数(例如，δh等)形成液滴。通过在接合部1758处从通道段1752连续注入水性流体1760，可以在储器1754中收集多个液滴。[1109]生成的离散液滴可包括多个颗粒1756中的一个或多个颗粒。如本文他处所述，颗粒可以是任何颗粒，例如珠、细胞珠、凝胶珠、生物颗粒、生物颗粒的大分子成分或其它颗粒。或者，产生的离散液滴可不包括任何颗粒。[1110]在一些实例中，水性流体1760可具有颗粒1756的基本均匀浓度或频率。如本文他处所述，颗粒1756(例如，珠)可以从单独的通道(图17中未示出)引入通道段1752中。颗粒1756在通道段1752中的频率可通过控制其中颗粒1756被引入到通道区段1752的频率和/或在通道段1752和单独通道中流体的相对流速来控制。在一些情况下，颗粒1756可以从多个不同的通道被引入到通道段1752中，并且频率被相应地控制。在某些情况下，可以通过分开的通道引入不同的颗粒。例如，第一单独通道可引入珠，而第二单独通道可将生物颗粒引入通道段1752中。引入珠的第一单独通道可以在引入生物颗粒的第二单独通道的上游或下游。[1111]在一些实例中，第二流体1762可不经受和/或不导向任何流入或流出储器1754的流。例如，第二流体1762可以在储器1754中基本静止。在一些情况下，第二流体1762可以在储器1754内流动，但不能流入或流出储器1754，例如通过向储器1754施加压力和/或受到在接合部1758处进入的水性流体1760的影响。或者，第二流体1762可经历和/或被引导流入或流出储器1754。例如，储器1754可以是引导第二流体1762从上游至下游、输送产生的液滴的通道。[1112]在接合点1758处或附近的通道结构1750可具有某些几何特征，其至少部分地确定由通道结构1750形成的液滴的体积和/或形状。通道段1752可具有第一截面高度h1，并且储器1754可具有第二截面高度h2。第一截面高度h1和第二截面高度h2可以不同，从而在接合部1758处，有δh的高度差。第二截面高度h2可以大于第一截面高度h1。在一些情况下，储器此后可逐渐增加截面高度，例如，它离接合部1758越来越远。在一些情况下，储器的截面高度可根据接合部1758处或附近的扩展角β而增加。高度差δh和/或扩张角β可使舌片(在接合点1758处离开通道段1752和在液滴形成之前进入储器1754的水性流体1760的部分)深度增加，并有助于中间形成液滴的曲率减小。例如，液滴体积可能随着高度差的增加和/或扩展角的增加而减少。[1113]高度差δh可至少约为1μm。或者，高度差可为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500μm或更多。或者，高度差可为至多约500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1μm或更小。在一些情况下，扩展角β可以是约0.5°至约4°、约0.1°至约10°或约0°至约90°的范围。例如，扩展角可至少约为0.01°、0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°或更大。在一些情况下，扩展角可以是至多约89°、88°、87°、86°、85°、84°、83°、82°、81°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°、1°、0.1°、0.01°或更小。[1114]在一些实例中，进入接合点1758的水性流体1760的流速可在约0.04微升(μl)/分钟(min)与约40μl/分钟之间。在一些实例中，进入接合点1758的水性流体1760的流速可在约0.01微升(μl)/分钟(min)与约100μl/分钟之间。或者，进入接合部1758的水性流体1760的流速可小于约0.01μl/min。或者，进入接合点1758的水性流体1760的流速可大于约40μl/min，例如45μl/min、50μl/min、55μl/min、60μl/min、65μl/min、70μl/min、75μl/min、80μl/min、85μl/min、90μl/min，95μl/min、100μl/min、110μl/min、120μl/min、130μl/min、140μl/min、150μl/min或更高。在较低流速下，例如约小于或等于10微升/分钟的流速，液滴半径可能不取决于进入接合部1758的水性流体1760的流速。第二流体1762在储器1754中可以是静止的或基本上静止的。或者，第二流体1762可以流动，例如以上述针对水性流体1760描述的流速。[1115]虽然图17b说明高度差δh在接合部1758处陡增(例如，阶梯增加)，高度差可逐步增加(例如，从约0μm到最大高度差)。或者，高度差可以从最大高度差逐步减小(例如，锥形)。如本文所用，高度差的逐步增加或减少可以指高度差的连续增量增加或减少，其中高度曲线的任何一个差分段与该高度曲线的紧邻的差分段之间的角度大于90°。例如，在接合部1758，通道的底壁和储器的底壁可以以大于90°的角度相交。或者或者另外，所述通道的顶壁(例如，顶板)和所述储器的顶壁(例如，顶板)可以大于90°的角度相交。逐步增加或减少可以是线性的或非线性的(例如，指数的、正弦的等)。替代地或另外地，高度差可以线性或非线性可变地增加和/或减少。虽然图17b显示扩展的储器截面高度为线性(例如，恒定扩展角β)，但截面高度可以非线性扩展。例如，储器可以至少部分地由具有可变扩展角的圆顶状(例如，半球形)形状限定。截面高度可以以任何形状扩展。[1116]图17c描述了一个工作流，其中细胞与带有条形码的珠1770一起被划分进入液滴。参见图17a。液滴形成一个隔离的反应室，在其中细胞可被裂解1771，然后细胞内的目标分析物可根据先前描述的方法被捕获1772和扩增的1773、1774。在序列文库制备清理1775之后，根据本文所述的方法对材料进行测序和/或定量1776。[1117]应当注意的是，虽然图17c中的示例工作流包括专门用于mrna分析的步骤，但是可以对多种其他分析物(包括先前描述的任何分析物)实施类似工作流。[1118]举例来说，在如图17c所示分析样品rna的上下文中，释放的核酸分子之一(例如，来自珠)的多聚(t)片段可与mrna分子的多聚(a)尾杂交。逆转录可产生mrna的cdna转录物，该转录物包括核酸分子的每个序列区段。如果核酸分子包含一个锚定序列，它将更有可能与mrna的多聚(a)尾的序列末端杂交并起始逆转录。[1119]在任何给定的分区内，个体mrna分子的所有cdna转录物都可以包含一个共同的条形码序列区段。然而，由给定分区内的不同mrna分子产生的转录物可以在独特分子识别序列区段(例如，umi区段)处变化。有益的是，即使在随后对给定分区的内容物进行任何扩增之后，不同umi的数目也可以指示源自给定分区的mrna的量。如上所述，转录物可被扩增、净化和测序以鉴定mrna的cdna转录物的序列，以及对条形码区段和umi区段进行测序。在描述多聚(t)引物序列的同时，其它靶向或随机引发序列也可用于起始逆转录反应。同样地，尽管描述为将条码化寡核苷酸释放到分区中，但在某些情况下，结合到珠的核酸分子可用于杂交并捕获珠固相上的mrna，例如，以促进rna与其他细胞内容物的分离。[1120]在一些实施方式中，分区包括前体，所述前体包括具有反应性或能够被活化以使其变得具有反应性的官能团的前体可与其它前体聚合以生成包括所述活化或可活化官能团的凝胶珠。然后可以使用官能团将其它物质(例如，二硫键接头、引物、其他寡核苷酸等)附接到凝胶珠上。例如，特征为羧酸(cooh)基团的一些前体可与其它前体共聚合以形成也包括cooh官能团的珠。在一些情况中，丙烯酸(包括游离cooh基团的物质)、丙烯酰胺和双(丙烯酰)胱胺可共聚合在一起以产生包括游离cooh基团的珠。珠的cooh基团可被活化(例如，经由1‑乙基‑3‑(3‑二甲氨基丙基)碳二亚胺(edc)和n‑羟基琥珀酰亚胺(nhs)或4‑(4，6‑二甲氧基‑1，3，5‑三嗪‑2‑基)‑4‑甲基吗啉氯化物(dmtmm))以使其具有反应性(例如，与胺官能团反应，其中edc/nhs或dmtmm用于活化)。活化的cooh基团随后可与连接到珠的部分的适当的物质(例如，包括胺官能团的物质，其中羧酸基团被活化以可与胺官能团反应)反应。[1121]在一些实施方式中，珠可由包括可降解化学交联剂(例如bac或胱胺)的材料形成。这种可降解交联剂的降解可以通过各种机制来实现。在一些实例中，珠可与可引起氧化、还原或其它化学变化的化学降解剂接触。例如，化学降解剂可以是还原剂，例如二硫苏糖醇(dtt)。还原剂的其他实例可包括β‑巯基乙醇、(2s)‑2‑氨基‑1，4‑二巯基丁烷(二硫丁胺或dtba)、三(2‑羧乙基)膦(tcep)或其组合。还原剂可降解形成珠的凝胶前体之间形成的二硫键，从而降解珠。[1122]可降解珠可包括具有不稳定键的一种或多种物质，使得当珠/物质暴露于适当的刺激物时，键被破坏从而珠在分区内降解。不稳定键可以是化学键(例如，共价键、离子键)或者可以是另一种类型的物理相互作用(例如，范德华相互作用、偶极‑偶极相互作用等)。在一些实施方式中，用于生成珠的交联剂可包括不稳定键。当暴露在适当的条件下时，不稳定的键会断裂，珠会降解。例如，特征为胱胺并通过二硫键连接到条形码序列的聚丙烯酰胺珠可与油包水乳液液滴内的还原剂结合。在液滴内，还原剂可以破坏各种二硫键，导致珠降解，条形码序列释放到液滴的水性内部环境中。在另一实例中，在碱性溶液中加热具有珠结合条形码序列的液滴也可导致珠降解并将所附接的条形码序列释放到液滴的水性内部环境中。游离物质(例如，寡核苷酸、核酸分子)可以与分区中包含的其他试剂相互作用。[1123]与不降解的珠相比，当对珠施加适当的刺激时，可降解珠可用于更快速地从珠释放附接的物质(例如，核酸分子、条形码序列、引物等)。例如，对于结合到多孔珠的内表面的物质或在包封的物质的情况下，在珠降解时，该物质可对溶液中的其他物质具有更大的移动性和可及性。在一些实施方式中，物质还可经由可降解接头(例如，二硫键接头)附接到可降解珠。所述可降解接头可对与所述可降解珠相同的刺激作出响应，或者所述两种可降解物质可对不同的刺激作出响应。例如，条形码序列可以通过二硫键附接到包含胱胺的聚丙烯酰胺珠。当条码化珠暴露于还原剂时，珠降解并且在条形码序列和珠之间的二硫键和珠中胱胺的二硫键断裂时释放空间条形码序列。[1124]任何适当数量的物质(例如，引物，条码化寡核苷酸)可与珠粒相关联，使得在从珠释放时，物质(例如，引物，例如，条码化寡核苷酸)以预定浓度存在于分区中。可选择该预定浓度以促进某些反应以在分区内产生测序文库(例如扩增)。在某些情况下，引物的预定浓度可通过产生带有核酸分子(例如寡核苷酸)的珠的过程来限制。[1125]如将从上述描述中了解到的，虽然被称为珠的降解，但在许多实施方式中，降解可指结合或夹带物质与珠的解离，具有或不具有物理珠本身的结构降解。例如，由于化学环境的变化，夹带的物质可以通过渗透压差从珠中释放出来。举例来说，由于渗透压差引起的珠孔体积的改变通常可以在珠本身没有结构降解的情况下发生。在一些情况中，由于珠的透化溶胀导致的孔体积增大可使珠内夹带的物质释放。在一些实施方式中，由于孔体积收缩，珠的透化收缩可导致珠更好地保留夹带的物质。[1126]许多化学触发物可用于触发分区内珠的降解。这些化学变化的实例可包括但不限于ph介导的珠内组分完整性的改变、通过交联键的裂解降解珠的组分以及珠的组分的解聚。[1127]在某些实施方式中，溶液ph值的变化(例如ph值的增加)可触发珠的降解。在其他实施方式中，暴露于水溶液(例如水)可触发水解降解，从而引发珠的降解。在某些情况下，任何刺激组合都可能引发珠降解。例如，ph值的变化可以使化学试剂(例如dtt)成为有效的还原剂。[1128]在应用热刺激时，也可以诱导珠释放其内容物。温度的变化会引起珠的各种变化。例如，热会使固体珠液化。热的变化会导致珠熔化，使珠的部分降解。在其他情况中，热可增加珠组分的内部压力，使得珠破裂或爆炸。热也可以作用于热敏聚合物作为材料来构建珠。[1129]除了珠和分析物之外，形成的分区可以包括各种不同的试剂和物质。例如，当裂解试剂存在于分区内时，裂解试剂可促进分区内分析物的释放。裂解剂的实例包括生物活性试剂，例如用于裂解不同细胞类型的裂解酶，例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物等，例如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌素、唇膏酶、基他酶、溶细胞酶和多种其它市售的裂解酶，例如来自西格玛奥德里奇公司(密苏里州圣路易斯)，以及其他市售的裂解酶。其他裂解剂可另外或可选地共划分以使分析物释放到分区中。例如，在某些情况下，基于表面活性剂的裂解溶液可用于裂解细胞，尽管这些溶液对于表面活性剂可干扰稳定乳液的基于乳液的系统可能不太理想。在一些实施方式中，裂解溶液可包括非离子表面活性剂，例如tritonx‑100和tween20。在一些实施方式中，裂解溶液可包括离子表面活性剂，例如肌氨酰和十二烷基硫酸钠(sds)。电穿孔、热的、声学的或机械的细胞分裂也可用于某些实施方式中，例如，基于非乳液的分配，例如可作为液滴划分的补充或代替液滴划分的分析物的封装，在细胞破裂后，囊膜的任何孔体积足够小以保留给定大小的核酸片段。[1130]可与分区中的分析物共划分的其它物质的实例包括但不限于dna酶和rna酶失活剂或抑制剂(例如蛋白酶k)、螯合剂(例如edta)以及用于去除或以其它方式降低不同细胞裂解物组分对核酸后续加工的负活性或影响的其它试剂。其他试剂也可以被共划分，包括用于片段化dna的核酸内切酶、dna聚合酶和用于扩增核酸片段和将条形码分子标签附接到扩增的片段的dntp。[1131]其他试剂还可包括逆转录酶，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和寡核苷酸，以及可用于模板转换的转换寡核苷酸(在本文中也称为“转换寡核苷酸”或“模板转换寡核苷酸”)。在一些实施方式中，模板转换可用于增加edna的长度。模板转换可用于将预先定义的核酸序列附加到cdna。在模板转换的实例中，cdna可由模板(例如，细胞mrna)的逆转录产生，其中具有末端转移酶活性的逆转录酶可以非模板依赖的方式向cdna添加其它的核苷酸(例如，多聚(c))。转换寡核苷酸可以包括与其它核苷酸互补的序列，例如多聚(g)。cdna上的其它核苷酸(例如，多聚(c))可与转换寡核苷酸上的其它核苷酸(例如，多聚(g))杂交，由此转换寡核苷酸可被逆转录酶用作模板以进一步延伸cdna。[1132]模板转换寡核苷酸可以包括杂交区和模板区。杂交区可以包括能够与靶标杂交的任何序列。在一些情况中，杂交区包括一系列g碱基以与cdna分子3′端的突出端c碱基互补。连续g碱基可包括1个g碱基、2个g碱基、3个g碱基、4个g碱基、5个g碱基或超过5个g碱基。模板序列可以包括待纳入cdna的任何序列。在一些情况中，模板区包括至少1个(例如，至少2个、3个、4个、5个或更多)标签序列和/或功能序列。转换寡核苷酸可包括脱氧核糖核酸；核糖核酸；桥接核酸，修饰的核酸，包括2‑氨基嘌呤，2，6‑二氨基嘌呤(2‑氨基‑da)，逆序dt，5‑甲基dc，2′‑脱氧肌苷，超级t(5‑羟基丁炔基‑2′‑脱氧尿苷)，超级g(8‑氮杂‑7‑脱氮鸟苷)，锁核酸(lna)，未锁核酸(una，例如una‑a，una‑u，una‑c，una‑g)，iso‑dg，iso‑dc，2′氟碱基(例如氟c，氟u，氟a和氟g)，以及上述物质的组合。[1133]在一些实施方式中，与分析物划分的珠可包括结合到珠的不同类型的寡核苷酸，其中不同类型的寡核苷酸结合到不同类型的分析物。例如，珠可以包括一个或多个第一寡核苷酸(例如，可以是捕获探针)和一个或多个第二寡核苷酸(例如，可以是捕获探针)，第一寡核苷酸可以结合或杂交到第一类型的分析物，例如mrna，第二寡核苷酸可以结合或杂交到第二类型的分析物，例如gdna。分区还可以包括有助于从共划分的细胞释放核酸的裂解剂，并且还可以包括可以降解珠和/或破坏寡核苷酸和珠之间的共价键的剂(例如还原剂)，从而将寡核苷酸释放到分区中。释放的条码化寡核苷酸(也可以条码化)可以与从细胞释放的mrna以及从细胞释放的gdna杂交。[1134]由此由杂交形成的条码化构建体可包括第一类构建体，其包括对应于来自珠的原始条形码序列的序列和对应于来自细胞的转录物的序列，以及第二类构建体，其包括对应于来自珠的原始条形码序列的序列和对应于来自细胞的基因组dna的序列。然后可以从分区中释放/移出条码化构建体，并且在一些实施方式中，进一步加工以添加任何其他序列。然后可以对得到的构建体进行测序，对测序数据进行加工，并将结果用于在空间上表征来自细胞的mrna和gdna。[1135]在另一实例中，分区包括珠，其包括具有第一条形码序列的第一类寡核苷酸(例如，第一捕获探针)、可与mrna转录物的多聚(a)尾杂交的多聚(t)引发序列以及可独特地识别给定转录物的umi条形码序列。该珠还包括具有第二条形码序列的第二类寡核苷酸(例如，第二捕获探针)、能够与结合到划分细胞表面的抗体的第三条码化寡核苷酸(例如，分析物捕获剂)特异性杂交的靶向引发序列。第三条码化寡核苷酸包括独特地识别抗体的umi条形码序列(因此，它所结合的特定细胞表面特征)。[1136]在该示例中，第一和第二条码化寡核苷酸包括相同的空间条形码序列(例如，第一和第二条形码序列相同)，这使条码化核酸与分区的下游关联。然而，在一些实施方式中，第一和第二条码化序列不同。[1137]分区还可以包括有助于从细胞释放核酸的裂解剂，并且还可以包括可以降解珠和/或破坏条码化寡核苷酸和珠之间的共价键的剂(例如还原剂)，从而将它们释放到分区中。第一类释放的条码化寡核苷酸可与从细胞释放的mrna杂交，第二类释放的条码化寡核苷酸可与第三类条码化寡核苷酸杂交，形成条码化构建体。[1138]第一类条码化构建体包括与来自珠的第一条形码序列相对应的空间条形码序列和与来自第一类寡核苷酸的umi条形码序列相对应的序列，其识别细胞转录物。第二类条码化构建体包括与来自第二类寡核苷酸的第二条形码序列相对应的空间条形码序列和与第三类寡核苷酸(例如，分析物捕获剂)相对应的umi条形码序列，并用于识别细胞表面特征。然后可以从分区中释放/移出条码化构建体，并且在一些实施方式中，进一步加工以添加任何其他序列。然后对得到的构建体进行测序，对测序数据进行处理，结果用于表征细胞的mrna和细胞表面特征。[1139]前面的讨论涉及两个带有寡核苷酸的珠的具体例子，用于分析一个分区内的两种不同分析物。更一般地，被划分的珠可以具有先前描述的任何结构，并且可以包括所描述的用于分析分区内两个或更多个(例如，三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、八个或更多个、十个或更多个、12个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个，40个或更多个，50个或更多个)的不同类型的分析物的寡核苷酸的任何组合。用于同时分析分区内分析物的不同组合的具有不同类型寡核苷酸(例如，捕获探针)组合的珠的实例包括但不限于：(a)基因组dna和细胞表面特征(例如，使用本文所述的分析物捕获剂)；(b)mrna和谱系追踪构建体；(c)mrna和细胞甲基化状态；(d)mrna和可及染色质(例如，atac‑seq、dna酶‑seq和/或微球菌酶‑seq)；(e)mrna和细胞表面或细胞内蛋白质和/或代谢物；(f)条码化分析物捕获剂(例如，本文所述的mhc多聚体)和免疫细胞受体(例如，t细胞受体)的v(d)j序列；和(g)mrna和扰动剂(例如，crispr‑crrna/sgrna、talen、锌指核酸酶和/或本文所述的反义寡核苷酸)。在一些实施方式中，扰动剂可以是小分子、抗体、药物、适体、mirna、物理环境(例如，温度变化)，或任何其它已知扰动剂。[1140]另外，在一些实施方式中，如本文所述在分区或液滴内引入和加工的未聚集细胞或解聚细胞可从分区移出，与空间阵列接触，并根据本文所述方法进行空间条码化。例如，如本文所述，未聚集细胞样品的单细胞可被划分进入分区或液滴。分区或液滴可以包括使细胞透化、用细胞条形码条码化靶向的细胞分析物，以及扩增条码化的分析物的试剂。分区或液滴可以与本文所述的任何空间阵列接触。在一些实施方式中，分区可以被溶解，从而使分区的内容物被置于与空间阵列的捕获探针接触。空间阵列的捕获探针然后可以捕获来自破裂的分区或液滴中的目标分析物，并通过本文所述的空间工作流程进行处理。[1141](g)捕获的分析物的分析[1142](i)从阵列移出样品[1143]在一些实施方式中，在将生物样品与包括捕获探针的基材接触之后，可任选地进行移出步骤以从基材移出全部或部分生物样品。在一些实施方式中，移出步骤包括生物样品细胞的酶促和/或化学降解。例如，移出步骤可包括用酶(例如，蛋白酶，例如，蛋白酶k)处理生物样品以从基材去除生物样品的至少部分。在一些实施方式中，移出步骤可包括组织的消融(例如，激光消融)。[1144]在一些实施方式中，本文提供了用于从生物样品(例如，存在于生物样品中)空间检测分析物(例如，检测分析物的位置，例如，生物分析物)的方法，该方法包括：(a)任选地对基材上的生物样品进行染色和/或成像；(b)透化基材上的生物样品(例如，提供一种包含透化试剂的溶液)；(c)将生物样品与包含多个捕获探针的阵列接触，其中多个中的捕获探针捕获生物分析物；和(d)分析捕获的生物分析物，从而在空间上检测所述生物分析物；其中所述生物样品全部或部分地从所述基材移出。[1145]在一些实施方式中，不从基材移出生物样品。例如，在从基材释放捕获探针(例如，结合到分析物的捕获探针)之前，不从基材移出生物样品。在一些实施方式中，这种释放包括从基材上裂解捕获探针(例如，通过裂解域)。在一些实施方式中，这种释放不包括从基材释放捕获探针(例如，可以制备与分析物结合的捕获探针的拷贝，且该拷贝可从基材释放，例如，通过变性)。在一些实施方式中，生物样品从基材释放后，在分析结合到捕获探针的分析物之前，不从基材移出生物样品。在一些实施方式中，在从基材移出捕获探针期间和/或在从基材释放后分析结合到捕获探针的分析物期间，生物样品保持在基材上。在一些实施方式中，可以在不使生物样品经受细胞(例如透化的细胞)的酶促和/或化学降解或组织的消融(例如激光消融)的情况下进行对结合到来自基材的捕获探针的分析物的分析。[1146]在一些实施方式中，至少部分生物样品不从基材被移出。例如，在从基材释放捕获探针(例如，与分析物结合的捕获探针)和/或分析从基材释放的与捕获探针结合的分析物之前，生物样品的部分可以保留在基材上。在一些实施方式中，在分析结合到来自基材的捕获探针的分析物之前，生物样品的至少部分不经受细胞(例如透化的细胞)的酶促和/或化学降解或组织的消融(例如激光消融)。[1147]在一些实施方式中，本文提供了用于从生物样品(例如，存在于生物样品中)空间检测分析物(例如，检测分析物的位置，例如，生物分析物)的方法，其包括：(a)任选地对基材上的生物样品进行染色和/或成像；(b)透化基材上的生物样品(例如，提供一种包含透化试剂的溶液)；(c)将生物样品与包含多个捕获探针的阵列接触，其中多个中的捕获探针捕获生物分析物；和(d)分析捕获的生物分析物，从而在空间上检测所述生物分析物；其中所述生物样品未从基材移出。[1148]在一些实施方式中，本文提供用于从生物样品空间检测感兴趣的生物分析物的方法，其包括：(a)在基材上对生物样品进行染色和成像；(b)向基材上的生物样品提供包含透化试剂的溶液；(c)使生物样品接触基材上的阵列，其中所述阵列包括一个或多个捕获探针，从而使所述一个或多个捕获探针捕获感兴趣的生物分析物；和(d)分析所捕获的生物分析物，从而在空间上检测感兴趣的生物分析物；其中所述生物样品未从基材上移出。[1149]在一些实施方式中，该方法还包括选择生物样品中的感兴趣区域以进行空间转录组分析。在一些实施方式中，一个或多个捕获探针中的一个或多个包括捕获域。在一些实施方式中，一个或多个捕获探针复数中的一个或多个包含独特分子标识符(umi)。在一些实施方式中，一个或多个捕获探针中的一个或多个包括裂解域。在一些实施方式中，裂解域包含由尿嘧啶dna糖基酶、无嘌呤/无嘧啶(ap)核酸内切酶(ape1)、u尿嘧啶特异性切除试剂(user)和/或核酸内切酶viii识别和裂解的序列。在一些实施方式中，一个或多个捕获探针不包含裂解域并且不从阵列被裂解。[1150](ii)延伸的捕获探针[1151]在一些实施方式中，捕获探针可以被延伸(“延伸的捕获探针”，例如，如本文所述(例如，部分ii(b)(vii)))。例如，延伸捕获探针可以包括从捕获的(杂交的)rna生成cdna。该过程涉及合成杂交核酸的互补链，例如，基于捕获的rna模板(与捕获探针的捕获域杂交的rna)生成cdna。因此，在延伸捕获探针的初始步骤(例如cdna生成)中，捕获的(杂交的)核酸(例如rna)充当延伸的模板(例如逆转录步骤)。[1152]在一些实施方式中，捕获探针使用逆转录延伸。例如，逆转录包括使用逆转录酶从rna(例如信使rna)合成cdna(互补或拷贝dna)。在一些实施方式中，当组织仍在原位时进行逆转录，产生分析物文库，其中分析物文库包括来自邻近捕获探针的空间条形码。在一些实施方式中，捕获探针使用一种或多种dna聚合酶延伸。[1153]在一些实施方式中，捕获探针的捕获域包括用于产生与捕获探针杂交的核酸互补链的引物，例如，用于dna聚合酶和/或逆转录的引物。由延伸反应产生的核酸(例如dna和/或cdna)分子包含捕获探针的序列。捕获探针的延伸，例如dna聚合酶和/或逆转录反应，可以使用各种合适的酶和方案来进行。[1154]在一些实施方式中，产生全长dna(例如cdna)分子。在一些实施方式中，“全长”dna分子是指整个捕获的核酸分子。然而，如果核酸(例如rna)在组织样品中部分降解，则捕获的核酸分子将与组织样品中的初始rna长度不同。在一些实施方式中，延伸的探针的3′端(例如第一链cdna分子)被修饰。例如，接头或衔接子可以连接到延伸的探针的3′端。这可以通过使用单链连接酶如t4rna连接酶或circlegasetm(可从威斯康星州麦迪逊的艾匹森特生物技术公司(epicentrebiotechnologies)购得)来实现。在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸用于延伸cdna以产生全长cdna(或尽可能接近全长cdna)。在一些实施方式中，第二链合成辅助探针(能够与延伸的捕获探针的3′端杂交的部分双链dna分子)可以使用双链连接酶(例如t4dna连接酶)连接到延伸的探针的3′端，例如第一链cdna分子。适用于连接步骤的其他酶的其他酶在本领域中是已知的，并且包括例如tthdna连接酶、taqdna连接酶、热球菌属(菌株9°n)dna连接酶(9°ntmdna连接酶，新英格兰生物实验室(newenglandbiolabs))、ampligasetm(可从威斯康星州麦迪逊的艾匹森特生物技术公司(epicentrebiotechnologies)获得)和splintr(可从马萨诸塞州伊普斯维奇的新英格兰生物实验室获得)。在一些实施方式中，多核苷酸尾(例如多聚(a)尾)纳入延伸的探针分子的3′端。在一些实施方式中，使用末端转移酶活性酶纳入多核苷酸尾。[1155]在一些实施方式中，处理双链延伸的捕获探针以在扩增和/或分析(例如序列分析)之前去除任何未延伸的捕获探针。这可以通过多种方法实现，例如，使用酶降解未延伸的探针，例如核酸外切酶或纯化柱。[1156]在一些实施方式中，延伸的捕获探针被扩增以产生足以进行分析的量，例如通过dna测序。在一些实施方式中，延伸的捕获探针的第一链(例如，dna和/或cdna分子)用作扩增反应(例如，聚合酶链反应)的模板。[1157]在一些实施方式中，扩增反应使用包括亲和力基团的引物将亲和力基团纳入延伸的捕获探针(例如，rna‑cdna杂交)上。在一些实施方式中，所述引物包括亲和基团，所述延伸的捕获探针包括亲和基团。亲和基团可以对应于前面描述的任何亲和基团。[1158]在一些实施方式中，包括亲和基团的延伸的捕获探针可以耦合到亲和基团特异性的基材。在一些实施方式中，基材可包括抗体或抗体片段。在一些实施方式中，基材包括亲和素或链霉亲和素，并且亲和基团包括生物素。在一些实施方式中，基材包括麦芽糖，亲和基团包括麦芽糖结合蛋白。在一些实施方式中，基材包括麦芽糖结合蛋白，亲和基团包括麦芽糖。在一些实施方式中，只要延伸的探针的拷贝未固定到基材，则扩增延伸的捕获探针可以起到从基材表面释放延伸的探针的作用。[1159]在一些实施方式中，释放延伸的捕获探针或其互补物或扩增子。从基材表面释放延伸的捕获探针或其互补物或扩增子的步骤可以通过多种方式实现。在一些实施方式中，通过核酸裂解和/或变性(例如通过加热使双链分子变性)从阵列释放延伸的捕获探针或其互补物。[1160]在一些实施方式中，通过物理方式从基材的表面(例如阵列)释放延伸的捕获探针或其互补物或扩增子。例如，当延伸捕获探针被间接固定在阵列基材上时，例如通过与表面探针杂交，能足以破坏延伸捕获探针和表面探针之间的相互作用。破坏核酸分子之间相互作用的方法包括本领域已知的使双链核酸分子变性。释放dna分子(即剥离延伸探针阵列)的直接方法是使用干扰双链分子氢键的溶液。在一些实施方式中，通过施加加热的溶液(例如至少85℃的水或缓冲液，例如至少90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或99℃的水)来释放延伸的捕获探针。在一些实施方式中，添加包括盐、表面活性剂等可以进一步使核酸分子之间的相互作用不稳定的溶液以从基材释放延伸的捕获探针。[1161]在一些实施方式中，延伸的捕获探针包括裂解域，延伸的捕获探针通过裂解从基材表面释放。例如，延伸的捕获探针的裂解域可以通过本文所述的任何方法裂解。在一些实施方式中，在扩增延伸的捕获探针的步骤之前，例如通过裂解延伸的捕获探针中的裂解域，从基材表面释放延伸的捕获探针。[1162](iii)裂解域[1163]捕获探针可以任选地包括“裂解域”，其中捕获探针的一个或多个区段或区域(例如，空间条形码和/或umi)可以可释放地、可裂解地或可逆地附接到特征或其它基材，使得空间条形码和/或umi可以通过裂解捕获探针和特征之间的联接来释放或可释放，或者通过降解底层(underlying)基材或化学基材来释放，从而使裂解的捕获探针的空间条形码和/或umi被其他试剂触及或可触及，或者两者。裂解域的非限制性方面在本文中描述(例如，在部分ii(b)(ii)中)。[1164]在一些实施方式中，捕获探针(例如通过二硫键)连接到特征。在一些实施方式中，捕获探针通过丙烯基团(例如，间隔物c3)连接至特征。可以添加还原剂来破坏各个二硫键，从而释放包含空间条形码序列的捕获探针。在另一个示例中，加热也可能导致附接的捕获探针的降解和释放。在一些实施方式中，加热通过激光(例如，激光烧蚀)进行，从而特定位置处的特征可被降解。除了可热裂解键、二硫键、光敏键和紫外光敏感键之外，可耦合到捕获探针(即，空间条形码)的不稳定键的其他非限制性实例包括酯键(例如，可与酸、碱或羟胺裂解)、邻二醇键(例如，可通过高碘酸钠裂解)、diels‑alder键(例如，可通过热裂解)、砜键(例如，可通过碱裂解)、硅基醚键(例如，可通过酸裂解)、糖苷键(例如，可通过淀粉酶裂解)、肽键(例如，可通过蛋白酶裂解)或磷酸二酯键(例如，可通过核酸酶裂解(例如，dna酶))。[1165]在一些实施方式中，裂解域包括多聚(u)序列，其可由尿嘧啶dna糖基化酶(udg)和dna糖基化酶‑裂解酶内切酶viii(商业上称为usertm酶)的混合物裂解。在一些实施方式中，裂解域可以是单个u。在一些实施方式中，裂解域可以是可以用无碱基位点特异性核酸内切酶(例如，核酸内切酶iv或核酸内切酶viii)裂解的无碱基位点。[1166]在一些实施方式中，捕获探针的裂解域是捕获探针内的核苷酸序列，其例如通过光或热等物理方式、化学或酶促被特异地裂解。裂解域在捕获探针内的位置将取决于捕获探针是否固定在基材上，使得其具有能够作为延伸引物的游离3′端(例如，通过其5′或3′端)。例如，如果捕获探针被其5′端固定，则裂解域将位于空间条形码和/或umi的5′处，并且所述结构域的裂解导致捕获探针的部分(包括空间条形码和/或umi)和空间条形码3′的序列，和任选地部分裂解域，从特征释放。或者，如果捕获探针被其3′端固定，则裂解域将位于捕获域(和空间条形码)3′处，并且所述域的裂解导致捕获探针的部分(包括空间条形码和空间条形码3′的序列)从特征释放。在一些实施方式中，裂解导致裂解结构域的部分移出。在一些实施方式中，裂解导致裂解结构域的完全移出，特别是当捕获探针通过其3′端固定时，因为裂解结构域的部分的存在可能会干扰捕获域和目标核酸的杂交和/或其随后的延伸。[1167](iv)测序[1168]在来自样品的分析物已根据上述与基于一般空间细胞的分析方法相关的任何方法与捕获探针、分析物捕获剂或其他条码化寡核苷酸序列杂交或以其他方式结合之后，杂交/结合产生的条码化构建体通过测序进行分析以鉴定分析物。[1169]在一些实施方式中，如上文所述，通过与与细胞表面杂交、结合或关联或引入细胞的捕获探针或分析物捕获剂杂交直接对样品进行条码化，可对完整样品进行测序。或者，如上文所述，如果条码化样品已被分离成片段、细胞群或个体细胞，则可对个体片段、细胞群或细胞进行测序。如上所述，对于已通过珠划分进行条码化的分析物，可通过打破分区从分区中提取个体分析物(例如，细胞或细胞裂解后的细胞内容物)，然后通过测序来分析以识别分析物。[1170]多种不同的测序方法可用于分析条码化的分析物构建体。一般来说，测序的多核苷酸可以是例如，核酸分子，例如脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)，包括其变体或衍生物(例如，单链dna或dna/rna杂合体，以及具有核苷酸类似物的核酸分子)。[1171]多核苷酸的测序可以通过各种商业系统进行。更一般地，可以使用核酸扩增、聚合酶链反应(pcr)(例如，数字pcr和液滴数字pcr(ddpcr)、定量pcr、实时pcr、多重pcr、基于pcr的单重方法、乳液pcr)和/或等温扩增来进行测序。[1172]对遗传物质进行测序的方法的其他示例包括但不限于dna杂交方法(例如，southern印迹法)、限制性酶消化方法、sanger测序方法、下一代测序方法(例如，单分子实时测序、纳米孔测序和polony测序)，连接法和微阵列法。可使用的测序方法的其他示例包括靶向测序、单分子实时测序、外显子测序、基于电子显微镜的测序、面板测序、晶体管介导测序、直接测序、随机鸟枪测序、sanger双脱氧终止测序、全基因组测序，杂交测序、焦磷酸测序、毛细管电泳、凝胶电泳、双链体测序、循环测序、单碱基延伸测序、固相测序、高通量测序、大规模平行标记测序、低温共扩增pcr(cold‑pcr)、可逆染料终止子测序、双端测序、近期测序、核酸外切酶测序、连接测序、短读测序、单分子测序、合成测序、实时测序、反向终止子测序、纳米孔测序、454测序、solexa基因组分析仪测序、solidtm测序、ms‑pet测序及其任何组合。[1173]核酸分子(包括条码化核酸分子或其衍生物)的序列分析可以是直接的或间接的。因此，序列分析基材(可被视为经受序列分析步骤或过程的分子)可为条码化的核酸分子或其可为从其衍生的分子(例如，其互补物)。因此，例如，在测序反应的序列分析步骤中，测序模板可以是条码化的核酸分子，也可以是从其衍生的分子。例如，第一和/或第二链dna分子可以直接进行序列分析(例如测序)，即可以直接参与序列分析反应或过程(例如测序反应或测序过程，或者是被测序或以其他方式识别的分子)。或者，可在序列分析(例如，通过另一技术进行测序或鉴定)之前对条码化核酸分子进行第二链合成或扩增的步骤。因此，序列分析底物(例如模板)可以是扩增子或条码化核酸分子的第二链。[1174]在一些实施方式中，双链分子的两条链可经序列分析(例如，测序)。在一些实施方式中，可以分析(例如测序)单链分子(例如条码化核酸分子)。为了进行单分子测序，可以在3′末端修饰核酸链。[1175]大规模平行焦磷酸测序技术可用于对核酸进行测序。在焦磷酸测序中，核酸在油溶液中的水滴内扩增(乳液pcr)，每个液滴包含单一的核酸模板，其附接在单一的涂有引物的珠上，然后形成克隆群体。测序系统包含许多皮升体积孔，每个孔包含一个珠和测序酶。焦磷酸测序使用荧光素酶产生光来检测添加到新生核酸中的个体核苷酸，并且组合数据用于产生序列读取。[1176]作为焦磷酸测序的另一个示例应用，释放的ppi可通过atp磺酰化酶立即转化为三磷酸腺苷(atp)来检测，并且产生的atp水平可通过荧光素酶产生的光子来检测，如ronaghi等anal.biochem.242(1)，84‑9(1996)；ronaghi，genomeres.11(1)，3‑11(2001)；ronaghi等，science281(5375)，363(1998)；以及美国专利号6,210,891，6,258,568和6,274,320所述，其全部内容通过引用纳入本文。[1177]在一些实施方式中，大规模平行测序技术可基于可逆染料终止剂。例如，首先将dna分子附接到例如玻璃或硅基材上的引物上，并进行扩增以形成局部克隆群体(桥式扩增)。添加四种类型的ddntp，并冲走未结合的核苷酸。与焦磷酸测序不同，由于阻断基团(例如，ddntp的糖部分上存在3′阻断基团)，dna一次仅延伸一个核苷酸。检测器获取荧光标记的核苷酸的图像，然后染料连同末端3′阻断基团从dna中化学去除，作为后续循环的前体。可以重复此过程，直到获得所需的序列数据。[1178]在一些实施方式中，通过检测在dna聚合期间释放的氢离子来进行测序。含有待测序的模板dna链的微孔可以充满单一类型的核苷酸。如果引入的核苷酸与前导模板核苷酸互补，则它被纳入生长的互补链。这会导致氢离子释放，从而触发超敏离子传感器，这表明发生了反应。若模板系列中存在均聚重复系列，单次循环中会纳入多个核苷酸。这导致对应数量的氢离子释放，和成比例的更高电子信号。[1179]在一些实施方式中，可以原位进行测序。原位测序方法特别有用，例如，当样品表面上的分析物(例如，细胞表面分析物)或样品内的分析物(例如，细胞内分析物)已被条码化后，生物样品保持完整。原位测序通常涉及以连续的、模板依赖的方式将标记的核苷酸(例如，荧光标记的单核苷酸或二核苷酸)纳入或将标记的引物(例如，标记的随机六聚体)杂交到核酸模板上，使得可以确定纳入的核苷酸或标记的引物延伸产物的核苷酸序列的相同性(即，核苷酸序列)，从而测定相应模板核酸的核苷酸序列。例如，在mitra等，(2003)anal.biochem.320，55‑65，和lee等，(2014)science，343(6177)，1360‑1363中描述了原位测序的各个方面，通过引用将其全部内容纳入本文。[1180]此外，pct专利申请公开号wo2014/163886、wo2018/045181、wo2018/045186和美国专利号10138509和10179932中描述了用于进行原位测序的方法和系统的示例，其全部内容通过引用纳入本文中。用于原位测序的示例技术包括但不限于starmap(例如在wang等，(2018)science，361(6499)5691中描述)、merfish(例如在moffitt，(2016)methodsinenzymology，572，1‑49中描述)和fisseq(例如在美国专利申请公开号2019/0032121中描述)。上述各参考文献的全部内容通过引用纳入本文。[1181]对于已通过划分进行条码化的分析物，条码化核酸分子或其衍生物(例如，已添加一个或多个功能序列的条码化核酸分子，或已从中移出一个或多个特征的条码化核酸分子)可汇集并一起加工以用于后续分析，例如在高分辨率测序仪上测序。可以使用条形码序列实现汇集处理。例如，给定分区的条码化核酸分子可以具有相同的条形码，这与其他空间分区的条形码不同。或者，可以分开处理不同分区的条码化核酸分子以进行后续分析(例如，测序)。[1182]在一些实施方式中，在捕获探针不包含空间条形码的情况下，可以在捕获探针从生物样品捕获分析物之后和分析分析物之前添加空间条形码。当在捕获分析物之后添加空间条形码时，可在扩增分析物之后添加条形码(例如，rna的逆转录和聚合酶扩增)。在一些实施方式中，分析物分析使用一个或多个捕获的分析物的直接测序，例如杂交的rna的直接测序。在一些实施方式中，在杂交的rna的逆转录之后进行直接测序。在一些实施方式中，在杂交的rna的逆转录的扩增之后进行直接测序。[1183]在一些实施方式中，通过合成测序(sbs)进行捕获的rna的直接测序。在一些实施方式中，测序引物与捕获探针的一个或多个域(例如，功能域)中的序列互补。在此类实施方式中，通过合成进行测序可包括逆转录和/或扩增以产生模板序列(例如，功能域)，其中引物序列可与模板序列结合。[1184]sbs可涉及将适当的引物(有时称为测序引物)与待测序的核酸模板杂交、延伸引物以及检测用于延伸引物的核苷酸。优选地，在进一步的核苷酸添加到生长的核酸链之前检测用于延伸引物的核酸，从而能进行逐碱基原位核酸测序。通过在引物延伸反应中包括一个或多个标记的核苷酸，有助于检测纳入的核苷酸。为了使适当的测序引物与待测序的核酸模板杂交，核酸模板通常应为单链形式。如果构成核酸特征的核酸模板以双链形式存在，则可使用本领域公知的方法(例如通过变性，裂解等)对其进行处理以提供单链核酸模板。与核酸模板杂交并用于引物延伸的测序引物优选短寡核苷酸，例如长度为15到25个核苷酸。测序引物可以以溶液或固定形式提供。一旦通过使核酸模板和测序引物经受适当条件将测序引物退火到待测序的核酸模板，则进行引物延伸，例如使用核酸聚合酶和核苷酸供应，其中至少一些以标记形式提供，以及如果提供合适的核苷酸，则适于引物延伸的条件。[1185]优选地，在每个引物延伸步骤之后，包括洗涤步骤以去除可干扰后续步骤的未纳入的核苷酸。一旦进行了引物延伸步骤，就对核酸群体进行监测，以确定标记的核苷酸是否已被纳入延伸的引物中。然后可以重复引物延伸步骤以确定下一个和随后纳入延伸的引物中的核苷酸。如果所确定的序列未知，应用于给定群体的核苷酸通常以选定的顺序应用，然后在整个分析过程中重复，例如datp、dttp、dctp、dgtp。[1186]可使用的sbs技术描述于例如，但不限于美国专利申请公开号2007/0166705，美国专利申请公开号2006/0188901，u.s.patent7,057,026，美国专利申请公开号2006/0240439，美国专利申请公开号2006/0281109，pct专利申请公开号wo05/065814，美国专利申请公开号2005/0100900，pct专利申请公开号wo06/064199，pct专利申请公开号wo07/010,251，美国专利申请公开号2012/0270305，美国专利申请公开号2013/0260372，和美国专利申请公开号2013/0079232中的技术，其全部内容通过引用纳入本文。[1187]在一些实施方式中，捕获的rna的直接测序通过顺序荧光杂交(例如，通过杂交进行测序)来进行。在一些实施方式中，原位进行rna与捕获探针杂交的杂交反应。在一些实施方式中，捕获的rna在与测序探针杂交之前不被扩增。在一些实施方式中，rna在与测序探针杂交之前被扩增(例如，逆转录到cdna和cdna的扩增)。在一些实施方式中，使用单分子杂交链式反应进行扩增。在一些实施方式中，使用滚动链扩增来进行扩增。[1188]顺序荧光杂交可包括探针的顺序杂交，包括简并引物序列和可检测的标记物。简并引物序列是能够与独立于所述核酸片段序列的任何核酸片段杂交的短寡核苷酸序列。例如，这种方法可以包括以下步骤：(a)提供包括四个探针的混合物，每个探针在5′端包括a、c、g或t，进一步包括长度为5到11个核苷酸的简并核苷酸序列，并且进一步包括对于在5′端有a、c、g或t的探针而言不同的功能域(例如，荧光分子)；(b)将步骤(a)的探针与目标多核苷酸序列相关联，其序列需求将通过该方法确定；(c)测量四个功能域的活性并记录活性的相对空间位置；(d)从目标多核苷酸序列移出来自步骤(a)‑(b)中的试剂；并且将步骤(a)‑(d)重复n个循环，直到确定每个珠的空间域的核苷酸序列，经过修改，步骤(a)中使用的寡核苷酸与靶多核苷酸序列的部分以及所述序列的部分侧接的位置1到n互补。由于条形码序列不同，在一些实施方式中，这些其它侧接序列是简并序列。来自阵列上每个点的循环1到n的荧光信号可用于确定目标多核苷酸序列的序列。[1189]在一些实施方式中，使用顺序荧光杂交对捕获的rna进行体外直接测序。在一些实施方式中，捕获的rna在与测序探针杂交之前被扩增(例如，逆转录到cdna和cdna的扩增)。在一些实施方式中，含有捕获的rna的捕获探针暴露于靶向rna编码区的测序探针。在一些实施方式中，一个或多个测序探针靶向每个编码区域。在一些实施方式中，测序探针被设计成与测序试剂(例如，染料标记的读出寡核苷酸)杂交。然后，测序探针可以与测序试剂杂交。在一些实施方式中，对测序反应的输出进行成像。在一些实施方式中，从测序反应的图像解析cdna的特定序列。在一些实施方式中，在与测序探针杂交之前进行对捕获的rna的逆转录。在一些实施方式中，测序探针被设计成靶向rna编码区的互补序列(例如，靶向cdna)。[1190]在一些实施方式中，使用基于纳米孔的方法直接对捕获的rna进行测序。在一些实施方式中，使用纳米孔直接rna测序进行直接测序，其中捕获的rna通过纳米孔易位。纳米孔电流可以被记录并转换成碱基序列。在一些实施方式中，捕获的rna在纳米孔测序期间保持附接到基材。在一些实施方式中，捕获的rna在纳米孔测序之前从基材释放。在一些实施方式中，其中感兴趣的分析物是蛋白质，可使用基于纳米孔的方法进行蛋白质的直接测序。可使用的基于纳米孔的测序方法的实例描述于deamer等，trendsbiotechnol.18，147‑151(2000)；deamer等，acc.chem.res.35：817‑825(2002)；li等，nat.mater.2：611‑615(2003)；soni等，clin.chem.53，1996‑2001(2007)；healy等，nanomed.2，459‑481(2007)；cockroft等，j.am.chem.soc.130，818‑820(2008)；以及美国专利号7,001,792。上述各参考文献的全部内容通过引用纳入本文。[1191]在一些实施方式中，使用通过连接的单分子测序来进行捕获的rna的直接测序。这种技术利用dna连接酶纳入寡核苷酸并鉴定这种寡核苷酸的纳入。寡核苷酸通常具有与寡核苷酸杂交的序列中的特定核苷酸的相同性相关的不同标记物。例如，在shendure等，science(2005)，309：1728‑1732和美国专利号5599675、5750341、6969488、6172218和6306597中描述了连接测序所涉及的方面和特征，其全部内容通过引用纳入本文中。[1192]在一些实施方式中，核酸杂交可用于测序。这些方法利用与条形码序列的至少部分互补的标记的核酸解码器探针。多重解码可以使用具有可分辨标签的许多不同探针的集来进行。例如在美国专利号8,460,865，和gunderson等，genomeresearch14：870‑877(2004)中描述了核酸杂交测序的非限制性实例，其全部内容通过引用纳入本文。[1193]在一些实施方式中，商用高通量数字测序技术可用于分析条形码序列，其中dna模板不是一次测序一个，而是在批量过程中测序，并且许多序列优选地以平行方式读出，或者也可以使用其自身可以平行化的超高通量串行过程。此类技术的实例包括测序(例如，基于流动池的测序技术)、使用修饰核苷酸的合成测序(例如在由加利福尼亚州圣迭戈的illumina公司的truseqtm和hiseqtm技术市售)，由马萨诸塞州剑桥的helicos生命科学集团提供的heliscopetm和加利福尼亚州门罗公园的太平洋生物科学公司提供的pacbiors)、离子检测技术测序(加利福尼亚州南旧金山的离子激流公司)和dna纳米球测序(加利福尼亚州山景城的完全基因组公司(completegenomics，inc.))。[1194]在一些实施方式中，在将核苷酸纳入延伸产物时释放的质子的检测可用于本文所述的方法中。例如，美国专利申请公开号2009/0026082、2009/0127589、2010/0137143和2010/0282617中描述的测序方法和系统可用于直接对条形码进行测序。[1195]在一些实施方式中，可在测序期间使用对dna聚合酶活性的实时监测。例如，如levene等，science(2003)，299，682‑686，lundquist等，opt.lett.(2008)，33，1026‑1028，和korlach等，proc.natl.acad.sci.usa(2008)，105，1176‑1181中所述，可通过荧光共振能量转移(fret)检测核苷酸纳入。上述各参考文献的全部内容通过引用纳入本文。[1196](v)时间分析[1197]在一些实施方式中，本文所述方法可用于随时间(例如，在用试剂处理之前或之后或不同分化阶段)评估细胞或生物样品中的分析物水平和/或表达。在一些示例中，本文所述的方法可以在于不同时间点(例如，在用药剂治疗之前或之后、分化的不同阶段、疾病进展的不同阶段、不同的对象的年龄，在物理扰动之前或之后，在用本文所述的扰动剂处理之前或之后，或者在对试剂产生抗性之前或之后)获得的多种相似生物样品或细胞上进行。如本文所述，“扰动剂”或“扰动试剂”可以是小分子、抗体、药物、适体、核酸(例如，mirna)、crisprcrrna/sgrna、talen、锌指核酸酶、反义寡核苷酸物理环境(例如，温度变化)和/或任何其它已知的扰动剂，其中该扰动剂改变平衡或体内稳态。[1198]在一些实施方式中，本文所述的方法可以对从对象获得的多个相似的生物样品或细胞进行2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。例如，多个相似的生物样品可以是来自相同对象、相同组织、相同类器官、相同细胞悬液或本文所述的任何其它生物样品的重复样品。在一些实施方式中，本文所述的方法可以在于不同时间点(例如，在用扰动剂治疗之前或之后、分化的不同阶段、疾病进展的不同阶段、对象的不同年龄，或在对药剂产生抗性之前或之后)获得的相同生物样品或细胞上进行。在一些实施方式中，扰动剂可以是小分子，抗体、核酸、肽和/或其它外部刺激(例如，温度变化)。在一些实施方式中，生物样品在每个时间点与不同的阵列接触。[1199]在一些实施方式中，可将样品置于允许细胞生长和/或维持和/或防止缺氧的受控环境中。在一些实施方式中，受控环境允许在不同时间点分析样品。条码化阵列可以置于样品附近(例如，顶部)并使用显微镜或其它合适的仪器成像以配准生物样品与条码化阵列的相对位置，任选地使用光学编码基准标志物。可以施加电场一段时间，从而使生物分析物(例如，dna、rna、蛋白质、代谢物、小分子、脂质等)从样品中释放并被空间条码化阵列上的捕获探针捕获，保存样品的空间信息。条码化阵列可以被移出，并且确定其中的空间和分子信息(例如，通过进行用于下一代测序或原位测序的文库构建)。测序之后可以进行计算分析以关联分子信息(例如，基因表达值与空间条形码)。这些步骤可以重复一次或多次以捕获分析物在不同时间点的空间信息。[1200]在一些实施方式中，如本文所述的方法可以与细胞迁移测定组合。细胞迁移测定可以包括一个或多个微打印线或悬浮的3d纳米纤维，细胞在其上迁移。可以通过对细胞迁移进行成像和/或将迁移的细胞与空间条码化阵列接触来使用这些测定法测量迁移。用于细胞迁移测定的阵列可以在阵列的基材上包含一个或多个通道，例如以将细胞迁移限制在沿基材的一维。此外，通道可以引导细胞的迁移，从而使它不接触阵列上的另一个细胞(例如，通道彼此不重叠)，并且在一些实施方式中，通道的宽度与细胞大致相同或比细胞更宽(例如，对于哺乳动物细胞，一个通道可以具有约2μm到约10μm的宽度)。可以使用本文所述的任何方法来识别空间条码化阵列上的细胞位置。[1201]在一些实施方式中，细胞可以布置在如本文所述的阵列上并允许迁移。细胞迁移测定中的细胞迁移可用于测量目标表型(例如，侵袭性表型)。在一些实施方式中，可以测量细胞迁移距离并将其与生物分析物相关联。可以将试剂添加到阵列中以促进细胞迁移。例如，阵列可以用一种或多种细胞外基质(ecm)成分(例如基材膜提取物(bme)、层粘连蛋白i、胶原蛋白i、胶原蛋白iv、纤连蛋白、玻连蛋白、弹性蛋白)、细胞培养基、化学引诱剂、化学驱除剂或它们的组合被覆。在一些实施方案中，试剂例如化学引诱剂或化学驱除剂可以仅布置在阵列的部分上，以沿着阵列的一个或多个轴或通道的梯度或其组合形式存在。[1202](vi)空间解析分析物信息[1203]在一些实施方式中，查找表(lut)可用于将特征的一个特性与另一个特性相关联。这些性质包括，例如，位置、条形码(例如，核酸条形码分子)、空间条形码、光学标记物、分子标签和其他性质。[1204]在一些实施方式中，查找表可以将核酸条形码分子与特征相关联。在一些实施方式中，特征的光学标记物可使将特征与生物颗粒(例如，细胞或细胞核)相关联。特征与生物颗粒的关联可进一步允许将生物颗粒的核酸分子的核酸序列与生物颗粒的一个或多个物理性质(例如，细胞的类型或细胞的位置)相关联。例如，基于条形码和光学标记物之间的关系，光学标记物可用于确定特征的位置，从而将特征的位置与特征的条形码序列相关联。后续分析(如测序)可将条形码序列与样品中的分析物相关联。因此，基于位置和条形码序列之间的关系，可以确定生物分析物(例如，在特定类型的细胞中或在生物样品的特定位置的细胞中)的位置。[1205]在一些实施方式中，特征可以具有附接在其上的多个核酸条形码分子。多个核酸条形码分子可以包括条形码序列。附接至给定特征的多个核酸分子可以具有相同的条形码序列，或者具有两个或更多个不同的条形码序列。可以使用不同的条形码序列来提高空间定位精度。[1206]如上所述，可以进一步处理从样品获得的分析物，例如rna、dna、肽、脂质和蛋白质。特别地，来自样品的个体细胞的内容物可以提供独特空间条形码序列，使得在对分析物进行表征时，可以将分析物归因于来自同一细胞。更一般地，空间条形码可用于将分析物归属于样品中相应的空间位置。例如，多个空间条形码的分层空间定位可用于识别和表征样品特定空间区域上的分析物。在一些实施方式中，空间区域对应于先前识别的特定感兴趣空间区域，例如，先前确定的细胞结构的特定结构。在一些实施方式中，空间区域对应于肉眼无法看到的小结构或细胞组。在一些实施方式中，独特分子标识符可用于在单细胞水平上识别和表征分析物。[1207]所述分析物可以包括核酸分子，所述核酸分子可以用核酸条形码分子的条形码序列进行条码化。在一些实施方式中，可以对条码化的分析物进行测序以获得核酸序列。在一些实施方式中，核酸序列可包括与样品相关的遗传信息。核酸序列可以包括条形码序列或其互补序列。核酸序列的条形码序列或其互补物可以电子方式与分析物的性质(例如，颜色和/或强度)相关联，使用lut以识别阵列中的相关特征。[1208](vii)邻近捕获[1209]在一些实施方式中，存在于生物样品中的一个或多个分析物的二维或三维空间概况分析可使用邻近捕获反应来进行，该反应是检测在空间上彼此接近和/或相互作用的两个分析物的反应。例如，邻近捕获反应可用于检测空间上彼此接近的dna序列，例如，dna序列可在同一染色体内，但相隔约700bp或更小。作为另一个示例，邻近捕获反应可用于检测蛋白质关联，例如相互相互作用的两种蛋白质。可以原位进行邻近捕获反应以检测在空间上彼此接近和/或在细胞内彼此相互作用的两种分析物。邻近捕获反应的非限制性示例包括dna纳米检查、dna显微镜检查和染色体构象捕获方法。染色体构象捕获(3c)和衍生实验程序可用于估计不同基因组元素之间的空间接近度。染色质捕获方法的非限制性示例包括染色体构象捕获(3‑c)、芯片构象捕获(4‑c)、5‑c、chia‑pet、hi‑c、靶向染色质捕获(t2c)。例如，在miele等，methodsmolbiol.(2009)，464，simonis等，nat.genet.(2006)，38(11)：1348‑54，raab等，embo.j.(2012)，31(2)：330‑350，和eagen等，trendsbiochem.sci.(2018)43(6)：469‑478中描述了此类方法的实例，其全部内容通过引用纳入本文。[1210]在一些实施方式中，邻近捕获反应包括邻近连接。在一些实施方式中，邻近连接可包括使用具有可参与连接、复制和序列解码反应的附接的dna链的抗体。例如，邻近连接反应可包括附接到抗体对上的寡核苷酸，如果抗体已接近每一寡核苷酸(例如通过结合相同的靶蛋白(复合物))则可通过连接将其接合，并且形成的dna连接产物随后用于模板pcr扩增，如等，methods.(2008)，45(3)：227‑32所述，其全部内容通过引用纳入本文。在一些实施方式中，邻近连接可包括染色体构象捕获方法。[1211]在一些实施方式中，对彼此之间约400nm距离(例如，约300nm、约200nm、约150nm、约100nm、约50nm、约25nm、约10nm或约5nm)内的分析物进行接近捕获反应。通常，邻近捕获反应可以是可逆的或不可逆的。[1212](viii)从阵列移出特征[1213]空间条码化阵列可以与生物样品接触以空间检测生物样品中存在的分析物。在一些实施方式中，可以从基材表面移除特征(例如凝胶垫、珠)以进行其它分析(例如成像、测序或量化)。在一些实施方式中，特征(例如凝胶垫、珠)可以通过机械反应(例如刮擦)、通过酶促反应或通过化学反应移除。在一些实施方式中，特征(例如，凝胶垫、珠)可以被抽吸。在一些实施方式中，在特征被移除(通过任何方法)之后，特征可以与独特条码化珠结合。在一些实施方式中，特征内的寡核苷酸可与条码化珠上的条形码序列连接或杂交。例如，特征内的空间条形码寡核苷酸可以连接到条码化珠上的条形码序列。此外，捕获探针可以连接到条码化珠上的条形码序列。在一些实施方式中，特征和珠可以被划分。在一些实施方式中，特征(例如，凝胶垫、珠)和独特条码化珠可被划分进入囊泡。在一些实施方式中，囊泡可具有脂质双层。在一些实施方式中，特征和珠可以被包封。在一些实施方式中，特征和珠可以包封在油乳液中。在一些实施方式中，特征和珠可以包封在油包水乳液中。一旦被划分，特征(例如，凝胶垫、珠)可以被处理用于进一步分析(例如，测序)，根据本文所述的任何方法。[1214](ix)其它应用[1215]本文所述的空间分析方法可用于检测和表征生物样品中一种或多种单倍型的空间分布。如本公开中所使用的，单倍型用于描述基因组的给定区段中的一个或多个突变、dna变异、多态性，其可用于对遗传区段，或包含单核苷酸多态性(snp)的等位基因或遗传区段的集合进行分类。单倍型关联研究用于更好地了解生物状况。例如，在人类推定的疾病基因座处或与之相关的单倍型变异体的鉴定和表征可以为了解疾病易感性的遗传原因提供基础。本领域中使用的术语“基因座(locus)”(复数“基因座(loci)”)可以是染色体上的固定位置，包括基因或遗传标志物的位置，其可以包含多个单倍型，包括等位基因和snp。[1216]变异单倍型检测是一种用于在单细胞研究中识别杂合细胞的技术。结合空间分析，变异单倍型检测可以进一步提供关于受各种生物状况影响或表现出各种生物状况的生物样品(例如，组织)中杂合细胞分布的新信息。这些数据可揭示变异单倍型与疾病结果之间的因果关系，以帮助识别疾病相关变异，或揭示生物样品中的异质性。[1217]在一些实施方式中，变异单倍型检测是可与本文所述的空间分析方法结合使用、附加于本文所述的空间分析方法或作为其部分使用的技术。简而言之，变异单倍型检测可以包括提供用于在计算机系统上进行算法的输入，以及进行分析以识别和确定单倍型的空间分布。一个输入可以是从与生物样品接触并随后与基因组比对的二维空间阵列获得的多个序列读数。序列读数还可以包含带有位置信息的空间条形码，这样序列读数可以映射到生物样品上的某个位置。其它输入可以包括基因序列变异或单倍型的电子数据文件，以及参考基因组。对于每个基因座，将相应的序列读数和变异单倍型进行比对以确定每个序列读数的单倍型同一性。然后对序列读数的单倍型特征(haplotypeidentity)和空间条形码进行分类，以确定生物样品中单倍型的空间分布。如上所述，该空间分布可用于表征样品的生物学状况。在一些实施方式中，序列读数是通过对基材上的二维位置阵列进行原位测序获得的，而在一些实施方式中，序列读数是通过高通量测序获得的。在一些实施方式中，使用用于生成本文所述的序列读数的其它方法，例如配对末端测序。[1218]在一些实施方式中，多个基因座中的各个基因座是双等位基因的并且各个基因座的相应单倍型组由第一等位基因和第二等位基因组成。在一些此类实施方式中，相应基因座包括杂合单核苷酸多态性(snp)、杂合插入或杂合缺失。[1219]在一些实施方式中，可以通过原位测序方法分析(例如，测序)由本文所述的任何空间分析方法捕获的分析物。例如，包括直接或间接(例如，通过特征)附接的多个捕获探针(例如，阵列)的基材，其包括空间条形码和捕获域。在一些实施方式中，捕获域可以被设置为与分析物(例如，mrna)相互作用(例如，杂交)。在一些实施方式中，生物样品可以与阵列接触，从而使捕获探针的捕获域与分析物相互作用(例如，杂交)。在一些实施方式中，捕获探针可用作与捕获的分析物进行杂交或连接反应的模板。例如，可以使用本文所述的任何示例性逆转录酶进行逆转录反应以延伸与分析物杂交的捕获探针的3′端，由此产生延伸的捕获探针(例如，包括空间条形码和与分析物中的序列互补的序列的延伸的捕获探针)。在合成延伸捕获探针后，可以合成与延伸捕获探针互补的第二链。在一些实施方式中，可以使用本文所述的任何方法进行第二链合成。在一些实施方式中，当产生延伸捕获探针或第二链或两者时，可以使用胺修饰的核苷酸。例如，胺修饰的核苷酸可以是氨基烯丙基(aa)‑dutp、aa‑dctp、aa‑dgtp和/或aa‑datp。[1220]在一些实施方式中，在产生延伸捕获探针，第二链或两者之后延伸捕获探针和/或第二链两者可以从基材表面释放。例如，延伸的捕获探针和/或第二链可以通过本文所述的任何方法(例如，加热或通过裂解域的裂解)释放。在一些实施方式中，纳入延伸捕获探针中的胺修饰核苷酸可交联至基材表面或利用其胺修饰核苷酸交联至生物样品。在一些实施方式中，基材的表面可以被覆有水凝胶。在一些实施方式中，基材的表面可以被覆有蛋白质基质。在一些实施方式中，交联可以是不可逆的。在一些实施方式中，交联的延伸捕获探针和/或第二链可以被环化。例如，环状模板连接可以通过dna连接酶(例如，t4dna连接酶)进行，或者环状无模板连接可以通过不依赖模板的连接酶(例如，circligase)进行。在一些实施方式中，延伸捕获探针用circligase环化。在一些实施方式中，可以扩增环化的延伸捕获探针。例如，可以用合适的dna聚合酶(例如)进行滚环扩增。在一些实施方式中，捕获探针包括功能域(例如，测序接头)。在一些实施方式中，可以用与功能域互补的引物(例如，测序接合物)进行滚环扩增。在一些实施方式中，可以进行滚环扩增以产生两个或更多个扩增子(例如，一个或多个扩增子包括本文所述的任何胺修饰的核苷酸)。在一些实施方式中，通过滚环扩增产生的两个或更多个扩增子可以交联至基材表面和/或交联至生物样品。在一些实施方式中，两个或更多个扩增子可以被原位测序。原位测序可以通过本文所述的任何方法进行(参见，lee，j.h.，用于基因表达概况分析的rna的荧光原位测序(fisseq)(fluorescentinsitusequencing(fisseq)ofrnaforgeneexpressionprofiling)，natprotoc.，10(3)：442‑458，doi：10.1038/nprot.2014.191(2015)，其通过引用方式纳入本文)。在一些实施方式中，两个或更多个扩增子可以被成像。[1221]在一些实施方式中，可以通过本文所述的任何方法对核糖体rna(rrna)进行空间分析，包括内源核糖体rna(例如，生物样品天然有的)和/或外源rna(例如也存在于生物样品中的微生物核糖体rna和/或病毒rna)。如本文所用，“宏基因组学”可以指对生物样品中存在的外源核酸(例如，dna、rna或本文所述的其它核酸)的研究。如本文所用，“空间宏基因组学”可以指对生物样品中存在的外源核酸的空间位置的研究。空间宏基因组学还可以指鉴定生物样品中存在的一种或多种物种(例如，病毒或微生物)和/或鉴定物种之间的接近性(例如，共定位)模式的研究。[1222]在一些实施方式中，微生物rrna可以从生物样品中空间检测、定量和/或扩增。在一些实施方式中，rrna(例如，16s核糖体rna)可与特定微生物物种相关联。例如，微生物核糖体rna(例如16s核糖体rna)可用于鉴定生物样品中存在的一种或多种微生物(参见例如kolbert，c.p.和persing，d.h.，核糖体dna测序作为工具用于鉴定细菌病原体(ribosomaldnasequencingasatoolforidentificationofbacterialpathogens)，currentopinioninmicrobiology.2(3)：299‑305.doi：10.1016/s1369‑5274(99)80052‑6.pmid10383862(1999)，其通过引用方式纳入本文)。在一些实施方式中，可以鉴定与一种或多种其它微生物物种接近的微生物物种的鉴定。[1223]在一些实施方式中，基材可以用可光交联的覆层(例如，条件溶解的聚合物，例如，dtt敏感水凝胶)覆盖(例如，被覆)。生物样品可以与可光交联的被覆基材接触。在一些实施方式中，将生物样品和可光交联的基材组装成流动池，并且可将可光交联的聚合物与生物样品一起孵育。可以使用光源和光掩模将生物样品交联成限定尺寸的水凝胶体素。在一些实施方式中，流动池可以被拆卸和洗涤以移除未聚合的水凝胶。可光交联覆层可以用dtt处理以产生单细胞分区或近似单细胞分区。[1224]在一些实施方式中，单细胞或近似单细胞分区可被包封在囊泡中。囊泡可包含条码化特征(例如，珠)，且条码化特征可包含捕获域。在一些实施方式中，捕获域可以捕获微生物rrna(例如，微生物16srrna)。在一些实施方式中，捕获的微生物rrna可以通过本文所述的任何方法进行扩增和分析(例如，测序)。在一些实施方式中，经扩增和测序的微生物rrna可以鉴定微生物物种和/或一种或多种物种的接近(例如，共定位)模式。[1225]或者，可用基材(例如阵列)上的多个捕获探针对外源rrna(例如微生物或病毒)进行空间分析，其中捕获探针包括空间条形码和捕获域。在一些实施方式中，捕获域可以被设置为与生物样品中存在的微生物rrna相互作用(例如，杂交)。捕获探针可以设置为与任何微生物rrna相互作用。在一些实施方式中，捕获探针被设置为与微生物16srrna相互作用。可以处理(例如，透化)生物样品，从而使捕获域和分析物(例如，微生物rrna)相互作用(例如，杂交)。在一些实施方式中，捕获的分析物(例如微生物rrna)可以被逆转录产生第一链cdna，然后进行本文所述的第二链cdna合成。第一链cdna和/或第二链cdna可以包括部分或全部捕获探针序列，或其互补序列。捕获探针序列或其互补序列可以包括空间条形码或其互补序列。在一些实施方式中，第一链cdna和任选的第二链cdna可以通过本文所述的任何方法扩增。扩增的捕获探针和分析物可以通过本文所述的任何方法进行分析(例如，测序)。空间条码化特征的空间信息可用于确定生物样品中捕获的分析物(例如，微生物rrna)的空间位置。在一些实施方式中，捕获的分析物可以识别生物样品中存在的微生物物种。在一些实施方式中，生物样品中存在的微生物物种的空间信息和身份可以相互关联，从而揭示能否发现某些微生物物种彼此接近(例如，共定位)。[1226]本文提供了用于对生物样品内的分析物进行空间分析的方法。生物样品(例如，单个细胞、细胞群、组织切片等)的概况可以与其它细胞(例如，“正常”或“健康”的生物样品)的概况进行比较。在本文描述的用于对分析物进行空间概况分析的任何方法的一些实施方式中，该方法可以提供疾病(例如，癌症、阿尔茨海默病、帕金森病)的诊断。在本文描述的用于对分析物进行空间概况分析的任何方法的一些实施方式中，该方法可用于药物筛选。在本文描述的用于对分析物进行空间概况分析的任何方法的一些实施方式中，该方法可用于用类器官进行药物筛选。在本文描述的用于对分析物进行空间概况分析的任何方法的一些实施方式中，该方法可用于检测(例如，改变的)细胞信号转导的变化。在本文描述的用于对分析物进行空间概况分析的任何方法的一些实施方式中，该方法可以包括将病原体引入生物样品和评价生物样品对病原体的反应。在本文所述的用于空间概况分析分析物的任何方法的一些实施方式中，所述方法包括将生物样品暴露于扰动剂(例如，本文所述的任何扰动剂)并评估生物样品对扰动剂的响应。在本文描述的用于对分析物进行空间概况分析的任何方法的一些实施方式中，这些方法包括监测生物样品(例如类器官)中的细胞分化。在本文描述的用于对分析物进行空间概况分析的任何方法的一些实施方式中，该方法包括分析组织形态发生。在本文描述的用于对分析物进行空间概况分析的任何方法的一些实施方式中，该方法包括鉴定生物样品中的空间异质性(例如，鉴定生物样品中的不同细胞类型或群体)。在本文描述的用于空间概况分析分析物的任何方法的一些实施方式中，该方法包括分析分子事件的时空顺序(例如，时间)。例如，对分析物进行空间概况分析的方法可以包括监测疾病过程中的表达水平。[1227]本文提供的方法还可用于确定对象中炎症的相对水平(例如，确定炎症评分)或对象对治疗的反应或对治疗的抗性的发展。本文所述的方法还可用于鉴定潜在治疗干预的候选靶标和/或鉴定与对象的不同疾病状态相关的生物标志物。[1228](h)质量控制[1229](i)对照样品[1230]如本文所用，术语“对照样品”通常是指不溶于水性液体的基材，其允许将测试分析物准确且可追踪地定位在基材上。对照样品可以是本领域技术人员已知的任何合适的基材。示例性对照样品包含半多孔材料。半多孔材料的非限制性示例包括硝化纤维素膜、水凝胶和尼龙过滤器。[1231]对照样品可以具有任何合适的尺寸或体积(例如，大小或形状)。在一些实施方式中，对照样品是规则形状(例如，正方形、圆形或矩形)。在一些实施方式中，对照样品的表面具有任何合适的形式或形态。例如，对照样品的表面可以是平坦的或弯曲的(例如，朝向基材和对照样品之间发生相互作用的区域凸出地或凹入地弯曲)。在一些实施方式中，对照样品具有圆角(例如，为了增加安全性或稳健性)。在一些实施方式中，对照样品具有一个或多个截止角(例如，用于滑动夹或交叉台)。[1232]对照样品可包含多种测试分析物。在一些实施方式中，多种测试分析物的成员以已知量和已知位置布置在基材上。例如，多种测试分析物以已知量布置在对照样品的一个或多个位置处。在一些实施方式中，多种测试分析物以限定的图案(例如，x‑y网格图案)布置在基材上。在一些实施方式中，限定的图案包括一个或多个位置或点。[1233]在一些实施方式中，每个位置包含多个相同种类的测试分析物。在一些实施方式中，每个位置包含多个一种或多种不同种类的测试分析物。在一些实施方式中，对照样品上的每个位置代表生物样品例如组织样品的不同区域。在一些实施方式中，对照样品上不包含多种测试分析物的区域代表不存在生物样品的区域。[1234]在一些实施方式中，多种测试分析物包括一种或多种测试分析物，例如，第一测试分析物、第二测试分析物、第三测试分析物、第四测试分析物等。在一些实施方式中，多种测试分析物包括核酸。在一些实施方式中，每个位置或特征包含核酸序列的群。在一些实施方式中，第一测试分析物的核酸序列与第二测试分析物的核酸序列的不同之处在于单个核酸残基。在一些实施方式中，每个位置或特征包含一群rna转录物和一种或多种特异性表面标志物蛋白质或一种或多种crispr引导rna。在一些实施方式中，多种测试分析物包括细菌人工染色体(bac)。在一些实施方式中，对照样品上的每个位置都包含独特的bac混合物。在一些实施方案中，蛋白质与bac交联，例如，以模拟dna上的组蛋白结合。[1235]在一些实施方式中，第一测试分析物的浓度不同于对照样品上不同位置或特征处的第二测试分析物的浓度。在一些实施方式中，第一测试分析物和第二测试分析物包含相同的核苷酸序列。[1236](ii)空间rna完整性数(srin)[1237]如本文所用，术语“空间rna完整性数”或“srin”是指基于完整性评分的rna质量的原位指示。较高的srin分数与本文所述的空间分布分析中较高的数据质量相关。例如，与srin分数低于第一个生物样品的第二个生物样品相比，具有高srin分数的第一个生物样品将具有更高的数据质量。在一些实施方式中，针对组织切片、组织切片的一个或多个区域或单个细胞计算srin。[1238]在一些实施方式中，给定生物样品(例如，组织切片、组织的一个或多个区域或单细胞)的一个或多个srin通过以下方式计算：(a)提供(i)包括基材上多个捕获探针的空间阵列，其中捕获探针包含捕获域，和(ii)用组织学染色剂(例如，本文所述的任何染色剂)染色的组织；(b)将空间阵列与生物样品(例如，组织)接触；(c)用捕获域从生物样品(例如，组织)中捕获生物分析物(例如，18srrna分子)；(d)从捕获的生物分析物(例如18srrna)生成cdna分子；(e)使一种或多种标记的寡核苷酸探针与cdna杂交；(f)对标记的cdna和组织学染色剂(例如，本文所述的任何染色剂)成像，和(g)生成空间阵列中某个位置的空间rna完整性数，其包括对于该位置的标记的cdna图像和组织学染色剂(例如，本文所述的任何染色剂)图像的分析。[1239]在一些实施方式中，生物样品(例如，组织)用组织学染色剂染色。如本文所用，“组织学染色剂”可以是本文所述的任何染色剂。例如，生物样品可以用本文所述的if/ihc染色剂染色。例如，生物样品(例如，组织)可以用苏木精和曙红(“h&e”)染色。在一些实施方式中，在用标记的寡核苷酸探针标记cdna之前、之时或之后，用组织学染色剂(例如，本文所述的任何染色剂)染色生物样品(例如，组织)。在一些实施方式中，染色的生物样品可以任选地脱色(例如，在hcl中洗涤)。例如，在进一步处理之前，可以通过在稀释的hcl(0.01m)中洗涤来任选地从生物样品中去除来自h&e染色剂的苏木精。在一些实施方式中，染色的生物样品可以任选地在成像之后和透化之前脱色。[1240]在一些实施方式中，空间阵列包括固定在基材上的多个捕获探针，其中捕获探针包括至少一个捕获域。在一些实施方式中，捕获域包括多聚(t)序列。例如，捕获域包括能够从生物样品中捕获18srrna转录物的多聚(t)序列。[1241]在一些实施方式中，计算生物样品的一个或多个空间rna完整性数包括将至少一种(例如，至少两种、至少三种、至少四种或至少五种)标记的寡核苷酸探针与从18srrna产生的cdna杂交。在一些实施方式中，标记的寡核苷酸探针包括与18scdna的部分互补的序列。在一些实施方式中，四个标记的寡核苷酸探针(p1‑p4)被设计成在跨越18srrna的整个基因体的四个不同位置杂交。在一些实施方式中，标记的寡核苷酸探针可包括如本文所述的任何可检测标记物。例如，寡核苷酸标记的探针可以包括荧光标记(例如，cy3)。在一些实施方式中，被设计为与18scdna序列内不同位置互补的一种或多种标记的寡核苷酸探针包括相同的可检测标记物。例如，四个标记的寡核苷酸探针，(p1‑p4)，每个都被设计为与18scdna序列内的不同位置具有互补性，都可以具有相同的可检测标记物(例如，cy3)。在一些实施方式中，被设计为与18scdna序列内不同位置互补的一种或多种标记的寡核苷酸探针包括不同的可检测标记物。例如，各自设计为与18scdna序列内的不同位置具有互补性的四个标记的寡核苷酸探针(p1‑p4)可以包括不同的可检测标记物。[1242]在一些实施方式中，确定生物样品(例如，组织切片、组织的一个或多个区域或单个细胞)的空间rna完整性数包括分析对于相同位置的获自空间阵列和组织学染色剂(例如，本文所述的任何染色剂)的图像。例如，对于空间阵列，在荧光标记的(例如，cy3)寡核苷酸探针已与18scdna杂交之后，通过用激光(例如，532nm波长)扫描来生成所有图像。每个探针生成一张图像(p1‑p4)，并且在其中没有荧光标记的探针杂交的情况下(p0)生成一张图像。荧光单位(fu)数据的归一化是通过减去用p0记录的自发荧光并除以p1来进行的。对齐后，五个图像(每个探针一个图像，p1‑p4，和来自没有结合探针的区域的一个图像)被加载到脚本中。该脚本生成两个不同的图，一个空间rin值的热图和一个图像对齐误差图，它结合了组织学染色剂(例如，本文描述的任何染色剂)图像。图像对齐误差图用于观察哪些像素和位置由于p0‑p4图像之间的对齐误差而应从分析中排除。[1243]iii.一般空间细胞型分析方法[1244](a)条码化生物样品[1245]在一些实施方式中，本文提供用于将具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，肽、脂质或核酸分子)附接和/或引入生物样品(例如，生物样品中的细胞)以用于空间分析的方法和材料。在一些实施方式中，将具有多个条形码(例如，多个空间条形码)的多个分子(例如，多个核酸分子)引入生物样品(例如，生物样品中的多个细胞))用于空间分析。[1246]图18是描绘利用分析物结合部分与细胞表面的共价偶联或与细胞膜元件的非共价相互作用的细胞加标(celltagging)的示意图。图18列出了共价分析物结合部分/细胞表面相互作用的非详尽示例，包括蛋白质靶向、利用nhs化学的胺偶联、氰尿酰氯、通过马来酰亚胺添加的硫醇偶联，以及通过点击化学靶向在细胞表面表达的糖蛋白/糖脂。与细胞膜元件的非共价相互作用的非穷举实例包括脂质修饰的寡核苷酸、细胞膜的生物相容性锚定物(bam，例如，油烯基‑peg‑nhs)、脂质修饰的阳性中性聚合物和膜蛋白抗体。细胞标签可与分析物捕获剂和可裂解或不可裂解的空间条码化捕获探针结合使用，用于空间和多重化应用。[1247]在一些实施方式中，将具有多个条形码(例如，多个空间条形码)的多个分子(例如，多个脂质或核酸分子)引入生物样品(例如，引入生物样品中的多个细胞)以用于空间分析，其中所述多个分子以阵列形式引入所述生物样品。在一些实施方式中，具有多个条形码的多个分子(例如，多个脂质或核酸分子)以在本文中描述的多种阵列形式中的任一种提供在基材(例如，本文所述的多种基材中的任一种)上，并且生物样品与基材上的分子接触，从而使分子被引入到生物样品中。在一些实施方式中，引入到生物样品中的分子可裂解地附接在基材上，并在与生物样品接触时从基材上裂解并释放到生物样品中。在一些实施方式中，引入生物样品的分子在裂解之前共价附接至基材。在一些实施方式中，引入生物样品的分子非共价附接到基材上(例如，通过杂交)，并且当与生物样品接触时从基材释放到生物样品。[1248]在一些实施方式中，具有多个条形码(例如，多个空间条形码)的多个分子(例如，多个脂质或核酸分子)从基材迁移或转移到生物样品的细胞。在一些实施方式中，使多个分子从基材迁移到生物样品的细胞包括向基材和/或生物样品施加力(例如机械力、离心力或电泳力)以促进多个分子从基材迁移到生物样品。[1249]在本文所描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，物理力用于促进将具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)附接或引入生物样品(例如，生物样品中存在的细胞)中。如本文所用，“物理力”是指利用物理力来抵消细胞膜屏障以促进分子的细胞内递送。可根据本文所描述的材料和方法使用的物理力仪器和方法的实例包括使用针、弹道dna(ballisticdna)、电穿孔、声穿孔、光穿孔、磁感染、水穿孔及其组合。[1250](i)将细胞加标剂引至细胞表面[1251]在一些实施方式中，可使用细胞加标剂对生物样品(例如，生物样品中的细胞)进行标记，其中细胞加标剂有助于将具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)引入生物样品(例如，引入生物样品中的细胞)。如本文所用，术语“细胞加标剂”是指具有能够附接到细胞表面(例如，从而将条形码附接到细胞表面)和/或穿透和通过细胞膜(例如，从而将条形码引入细胞内部)的部分的分子。在一些实施方式中，细胞加标剂包括条形码(例如，空间条形码)。条码化的细胞加标剂的条形码可以是本文所述的多种条形码中的任一种。在一些实施方式中，条码化的细胞加标剂的条形码是空间条形码。在一些实施方式中，细胞加标剂包含含有条形码(例如，空间条形码)的核酸分子。在一些实施方式中，条码化的细胞加标剂的条形码识别相关分子，其中每个条形码与特定分子相关。在一些实施方式中，将一种或多种分子施用于样品。在一些实施方式中，包括条形码的核酸分子共价附接至细胞加标剂。在一些实施方式中，包括条形码的核酸分子非共价附接至细胞加标剂。非共价附接的非限制性示例包括将包含条形码的核酸分子与细胞加标剂上的核酸分子杂交(所述细胞加标剂上的核酸分子可以共价或非共价地结合到细胞加标剂上)。在一些实施方式中，附接到包括条形码(例如，空间条形码)的细胞加标剂的核酸分子还包括一个或多个其它域。这种其它域包括但不限于pcr柄、测序引发位点、用于与另一核酸分子杂交的结构域及其组合。[1252]在一些实施方式中，细胞加标剂附接到细胞表面。当细胞加标剂包括条形码(例如，包括空间条形码的核酸)时，条形码也附接于细胞表面。在本文所述的任何空间分析方法的一些实施方式中，细胞加标剂共价附接到细胞表面以促进空间分析试剂的引入。在本文所述的任何空间分析方法的一些实施方式中，细胞加标剂非共价附接到细胞表面以促进空间分析试剂的引入。[1253]在一些实施方式中，一旦用细胞加标剂对生物样品中的一个或多个细胞进行空间标记，就进行生物样品中存在的分析物的空间分析。在一些实施方式中，此类空间分析包括解离生物样品的空间加标的细胞(或生物样品的空间加标的细胞的子集)并逐个细胞地分析那些细胞中存在的分析物。可以使用用于逐个细胞地分析存在于细胞中的分析物的多种方法中的任何一种。非限制性示例包括本文所述的各种方法中的任何一种以及pct申请公开号wo2019/113533a1中所述的方法，其内容通过引用全部纳入本文。例如，空间加标的细胞可以用包含具有条形码(例如细胞条形码)的一种或多种核酸分子的珠包封(例如乳液)。珠上存在的核酸可以具有与加标的细胞上存在的核酸上的结构域杂交的结构域(例如，连接到细胞加标剂的核酸上的结构域)，从而连接细胞的空间条形码细胞到珠的细胞条形码。一旦细胞的空间条形码和珠的细胞条形码连接，就可以使用捕获探针(例如，存在于珠上的捕获探针)分析细胞中存在的分析物。这允许(使用这些方法)从特定细胞产生的核酸被单独扩增和测序(例如，在单独的分区或液滴内)。[1254]在一些实施方式中，一旦用细胞加标剂对生物样品中的一个或多个细胞进行空间标记，就进行生物样品中存在的分析物的空间分析，其中生物样品的细胞不解离成单细胞。在这样的实施方式中，可以采用各种空间分析方法，例如本文提供的任何方法。例如，一旦生物样品中的一个或多个细胞被细胞加标剂空间加标，则细胞中的分析物就可以被捕获和分析。在一些实施方式中，细胞加标剂包括空间条形码和可用于捕获存在于细胞中的分析物的捕获域。例如，包括空间条形码和捕获域的细胞加标剂可以以使得细胞加标剂位置已知(或可以在将它们引入细胞后确定)的方式被引入生物样品的细胞中。将细胞加标剂引入生物样品的一个非限制性示例是以阵列形式提供细胞加标剂(例如，在基材上形成阵列，例如本文提供的多种基材和阵列中的任一种)，其中细胞加标剂在阵列上的位置在引入时是已知的(或可以在引入后确定)。细胞可根据需要被透化(例如，使用本文所述的透化试剂和方法)，可向细胞提供用于分析物分析的试剂(例如，在分析物是结合到捕获探针的核酸的情况下，逆转录酶、聚合酶、核苷酸等)，并且分析物可以被分析。在一些实施方式中，被测定的分析物(和/或其拷贝)可以从基材释放并被分析。在一些实施方式中，原位测定所测定的分析物(和/或其拷贝)。[1255]可根据本文提供的用于对生物样品中的一个或多个分析物进行空间概况分析的材料和方法使用的附接在细胞表面的细胞加标剂和系统的非限制性示例(例如，因此，引入细胞加标剂和附接在细胞外部的任何条形码)包括：脂质标记引物/亲脂标记部分，阳性或中性寡核苷酸偶联聚合物、抗体标记引物、链霉亲和素偶联寡核苷酸、染料标记寡核苷酸、点击化学、受体‑配体系统、通过胺或巯基官能团的共价结合系统及其组合。[1256](ii)将细胞加标剂引至细胞内部[1257]可根据本文提供的材料和方法使用的用于对生物样品中的分析物进行空间概况分析的穿透和/或穿过细胞膜的细胞加标剂和系统的非限制性示例(例如，因此将细胞加标剂和与其附接的任何条形码引入细胞内部)包括：细胞穿透剂(例如，细胞穿透肽)、纳米颗粒、脂质体，多聚体、基于肽的化学载体、电穿孔、声穿孔、慢病毒载体、逆转录病毒载体及其组合。[1258]图19是显示示例性细胞标记方法的示意图。寡核苷酸递送载剂的非详尽示例可包括细胞穿透肽或纳米颗粒。递送系统的非穷举性示例可包括基于脂质的聚合物和金属纳米颗粒或寡聚物，其可偶联或包封在递送系统内。细胞标签可以与捕获剂条码域和可裂解或不可裂解的空间条码化捕获探针结合使用，用于空间和多重化应用。[1259]1.细胞穿透剂[1260]在本文描述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，通过细胞穿透剂促进由具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)鉴定生物分析物。在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)与细胞穿透剂偶联，并且细胞穿透剂允许分子与细胞内的分析物相互作用。本文所用的“细胞穿透剂”可以指能够促进将具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)引入生物样品的细胞中的试剂(参见，例如，lovatt等，natmethods.2014年2月；11(2)：190‑6，全文通过引用纳入本文)。在一些实施方式中，细胞穿透剂是细胞穿透肽。如本文所用，“细胞穿透剂”可以指能够穿过细胞膜的肽(例如，短肽，例如通常不超过30个残基的肽)。在一些实施方式中，细胞穿透剂或细胞穿透肽可以共价或非共价地偶联至分子(例如，条码化核酸分子)，很可能是在该分子的5’端。细胞穿透肽可将条码化核酸分子引导至特定细胞器。[1261]在本文所描述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，耦合到具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)的细胞穿透肽可以使用能量依赖或能量非依赖机制穿过细胞膜。例如，细胞穿透肽可通过质膜的物理扰动、内吞(例如，通过网格蛋白介导)、适应性易位、孔形成、电穿孔样透化和/或进入微域边界的直接易位穿过细胞膜。细胞穿透肽的非限制性示例包括：穿透素、tat肽、pvec、转运蛋白、mpg、pep‑1、聚精氨酸肽、map、r6w3、(d‑arg)9、cys(npys)‑(d‑arg)9、抗‑βγ(mps‑光传感因子‑样蛋白c末端)、cys(npys)触角足、cys(npys)‑(arg)9、cys(npys)‑tat(47‑57)、hiv‑1tat(48‑60)、kala、乳清蛋白、渗透素‑精氨酸、pep‑1‑半胱胺、tat(47‑57)ggg‑cys(npys)、tat‑nr2bct、透皮肽、synb1、synb3、ptd‑4、ptd‑5、fhvcoat‑(35‑49)、bmvgag‑(7‑25)、htlv‑iirex‑(4‑16)、r9‑tat、sbp、fbp、mpg、mpg(δnls)、pep‑2、mts、plsl，和聚赖氨酸肽(参见例如，bechara等，febslett.2013年6月19日；587(12)：1693‑702，其通过引用全文的方式纳入本文)。[1262]在一些实施方式中，可有两个取向供细胞穿透肽(cpp)偶联。例如，一个取向可以是(n‑末端)‑cpp‑cys‑(c‑末端)‑接头‑nh2c6‑5′‑寡聚物‑3′；3′‑寡聚物‑5′‑nh2c6‑接头‑(n‑末端)‑cys‑cpp‑(c‑末端)。本文所述的方法可以用其它cpp偶联和取向进行。[1263]2.纳米颗粒[1264]在本文描述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，通过无机颗粒(例如纳米颗粒)促进由具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)捕获生物分析物。在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)与无机颗粒(例如纳米颗粒)偶联，并且，具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的该分子(例如，核酸分子)利用该纳米颗粒来接近细胞内的分析物。可用于本文实施方式中来递送具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)进入细胞和/或细胞珠(cellbead)的纳米颗粒的非限制性示例包括：由金属(例如铁、金和银)、无机盐和陶瓷(例如钙、镁或硅的磷酸盐或碳酸盐)制备的无机纳米颗粒。纳米颗粒的表面可被被覆以促进具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)和捕获域的结合，或者该表面可被化学修饰以促进具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子的附接。也可以使用磁性纳米颗粒(例如超磁性氧化铁)、富勒烯(例如可溶性碳分子)、碳纳米管(例如圆柱形富勒烯)、量子点和超分子系统。[1265]3.脂质体[1266]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，通过脂质体促进由具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)捕获生物分析物。各种类型的脂质，包括阳离子脂质，可用于脂质体递送。在一些情况下，具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)经由脂质纳米乳液递送至细胞。脂质乳液是指一种不混溶的液体在另一种液体中通过乳化剂稳定的分散体。标记细胞可以包括使用固体脂质纳米颗粒。[1267]4.聚合体[1268]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，通过聚合体促进由具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)捕获生物分析物。在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)包含在聚合体中，并且具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)使用聚合体以触及细胞内的分析物。本文所指的“聚合体(polymersome)”是人工囊泡。例如，聚合体可以是类似于脂质体的囊泡，但是膜包含两亲性合成嵌段共聚物(参见，例如，rideau等，chem.soc.rev.，2018，47，8572‑8610，通过引用将其全部纳入本文)。在一些实施方式中，聚合物体包含二‑(ab)或三嵌段共聚物(例如aba或abc)，其中a和c是亲水性嵌段，b是疏水性嵌段。在一些实施方式中，聚合物囊泡包含聚(丁二烯)‑b‑聚(环氧乙烷)、聚(乙基乙烯)‑b‑聚(环氧乙烷)、聚苯乙烯‑b‑聚(环氧乙烷)、聚(2‑乙烯基吡啶)‑b‑聚(环氧乙烷)、聚二甲基硅氧烷‑b‑聚(环氧乙烷)、聚二甲基硅氧烷‑g‑聚(环氧乙烷)、聚己内酯‑b‑聚(环氧乙烷)、聚异丁烯‑b‑聚(环氧乙烷)、聚苯乙烯‑b‑聚丙烯酸、聚二甲基硅氧烷‑b‑聚‑2‑甲基‑2‑噁唑啉或其组合(其中b＝嵌段且g＝接枝)。[1269]5.基于肽的化学载体[1270]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，通过基于肽的化学载体(例如，基于阳离子肽的化学载体)促进由具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)捕获生物分析物。阳离子肽可以富含碱性残基，如赖氨酸和/或精氨酸。在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，通过基于聚合物的化学载体促进由具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)捕获生物分析物。阳离子聚合物，当与具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)混合时，可以形成称为复合体(polyplex)的纳米级复合物。基于聚合物的载体可包含天然蛋白质、肽和/或多糖。基于聚合物的载体可以包括合成聚合物。在一些实施方式中，基于聚合物的载体包括聚乙烯亚胺(pei)。pei可以将dna浓缩成带正电的颗粒，这些颗粒与阴离子细胞表面残基结合，并通过内吞作用进入细胞。在一些实施方式中，基于聚合物的化学载体包含聚(l)‑赖氨酸(pll)、聚(dl‑乳酸)(pla)、聚(dl‑丙交酯‑共‑糖苷)(plga)、聚鸟氨酸、聚精氨酸、组蛋白、鱼精蛋白或其组合。基于聚合物的载体可以包含聚合物的混合物，例如peg和pll。聚合物的其它非限制性示例包括树枝状聚合物、壳聚糖、葡聚糖的合成氨基衍生物和阳离子丙烯酸聚合物。[1271]6.电穿孔[1272]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，通过电穿孔促进由具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)捕获生物分析物。通过电穿孔，由具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)的生物分析物可通过施用电形成的细胞膜中的一个或多个孔进入细胞。根据外加电场强度和脉冲持续时间，膜的孔隙可以是可逆的。[1273]7.声波穿孔[1274]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，通过声孔效应促进由具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)捕获生物分析物。细胞膜可以使用声波暂时透化，从而允许通过具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)的生物分析物的细胞摄取。[1275]8.慢病毒载体和逆转录病毒载体[1276]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，通过载体促进由具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)捕获生物分析物。例如，本文所述的载体可以是表达载体，其中表达载体包括启动子序列，该启动子序列操作性地连接至编码具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)的序列。载体的非限制性示例包括质粒、转座子、粘粒和病毒载体(例如，任何腺病毒载体(例如psv或pcmv载体)、腺相关病毒(aav)载体、慢病毒载体和逆转录病毒载体)，以及任何载体。例如，载体可以包括足够的用于表达的顺式作用元件，其中其它表达元件可以由宿主哺乳动物细胞或在体外表达系统中提供。熟练的从业者将能够选择合适的载体和哺乳动物细胞以引入本文所述的任何空间概况分析试剂。[1277]9.用于分子的细胞内引入的其它方法和细胞加标剂[1278]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，通过使用针(例如，注射(例如，微量注射)、颗粒轰击、光穿孔、磁转染和/或水穿孔促进由具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)捕获生物分析物。例如，通过颗粒轰击，具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)可以被重金属颗粒被覆并高速递送至细胞。在光穿孔中，可使用激光脉冲在细胞膜中产生瞬时孔，使细胞摄取具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)。在磁转染中，具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)可以与磁性颗粒(例如，磁性纳米颗粒、纳米线等)偶联并通过施加磁场定位至靶细胞。在水穿孔中，具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)可以通过流体动力压力递送至细胞和/或细胞珠。[1279](iii)脂质加标的引物/亲脂性加标的部分[1280]在本文描述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)耦合到亲脂性分子。在一些实施方式中，亲脂性分子能够将亲脂性分子递送至细胞膜或核膜。在一些实施方式中，具有与亲脂性分子偶联的条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以与脂质膜例如细胞膜和核膜结合和/或插入到脂质膜例如细胞膜中。在一些情况下，插入可以是可逆的。在某些情况下，亲脂性分子与细胞之间的结合可使得细胞在随后的处理(例如，划分、细胞透化、扩增、汇集等)期间保留亲脂性分子(例如，和相关组分，例如核酸条形码分子)。在一些实施方式中，具有与亲脂性分子偶联的条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以进入细胞内空间和/oligonucleotide)的甾醇脂质可以附接到寡核苷酸部分的5′或3′末端。在一些实施方式中，锚固寡核苷酸和/或共锚固寡核苷酸可以整合到生物样品中的细胞的细胞膜中(例如，锚固寡核苷酸和/或共锚固寡核苷酸的甾醇脂质)。[1286]在一些实施方式中，甾醇脂质(例如，木蜡酸)锚固寡核苷酸连接到寡核苷酸的5′末端。在一些实施方式中，锚固寡核苷酸可具有恒定序列。在一些实施方式中，锚固寡核苷酸的恒定序列可为约15至约30个核苷酸长。在一些实施方式中，锚固寡核苷酸可在恒定序列的3′端具有其它结构域。在一些实施方式中，附加结构域可以是衔接子序列(例如，测序衔接子)。在一些实施方式中，衔接子序列可为约15至约35个核苷酸长。[1287]在一些实施方式中，共锚固寡核苷酸(例如棕榈酸)的脂质(例如甾醇脂质)附接到寡核苷酸的3′末端。在一些实施方式中，共锚固寡核苷酸可具有恒定序列。例如，共锚固寡核苷酸的恒定序列可以是来自锚固寡核苷酸的恒定序列的反向互补序列。在一些实施方式中，锚固寡核苷酸的恒定序列和共锚固寡核苷酸的恒定序列可以彼此结合(例如，杂交)。在一些实施方式中，锚固寡核苷酸和共锚固寡核苷酸的脂质(例如甾醇脂质)可以整合到生物样品中的细胞膜中，并且各自的恒定序列可以同时彼此杂交。在一些实施方式中，可以将可以包括若干个结构域的条码化寡核苷酸引入到彼此杂交的锚固寡核苷酸和共锚固寡核苷酸的整合体中。条码化寡核苷酸可以在5′到3′方向包括功能域(例如测序衔接子域)、独特分子标识符、样品条形码、第二独特分子标识符和恒定序列的反向互补序列。例如，在用本文所述的任何细胞加标剂标记细胞后，细胞可以用条码化特征(例如，珠)分区(例如，包封在囊泡中)。在一些实施方式中，条形码寡核苷酸的恒定序列的反向互补序列可以与条码化特征上的恒定序列(例如，序列的部分)相互作用(例如，杂交)。[1288](iv)细胞内裂解域[1289]如本文所用，捕获探针可以任选地包括“细胞内裂解域”，其中捕获探针的一个或多个区段或区域(例如，捕获域、空间条形码和/或umi)能够可释放地或可裂解地附接到一个或多个捕获探针的更多其它区段或区域，例如细胞穿透剂，从而使捕获域、空间条形码和/或umi可以通过捕获域、空间条形码和/或umi与细胞穿透剂和/或细胞透化标签之间的连接的裂解被释放或变得可释放。在一些实施方式中，捕获域、空间条形码和/或umi和细胞穿透剂之间的连接的裂解在胞内环境中被诱导(例如，将捕获探针引入细胞后，细胞内裂解域被裂解)。例如，捕获域、空间条形码和/或umi与细胞穿透剂之间的连接可以是被细胞中的还原条件裂解的二硫键，例如，在细胞内裂解域包含二硫键的情况下。可以使用任何其它合适的接头来释放或裂解捕获探针的细胞内裂解域。[1290](v)阳性或中性寡聚物偶联的聚合物[1291]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可耦合到乙二醇‑壳聚糖衍生物。在一些实施方式中，二醇壳聚糖衍生物可以与具有条形码(例如，空间条形码)的两个或更多个分子(例如，核酸分子)偶联。在一些实施方式中，二醇壳聚糖衍生物可与约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10或更多个分子偶联。乙二醇‑壳聚糖衍生物(例如乙二醇‑壳聚糖‑胆固醇)可作为疏水锚定物(参见wang等，j.mater.chem.b.，30：6165(2015)，其全文通过引用纳入本文)。可与具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)耦合的壳聚糖衍生物的非限制性示例可在cheung等，marinedrugs，13(8)：5156‑5186(2015)中找到，其全文通过引用纳入本文。[1292](vi)双功能nhs接头细胞加标[1293]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可偶联到双功能nhs接头。在一些实施方式中，偶联的双功能nhs接头(例如，双功能接头和具有条形码的分子)可以促进空间条形码附接到细胞表面。在一些实施方式中，在促进附接到细胞表面之后，可以移除(例如，洗掉)过量的nhs接头。在一些实施方式中，具有条形码的分子的偶联过程可以在非无水条件下进行以保持未反应的双功能nhs的活性。在一些实施方式中，非无水条件可在dmso存在下。在一些实施方式中，非无水条件可在dmf存在下。[1294](vii)抗体加标的引物[1295]在本文所述的任何空间分析方法的一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以以促进具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)附接至细胞表面的方式耦合至抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，促进向细胞表面的附接促进将具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)引入细胞中。在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以与导向存在于细胞表面上的抗原的抗体偶联。在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以与导向存在于多个细胞(例如，生物样品中的多个细胞)表面上的抗原的抗体偶联。在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以与导向存在于生物样品中的细胞、多个细胞，或基本全部细胞的表面上的抗原的抗体偶联。在一些实施方式中，条码化抗体针对细胞内抗原。可以使用本文所述的将具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)附接至另一分子(例如，抗体或其抗原片段)的任何示例性方法。[1296](viii)链霉亲和素偶联的寡核苷酸[1297]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以使用生物素‑链霉亲和素附接到细胞表面。在一些实施方式中，细胞表面多肽的赖氨酸残基侧链中的伯胺用nhs活化的生物素试剂标记。例如，多肽的n末端可以与nhs活化的生物素试剂反应形成稳定的酰胺键。在一些实施方式中，细胞加标剂包括与链霉亲和素偶联的具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)。在一些情况下，如本文所述，链霉亲和素可以利用点击化学(例如，马来酰亚胺修饰)，偶联至具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)。在一些实施方式中，包含纳入细胞表面蛋白的赖氨酸侧链中的nhs活化的生物素的细胞与偶联至具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)的链霉亲和素形成非共价键。在一些实施方式中，具有与链霉亲和素偶联的条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)本身是细胞标记剂的部分。[1298](ix)染料加标的寡核苷酸[1299]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)直接联接到可检测标记物。在一些实施方式中，可检测标记物是本文所述的任何可检测标记物。在一些实施方式中，可检测标记物是荧光标签。在一些实施方式中，带荧光标签的物理性质(例如，具有疏水性质的荧光标签)可克服具有条形码(例如空间条形码)的分子(例如核酸分子)的亲水性质。例如，在其中分子是核酸分子的一些实施方式中，荧光标签(例如，bodipy、cy3、atto647n和罗丹明红c2)可以偶联至具有条形码(例如，空间条形码)的核酸分子的5′端。在其中分子是核酸分子的一些实施方式中，具有疏水性质的任何荧光标签可以克服核酸分子亲水性质的方式偶联至具有条形码(例如，空间条形码)的核酸分子。具有疏水性的荧光标签的非限制性示例包括bodipy、cy3、atto647n和罗丹明红c2。[1300](x)点击化学[1301]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)耦合到点击化学部分。如本文所使用的，术语“点击化学”通常指模块化的、范围广的、给出高产率的、产生副产物(例如那些可通过非色谱方法去除的副产物)并且具有立体特异性(但不一定具有对映选择性)的反应(参见例如angew.chem.int.ed.，2001，40(11)：2004‑2021，通过引用将其全部纳入本文)。在某些情况下，点击化学可以描述成对的官能团，它们可以在温和的水性条件下选择性地相互反应。[1302]点击化学反应的一个实例是叠氮化物和炔烃的huisgen1，3‑偶极环加成，即叠氮化物与炔烃的铜催化反应以形成5元杂原子环1，2，3‑三唑。该反应也称为cu(i)‑催化的叠氮‑炔环加成(cuaac)、cu(i)点击化学或cu 点击化学。用于点击化学的催化剂包括但不限于cu(i)盐或通过用还原剂将cu(ii)试剂还原为cu(i)试剂而原位制备的cu(i)盐(pharmres.2008，25(10)：2216‑2230，其通过引用其全文方式纳入本文)。用于点击化学的已知cu(ii)试剂可包括但不限于cu(ii)‑(tbta)络合物和cu(ii)(thpta)络合物。tbta是三‑(1‑苄基‑1h‑1，2，3‑三唑‑4‑基)甲基]胺，也称为三‑(苄基三唑基甲基)胺，可以作为cu(i)盐的稳定配体。thpta是三‑(羟丙基三唑基甲基)胺，是用于cu(i)的稳定剂的另一个例子。其他条件也可用于使用无铜点击化学从叠氮化物和炔烃构建1，2，3‑三唑环，例如菌株促进的叠氮化物‑炔烃点击化学反应(spaac)(参见，例如，chem.commun.，2011，47：6257‑6259和nature，2015，519(7544)：486‑90，其各自都通过引用整体纳入本文)。[1303](xi)受体‑配体系统[1304]在本文所描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可耦合到配体，其中配体是细胞表面上的受体‑配体相互作用的部分。例如，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以偶联至与细胞表面受体选择性相互作用的配体，从而将具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)靶向至特定细胞。可使用的受体‑配体系统的非限制性实例包括整合素‑受体‑配体相互作用、gpcr‑受体‑配体相互作用、rtk‑受体‑配体相互作用和tlr‑配体相互作用(参见juliano，nucleicacidsres.，44(14)：6518‑6548(2016)，其全文通过引用纳入本文)。可以使用本文描述的用于将具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)连接至配体的任何方法(例如，本文描述的涉及将具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)附接到抗体上的任何方法)。[1305](xii)通过胺或硫醇官能团的共价结合系统[1306]在本文所描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可在分子内的位点(例如，具有核酸序列)纳入反应性官能团。在这种情况下，反应性官能团可以促进与配体和/或表面的偶联。在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可包括设计成与广泛的活化的接受基团(例如，马来酰亚胺和金微球)反应的巯基修饰剂。例如，带有硫醇修饰剂的具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以与马来酰亚胺偶联的肽相互作用，从而导致对肽的标记。在一些实施方式中，马来酰亚胺偶联的肽存在于细胞表面上，因此与硫醇修饰的具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)相互作用，所述具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)与细胞表面偶联。巯基修饰剂的非限制性实例包括：5′巯基修饰剂c6s‑s、3′巯基修饰剂c3s‑s、二巯基、3′巯基修饰剂氧杂6‑s‑s和二巯基丝氨酸。[1307]在本文所描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可包括胺修饰剂，例如，设计用于在酰化剂存在下附接到另一分子的胺修饰剂。在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以包括胺修饰剂，所述胺修饰剂被设计为附接到连接基团(例如，羰基酰胺、硫脲、磺酰胺和甲酰胺)的广泛阵列(broadarray)。例如，具有条形码(例如，空间条形码)和胺修饰剂的分子(例如，核酸分子)可以与磺酰胺偶联的肽相互作用，从而导致对肽的标记。在一些实施方式中，磺酰胺偶联的肽存在于细胞表面上，因此与胺修饰的具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)相互作用，所述具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)与细胞表面偶联。胺修饰剂的非限制性示例包括：dms(o)mt‑氨基‑修饰剂‑c6、氨基‑修饰剂‑c3‑tfa、氨基‑修饰剂‑c12、氨基‑修饰剂‑c6‑tfa、氨基‑dt、氨基‑修饰剂‑5，氨基修饰剂‑c2‑dt、氨基修饰剂‑c6‑dt和3′‑氨基修饰剂‑c7。[1308]作为另一实例，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可在分子内的位点(例如，具有核酸序列)纳入反应性官能团，例如n‑羟基琥珀酰亚胺(nhs)。在一些实施方式中，胺(例如，含胺的肽)存在于细胞表面，于是与具有条形码(例如，空间条形码)的nhs修饰的分子(例如，核酸分子)相互作用，该具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)与细胞表面偶联。在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)与双功能nhs接头反应以形成具有条形码(例如，核酸分子)的nhs修饰的分子(例如，核酸分子)。[1309]在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可耦合到用于细胞膜(bam)的生物相容性锚固物。例如，bam可以包括包含油烯基和peg的分子。油烯基可促进将具有条形码(例如空间条形码)的分子(例如核酸分子)锚定到细胞，并且peg可增加水溶性。在一些实施方式中，油烯基‑peg‑nhs可使用nhs化学与具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)耦合。[1310](xiii)基于叠氮化物的系统[1311]在一些实施方式中，其中分子(例如，具有核酸序列)在分子内的位点处纳入反应性官能团，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可与细胞表面上的叠氮化物基团耦合。在一些实施方式中，反应性官能团是炔基。在一些实施方式中，如本文所述的点击化学可用于将具有条形码(例如，空间条形码)的炔基修饰的分子(例如，核酸分子)附接至细胞表面上的叠氮基团。叠氮基团可以通过多种方法附接到细胞表面。例如，nhs化学可用于将叠氮基团连接到细胞表面。在一些实施方式中，n‑叠氮基乙酰基甘露糖胺四酰化(ac4mannaz)，其包含叠氮基基团，可以与细胞表面的唾液酸反应，以使叠氮化物附接在细胞表面。在一些实施方式中，叠氮化物通过叠氮化物的生物正交表达附接到细胞表面。例如，叠氮化物与细胞一起孵育。在一些实施方式中，炔基修饰的具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以在铜的存在下通过叠氮化物基团附接到细胞表面。在一些实施方式中，炔基修饰的具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以在无铜存在的情况下通过叠氮化物基团附接到细胞表面。[1312](xiv)基于凝集素的系统[1313]在本文所述的任何空间分析方法的一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以耦合至凝集素，其促进具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)附接细胞表面。凝集素可以结合聚糖，例如细胞表面的聚糖。在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)具有纳入的反应性官能团，例如叠氮化物基团。在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)和叠氮基团的分子(例如，核酸分子)与修饰的凝集素(例如，使用nhs化学修饰的凝集素)反应以引入叠氮化物反应基团。在一些实施方式中，活细胞用具有条形码(例如，空间条形码)的凝集素修饰的分子(例如，核酸分子)标记。在一些实施方式中，固定的细胞用具有条形码(例如，空间条形码)的凝集素修饰的分子(例如，核酸分子)标记。在一些实施方式中，透化的细胞用具有条形码(例如，空间条形码)的凝集素修饰的分子(例如，核酸分子)标记。在一些实施方式中，分泌途径中的细胞器可用具有条形码(例如，空间条形码)的凝集素修饰的分子(例如，核酸分子)标记。[1314](b)将样品分成单个细胞或细胞群的方法[1315]本文所描述的任何方法的一些实施方式可包括将生物样品分离成单细胞、细胞群、细胞类型或一个或多个感兴趣区域。例如，在与一个或多个捕获探针接触之前，可将生物样品分离成单细胞、细胞群、细胞类型或一个或多个感兴趣的区域。在其它示例中，首先将生物样品与一个或多个捕获探针接触，然后将其分离成单细胞、细胞群、细胞类型或一个或多个感兴趣的区域。[1316]在一些实施方式中，可以使用像素化将生物样品分离成块(chucks)。像素化可包括步骤：提供生物样品，并冲压出生物样品的一个或多个部分。然后可以使用生物样品的冲压出的部分来进行本文所述的任何方法。在一些实施方式中，生物样品的冲压出的部分可以是随机图案或设计图案。在一些实施方式中，生物样品的冲压出的部分可以集中在生物样品中的感兴趣区域或亚细胞结构上。[1317]图20a是说明用于“像素化”样品的示范性、非限制性、非穷尽性步骤的工作流示意图，其中样品通过空心针或微针切割、压印、显微解剖或转移，将样品的一小部分移动到个体分区或孔中。[1318]图20b是描绘多针像素化的示意图，其中针阵列穿过支架上的样品并穿入含有珠(例如，凝胶珠)和试剂的纳米孔中。一旦针进入纳米孔，细胞就会弹出。[1319]在一些实施方式中，与在进行本文所述的任何空间分析方法之前的原始生物样品大小(“块”)相比，生物样品(例如，组织样品或组织切片)被分成更小的部分。在一些实施方式中，该方法可包括通过按空间明确限定的图案(例如，阵列打印)施用的条形码对ffpe“块”进行空间条码化。为了将空间条形码与生物样品的特定“块”相关联，条形码(例如，空间条形码)可以具有足够的长度以防止条形码在后续步骤中扩散，或者条形码可被共价施加于ffpe样品。在一些实施方式中，空间条形码对于每个ffpe块是独特的。在一些实施方式中，空间条形码可以嵌入到ffpe载玻片上(例如，在基质例如蜡或水凝胶中)。在一些实施方式中，ffpe载玻片在添加空间条形码之前被加热(例如，蜡被加热)。在一些实施方式中，在添加空间条形码之后，ffpe载玻片可被冷却并切割或解离成块。分块(例如，切割)生物样品的方法是本领域已知的。例如，在一个非限制性示例中，生物样品的分块(chunking)可以以各种方式进行，例如激光显微裂解、机械手段、声学(例如，超声处理)方式或本文所述的任何其它方法。在一些实施方式中，可以将荧光团/量子点(qdots)等嵌入块中以保存关于生物样品的空间信息。这一步的条码化能够在保留局部空间信息的同时，对块进行大规模并行包封(例如，肿瘤对比正常/健康细胞)。在一些实施方式中，生物样品(例如，组织切片)的分块可导致生物样品的单细胞块。在其它实施方式中，可以进行生物样品的分块以获得对应于生物样品的患病部分的块。在另一个实施方式中，可以进行生物样品的分块以获得对应于生物样品的患病或健康部分的生物样品的离散块。在一些实施方式中，可以进行生物样品的分块以获得对应于生物样品中的特定细胞类型的分块(例如，基于结合目标蛋白的抗体的荧光或化学发光成像的分块)。[1320]在一些实施方式中，可以进一步处理空间条码化块。例如，空间条码化块可以单独包封(例如，基质、乳液或水凝胶)。在一些实施方式中，空间条码化块可以包封在分区(例如，孔、液滴、通道或囊泡)中。在一些实施方式中，空间条码化块可以包封在囊泡中。在一些实施方式中，囊泡可包含脂质双层。在一些实施方式中，空间条码化ffpe块可以用独特条码化珠包封。在一些实施方式中，独特条码化珠可具有功能域、裂解域、独特分子标识符和捕获域，或它们的组合。在一些实施方式中，包封的空间条码化ffpe块和独特条码化珠可被加热以使ffpe样品脱蜡。在一些实施方式中，包封的空间条码化ffpe块和独特条码化珠可用二甲苯处理以使ffpe样品脱蜡。在一些实施方式中，可以在单个步骤中处理脱石蜡样品以去交联亚甲基桥。在一些实施方式中，例如，当去交联化学与条码化或文库制备步骤不相容时，可以进行其它步骤。在一些实施方式中，在去交联亚甲基桥之后，源自或存在于块中的核酸可以结合独特条码化珠。在一些实施方式中，在空间条形码结合独特条码化珠之后，包封可被破坏(例如，裂解、熔化或移除)并且条码化珠可以被收集。在一些实施方式中，收集的条码化珠可以被洗涤并重新包封。在一些实施方式中，可根据本文所述的任何方法扩增(例如，pcr扩增)和处理(例如，测序)与珠相关联的核酸(例如，空间条形码、独特条形码、分析物转录物)。[1321]在一些实施方式中，可以使用激光捕获显微切割(例如，高度多重化的激光捕获显微切割)来分割或划分生物样品。[1322](c)分析物的释放和扩增[1323]在一些实施方式中，可将裂解试剂添加到样品中以促进从样品中释放分析物。裂解剂的实例包括但不限于生物活性试剂，例如用于裂解不同细胞类型的裂解酶，例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物，例如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌素、labiase酶、基他酶(kitalase)、溶细胞酶和多种其它市售的裂解酶。其它裂解剂可以附加地或替代地与生物样品共同划分以导致样品的内容物释放到分区中。在一些实施方式中，基于表面活性剂的裂解溶液可用于裂解细胞，尽管这些溶液对于表面活性剂可干扰稳定乳液的基于乳液的系统可能不太理想。裂解溶液可包括离子表面活性剂，例如肌氨酰和十二烷基硫酸钠(sds)。电穿孔、热的、声学的或机械的细胞分裂也可用于某些实施方式中，例如，基于非乳液的分配，例如可作为液滴划分的补充或代替液滴划分的生物材料的封装，在细胞破裂后，囊膜的任何孔体积足够小以保留给定大小的核酸片段。[1324]除透化剂外，还可添加其它试剂以与生物样品相互作用，包括例如dna酶和rna酶失活剂或抑制剂或螯合剂(例如edta)和其它试剂以使随后处理来自样品的分析物。在其它实施方式中，向样品中加入核酸酶，例如dna酶或rna酶，或蛋白酶，例如胃蛋白酶或蛋白酶k。[1325]可以添加至样品的其他试剂包括，例如，用于片段化dna的核酸内切酶、dna聚合酶和用于扩增核酸的dntp。也可以添加到样品中的其它酶包括但不限于聚合酶、转座酶、连接酶、蛋白酶k和dna酶等。其它试剂还可以包括逆转录酶，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和转换寡核苷酸。在一些实施方式中，模板转换可用于增加edna的长度，例如，通过将预定义的核酸序列附加到cdna。[1326]如果组织样品透化不够，则在基材上捕获的分析物的量可能过低，无法进行充分的分析。相反，如果组织样品透化性太强，则分析物可从其在组织样品中的来源扩散出去，从而失去组织样品中分析物的相对空间关系。因此，在充分透化组织样品以获得良好信号强度同时仍保持组织样品中分析物分布的空间分辨率之间的平衡是理想的。[1327]在一些实施方式中，在生物样品包括活细胞的情况下，可修改透化条件以使活细胞仅经历短暂的透化(例如，通过短时间重复脉冲的电场施加)，从而使一个或多个分析物从活细胞迁移到基材，同时保留细胞活力。[1328]在一些实施方式中，在将生物样品与包括捕获探针的基材接触之后，进行移出步骤以从基材移出全部或部分生物样品。在一些实施方式中，移出步骤包括生物样品的透化的细胞的酶促或化学降解。例如，移出步骤可包括用酶(例如，蛋白酶k)处理生物样品以从第一基材去除生物样品的至少部分。在一些实施方式中，移出步骤可包括组织的消融(例如，激光消融)。[1329]在一些实施方式中，其中rna是捕获自样品中的细胞的分析物，可以选择性地富集一种或多种感兴趣的rna物质。例如，感兴趣的一种或多种rna物质可通过添加一个或多个寡核苷酸来选择。可以使用多种方法中的任何一种来选择性地向下选择(例如，去除)一种或多种rna。例如，可以将探针给予选择性地与核糖体rna(rrna)杂交的样品，从而减少样品中rrna的集和浓度。随后将捕获探针应用于样品可导致由于样品中存在的非特异性rna的减少所得到的改善的rna捕获。在一些实施方式中，其它寡核苷酸是用于通过聚合酶引发反应的序列。例如，与一种或多种感兴趣的rna具有序列互补性的一种或多种引物序列可用于扩增一种或多种感兴趣的rna，从而选择性地富集这些rna。在一些实施方式中，与捕获的rna(例如cdna)的互补链具有序列互补性的寡核苷酸可结合到cdna。在一个非限制性示例中，具有与一种或多种感兴趣的cdna互补的序列的生物素化寡核苷酸能够结合到cdna并且可以利用生物素化‑链霉亲和素亲和力，使用本领域已知的任何数量的方法中的任何一种(例如，链霉亲和素珠)来选择。[1330]在一些实施方式中，本文所述的任何空间分析方法可包括调节来自生物样品的生物分析物与阵列上的捕获探针之间的相互作用速率。在一些实施方式中，可以通过调节生物样品(例如调节温度或ph)来调节相互作用的速率。在一些实施方式中，调节相互作用的速率包括使用外部刺激。可用于调节相互作用速率的外部刺激的非限制性示例包括光、温度、小分子、酶和/或活化剂。在一个示例中，光可用于活化核酸延伸反应中的聚合酶。在另一个示例中，温度可用于调节两个互补核酸分子之间的杂交。[1331]核酸分析物可使用聚合酶链反应(例如，数字pcr、定量pcr或实时pcr)、等温扩增或本文所述或本领域已知的任何核酸扩增或延伸反应进行扩增。[1332](d)划分(分区)[1333]如上所述，在一些实施方式中，样品可以任选地被分成单个细胞、细胞组(例如，基于细胞亚型或基因表达谱)或小于原始样品的其它片段/片。可以分析样品的这些较小部分中的每一个以获得样品的空间解析的分析物信息。本文描述了非限制性划分方法。[1334]对于已被分离成更小片段的样品‑特别是对于已被分解、解离或以其他方式分离成个体细胞的样品‑分析片段的一种方法涉及将片段划分进入个体分区(例如液滴)，然后分析分区的内容物。通常，每个分区都保持其自身内容物与其他分区的内容物的分离。例如，分区可以是乳液中的液滴。[1335]本文所述的方法提供用于将细胞(例如，细胞)从样品区室化(compartmentalization)或划分进入离散区室或体素(voxel)。如本文所用，每个“体素”表示一个三维体积单位。在一些实施方式中，体素保持其自身内容与其它体素的内容的分离。体素可以是体积的多个分区的阵列的一个分区。例如，体素可以是其中划分了三维客体的多个离散分区的阵列的一个分区。作为另一个示例，多个可光交联聚合物前体的成员可以交联成体素，所述体素是覆盖基材或基材的部分的光交联聚合物的阵列的部分。独特标识符，例如条形码，可以在之前、之后或同时传递给细胞，以允许稍后将细胞的特征归属于特定体素。在一些实施方式中，体素具有限定的尺寸。在一些实施方式中，体素包括单个细胞。[1336]例如，基材可被覆有dtt敏感的水凝胶，然后与生物样品接触。任选地，使附接于基材的捕获探针从基材释放，从而使释放的捕获探针被引入生物样品中，并且至少一种释放的捕获探针通过捕获域与生物样品中存在的至少一种生物分析物相互作用。生物样品和基材可以组装成流动池，并添加可光交联的聚合物前体。然后可以使用光源将生物样品的细胞交联成具有限定尺寸的水凝胶体素。可以拆卸和洗涤流动池以移除未聚合的聚合物前体。覆层可以用dtt处理以产生用于下游应用的单细胞分区。可以分析捕获探针/生物分析物，并且可以使用空间条码化特征的空间信息来确定生物样品中捕获的生物分析物的空间位置。[1337]除分析物外，分区可包括其它组分，尤其是一个或多个珠。分区可以包括单个凝胶珠、单个细胞珠或单个细胞珠和单个凝胶珠两者。[1338]分区还可以包括一种或多种试剂。例如条形码之类的独特标识符可在液滴生成之前、之后或与液滴生成同时注入到液滴中，例如经由微胶囊(例如，珠)。微流体通道网络(例如，在芯片上)可用于生成分区。替代机制也可用于个体生物颗粒的划分，包括多孔膜，通过多孔膜，细胞的水性混合物被挤压成非水流体。[1339]分区可以在流体流中流动。所述分区可包括例如具有围绕内部流体中心或核心的外部屏障的微泡。在某些情况下，分区可包括多孔基材，其能够在其基材内夹带和/或保持材料。所述分区可以是第二相内第一相的液滴，其中所述第一相和第二相是不混溶的。例如，分区可以是非水性连续相(例如油相)内的水性流体液滴。在另一实例中，该分区可为水相中非水性流体的液滴。在一些示例中，分区可以在油包水乳液或水包油乳液中提供。各种不同的容器在例如美国专利申请公开号2014/0155295中描述，其全部内容通过引用纳入本文。例如，在美国专利申请公开号2010/0105112中描述了用于在非水或油连续相中产生稳定液滴的乳液系统，其全部内容通过引用纳入本文。[1340]对于乳液中的液滴，可通过例如将水性流体中的颗粒流动流引入非水性流体的流动流，使得液滴在两个流的接合部产生来实现将个体颗粒分配到离散分区。可对流体特性(例如，流体流速、流体粘度等)、粒子特性(例如，体积分数、粒子大小、粒子浓度等)、微流体结构(例如，通道几何形状等)和其它参数进行调整以控制所得分区的占用率(例如，每个分区的分析物数量、每个分区的珠数量等)。例如，可以通过以分析物的特定浓度和/或流速提供水性流来控制分区占用率。[1341]为了生成单个分析物分区，可以选择不混溶流体的相对流速，使得平均而言，分区每个分区可以包含少于一个分析物，以确保被占用的分区主要是单独占用的。在某些情况下，多个分区中的分区最多可包含一个分析物。在一些实施方式中，可以选择或调整各种参数(例如，流体性质、颗粒性质、微流体结构等)，使得大多数分区被占用，例如，仅有小百分比的未占用分区。可以控制流和信道架构以确保给定数量的单占用分区、小于某一水平的未占用分区和/或小于某一水平的多占用分区。[1342]本文所述的通道段可以耦合到各种不同的流体源或接收部件中的任何一个，包括储层、管道、歧管或其他系统的流体部件。如将理解的，微流体通道结构可以具有各种几何形状。例如，微流体通道结构可以具有一个或多个通道连接。作为另一实例，微流体通道结构可具有2、3、4或5个通道段，每个通道段携带在通道接合部相遇的颗粒。流体可以通过一个或多个流体流动单元被引导沿着一个或多个通道或储层流动。流体流动单元可包括压缩机(例如，提供正压力)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。流体也可以通过施加的压差、离心力、电动泵、真空、毛细管和/或重力流来控制。[1343]分区可以包括一个或多个独特标识符，例如条形码。条形码可以是先前的、随后的或同时传送到容纳被分隔或被划分的生物颗粒的分区。例如，条形码可以在液滴生成之前、之后或同时注入液滴。将条形码传递到特定分区使稍后将个体生物颗粒的特性归因于特定分区。条形码可以例如在核酸分子(例如寡核苷酸)上通过任何合适的机制传递到分区。条码化核酸分子可以通过微胶囊传递到分区。在一些情况中，微胶囊可包括珠。[1344]在一些实施方式中，条形码核酸分子最初可与微胶囊结合，然后从微胶囊释放。条形码核酸分子的释放可以是被动的(例如，通过扩散出微胶囊)。另外或可选择地，可在施加使条码化核酸分子离解或从微胶囊释放的刺激物时从微胶囊释放。这种刺激可以破坏微胶囊，这种相互作用使条码化核酸分子与微胶囊或在微胶囊内耦合，或两者结合。这种刺激可以包括，例如，热刺激、光刺激、化学刺激(例如，ph值的改变或还原剂的使用)、机械刺激、辐射刺激、生物刺激(例如，酶)或其任何组合。[1345]在一些实施方式中，一个或多个条形码(例如，空间条形码、umi或其组合)可作为分析物的部分引入到分区中。如前所述，条形码可直接结合到分析物，或可形成捕获探针或分析物捕获剂的部分，所述捕获探针或分析物捕获剂与分析物杂交、偶联或以其他方式关联，使得当分析物被引入分区时，条形码也被引入。[1346]图21描述了示例性工作流，其中样品与空间条码化捕获探针阵列接触，并且样品被固定、染色和成像2101，如本文别处所述。可以使用本文所述的任何方法从阵列2102上裂解捕获探针。如本文他处所述，捕获探针可通过被动或主动迁移向细胞扩散。然后可将捕获探针引入本文别处所述的样品2103，其中捕获探针能够使用本文所述的细胞穿透肽或脂质递送系统之一在没有细胞透化的情况下进入细胞。然后可以任选地对样品进行成像以通过结合在捕获探针2104内的报告分子来确认探针摄取。然后样品可从阵列中分离并经历解离2105，其中样品被分离成单细胞或小细胞群。一旦样品被解离，可将单细胞引入水包油液滴2106中，其中单细胞与液滴内的试剂结合并处理以使得穿透细胞的空间条形码标记液滴内该细胞的内容物。其它细胞分开地同时进行分区反应。然后对液滴的内容物进行测序2107，以便将一个或多个特定细胞与样品内的特定空间位置相关联2108。[1347]如上所述，图16示出了用于将个体分析物(例如，细胞)划分进入离散分区的微流体通道结构的示例。图17a和17c还展示了可用于将珠输送到液滴的微流体通道结构的其他示例。[1348]如上所述，可以将各种不同的珠合并到分区中。在一些实施方式中，例如，可以将非条码化珠纳入分区中。例如，在纳入分区中的生物颗粒(例如，细胞)携带一个或多个条形码(例如，空间条形码、umi及其组合)的情况下，珠可以是非条码化珠。[1349]在一些实施方式中，携带条形码的珠可以纳入分区中。例如，核酸分子(例如寡核苷酸)可通过可释放连接(例如二硫键接头)耦合到珠。同一珠可与一个或多个其它核酸分子耦合(例如，通过可释放连接)。核酸分子可以是或包括条形码。如本文别处所述，条形码的结构可以包括多个序列元件。[1350]所述核酸分子可包括可用于后续加工的功能域。例如，功能域可包括测序仪特异性流动池附接序列(例如，用于测序系统的p5序列)和测序引物序列(例如，用于测序系统的r1引物)中的一个或多个。核酸分子可包括用于对样品(例如dna、rna、蛋白质等)进行条码化的条形码序列。在某些情况下，条形码序列可以是珠特异性的，使得条形码序列对于耦合到同一珠的所有核酸分子是共同的。可选地或另外，条形码序列可以是分区特异性的，使得条形码序列对于耦合到被划分到相同分区中的一个或多个珠的所有核酸分子是共同的。核酸分子可包括特定引发序列，例如mrna特定引发序列(例如，多聚(t)序列)、靶向的引发序列和/或随机引发序列。核酸分子可包括锚定序列以确保特定引发序列在序列末端(例如，mrna的)杂交。例如，锚定序列可包括核苷酸的随机短序列，例如1‑聚体、2‑聚体、3‑聚体或更长的序列，其可确保多聚(t)片段更有可能在mrna的多聚(a)尾的序列末端杂交。[1351]核酸分子可包括独特分子识别序列(例如，独特分子标识符(umi))。在一些实施方式中，独特分子识别序列可包括约5至约8个核苷酸。或者，独特分子识别序列可包括少于约5个或多于约8个核苷酸。独特分子识别序列可以是在耦合到单个珠的个体核酸分子之间变化的独特序列。[1352]在一些实施方式中，独特分子识别序列可以是随机序列(例如，随机n‑聚体序列)。例如，umi可以提供捕获的起始mrna分子的独特标识符，以便能够对原始表达rna的数量进行定量。[1353]一般来说，个体珠可以耦合到任意数量的个体核酸分子，例如，从一个到几十个到几十万个甚至数百万个个体核酸分子。个体核酸分子的相应条形码可以包括共同序列段或相对共同序列段以及耦合到同一珠的不同个体核酸分子之间的可变或独特序列段。[1354]在任何给定的分区内，个体mrna分子的所有edna转录物都可以包含一个共同的条形码序列区段。然而，由给定分区内的不同mrna分子产生的转录物可以在独特分子识别序列区段(例如，umi区段)处变化。有益的是，即使在随后对给定分区的内容物进行任何扩增之后，不同umi的数目也可以指示源自给定分区的mrna的量。如上所述，转录物可被扩增、净化和测序以鉴定mrna的cdna转录物的序列，以及对条形码区段和umi区段进行测序。在描述多聚(t)引物序列的同时，其它靶向或随机引发序列也可用于起始逆转录反应。同样地，尽管描述为将条码化寡核苷酸释放到分区中，但在某些情况下，结合到珠的核酸分子可用于杂交并捕获珠固相上的mrna，例如，以促进rna与其他细胞内容物的分离。[1355]在一些实施方式中，包括具有反应性或能够被活化以使其变得具有反应性的官能团的前体可与其它前体聚合以生成包括所述活化或可活化官能团的凝胶珠。然后可以使用官能团将其它物质(例如，二硫键接头、引物、其他寡核苷酸等)附接到凝胶珠上。例如，特征为羧酸(cooh)基团的一些前体可与其它前体共聚合以形成也包括cooh官能团的珠。在一些情况中，丙烯酸(包括游离cooh基团的物质)、丙烯酰胺和双(丙烯酰)胱胺可共聚合在一起以产生包括游离cooh基团的珠。珠的cooh基团可被活化(例如，经由1‑乙基‑3‑(3‑二甲氨基丙基)碳二亚胺(edc)和n‑羟基琥珀酰亚胺(nhs)或4‑(4，6‑二甲氧基‑1，3，5‑三嗪‑2‑基)‑4‑甲基吗啉氯化物(dmtmm))以使其具有反应性(例如，与胺官能团反应，其中edc/nhs或dmtmm用于活化)。活化的cooh基团随后可与连接到珠的部分的适当的物质(例如，包括胺官能团的物质，其中羧酸基团被活化以可与胺官能团反应)反应。[1356]在一些实施方式中，可降解珠可引入到分区中，使得珠在分区内降解并且当施加适当的刺激时，任何相关物质(例如，寡核苷酸)在液滴内释放。游离物质(例如，寡核苷酸、核酸分子)可以与分区中包含的其他试剂相互作用。例如，特征为胱胺并通过二硫键连接到条形码序列的聚丙烯酰胺珠可与油包水乳液液滴内的还原剂结合。在液滴内，还原剂可以破坏各种二硫键，导致珠降解，条形码序列释放到液滴的水性内部环境中。在另一实例中，在碱性溶液中加热具有珠结合条形码序列的液滴也可导致珠降解并将所附接的条形码序列释放到液滴的水性内部环境中。[1357]任何适当数量的物质(例如，引物，条码化寡核苷酸)可与珠粒相关联，使得在从珠释放时，物质(例如，引物，例如，条码化寡核苷酸)以预定浓度存在于分区中。可选择该预定浓度以促进某些反应以在分区内产生测序文库(例如扩增)。在某些情况下，引物的预定浓度可通过产生带有核酸分子(例如寡核苷酸)的珠的过程来限制。[1358]可降解珠可包括具有不稳定键的一种或多种物质，使得当珠/物质暴露于适当的刺激物时，键被破坏并且珠降解。不稳定键可以是化学键(例如，共价键、离子键)或者可以是另一种类型的物理相互作用(例如，范德华相互作用、偶极‑偶极相互作用等)。在一些实施方式中，用于生成珠的交联剂可包括不稳定键。当暴露在适当的条件下时，不稳定的键会断裂，珠会降解。例如，当将包含胱胺交联剂的聚丙烯酰胺凝胶珠暴露于还原剂时，胱胺的二硫键可被破坏且珠降解。[1359]与不降解的珠相比，当对珠施加适当的刺激时，可降解珠可用于更快速地从珠释放附接的物质(例如，核酸分子、条形码序列、引物等)。例如，对于结合到多孔珠的内表面的物质或在包封的物质的情况下，在珠降解时，该物质可对溶液中的其他物质具有更大的移动性和可及性。在一些实施方式中，物质还可经由可降解接头(例如，二硫键接头)附接到可降解珠。所述可降解接头可对与所述可降解珠相同的刺激作出响应，或者所述两种可降解物质可对不同的刺激作出响应。例如，条形码序列可以通过二硫键附接到包含胱胺的聚丙烯酰胺珠。当条码化珠暴露于还原剂时，珠降解并且在条形码序列和珠之间的二硫键和珠中胱胺的二硫键断裂时释放空间条形码序列。[1360]如将从上述描述中了解到的，虽然被称为珠的降解，但在许多实施方式中，降解可指结合或夹带物质与珠的解离，具有或不具有物理珠本身的结构降解。例如，由于化学环境的变化，夹带的物质可以通过渗透压差从珠中释放出来。举例来说，由于渗透压差引起的珠孔体积的改变通常可以在珠本身没有结构降解的情况下发生。在一些情况中，由于珠的透化溶胀导致的孔体积增大可使珠内夹带的物质释放。在一些实施方式中，由于孔体积收缩，珠的透化收缩可导致珠更好地保留夹带的物质。[1361]许多化学触发物可用于触发分区内珠的降解。这些化学变化的实例可包括但不限于ph介导的珠内组分完整性的改变、通过交联键的裂解降解珠的组分以及珠的组分的解聚。[1362]在一些实施方式中，珠可由包括可降解化学交联剂(例如bac或胱胺)的材料形成。这种可降解交联剂的降解可以通过各种机制来实现。在一些实例中，珠可与可引起氧化、还原或其它化学变化的化学降解剂接触。例如，化学降解剂可以是还原剂，例如二硫苏糖醇(dtt)。还原剂的其他实例可包括β‑巯基乙醇、(2s)‑2‑氨基‑1，4‑二巯基丁烷(二硫丁胺或dtba)、三(2‑羧乙基)膦(tcep)或其组合。还原剂可降解形成珠的凝胶前体之间形成的二硫键，从而降解珠。[1363]在某些实施方式中，溶液ph值的变化(例如ph值的增加)可触发珠的降解。在其他实施方式中，暴露于水溶液(例如水)可触发水解降解，从而引发珠的降解。在某些情况下，任何刺激组合都可能引发珠降解。例如，ph值的变化可以使化学试剂(例如dtt)成为有效的还原剂。[1364]在应用热刺激时，也可以诱导珠释放其内容物。温度的变化会引起珠的各种变化。例如，热会使固体珠液化。热的变化会导致珠熔化，使珠的部分降解。在其他情况中，热可增加珠组分的内部压力，使得珠破裂或爆炸。热也可以作用于热敏聚合物作为材料来构建珠。[1365]除了珠和分析物之外，形成的分区可以包括各种不同的试剂和物质。例如，当裂解试剂存在于分区内时，裂解试剂可促进分区内分析物的释放。裂解剂的实例包括生物活性试剂，例如用于裂解不同细胞类型的裂解酶，例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物等，例如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌素、labiase酶、基他酶、溶细胞酶和多种其它市售的裂解酶，例如来自西格玛奥德里奇公司(密苏里州圣路易斯)，以及其他市售的裂解酶。其他裂解剂可另外或可选地共划分以使分析物释放到分区中。例如，在某些情况下，基于表面活性剂的裂解溶液可用于裂解细胞，尽管这些溶液对于表面活性剂可干扰稳定乳液的基于乳液的系统可能不太理想。在一些实施方式中，裂解溶液可包括非离子表面活性剂，例如tritonx‑100和tween20。在一些实施方式中，裂解溶液可包括离子表面活性剂，例如肌氨酰和十二烷基硫酸钠(sds)。电穿孔、热的、声学的或机械的细胞分裂也可用于某些实施方式中，例如，基于非乳液的分配，例如可作为液滴划分的补充或代替液滴划分的分析物的封装，在细胞破裂后，囊膜的任何孔体积足够小以保留给定大小的核酸片段。[1366]可与分区中的分析物共划分的其它物质的实例包括但不限于dna酶和rna酶失活剂或抑制剂或螯合剂(例如edta)以及用于去除或以其它方式降低不同细胞裂解物组分对核酸后续加工的负活性或影响的其它试剂。其他试剂也可以被共划分，包括用于片段化dna的核酸内切酶、dna聚合酶和用于扩增核酸片段和将条形码分子标签附接到扩增的片段的dntp。[1367]其他试剂还可包括逆转录酶，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和寡核苷酸，以及可用于模板转换的转换寡核苷酸(在本文中也称为“转换寡核苷酸”或“模板转换寡核苷酸”)。在一些实施方式中，模板转换可用于增加cdna的长度。模板转换可用于将预先定义的核酸序列附加到cdna。在模板转换的实例中，cdna可由模板(例如，细胞mrna)的逆转录产生，其中具有末端转移酶活性的逆转录酶可以非模板依赖的方式向cdna添加其它的核苷酸(例如，多聚(c))。转换寡核苷酸可以包括与其它核苷酸互补的序列，例如多聚(g)。cdna上的其它核苷酸(例如，多聚(c))可与转换寡核苷酸上的其它核苷酸(例如，多聚(g))杂交，由此转换寡核苷酸可被逆转录酶用作模板以进一步延伸cdna。[1368]模板转换寡核苷酸可以包括杂交区和模板区。杂交区可以包括能够与靶标杂交的任何序列。在一些情况中，杂交区包括一系列g碱基以与cdna分子3′端的突出端c碱基互补。连续g碱基可包括1个g碱基、2个g碱基、3个g碱基、4个g碱基、5个g碱基或超过5个g碱基。模板序列可以包括待纳入cdna的任何序列。在一些情况中，模板区包括至少1个(例如，至少2个、3个、4个、5个或更多)标签序列和/或功能序列。模板转换寡核苷酸可包括脱氧核糖核酸；核糖核酸；修饰的核酸，包括2‑氨基嘌呤、2,6‑二氨基嘌呤(2‑氨基‑da)、反向dt、5‑甲基dc、2′‑脱氧肌苷、超t(5‑羟基丁基‑2′‑脱氧尿苷)、超g(8‑氮杂‑7‑脱氮鸟苷)、锁核酸(lna)、解锁核酸(una，例如，una‑a、una‑u、una‑c、una‑g)、iso‑dg、iso‑dc、2′氟碱基(例如，氟c、氟u、氟a和氟g)和上述的任何组合。[1369]在一些实施方式中，与分析物划分的珠可包括结合到珠的不同类型的寡核苷酸，其中不同类型的寡核苷酸结合到不同类型的分析物。例如，珠可以包括一个或多个第一寡核苷酸(例如，可以是捕获探针)和一个或多个第二寡核苷酸(例如，可以是捕获探针)，第一寡核苷酸可以结合或杂交到第一类型的分析物，例如mrna，第二寡核苷酸可以结合或杂交到第二类型的分析物，例如gdna。分区还可以包括有助于从共划分的细胞释放核酸的裂解剂，并且还可以包括可以降解珠和/或破坏寡核苷酸和珠之间的共价键的剂(例如还原剂)，从而将寡核苷酸释放到分区中。释放的条码化寡核苷酸(也可以条码化)可以与从细胞释放的mrna以及从细胞释放的gdna杂交。[1370]由此由杂交形成的条码化构建体可包括第一类构建体，其包括对应于来自珠的原始条形码序列的序列和对应于来自细胞的转录物的序列，以及第二类构建体，其包括对应于来自珠的原始条形码序列的序列和对应于来自细胞的基因组dna的序列。然后可以从分区中释放/移出条码化构建体，并且在一些实施方式中，进一步加工以添加任何其他序列。然后可以对得到的构建体进行测序，对测序数据进行加工，并将结果用于在空间上表征来自细胞的mrna和gdna。[1371]在另一实例中，分区包括珠，其包括具有第一条形码序列的第一类寡核苷酸(例如，第一捕获探针)、可与mrna转录物的多聚(a)尾杂交的多聚(t)引发序列以及可独特地识别给定转录物的umi条形码序列。该珠还包括具有第二条形码序列的第二类寡核苷酸(例如，第二捕获探针)、能够与结合到划分细胞表面的抗体的第三条码化寡核苷酸(例如，分析物捕获剂)特异性杂交的靶向引发序列。第三条码化寡核苷酸包括独特地识别抗体的umi条形码序列(因此，它所结合的特定细胞表面特征)。[1372]在该示例中，第一和第二条码化寡核苷酸包括相同的空间条形码序列(例如，第一和第二条形码序列相同)，这使条码化核酸与分区的下游关联。然而，在一些实施方式中，第一和第二条码化序列不同。[1373]分区还可以包括有助于从细胞释放核酸的裂解剂，并且还可以包括可以降解珠和/或破坏条码化寡核苷酸和珠之间的共价键的剂(例如还原剂)，从而将它们释放到分区中。第一类释放的条码化寡核苷酸可与从细胞释放的mrna杂交，第二类释放的条码化寡核苷酸可与第三类条码化寡核苷酸杂交，形成条码化构建体。[1374]第一类条码化构建体包括与来自珠的第一条形码序列相对应的空间条形码序列和与来自第一类寡核苷酸的umi条形码序列相对应的序列，其识别细胞转录物。第二类条码化构建体包括与来自第二类寡核苷酸的第二条形码序列相对应的空间条形码序列和与第三类寡核苷酸(例如，分析物捕获剂)相对应的umi条形码序列，并用于识别细胞表面特征。然后可以从分区中释放/移出条码化构建体，并且在一些实施方式中，进一步加工以添加任何其他序列。然后对得到的构建体进行测序，对测序数据进行处理，结果用于表征细胞的mrna和细胞表面特征。[1375]前面的讨论涉及两个带有寡核苷酸的珠的具体例子，用于分析一个分区内的两种不同分析物。更一般地，被划分的珠可以具有先前描述的任何结构，并且可以包括所描述的用于分析分区内两个或更多个(例如，三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、八个或更多个、十个或更多个、12个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个，40个或更多个，50个或更多个)的不同类型的分析物的寡核苷酸的任何组合。用于同时分析分区内分析物的不同组合的具有不同类型寡核苷酸(例如，捕获探针)组合的珠的实例包括但不限于：(a)基因组dna和细胞表面特征(例如，使用本文所述的分析物捕获剂)；(b)mrna和谱系追踪构建体；(c)mrna和细胞甲基化状态；(d)mrna和可及染色质(例如，atac‑seq、dna酶‑seq和/或微球菌酶‑seq)；(e)mrna和细胞表面或细胞内蛋白质和/或代谢物；(f)条码化分析物捕获剂(例如，本文所述的mhc多聚体)和免疫细胞受体(例如，t细胞受体)的v(d)j序列；和(g)mrna和扰动剂(例如，crispr‑crrna/sgrna、talen、锌指核酸酶和/或本文所述的反义寡核苷酸)。在一些实施方式中，扰动剂可以是小分子、抗体、药物、适体、核酸(例如mirna)、物理环境(例如，温度变化)，或任何其它已知扰动剂。[1376](e)测序分析[1377]在来自样品的分析物已根据上述与基于一般空间细胞的分析方法相关的任何方法与捕获探针、分析物捕获剂或其他条码化寡核苷酸序列杂交或以其他方式结合之后，杂交/结合产生的条码化构建体通过测序进行分析以鉴定分析物。[1378]在一些实施方式中，如上文所述，通过与与细胞表面杂交、结合或关联或引入细胞的捕获探针或分析物捕获剂杂交直接对样品进行条码化，可对完整样品进行测序。或者，如上文所述，如果条码化样品已被分离成片段、细胞群或个体细胞，则可对个体片段、细胞群或细胞进行测序。如上所述，对于已通过珠划分进行条码化的分析物，可通过打破分区从分区中提取个体分析物(例如，细胞或细胞裂解后的细胞内容物)，然后通过测序来分析以识别分析物。[1379]多种不同的测序方法可用于分析条码化的分析物构建体。一般来说，测序的多核苷酸可以是例如核酸分子，例如脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)，包括其变体或衍生物(例如，单链dna或dna/rna杂合体，以及具有核苷酸类似物的核酸分子)。[1380]多核苷酸的测序可以通过各种商业系统进行。更一般地，可以使用核酸扩增、聚合酶链反应(pcr)(例如，数字pcr和液滴数字pcr(ddpcr)、定量pcr、实时pcr、多重pcr、基于pcr的单重方法、乳液pcr)和/或等温扩增来进行测序。[1381]对遗传物质进行测序的方法的其他示例包括但不限于dna杂交方法(例如，southern印迹法)、限制性酶消化方法、sanger测序方法、下一代测序方法(例如，单分子实时测序、纳米孔测序和polony测序)，连接法和微阵列法。可使用的测序方法的其他示例包括靶向测序、单分子实时测序、外显子测序、基于电子显微镜的测序、面板测序、晶体管介导测序、直接测序、随机鸟枪测序、sanger双脱氧终止测序、全基因组测序，杂交测序、焦磷酸测序、毛细管电泳、凝胶电泳、双链体测序、循环测序、单碱基延伸测序、固相测序、高通量测序、大规模平行标记测序、低温共扩增pcr(cold‑pcr)、可逆染料终止子测序、双端测序、近期测序、核酸外切酶测序、连接测序、短读测序、单分子测序、合成测序、实时测序、反向终止子测序、纳米孔测序、454测序、solexa基因组分析仪测序、solidtm测序、ms‑pet测序及其任何组合。[1382]核酸分子(包括条码化核酸分子或其衍生物)的序列分析可以是直接的或间接的。因此，序列分析基材(可被视为经受序列分析步骤或过程的分子)可直接为条码化的核酸分子或其可为从其衍生的分子(例如，其互补物)。因此，例如，在测序反应的序列分析步骤中，测序模板可以是条码化的核酸分子，也可以是从其衍生的分子。例如，第一和/或第二链dna分子可以直接进行序列分析(例如测序)，即可以直接参与序列分析反应或过程(例如测序反应或测序过程，或者是被测序或以其他方式识别的分子)。或者，可在序列分析(例如，通过另一技术进行测序或鉴定)之前对条码化核酸分子进行第二链合成或扩增的步骤。因此，序列分析底物(例如模板)可以是扩增子或条码化核酸分子的第二链。[1383]在一些实施方式中，双链分子的两条链可经序列分析(例如，测序)。在一些实施方式中，可以分析(例如测序)单链分子(例如条码化核酸分子)。为了进行单分子测序，可以在3′末端修饰核酸链。[1384]在一些实施方式中，大规模平行焦磷酸测序技术可用于核酸测序。在焦磷酸测序中，核酸在油溶液中的水滴内扩增(乳液pcr)，每个液滴包含单一的核酸模板，其附接在单一的涂有引物的珠上，然后形成克隆群体。测序系统包含许多皮升体积孔，每个孔包含一个珠和测序酶。焦磷酸测序使用荧光素酶产生光来检测添加到新生核酸中的个体核苷酸，并且组合数据用于产生序列读取。[1385]作为焦磷酸测序的另一个示例应用，释放的ppi可通过atp磺酰化酶立即转化为三磷酸腺苷(atp)来检测，并且产生的atp水平可通过荧光素酶产生的光子来检测，如ronaghi等anal.biochem.242(1)，84‑9(1996)；ronaghi，genomeres.11(1)，3‑11(2001)；ronaghi等，science281(5375)，363(1998)；以及美国专利号6,210,891，6,258,568和6,274,320所述，其全部内容通过引用纳入本文。[1386]大规模平行测序技术可用于核酸测序，如上所述。在一个实施方式中，大规模平行测序技术可基于可逆染料终止剂。例如，首先将dna分子附接到例如玻璃或硅基材上的引物上，并进行扩增以形成局部克隆群体(例如，通过桥式扩增)。添加四种类型的ddntp，并冲走未结合的核苷酸。与焦磷酸测序不同，由于阻断基团(例如，ddntp的糖部分上存在3′阻断基团)，dna一次仅延伸一个核苷酸。检测器获取荧光标记的核苷酸的图像，然后染料连同末端3′阻断基团从dna中化学去除，作为后续循环的前体。可以重复此过程，直到获得所需的序列数据。[1387]在一些实施方式中，通过检测在dna聚合期间释放的氢离子来进行测序。含有待测序的模板dna链的微孔可以充满单一类型的核苷酸。如果引入的核苷酸与前导模板核苷酸互补，则它被纳入生长的互补链。这会导致氢离子释放，从而触发超敏离子传感器，这表明发生了反应。若模板系列中存在均聚重复系列，单次循环中会纳入多个核苷酸。这导致对应数量的氢离子释放，和成比例的更高电子信号。[1388]在一些实施方式中，可以原位进行测序。原位测序方法特别有用，例如，当样品表面上的分析物(例如，细胞表面分析物)或样品内的分析物(例如，细胞内分析物)已被条码化后，生物样品保持完整。原位测序通常涉及以连续的、模板依赖的方式将标记的核苷酸(例如，荧光标记的单核苷酸或二核苷酸)纳入或将标记的引物(例如，标记的随机六聚体)杂交到核酸模板上，使得可以确定纳入的核苷酸或标记的引物延伸产物的核苷酸序列的相同性(即，核苷酸序列)，从而测定相应模板核酸的核苷酸序列。例如，在mitra等，(2003)anal.biochem.320，55‑65，和lee等，(2014)science，343(6177)，1360‑1363中描述了原位测序的各个方面，通过引用将其全部内容纳入本文。[1389]此外，pct专利申请公开号wo2014/163886、wo2018/045181、wo2018/045186和美国专利号10138509和10179932中描述了用于进行原位测序的方法和系统的示例，其全部内容通过引用纳入本文中。用于原位测序的示例技术包括但不限于starmap(例如在wang等，(2018)science，361(6499)5691中描述)、merfish(例如在moffitt，(2016)methodsinenzymology，572，1‑49中描述)和fisseq(例如在美国专利申请公开号2019/0032121中描述)。上述各参考文献的全部内容通过引用纳入本文。[1390]对于已通过划分进行条码化的分析物，条码化核酸分子或其衍生物(例如，已添加一个或多个功能序列的条码化核酸分子，或已从中移出一个或多个特征的条码化核酸分子)可汇集并一起加工以用于后续分析，例如在高分辨率测序仪上测序。可以使用条形码序列实现汇集处理。例如，给定分区的条码化核酸分子可以具有相同的条形码，这与其他空间分区的条形码不同。或者，可以分开处理不同分区的条码化核酸分子以进行后续分析(例如，测序)。[1391]在一些实施方式中，在捕获探针不包含空间条形码的情况下，可以在捕获探针从生物样品捕获分析物之后和分析分析物之前添加空间条形码。当在捕获分析物之后添加空间条形码时，可在扩增分析物之后添加条形码(例如，rna的逆转录和聚合酶扩增)。在一些实施方式中，分析物分析使用一个或多个捕获的分析物的直接测序，例如杂交的rna的直接测序。在一些实施方式中，在杂交的rna的逆转录之后进行直接测序。在一些实施方式中，在杂交的rna的逆转录的扩增之后进行直接测序。[1392]在一些实施方式中，通过合成测序(sbs)进行捕获的rna的直接测序。在一些实施方式中，测序引物与捕获探针的一个或多个域(例如，功能域)中的序列互补。在此类实施方式中，通过合成进行测序可包括逆转录和/或扩增以产生模板序列(例如，功能域)，其中引物序列可与模板序列结合。[1393]sbs可涉及将适当的引物(有时称为测序引物)与待测序的核酸模板杂交、延伸引物以及检测用于延伸引物的核苷酸。优选地，在进一步的核苷酸添加到生长的核酸链之前检测用于延伸引物的核酸，从而能进行逐碱基原位核酸测序。通过在引物延伸反应中包括一个或多个标记的核苷酸，有助于检测纳入的核苷酸。为了使适当的测序引物与待测序的核酸模板杂交，核酸模板通常应为单链形式。如果构成核酸特征的核酸模板以双链形式存在，则可使用本领域公知的方法(例如通过变性，裂解等)对其进行处理以提供单链核酸模板。与核酸模板杂交并用于引物延伸的测序引物优选短寡核苷酸，例如长度为15到25个核苷酸。测序引物的长度也可以大于25个核苷酸。例如，测序引物的长度可为约20至约60个核苷酸，或长度超过60个核苷酸。测序引物可以以溶液或固定形式提供。一旦通过使核酸模板和测序引物经受适当条件将测序引物退火到待测序的核酸模板，则进行引物延伸，例如使用核酸聚合酶和核苷酸供应，其中至少一些以标记形式提供，以及如果提供合适的核苷酸，则适于引物延伸的条件。[1394]优选地，在每个引物延伸步骤之后，包括洗涤步骤以去除可干扰后续步骤的未纳入的核苷酸。一旦进行了引物延伸步骤，就对核酸群体进行监测，以确定标记的核苷酸是否已被纳入延伸的引物中。然后可以重复引物延伸步骤以确定下一个和随后纳入延伸的引物中的核苷酸。如果所确定的序列未知，应用于给定群体的核苷酸通常以选定的顺序应用，然后在整个分析过程中重复，例如datp、dttp、dctp、dgtp。[1395]可使用的sbs技术描述于例如，但不限于美国专利申请公开号2007/0166705，美国专利申请公开号2006/0188901，u.s.patent7,057,026，美国专利申请公开号2006/0240439，美国专利申请公开号2006/0281109，pct专利申请公开号wo05/065814，美国专利申请公开号2005/0100900，pct专利申请公开号wo06/064199，pct专利申请公开号wo07/010,251，美国专利申请公开号2012/0270305，美国专利申请公开号2013/0260372，和美国专利申请公开号2013/0079232中的技术，其全部内容通过引用纳入本文。[1396]在一些实施方式中，捕获的rna的直接测序通过顺序荧光杂交(例如，通过杂交进行测序)来进行。在一些实施方式中，原位进行rna与捕获探针杂交的杂交反应。在一些实施方式中，捕获的rna在与测序探针杂交之前不被扩增。在一些实施方式中，rna在与测序探针杂交之前被扩增(例如，逆转录到cdna和cdna的扩增)。在一些实施方式中，使用单分子杂交链式反应进行扩增。在一些实施方式中，使用滚动链扩增来进行扩增。[1397]顺序荧光杂交可包括探针的顺序杂交，包括简并引物序列和可检测的标记物。简并引物序列是能够与独立于所述核酸片段序列的任何核酸片段杂交的短寡核苷酸序列。例如，这种方法可以包括以下步骤：(a)提供包括四个探针的混合物，每个探针在5′端包括a、c、g或t，进一步包括长度为5到11个核苷酸的简并核苷酸序列，并且进一步包括对于在5′端有a、c、g或t的探针而言不同的功能域(例如，荧光分子)；(b)将步骤(a)的探针与目标多核苷酸序列相关联，其序列需求将通过该方法确定；(c)测量四个功能域的活性并记录活性的相对空间位置；(d)从目标多核苷酸序列移出来自步骤(a)‑(b)中的试剂；并且将步骤(a)‑(d)重复n个循环，直到确定每个珠的空间域的核苷酸序列，经过修改，步骤(a)中使用的寡核苷酸与靶多核苷酸序列的部分以及所述序列的部分侧接的位置1到n互补。由于条形码序列不同，在一些实施方式中，这些其它侧接序列是简并序列。来自阵列上每个点的循环1到n的荧光信号可用于确定目标多核苷酸序列的序列。[1398]在一些实施方式中，使用顺序荧光杂交对捕获的rna进行体外直接测序。在一些实施方式中，捕获的rna在与测序探针杂交之前被扩增(例如，逆转录到cdna和edna的扩增)。在一些实施方式中，含有捕获的rna的捕获探针暴露于靶向rna编码区的测序探针。在一些实施方式中，一个或多个测序探针靶向每个编码区域。在一些实施方式中，测序探针被设计成与测序试剂(例如，染料标记的读出寡核苷酸)杂交。然后，测序探针可以与测序试剂杂交。在一些实施方式中，对测序反应的输出进行成像。在一些实施方式中，从测序反应的图像解析cdna的特定序列。在一些实施方式中，在与测序探针杂交之前进行对捕获的rna的逆转录。在一些实施方式中，测序探针被设计成靶向rna编码区的互补序列(例如，靶向edna)。[1399]在一些实施方式中，使用基于纳米孔的方法直接对捕获的rna进行测序。在一些实施方式中，使用纳米孔直接rna测序进行直接测序，其中捕获的rna通过纳米孔易位。纳米孔电流可以被记录并转换成碱基序列。在一些实施方式中，捕获的rna在纳米孔测序期间保持附接到基材。在一些实施方式中，捕获的rna在纳米孔测序之前从基材释放。在一些实施方式中，其中感兴趣的分析物是蛋白质，可使用基于纳米孔的方法进行蛋白质的直接测序。可使用的基于纳米孔的测序方法的实例描述于deamer等，trendsbiotechnol.18，147‑151(2000)；deamer等，acc.chem.res.35：817‑825(2002)；li等，nat.mater.2：611‑615(2003)；soni等，clin.chem.53，1996‑2001(2007)；healy等，nanomed.2，459‑481(2007)；cockroft等，j.am.chem.soc.130，818‑820(2008)；以及美国专利号7,001,792。上述各参考文献的全部内容通过引用纳入本文。[1400]在一些实施方式中，使用通过连接的单分子测序来进行捕获的rna的直接测序。这种技术利用dna连接酶纳入寡核苷酸并鉴定这种寡核苷酸的纳入。寡核苷酸通常具有与寡核苷酸杂交的序列中的特定核苷酸的相同性相关的不同标记物。例如，在shendure等，science(2005)，309：1728‑1732和美国专利号5599675、5750341、6969488、6172218和6306597中描述了连接测序所涉及的方面和特征，其全部内容通过引用纳入本文中。[1401]在一些实施方式中，核酸杂交可用于测序。这些方法利用与条形码序列的至少部分互补的标记的核酸解码器探针。多重解码可以使用具有可分辨标签的许多不同探针的集来进行。例如在美国专利号8,460,865，和gunderson等，genomeresearch14：870‑877(2004)中描述了核酸杂交测序的非限制性实例，其全部内容通过引用纳入本文。[1402]在一些实施方式中，商用高通量数字测序技术可用于分析条形码序列，其中dna模板不是一次测序一个，而是在批量过程中测序，并且许多序列优选地以平行方式读出，或者也可以使用其自身可以平行化的超高通量串行过程。此类技术的实例包括测序(例如，基于流动池的测序技术)、使用修饰核苷酸的合成测序(例如在由加利福尼亚州圣迭戈的illumina公司的truseqtm和hiseqtm技术市售)，由马萨诸塞州剑桥的helicos生命科学集团提供的heliscopetm和加利福尼亚州门罗公园的太平洋生物科学公司提供的pacbiors)、离子检测技术测序(加利福尼亚州南旧金山的离子激流公司)和dna纳米球测序(加利福尼亚州山景城的完全基因组公司(completegenomics，inc.))。[1403]在一些实施方式中，在将核苷酸纳入延伸产物时释放的质子的检测可用于本文所述的方法中。例如，美国专利申请公开号2009/0026082、2009/0127589、2010/0137143和2010/0282617中描述的测序方法和系统可用于直接对条形码进行测序。上述各参考文献的全部内容通过引用纳入本文。[1404]在一些实施方式中，可在测序期间使用对dna聚合酶活性的实时监测。例如，如levene等，science(2003)，299，682‑686，lundquist等，opt.lett.(2008)，33，1026‑1028，和korlach等，proc.natl.acad.sci.usa(2008)，105，1176‑1181中所述，可通过荧光共振能量转移(fret)检测核苷酸纳入。上述各参考文献的全部内容通过引用纳入本文。[1405]iv.多重化[1406](a)一般多重化[1407]在如本文所述的空间分析的各种实施方式中，特征可以包括用于分析个体细胞的内在和外在信息的不同类型的捕获探针。例如，特征可以包括以下一个或多个：1)具有能够结合到细胞中的一个或多个内源性核酸的捕获域的捕获探针；2)具有能够结合到细胞中的一个或多个外源性核酸的捕获域的捕获探针(例如，来自感染细胞的微生物(例如，病毒，细菌)的核酸、引入细胞的核酸(例如质粒或从中衍生的核酸)、用于基因编辑的核酸(例如crispr相关rna，例如crrna、导向rna)；3)具有能够结合到分析物捕获剂的捕获域的捕获探针(例如，与寡核苷酸偶联的抗体，该寡核苷酸包括具有结合捕获域的分析物捕获序列的捕获剂条形码结构域)，和4)具有能够结合到蛋白质(例如，在细胞中表达的外源性蛋白质、来自感染细胞的微生物(例如，病毒、细菌)的蛋白质)的结构域的捕获部分，或所述细胞蛋白质的结合伴侣(例如，免疫细胞受体的抗原)。[1408]在如本文所述的任何空间分析方法的一些实施方式中，空间概况分析包括对两种不同类型的分析物的同时分析。特征可以是一个凝胶珠，它偶联(例如，可逆偶联)到一个或多个捕获探针。捕获探针可包括空间条形码序列和可与mrna转录物的多聚(a)尾杂交的多聚(t)引发序列。捕获探针还可以包括能够独特地识别给定转录物的umi序列。捕获探针还可以包括空间条形码序列和能够与gdna随机杂交的随机n‑聚体引发序列。在这种设置中，捕获探针可以包含相同的空间条形码序列，这允许下游测序读数与特征的关联。[1409]在如本文所述的任何空间分析方法的一些实施方式中，特征可以是凝胶珠，其耦合(例如，可逆耦合)至捕获探针。捕获探针可包括空间条形码序列和可与mrna转录物的多聚(a)尾杂交的多聚(t)引发序列。捕获探针还可以包括能够独特地识别给定转录物的umi序列。捕获探针可以包括空间条形码序列和能够与分析物捕获剂特异性杂交的捕获域。分析物捕获剂可以包括寡核苷酸，该寡核苷酸包括与与特征偶联的捕获域相互作用的分析物捕获序列。分析物捕获剂的寡核苷酸可以与结合到细胞表面的抗体偶联。寡核苷酸包括独特地识别抗体(和因此，其结合到的特定细胞表面特征)的条形码序列(因此，它所结合的特定细胞表面特征)。在这种设置中，捕获探针包括相同的空间条形码序列，这允许条码化核酸与空间阵列上位置的下游关联。在本文所描述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，可通过任何合适的路线产生分析物捕获剂，包括经由本文别处所描述的示例性耦合方案。[1410]在本文所述的任何空间分析方法的一些实施方式中，可同时测量的两个或更多个生物分析物的其他组合包括但不限于：(a)基因组dna和细胞表面特征(例如，通过结合到细胞表面特征的分析物捕获剂)，(b)mrna和谱系追踪结构，(c)mrna和细胞甲基化状态，(d)mrna和可及染色质(例如atac‑seq、dna酶‑seq和/或微球菌酶‑seq)，(e)mrna和细胞表面或细胞内蛋白质和/或代谢物，(f)mrna和染色质(细胞中染色质的空间组织)，(g)分析物捕获剂(例如，本文所述的任何mhc多聚体)和免疫细胞受体(例如t细胞受体)的v(d)j序列，(h)mrna和扰动剂(例如crisprcrrna/sgrna、talen、锌指核酸酶和/或本文所述的反义寡核苷酸)，(i)基因组dna和扰动剂，(j)分析物捕获剂和扰动剂，(k)可及染色质和扰动剂，(1)染色质(例如，细胞中染色质的空间组织)和扰动剂，和(m)细胞表面或细胞内蛋白质和/或代谢物和扰动剂(例如，本文所述扰动剂中任一种)，或其任何组合。[1411]在本文所描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，第一分析物可包括具有编码免疫细胞受体(例如tcr或bcr)的v(d)j序列的至少部分的核酸序列(例如，mrna，源自mrna逆转录的互补dna)的核酸分子。在一些实施方式中，具有编码免疫细胞受体的v(d)j序列的至少部分的核酸序列的核酸分子是首先使用含多聚(t)的引物从相应mrna的逆转录产生的cdna。然后可以使用引物对所生成的cdna进行条码化，所述引物的特征为与所生成的cdna的至少部分杂交的空间条形码序列(和可选的umi序列)。在一些实施方式中，结合末端转移酶或具有末端转移酶活性的逆转录酶的模板转换寡核苷酸可用于在cdna上产生引发区，条码化引物可在cdna产生期间与其杂交。末端转移酶活性可例如将多聚(c)尾添加至cdna的3′端，使得模板转换寡核苷酸可经由多聚(g)引发序列结合且cdna的3′端可进一步延伸。原始mrna模板和模板转换寡核苷酸随后可从cdna变性，并且包含与cdna上所生成的引发区的至少部分互补的序列的条码化引物随后可与cdna和包含条形码序列(和任何可选的umi序列)和产生的cdna互补物的条码化构建体杂交。在pct专利申请号wo2018/075693和美国专利申请公开号2018/0105808中描述了适用于对从mrna转录物生成的cdna进行条码化的其他方法和组合物，所述mrna转录物包括编码免疫细胞受体的v(d)j区域的那些，和/或包括模板转换寡核苷酸的组合物和条码化方法，各自均通过引用全文纳入本文。[1412]在一些实施方式中，可以使用类似于本文所述的方法来进行v(d)j分析。例如，v(d)j分析可以通过使用与免疫细胞的特定表面特征结合并与条形码序列(例如，分析物结合部分条形码)相关联的一种或多种分析物捕获剂来完成。一种或多种分析物捕获剂可包括mhc或mhc多聚体。条码化的寡核苷酸与可用于v(d)j分析的珠偶联。寡核苷酸通过可释放的连接如二硫键接头偶联到珠上。寡核苷酸可以包括对后续处理有用的功能序列，例如可以包括测序仪特异性流动池附接序列(例如p5序列)的功能序列，以及可以包括测序引物序列(例如r1引物结合位点)的功能序列。在一些实施方式中，该序列可以包括p7序列和r2引物结合位点。条形码序列可包含在结构中以用于对模板多核苷酸进行条码化。可选择功能性序列可以与各种不同测序系统中的任何一种兼容，例如454测序、离子激流质子或pgm、illuminax10等及其要求。在一些实施方式中，条形码序列、功能序列(例如，流动池附接序列)和附加序列(例如，测序引物序列)可以是附接到给定珠的全部寡核苷酸所共有的。条码化的寡核苷酸还可以包括促进模板转换的序列(例如，多聚(g)序列)。在一些实施方式中，如本文别处所述，其他序列提供独特分子标识符(umi)序列区段。[1413]在使用条形码寡核苷酸的细胞多核苷酸分析的示例性方法中，将细胞与带有条码化寡核苷酸和例如逆转录酶、引物、寡核苷酸(例如，模板转换寡核苷酸)、dntp和还原剂的其他试剂的珠一起共划分到分区中(例如，乳液中的液滴)。在该分区内，细胞可被裂解以产生多个模板多核苷酸(例如，dna例如基因组dna、rna例如mrna等)。[1414]具有来自细胞的模板多核苷酸和(i)具有朝向3′末端的序列的引物的反应混合物，该序列与模板多核苷酸杂交(例如，多聚(t))和(ii)模板转换寡核苷酸，其包括朝向5′末端的第一寡核苷酸，可经受扩增反应以产生第一扩增产物。在一些实施方式中，模板多核苷酸是具有多聚(a)尾的mrna，并且与模板多核苷酸杂交的引物包括朝向3′末端的多聚(t)序列，其与多聚(a)区段互补。第一寡核苷酸可包括以下的至少一个：衔接子序列、条形码序列、独特分子标识符(umi)序列、引物结合位点和测序引物结合位点或其任何组合。在一些情况中，第一寡核苷酸是能够由多个分区的全部分区所共有的序列。例如，第一寡核苷酸可包括流动池附接序列、扩增引物结合位点或测序引物结合位点，并且第一扩增反应促进该寡核苷酸与来自细胞的模板多核苷酸的附接。在一些实施方式中，第一寡核苷酸包括引物结合位点。在一些实施方式中，第一寡核苷酸包括测序引物结合位点。[1415]朝向引物3′端(例如，多聚(t))的序列与模板多核苷酸杂交。在第一扩增反应中，延伸反应试剂，例如逆转录酶、三磷酸核苷、辅因子(例如，mg2 或mn2 )(它们也是共同划分的)可以利用细胞的核酸作为模板来延伸引物序列，产生转录物，例如cdna，其具有与引物退火的细胞核酸的链互补的片段。在一些实施方式中，逆转录酶具有末端转移酶活性，并且逆转录酶以非模板依赖的方式向cdna添加其它的核苷酸，例如多聚(c)。[1416]模板转换寡核苷酸，例如包括多聚(g)序列的模板转换寡核苷酸，可与cdna杂交并促进第一扩增反应中的模板转换。因此，转录物可以包括引物的序列、与来自细胞的模板多核苷酸互补的序列和与模板转换寡核苷酸互补的序列。[1417]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，在第一扩增反应之后，第一扩增产物或转录物可经受第二扩增反应以产生第二扩增产物。在一些实施方式中，附加序列(例如，功能序列，例如流动池附接序列、测序引物结合序列、条形码序列等)被附接。第一和第二扩增反应可以在相同体积中进行，例如在液滴中。在一些实施方式中，第一扩增产物在有条码化寡核苷酸存在的情况下经历第二扩增反应，以产生具有条形码序列的第二扩增产物。条形码序列对于分区可以是独特的，即每个分区可以具有独特条形码序列。条码化的寡核苷酸可以包括具有模板转换寡核苷酸的至少一个区段和至少第二寡核苷酸的序列。条码化寡核苷酸上的模板转换寡核苷酸的区段能促进条码化寡核苷酸与转录物(例如cdna)的杂交，以促进第二扩增产物的产生。除了条形码序列之外，条码化寡核苷酸可包括第二寡核苷酸，例如以下的至少一个：衔接子序列、独特分子标识符(umi)序列、引物结合位点和测序引物结合位点，或其任何组合。[1418]在本文所描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，第二扩增反应使用第一扩增产物作为模板并且使用条码化寡核苷酸作为引物。在一些实施方式中，条码化寡核苷酸上的模板转换寡核苷酸的区段可与所述cdna或具有与模板转换寡核苷酸互补的序列的互补片段或从模板转换寡核苷酸拷贝的序列的部分杂交。在第二扩增反应中，延伸反应试剂，例如聚合酶、三磷酸核苷、辅因子(例如mg2 或mn2 )(其也是被共划分的)，可以使用第一扩增产物作为模板来延伸引物序列。第二扩增产物可包括第二寡核苷酸、模板多核苷酸(例如，mrna)区段的序列和与引物互补的序列。[1419]在本文所描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，第二扩增反应使用条码化寡核苷酸作为模板并且使用第一扩增产物的部分作为引物。具有与模板转换寡核苷酸互补的序列的第一扩增产物(例如，cdna)的区段能与包含模板转换寡核苷酸的至少一个区段的序列的条码化寡核苷酸的区段杂交。在第二扩增反应中，延伸反应试剂，例如聚合酶、三磷酸核苷、辅因子(例如mg2 或mn2 )(其也是被共同划分的)，可以使用条码化寡核苷酸作为模板来延伸引物序列。第二扩增产物可以包括引物的序列、与模板多核苷酸(例如mrna)的序列互补的序列和与第二寡核苷酸互补的序列。[1420]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，可以同时测量三类或更多类的生物分析物。例如，特征可以包括可以通过三个不同的捕获域参与至少三种不同类型的分析物的测定的捕获探针。珠可耦合到条码化寡核苷酸，所述条码化寡核苷酸包括包含用于mrna分析的多聚(t)引发序列的捕获域；条码化寡核苷酸，所述条码化寡核苷酸包括包含用于gdna分析的随机n‑聚体引发序列的捕获域；以及条码化寡核苷酸，所述条码化寡核苷酸包括可特异性地通过其分析物捕获序列与分析物捕获剂(例如，带有空间条形码的抗体)结合。[1421]在本文所述的任何空间分析方法的一些实施方式中，可同时测量的三种或更多生物分析物的其他组合包括但不限于：(a)mrna，谱系追踪构建体，以及细胞表面和/或细胞内蛋白质和/或代谢物；(b)mrna，可及染色质(例如，atac‑seq，dna酶‑seq和/或微球菌酶‑seq)和细胞表面和/或细胞内蛋白质和/或代谢物；(c)mrna、基因组dna和扰动剂(例如，如本文所述的crispr‑crrna/sgrna、talen、锌指核酸酶和/或反义寡核苷酸)；(d)mrna，可及染色质和扰动剂；(e)mrna，分析物捕获试剂(例如，本文所述的任何mhc多聚体)和扰动剂；(f)mrna，细胞表面和/或细胞内蛋白质和/或代谢物和扰动剂；(g)mrna，免疫细胞受体(例如，t细胞受体)的v(d)j序列和扰动剂；(h)mrna，分析物捕获剂和免疫细胞受体的v(d)j序列；(i)细胞表面和/或细胞内蛋白质和/或代谢物，分析物捕获剂(例如，本文所述mhc多聚体)和免疫细胞受体的v(d)j序列；(j)甲基化状态，mrna和细胞表面和/或细胞内蛋白质和/或代谢物；(k)mrna，染色质(例如，细胞中染色质的空间组织)和扰动剂；(1)免疫细胞受体的v(d)j序列，染色质(例如，细胞中染色质的空间组织)；和扰动剂；和(m)mrna，免疫细胞受体的v(d)j序列和染色质(例如，细胞中染色质的空间组织)，或其任何组合。[1422]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，可以同时测量四类或更多类的生物分析物。特征可以是与条码化引物偶联的珠，所述引物各自可以参与不同类型分析物的测定。所述特征耦合(例如，可逆耦合)到捕获探针，所述捕获探针包括用于mrna分析的多聚(t)引发序列的捕获域，并且还耦合(例如，可逆耦合)到捕获探针，所述捕获探针包括用于gdna分析的随机n‑聚体引发序列的捕获域。此外，该特征还偶联(例如，可逆偶联)至捕获探针，该捕获探针通过其捕获域结合分析物捕获剂的分析物捕获序列。该特征还可偶联(例如，可逆偶联)至捕获探针，该捕获探针可通过其捕获域特异性地结合能够以扰动剂方式起作用的核酸分子(例如，crisprcrrna/sgrna、talen、锌指核酸酶和/或反义寡核苷酸，如本文所述)。[1423]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，存在于给定特征或给定珠上的各种空间条码化捕获探针中的每一个包括相同的空间条形码序列。在一些实施方式中，每个条码化的捕获探针可以以适合于分析其各自分析物的方式从特征中释放。例如，条码化构建体a、b、c和d可以如本文他处所述产生并分析。条码化构建体a可以包括对应于来自珠的条形码序列(例如，空间条形码)的序列和对应于目标mrna的dna序列。条码化构建体b可以包括对应于来自珠的条形码序列(例如，空间条形码)的序列和对应于基因组dna的序列。条码化构建体c可以包括对应于来自珠的条形码序列(例如，空间条形码)的序列和对应于与分析物捕获剂相关联的条形码序列(例如，分析物结合部分条形码)的序列。条码化构建体d可以包括对应于来自珠的条形码序列(例如，空间条形码)的序列和对应于crispr核酸的序列(其在一些实施方式中还包括条形码序列)。可以分析每个构建体(例如，通过多种测序方法中的任一种)并且结果可以与各种分析物来源的给定细胞相关联。条码化(或甚至非条码化)构建体可以定制用于分析与核酸相关并且能够与这样的构建体结合的任何给定分析物。[1424]在本文所述的任何空间分析方法的一些实施方式中，可同时测量的四种或更多生物分析物的其他组合包括但不限于：(a)mrna，谱系追踪构建物，细胞表面和/或细胞内蛋白质和/或代谢物，以及gdna；(b)mrna，可获得的染色质(例如，atac‑seq、dna酶‑seq和/或微球菌酶‑seq)，细胞表面和/或细胞内蛋白质和/或代谢物以及扰动剂(例如，如本文所述的crispr‑crrna/sgrna、talen、锌指核酸酶和/或反义寡核苷酸)；(c)mrna、细胞表面和/或细胞内蛋白质和/或代谢物，分析物捕获剂(例如免疫细胞受体(例如，t细胞受体)的v(d)j序列；(d)mrna，基因组dna，扰动剂和可及染色质；(e)mrna，细胞表面和/或细胞内蛋白质和/或代谢物，分析物捕获剂(例如，本文所述mhc多聚体)和扰动剂；(f)mrna，细胞表面和/或细胞内蛋白质和/或代谢物，扰动剂和免疫细胞受体(例如t细胞受体)的v(d)j序列；(g)mrna，扰动剂，分析物捕获剂(例如本文所述的mhc多聚体)和免疫细胞受体(例如t细胞受体)的v(d)j序列；(h)mrna，染色质(例如，细胞中染色质的空间组织)和扰动剂；(i)免疫细胞受体的v(d)j序列，染色质(例如，细胞中染色质的空间组织)；和扰动剂；(j)mrna，免疫细胞受体的v(d)j序列，染色质(例如，细胞中染色质的空间组织)和基因组dna；(k)mrna，免疫细胞受体的v(d)j序列，染色质(例如，细胞中染色质的空间组织)和扰动剂，或其任何组合。[1425](b)用于多分析物分析的空间阵列的构建[1426]本公开还提供用于构建能够进行多分析物分析的空间阵列的方法和材料。在一些实施方式中，空间阵列包括在基材上的多个特征，其中多个特征的一个或多个成员包括多个具有第一类型功能序列的寡核苷酸和具有第二不同类型的功能序列的寡核苷酸。在一些实施方式中，特征可包括具有两种类型功能序列的寡核苷酸。特征可以与包含truseq功能序列的寡核苷酸偶联，并且也可以与包含nextera功能序列的寡核苷酸偶联。在一些实施方式中，多个特征的一个或多个成员包括两种类型的功能序列。在一些实施方式中，多个特征的一个或多个成员包括第一类型的功能序列。在一些实施方式中，多个特征的一个或多个成员包括第二类型的功能序列。在一些实施方式中，可将其他寡核苷酸添加到功能性序列以产生全寡核苷酸，其中全寡核苷酸包括空间条形码序列、可选umi序列、引发序列和捕获域。这些序列的附接可以通过连接(包括美国专利申请公开号20140378345中描述的通过夹板连接，其全部内容通过引用并入本文)或任何其它合适的途径实现。如本文所讨论的，寡核苷酸可以与有助于构建完整的完整寡核苷酸(例如，能够进行空间分析的寡核苷酸)的夹板序列杂交。[1427]在一些实施方式中，与位于特征上的功能序列(例如，truseq和nextera)杂交的寡核苷酸包括能够捕获不同类型的分析物(例如，mrna、基因组dna、细胞表面蛋白质或可及染色质)的捕获域。在一些示例中，可结合至truseq功能序列的寡核苷酸可包括包含多聚(t)捕获序列的捕获域。除了多聚(t)捕获序列之外，能够结合truseq官能团的寡核苷酸还可以包括捕获域，所述捕获域包括用于捕获基因组dna的随机n聚体(n‑mer)序列(例如，或能够捕获本文所述的任何生物分析物的本文所述的任何其它序列或结构域)。在这种情况下，空间阵列可以通过将truseq‑多聚(t)和truseq‑n聚体寡核苷酸的比率施用于包含功能性truseq序列的特征来构建。这可以产生空间阵列，其中部分寡核苷酸可以捕获mrna，另一不同部分寡核苷酸可以捕获基因组dna。在一些实施方式中，多个特征的一个或多个成员包括truseq和nextera功能性序列。在这种情况下，包括两种类型的功能序列的特征能够结合对每个功能序列具有特异性的寡核苷酸。例如，能够与truseq功能序列结合的寡核苷酸可用于递送包含多聚(t)捕获域的寡核苷酸，而能够与nextera功能序列结合的寡核苷酸可用于递送包含n聚体捕获域的寡核苷酸，用于捕获基因组dna。本领域普通技术人员将认识到，捕获域(例如，具有本文所述的能够结合到本文所述的任何不同类型的分析物的各种捕获序列中的任何一种的捕获域，如本文所述)的任何组合可与能够结合到truseq和nextera功能性序列的寡核苷酸组合以构建空间阵列。[1428]在一些实施方式中，包括捕获域(例如，能够耦合到分析物的寡核苷酸)或分析物捕获剂的寡核苷酸可包括能够结合或连接到分析引物的寡核苷酸序列。衔接子可允许捕获探针或分析物捕获剂附接至任何合适的测定引物并用于任何合适的测定。所述分析引物可以包括引发区和能够结合或连接到衔接子的序列。在一些实施方式中，衔接子可以是非特异性引物(例如，5′突出端)并且测定引物可包括能够被连接到5′突出端的3′突出端。分析引物上的引发区可以是本文所述的任何引物，例如多聚(t)引物、随机n‑聚体引物、靶向特异性引物或分析物捕获剂捕获序列。[1429]在一些实例中，寡核苷酸可包括衔接子，例如具有10个核苷酸的5′突出端。衔接子可以连接到测定引物，其各自包括一个3′突出端，其中10个核苷酸与衔接子的5′突出端互补。捕获探针可通过附接到为该测定设计的测定引物而用于任何分析。[1430]衔接子和分析引物可用于允许捕获探针或分析物捕获剂附接到任何合适的测定引物并用于任何合适的测定。包含空间条形码的捕获探针可以附接到包含多聚(dt)序列的珠上。包括空间条形码和多聚(t)序列的捕获探针可用于测定如本文一般描述的多种生物分析物(例如，生物分析物包括多聚(a)序列或偶联至分析物捕获剂或以其它方式与分析物捕获剂相关联，所述分析物捕获剂包含多聚(a)序列作为分析物捕获序列)。[1431]具有多聚(a)序列的夹板寡核苷酸可用于促进耦合到捕获探针，捕获探针包括空间条形码和促进耦合到分析引物的第二序列。测定引物包括与夹板寡核苷酸第二序列互补的序列和确定测定引物功能的测定特异性序列(例如，多聚(t)引物、随机n聚体引物、目标特异性引物或分析物捕获剂捕获序列，如本文所述)。[1432]在本文所描述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，特征可以包括捕获探针，其包括包括例如具有3′末端3rg的转换寡核苷酸的空间条形码。例如，可以使用具有用3rg序列功能化的空间条形码的特征(例如，凝胶珠)，其能够实现模板切换(例如，逆转录酶模板切换)，但对于任何聚体测定都不是特异性的。在一些实施方式中，添加到反应中的测定引物可以确定分析哪种类型的分析物。例如，测定引物可以包括能够结合目标生物分析物的结合域(例如，用于mrna的多聚(t)，用于基因组dna的n聚体等)。捕获探针(例如，能够进行空间概况分析的寡核苷酸)可以通过使用逆转录酶/聚合酶进行延伸来产生，随后模板转换到条码化衔接子寡核苷酸上以纳入条形码和其他功能性序列。在一些实施方式中，测定引物包括能够结合用于mrna分析的多聚(t)序列的捕获域、用于基因组dna分析的随机引物或能够结合与分析物结合部分偶联的核酸分子的捕获序列(例如，分析物捕获剂的分析物捕获序列)或可用作扰动剂的核酸分子(例如，如本文所述的crisprcrrna/sgrna、talen、锌指核酸酶和/或反义寡核苷酸)。[1433]v.样品分析系统[1434]上述用于分析生物样品的方法可以使用各种硬件组件来实现。在本节中，将描述此类组件的示例。然而，应当理解，一般来说，本文讨论的各种步骤和技术可以使用各种不同的装置和系统组件来进行，并非所有这些都被明确地阐述。[1435]图22a是示出示例样品处理设备2200的示意图。样品处理设备2200包括样品室2202，其在关闭或密封时是流体密封的。在室2202内，第一保持器2204保持样品2208所在的第一基材2206。样品室2202还包括第二保持器2210，其保持具有特征阵列2214的第二基材2212，如上所述。[1436]流体储器2216经由流体入口2218连接到样品室2202的内部体积。流体出口2220还连接到样品室2202的内部体积和阀2222。反过来，阀2222连接到废物储器2224，并且可选地连接到分析装置2226。控制单元2228电连接到第二保持器2210、阀2222、废物储器2224和流体储器2216。[1437]在设备2200的操作期间，上述任何试剂、溶液和其它生化组分可经由流体入口2218从流体储器2216输送到样品室2202。控制单元2228连接到流体储器2216，可以控制试剂、溶液和组分的递送，并根据各种样品类型和分析程序的编程分析方案调整体积和流速。在一些实施方式中，流体储器2216包括可由控制单元2228控制的泵，以便于将物质输送到样品室2202中。[1438]在某些实施方式中，流体储器2216包括多个室，每个室通过歧管(未示出)连接到流体入口2218。控制单元2228可以通过调节歧管来选择性地将来自多个室中的任何一个或多个室的物质输送到样品室2202中，以确保所选择的室在流体上连接到流体入口2218。[1439]一般而言，控制单元2228可被配置成在第一基材2212上的样品2208与第一基材2212上的特征阵列2214相互作用之前、之后或之前和之后将物质从流体储器2216引入样品室2202。前面已经描述了许多此类物质的例子。此类物质的实例包括但不限于透化剂、缓冲剂、固定剂、染色溶液、洗涤溶液和各种生物试剂的溶液(例如，酶、肽、寡核苷酸、引物)。[1440]为了起始样品2208和特征阵列2214之间的相互作用，样品和阵列在空间上接近。为了促进该步骤，第二保持器2210——在控制单元2228的控制下——可以在x‑、y‑和z‑坐标方向中的任何一个方向上平移第二基材2212。具体地，控制单元2228可以指示第二保持器2210在z方向上平移第二基材2212，使得样品2208接触或接近接触特征阵列2214。[1441]在一些实施方式中，设备2200可以任选地包括对准子系统2230，其可以电连接到控制单元2228。对准子系统2230的功能是确保样品2208和特征阵列2214在z方向上平移第二基材2212之前在x‑y平面上对齐，以便样品2208接触或近乎接触特征阵列2214。[1442]对准子系统2230可以以多种方式实现。在一些实施方式中，例如，对准子系统2230包括成像单元，其获得显示第一基材2206和/或第二基材2212上的基准标识(marking)的一个或多个图像。控制单元2218分析图像以确定第二基材2212在x和/或y坐标方向上的适当平移，以确保样品2208和特征阵列2214在z坐标方向上的平移之前对齐。[1443]在某些实施方式中，控制单元2228可任选地调节从样品室2202移出物质。例如，控制单元2228可以选择性地调整阀2222，使得从流体储器2216引入样品室2202的物质被引导到废物储器2224。在一些实施方式中，废物储器2224可以包括电连接到控制单元2228的减压源(未示出)。控制单元2228可调节流体出口2220中的流体压力，以控制流体从样品室2202移入废物储器2224的速率。[1444]在一些实施方式中，来自样品2208或来自特征阵列2214的分析物可通过控制单元2228对阀2222的适当调节选择性地输送到分析装置2226。如上所述，在一些实施方式中，分析装置2226包括电连接到控制单元2228的减压源(未示出)，以便控制单元2228可以调整将分析物输送到分析装置2226的速率。因此，流体出口2220有效地起到分析物收集器的作用，而分析物的分析由分析装置2226进行。应当注意，并非本文所描述的所有工作流和方法都经由分析装置2226来实现。例如，在一些实施方式中，由特征阵列2214捕获的分析物保持与阵列结合(即，不从阵列上裂解)，并且直接分析特征阵列2214以识别特定结合的样品组分。[1445]除了上述组件之外，设备2200还可以任选地包括其它特征。在一些实施方式中，例如，样品室2202包括电连接到控制单元2228的加热子系统2232。控制单元2228可激活加热子系统2232以加热样品2208和/或特征阵列2214，这可有助于促进本文所述方法的某些步骤。[1446]在某些实施方式中，样品室2202包括与控制单元2228电连接的电极2234。控制单元2228可以任选地激活电极2234，从而在第一和第二基材之间建立电场。例如，此类场可用于促进分析物从样品2208向特征阵列2214迁移。[1447]在本文描述的一些方法中，获取样品和/或特征阵列的一个或多个图像。通常可以以各种方式实现用于获得这种图像的成像设备。图22b示出了成像设备2250的一个示例。成像设备2250包括光源2252、光调整光学元件2254、光传送光学元件2256、光收集光学元件2260、光调节光学元件2262和检测子系统2264。上述每个部件可以可选地连接到控制单元2228，或者可选地连接到另一个控制单元。为了下面的说明，假设控制单元2228连接到成像设备2250的部件。[1448]在成像设备2250的操作期间，光源2252产生光。通常，由光源2252产生的光可以包括电磁光谱的紫外光、可见光和/或红外区域中的任何一个或多个区域中的光。可以使用各种不同的光源元件来产生光，包括(但不限于)发光二极管、激光二极管、激光源、荧光源、白炽灯源和辉光放电源。[1449]光源2252产生的光由光调整光学元件2254接收。一般而言，光调整光学元件2254针对特定成像应用修改光源2252产生的光。例如，在一些实施方式中，光调整光学元件2254例如通过滤除光的某些波长来修改光的光谱特性。为此，光调整光学元件2254可以包括各种光谱光学元件，例如滤光器、光栅、棱镜和色差分束器。[1450]在某些实施方式中，光调整光学元件2254修改由光源2252产生的光的空间特性。可用于此目的的组件的示例包括(但不限于)孔径、相位掩模、变迹元件和扩散器。[1451]在通过光调整光学器件2254进行修改之后，光被光传送光学器件2256接收并且被引导到样品2208或特征阵列2214上，其中任一样品2208或特征阵列2214被定位在支架2258上。光调整光学元件2254通常用于收集光并将光引导到样品或阵列的表面上。各种不同的光学元件可用于此目的，且此类元件的实例包括但不限于透镜、镜、分束器及具有非零光功率的各种其它元件。[1452]从样品2208或特征阵列2214射出的光由光收集光学元件2260收集。一般而言，光收集光学元件2260可以包括与上述与光传送光学元件2256相关的那些元件中的任何元件类似的元件。然后可以任选地通过光调节光学元件2262来修改收集的光，光调节光学元件2262通常可以包括上述与光调整光学元件2254相关的任何元件。[1453]然后由检测子系统2264检测光。通常，检测子系统2264通过检测来自样品或特征阵列的光来生成样品2208或特征阵列2214的一个或多个图像。检测子系统2264中可以使用各种不同的成像元件，包括ccd检测器和其他图像捕获装置。[1454]如图22b所示，上述每个组件可以任选地连接到控制单元2228，使得控制单元2228可以调整成像设备的各种特性。例如，控制单元2228可以相对于入射光的位置并且也相对于入射光的焦平面(如果入射光被聚焦)来调整样品2208或特征阵列2214的位置。控制单元2228还可以选择性地过滤入射光和从样品中射出的光。[1455]成像设备2250通常可以获得各种不同成像模式的图像。在一些实施方式中，例如，图像是透射光图像，如图22b所示。在某些实施方式中，设备2250被配置为获得反射图像。在一些实施方式中，设备2250可以被配置成获得双折射图像、荧光图像、磷光图像、多光子吸收图像，以及更一般地，任何已知的图像类型。[1456]一般而言，控制单元2228可以通过向样品处理设备2200和/或成像设备2250的组件发送适当的控制信号来进行本文中描述的不明确要求用户干预的任何方法步骤。为了进行这些步骤，控制单元2228通常包括软件指令，当进行这些指令时，使控制单元2228进行特定步骤。在一些实施方式中，控制单元2228包括电子处理器和电子处理器可读的软件指令，并使处理器进行本文描述的步骤。在某些实施方式中，控制单元2228包括一个或多个应用特定的整合电路，所述整合电路具有有效地用作软件指令的电路配置。[1457]控制单元2228可以以多种方式实现。图22c是示出控制单元2228的一个示例的示意图，其包括电子处理器2280、存储单元2282、存储设备2284和输入/输出界面2286。处理器2280能够处理存储在存储器单元2282或存储设备2284中的指令，并且在输入/输出界面2286上显示信息。[1458]存储器单元2282存储信息。在一些实施方式中，存储单元2282是计算机可读介质。存储单元2282可以包括易失性存储器和/或非易失性存储器。存储设备2284能够提供大容量存储，并且在一些实施方式中，存储设备2284是计算机可读介质。在某些实施方式中，存储设备2284可以是软盘设备、硬盘设备、光盘设备、磁带设备、固态设备或另一种类型的可写介质。[1459]输入/输出界面2286实现输入/输出操作。在一些实施方式中，输入/输出界面2286包括键盘和/或指针设备。在一些实施方式中，输入/输出界面2286包括用于显示图形用户界面和/或显示信息的显示单元。[1460]进行并使控制单元2228进行本文所述的任何步骤或过程的指令可以在数字电子电路、或计算机硬件、固件或这些的组合中实现。这些指令可以在有形地体现在信息载体(例如，在机器可读存储设备)中的计算机程序产品中实现，以便由可编程处理器(例如，处理器2280)进行。计算机程序可以用任何形式的编程语言编写，包括编译或解释语言，并且可以用任何形式部署，包括作为独立程序或作为模块、组件、子程序或适合在计算环境中使用的其他单元。适于有形地体现计算机程序指令和数据的存储设备包括所有形式的非易失性存储器，包括例如半导体存储器设备，例如eprom、eeprom和闪存设备；磁盘，例如内部硬盘和可移动磁盘；磁光盘；以及cd‑rom和dvd‑rom光盘。处理器和存储器可由asic(专用整合电路)补充或纳入asic中。[1461]处理器2280可以包括各种合适的处理器中的任何一个或多个。例如，用于进行指令程序的合适处理器包括通用和专用微处理器，以及任何类型的计算机或计算设备的唯一处理器或多个处理器中的一个。[1462]示例性实施方式[1463]在本文所述的工作流的一些非限制性示例中，可将样品浸入100％冷冻甲醇中，并在‑20℃下孵育30分钟。20分钟后，可移出样品并在超纯水中冲洗。冲洗样品后，制备新鲜的曙红溶液，随后样品可以用异丙醇覆盖。将样品在异丙醇中孵育1分钟后，可以通过将载玻片保持一定角度来移除试剂，此时载玻片的底部边缘可以与实验室抹布接触并风干。样品可以被均一地覆盖于苏木精溶液中，并在室温下孵育7分钟。将样品在苏木精中孵育7分钟后，可以通过将载玻片保持一定角度来移除试剂，此时载玻片的底部边缘可以与实验室擦拭物接触。可以将含有样品的载玻片浸入水中，移除多余的液体。之后，样品可以用发蓝缓冲液覆盖，并可以在室温下孵育2分钟。将装有样品的载玻片再次浸入水中，均一覆盖伊红溶液，室温孵育1分钟。载玻片可以风干不超过30分钟，然后在37℃孵育5分钟。可以使用明场成像设置对样品进行成像。[1464]此外，可以通过以下示例性步骤处理生物样品以进行样品透化和cdna生成。样品可以暴露于透化酶并在37℃孵育预定的透化时间(这是组织类型特异性的)。通过添加0.1xssc缓冲液，可以移除透化酶并准备用于分析物捕获的样品。然后可以对样品进行预平衡热循环方案(例如，53℃盖温和预平衡，53℃逆转录45分钟，然后保持在4℃)，ssc缓冲液可被移除。可以将含有无核酸酶水、逆转录酶试剂、模板转换寡核苷酸、还原剂和逆转录酶的主混物(mastermix)加入生物样品和基材中，并且可以对带有主混物的样品进行热循环方案(例如，在53℃进行逆转录45分钟并在4℃保持)。可以通过使基材经受热循环方案(例如，在65℃预平衡，在65℃合成第二条链15分钟，然后在4℃保持)在基材上进行第二条链合成。可以从样品中移除主混物试剂，然后加入0.8mkoh并在室温下孵育5分钟。可以移除koh，可以添加洗脱缓冲液并将其从样品中移除。可以将包含第二链试剂、第二链引物和第二链酶的第二链混合物(secondstrandmix)添加到样品中，并且可以密封和孵育样品。在孵育结束时，可以移除试剂，加入洗脱缓冲液并将其从样品中移除，再次向样品中加入0.8mkoh，使样品在室温下孵育10分钟。可以添加tris‑hcl，混合试剂。可以将样品转移至新管中，涡旋并置于冰上。[1465]此外，生物样品可以通过以下用于cdna扩增和质量控制的示例性步骤进行处理。可以制备qpcr混合物(qpcrmix)，包括无核酸酶水、qpcr主混物(qpcrmastermix)和cdna引物，并将其移液到qpcr板的孔中。可将少量样品加入铺板的qpcr混合物，并根据预定的热循环方案进行热循环(例如，步骤1：98℃3分钟，步骤2：98℃5秒，步骤3：63℃30秒，步骤4：记录扩增信号，步骤5：重复98℃5秒，63℃30秒，共25个循环)。完成热循环后，可以制备cdna扩增混合物，其包括扩增混合物和cdna引物，并使其与剩余样品合并且混合。然后可以对样品进行孵育和热循环(例如，盖温105℃持续约45‑60分钟；步骤1：98℃3分钟，步骤2：98℃15秒，步骤3：63℃20秒，步骤4：72℃1分钟，步骤5：[循环次数由qpcrcq值确定]，步骤6：72℃1分钟，步骤7：保持在4℃)。然后可以将样品在4℃储存至多72小时或在‑20℃储存至多1周，或者重新悬浮在0.6xspriselect试剂中并移液以确保正确混合。然后可以将样品在室温下孵育5分钟，并通过将样品放在磁体上(例如，磁体处于高位)对样品进行清洁。去除上清液，向沉淀物中加入80％乙醇，孵育30秒。乙醇可以被去除，沉淀物可以被再次清洗。然后可以将样品离心并置于磁体上(例如，磁体处于低位)。可以移除任何剩余的乙醇，并且可以将样品风干至多2分钟。可移出磁体，将洗脱缓冲液添加到样品中，混合，并在室温下孵育2分钟。然后可以将样品置于磁体上(例如，在低位)直到溶液变清。样品可以转移至新的试管条上，并在4℃储存至多72小时或在‑20℃储存至多4周。部分样品可以在安捷伦生物分析仪高灵敏度芯片上运行，在该芯片上可以选择一个区域并测量cdna浓度以计算总cdna产量。或者，可以通过安捷伦bioanalyzer或安捷伦tapestation进行定量。[1466]此外，生物样品可以通过以下示例性步骤进行空间基因表达文库构建。可在冰上制备片段化混合物(fragmentationmix)，其包括片段化缓冲液和片段化酶。可以将洗脱缓冲液和片段化混合物添加到每个样品中，混合并离心。然后可将样品混合物置于热循环仪中，并根据预定方案循环(例如，盖温65℃持续约35分钟，预冷块降至4℃，然后在32℃片段化5分钟，65℃末端修复和a‑加尾30分钟，4℃保持)。可以将0.6xspriselect试剂添加到样品中并在室温下孵育5分钟。样品可以放在磁体上(例如，在高位)，直到溶液澄清，上清液可以转移到新的管带上。可以将0.8xspriselect试剂添加到样品中，混合并在室温下孵育5分钟。可以将样品置于磁体上(例如，在高位)直到溶液变清。去除上清液，向沉淀物加入80％乙醇，沉淀物孵育30秒，可除去乙醇。可以重复乙醇洗涤并将样品置于磁体上(例如，在低位)直到溶液变清。可以除去剩余的乙醇，向样品中添加洗脱缓冲液，混合，并在室温孵育2分钟。可将样品放在磁体上(例如，在高位)，直到溶液澄清，并将部分样品移到新的管带上。可以制备衔接子连接混合物(adaptorligationmix)，其包括连接缓冲液、dna连接酶和衔接子寡聚物，然后可对其进行离心。衔接子连接混合物可被添加至样品，移液管混合，然后简短离心。然后可以根据预定方案对样品进行热循环(例如，盖温30℃约15分钟，步骤1：20℃保持15分钟，步骤2：4℃保持)。样品可经涡旋以重新悬浮spriselect试剂，可以另将0.8xspriselect试剂添加到样品并在室温孵育5分钟，然后置于磁体上(例如，在高位)直到溶液澄清。可移除上清液，可用80％乙醇洗涤沉淀，孵育30秒，可移除乙醇。乙醇洗涤可以重复进行，样品可以在将样品放在磁体上(例如，在低位)之前短暂离心。可以移除任何剩余的乙醇，并且可以将样品风干至多2分钟。可以移开磁体，可以向样品添加洗脱缓冲液，并且样品可以用移液管混合，在室温孵育2分钟，然后置于磁体上(例如，在低位)直到溶液澄清。部分样品可以转移到一个新的管带上。扩增混合物，可制备并与样品合并。可以将单独的dualindextt组a添加至样品，移液器混合并进行预先确定的热循环方案(例如，盖温105℃持续约25‑40分钟，步骤1：98℃持续45秒，第2步：98℃持续20秒，第3步：54℃持续30秒；第4步：72℃持续20秒，第5步：恢复到第2步进行预定数量的循环，第6步：72℃持续1分钟，4℃保持)。涡旋以重新悬浮spriselect试剂，可以向每个样品中另添加0.6xspriselect试剂，混合并在室温孵育5分钟。样品可以放在磁体上(例如，在高位)，直到溶液澄清，上清液可以转移到新的管带上。可以将0.8xspriselect试剂添加到每个样品中，移液器混合，并在室温孵育5分钟。然后可以将样品置于磁体上(例如，在高位)直到溶液变清。可以移除上清液，用80％乙醇洗涤沉淀，孵育30秒，然后可移除乙醇。可以重复乙醇洗涤，将样品离心，并置于磁体上(例如，在低位)以移除任何剩余的乙醇。可以从磁体移出样品，然后将洗脱缓冲液添加到样品，移液器混合，并在室温孵育2分钟。可将样品放在磁体上(例如，在高位)，直到溶液澄清，并将部分样品移到新的管带上。样品可在4℃储存至多72小时，或在‑20℃长期储存。平均片段大小可以使用bioanalyzer痕迹或安捷伦tapestation确定。[1467]可以使用可用的测序平台对文库进行测序，包括miseq、nextseq500/550、hiseq2500、hiseq3000/4000、novaseq和iseq。[1468]在上述工作流程的替代实施方式中，可以通过将样品暴露于大于约1.0w/v％(例如，大于约2.0w/v％、大于约3.0w/v％、大于约3.0w/v％、大于约大于约4.0w/v％、大于约5.0w/v％、大于约6.0w/v％、大于约7.0w/v％、大于约8.0w/v％、大于约9.0w/v/v％、大于约10.0w/v％、大于约11.0w/v％、大于约12.0w/v％或大于约13.0w/v％)的十二烷基硫酸钠(sds)来对生物样品进行透化。在一些实施方式中，可通过将样品暴露至约1.0w/v％至约14.0w/v％(例如，约2.0w/v％至约14.0w/v％、约2.0w/v％至约12.0w/v％，约2.0w/v％至约10.0w/v％，约4.0w/v％至约14.0w/v％，约4.0w/v％至约12.0w/v％，约4.0w/v％至约10.0w/v％、约6.0w/v％至约14.0w/v％、约6.0w/v％至约12.0w/v％、约6.0w/v％至约10.0w/v％，约8.0w/v％至约14.0w/v％，约8.0w/v％至约12.0w/v％，约8.0w/v％至约10.0w/v％，约10.0％w/v％至约14.0w/v％、约10.0w/v％至约12.0w/v％或约12.0w/v％至约14.0w/v％)的sds和/或蛋白酶k(例如，在约35℃至约50℃、约35℃至约45℃、约35℃至约40℃、约40℃至约50℃、约40℃至约45℃或约45℃至约50℃的温度)(例如，持续约5分钟至约1小时、约5分钟至约40分钟、约5分钟至约30分钟、约5分钟至约20分钟或约5分钟至约10分钟)来使生物样品透化。[1469]在本文所述的任何工作流程的非限制性示例中，产生包括连续核苷酸序列的核酸分子，所述连续核苷酸序列包含：(a)第一引物序列(例如，读数1)；(b)空间条形码；(c)独特分子序列(umi)；(d)捕获域；(e)与来自生物样品的核酸中存在的序列互补的序列；(f)与模板转换寡核苷酸(tso)的序列基本互补的第二引物序列(例如，读数2)。在这些核酸分子的一些实施方式中，核酸分子是单链核酸分子。在这些核酸分子的一些实施方式中，核酸分子是双链核酸分子。在这些核酸分子的一些实施方式中，(a)到(f)以5′到3′方向位于连续核苷酸序列中。在这些核酸分子中的任一个的一些实施方式中，核酸分子连接至基材(例如，载玻片)。在这些核酸分子中的任一个的一些实施方式中，连续核酸序列的5′末端连接至基材(例如载玻片)。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，连续核苷酸序列是嵌合rna和dna序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，连续核苷酸序列是dna序列。[1470]在本文所述的任何工作流程的非限制性示例中，产生包括连续核苷酸序列的核酸分子，所述连续核苷酸序列包含：(a)与第一引物序列互补的序列(例如，与读数1互补的序列)；(b)与空间条形码互补的序列；(c)与独特分子序列互补的序列；(d)与捕获域互补的序列；(e)存在于来自生物样品的核酸中的序列；和(f)模板转换寡核苷酸(tso)的序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，核酸分子是单链的。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，核酸分子是双链的。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，连续核苷酸序列是dna序列。在这些核酸分子的一些实施方式中，(a)到(f)以3′到5′方向位于连续核苷酸序列中。[1471]在本文所述的任何工作流程的非限制性示例中，产生包括连续核苷酸序列的核酸分子，所述连续核苷酸序列包含：(a)第一引物序列(例如，读数1)；(b)空间条形码；(c)独特分子序列(umi)；(d)捕获域；(e)与来自生物样品的核酸中存在的序列互补的序列；和(f)第二引物序列(读数2)。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，核酸分子是单链核酸分子。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，核酸分子是双链核酸分子。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，(a)至(f)以5′至3′方向位于连续核苷酸序列中。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，连续核苷酸序列是dna序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，连续核苷酸序列还包含，从3′至(f)：(g)与第一衔接子序列互补的序列；和(h)与第三引物序列互补的序列。在任何核酸分子的一些实施方式中，第一衔接子序列是i7样品索引序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，第三引物序列是p7引物序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，(h)在连续核苷酸序列中相对于(g)位于3′。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，连续核苷酸序列还包含，5′至(a)：(i)第二衔接子序列；和(ii)第四引物序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，第二衔接子序列是i5样品索引序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，第四引物序列是p5引物序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，(ii)在连续核苷酸序列中相对于(i)位于5′。[1472]在本文所述的任何工作流程的非限制性示例中，产生包括连续核苷酸序列的核酸分子，所述连续核苷酸序列包含：(a)与第一引物序列互补的序列；(b)与空间条形码互补的序列；(c)与独特分子序列互补的序列；(d)与捕获域互补的序列；(e)存在于来自生物样品的核酸中的序列；和(f)与第二引物序列互补的序列。在这些核酸分子的一些实施方式中，与第一引物序列互补的序列是与读数1互补的序列。在这些核酸分子的一些实施方式中，与第二引物序列互补的序列是与读数2互补的序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，核酸分子是单链核酸分子。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，核酸分子是双链核酸分子。在这些核酸分子的一些实施方式中，(a)到(f)以3′到5′方向位于连续核苷酸序列中。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，连续核苷酸序列是dna序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，连续核苷酸序列还包含，5′至(f)：(g)第一衔接子序列；和(h)第三引物序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，第一衔接子序列是i7样品索引序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，第三引物序列是p7引物序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，(h)在连续核苷酸序列中相对于(g)位于5′。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，连续核苷酸序列还包含，3′至(a)：(i)与第二衔接子序列互补的序列；和(ii)与第四引物序列互补的序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，第二衔接子序列是i5样品索引序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，第四引物序列是p5引物序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，(ii)在连续核苷酸序列中相对于(i)位于3′。[1473]空间rin[1474]本文提供了用于确定组织中的空间rin的方案的非限制性示例，其可以包括收集乳腺癌组织和在液氮中快速冷冻。组织可以嵌入oct中，并在‑20℃以10或12μm的厚度切片，然后直接安装在空间阵列上，其包括具有18srrna捕获域的捕获探针。可以使用苏木精和伊红(h&e)染色方案对组织进行固定和染色。简言之，可以添加mayer苏木精，在水中洗涤，在发蓝缓冲液(bluingbuffer)中孵育，在水中洗涤，用曙红染色，然后在水中洗涤，最后干燥。为了观察h&e染色，切片可以用85％的甘油封固，并用盖玻片覆盖。明场成像可以使用metafer载玻片扫描平台(metasystems)进行，其中原始图像与vslide软件(metasystems)拼接在一起。可以通过以下方式来移除甘油：将空间阵列或载玻片保持置于水中直至盖玻片脱落然后风干直至剩余液体蒸发。可以任选地从组织切片中移除来自h&e染色剂的苏木精，例如，在进一步处理之前用稀hcl(0.01m)洗涤。然后组织切片准备好进行进一步处理。[1475]染色后，存在于组织切片中的18srrna被空间阵列上的18srrna特定捕获域捕获。然后将18srrna原位转化为cdna。具体而言，通过添加70μl反应混合物在密封杂交盒中于空间阵列上进行逆转录，所述反应混合物包括1x第一链缓冲液、5mmdtt、1m甜菜碱、6mmmgcl2、1mmdntp、0.2mg/mlbsa、50ng/μl放线菌素d、10％dmso、20u/μlsuperscriptiii逆转录酶、2u/μlrna酶out重组核糖核酸酶抑制剂。反应在42℃进行过夜。孵育后移除cdna合成混合物，并用0.1xssc缓冲液洗涤组织。[1476]为了制备用于寡核苷酸探针标记和成像的空间阵列，移出乳腺癌组织和rrna。组织移出可以如下进行：首先在rlt裂解缓冲液中用β‑巯基乙醇以3∶100的比例在56℃孵育1小时，并以300rpm的连续振荡。所有组织都可以在56℃使用1∶7比例的蛋白酶k和pkd缓冲液孵育1小时，以短间隔以300rpm轻轻振荡。然后如下以300rpm连续振荡洗涤空间阵列：首先在50℃于含有0.1％sds的2xssc中洗涤10分钟，然后在室温于0.2xssc中洗涤1分钟，最后在室温于0.1xssc中洗涤1分钟。然后将空间阵列旋转干燥并放回杂交盒中。可以使用反应混合物来进行rrna移除，所述反应混合物包含以下终浓度的：1x第一链缓冲液，0.4mg/mlbsa和16.3mu/μlrna酶h。反应可以在37℃进行1小时，并在300rpm下使用短间隔轻轻振荡。然后用0.1xssc缓冲液洗涤空间阵列，并在室温用60％dmso处理5分钟，然后用0.1xssc缓冲液洗涤3次。[1477]为了检测从18srrna产生的cdna，产生了与18scdna序列具有序列互补性的标记的寡核苷酸探针。鉴定寡核苷酸长度在18‑23个核苷酸之间，最佳为20个核苷酸，解链温度(tm)为38‑50℃，最佳温度为42℃，鸟嘌呤和胞嘧啶的含量为30‑60％，最佳值为50％。3′端的前五个碱基被设置为包括鸟嘌呤或胞嘧啶中的两个或各一个。使用mfold(二级结构测定)、oligocalc：寡核苷酸特性计算器(自二聚化和发夹形成测定)和blast(脱靶结合测定)检查寡核苷酸的质量。就与人类(nr_003286.2)和小鼠(nr_003278.3)18srrna的相容性选择序列位置。所选的寡核苷酸探针之四包括：探针1(p1；seqidno：4)gaggaattcccagtaagt，探针2(p2；seqidno：5)gagattgagcaataacag，探针3(p3；seqidno：6)gtagttccgaccataaac，和探针4(p4；seqidno：7)ggtgactctagataacct。对照寡核苷酸探针可经设计以一次包含三个检测探针的互补序列，每个探针之间有20个碱基的间隔序列。然后可以设计所选寡核苷酸探针以纳入cy3荧光团。[1478]接下来，标记的寡核苷酸探针与包含由18srrna产生的cdna或包含控制捕获探针的空间阵列杂交。该步骤可以包括至少4轮连续的杂交和成像，其中对于四个标记的寡核苷酸探针中的每一个进行至少一轮。在每轮杂交和成像之后，在继续下一轮杂交和成像之前，可以洗涤空间阵列以移除杂交的探针。[1479]标记的寡核苷酸探针的杂交包括向空间阵列添加预热(例如加热至50℃)的杂交混合物(10mmtris‑hcl、1mmedta、50mmnacl和0.5μm荧光加标探针)，其中包含至少0.5μm的荧光标记寡核苷酸探针之一(例如p1、p2、p3或p4之一)。然后可以使用具有以下设置的dna微阵列扫描仪对空间阵列进行成像：激发波长532nm设置为增益70，635nm设置为1。成像后，空间阵列用60％dmso在室温孵育5分钟并用0.1xssc缓冲液洗涤3次以移除杂交探针。随后的几轮杂交和成像使用在每一轮中使用的不同标记寡核苷酸探针进行(例如，第2轮使用p2，第3轮使用p3，第4轮使用p4)。进行初始的预杂交轮(p0)成像以评估背景荧光。[1480]每个标记的寡核苷酸探针(p1‑p4)生成一张图像，还有一张没有荧光标记的探针杂交的图像(p0)。荧光单位(fu)数据的归一化是通过减去用p0记录的自发荧光并除以p1来进行的。对齐组织中特定位置的五幅图像(来自每个探针的一幅图像，p1‑p4，以及来自该位置的一幅未标记的图像)后，将图像加载到脚本中并在rstudio中运行。该脚本可以生成两个不同的图，一个空间rin值的热图和一个图像对齐误差图。[1481]高质量的rna被定义为全长(或接近全长)的转录物，而低质量的rna被定义为片段化的转录物。空间rin值与传统rin值相似，其中rin值的范围从1到10，数字越大表示质量越高(例如，降解越少、片段化越少)的rna样品。[1482]空间atac组合物[1483]本文提供了用于鉴定分析物在生物样品中的位置的组合物。在一些实施方式中，核苷酸分子组合物包括a)空间条形码；b)独特分子；c)捕获域；d)功能域；和e)夹板寡核苷酸。在一些实施方式中，部分双链核苷酸分子组合物包括：a)空间条形码；b)独特分子标识符；c)捕获域；d)功能域；和e)夹板寡核苷酸。在一些实施方式中，组合物包括a)捕获探针，其包括i)空间条形码；ii)独特分子标识符；iii)捕获域；iv)功能域；和v)夹板寡核苷酸，和b)片段化的基因组dna，其包括i)包含转座子末端序列和与捕获域互补的序列的第一衔接子序列；和ii)包含转座子末端序列和第二衔接子序列的第二衔接子序列。在一些实施方式中，组合物包括a)与第一衔接子复合的转座酶单体，其包括i)转座子末端序列；和ii)与捕获域互补的序列；和b)与第二衔接子复合的转座酶第二单体，其包括i)转座子末端序列；和ii)第二衔接子序列；c)基因组dna；和d)捕获探针，其包括i)空间条形码；ii)独特分子标识符；iii)捕获域；iv)功能域；和v)夹板寡核苷酸。在一些实施方式中，组合物包括a)与第一衔接子复合的转座酶单体，其包括i)转座子末端序列；ii)与捕获域互补的序列；其中第一衔接子的5′末端被磷酸化，和b)与第二衔接子复合的转座酶第二单体，其包括i)转座子末端序列；ii)第二衔接子序列；其中第二衔接子的5′末端被磷酸化；c)基因组dna；和d)捕获探针，其包括i)空间条形码；ii)独特分子标识符；iii)捕获域；iv)功能域；和v)夹板寡核苷酸。在一些实施方式中，组合物包括a)转座酶二聚体，其包括i)与第一衔接子复合的转座酶单体，其包括1)转座子末端序列，2)与捕获域互补的序列；ii)与第二衔接子复合的转座酶第二单体，其包括1)转座子末端序列；2)第二衔接子序列；b)基因组dna；c)捕获探针，其包括i)空间条形码；ii)独特分子标识符；iii)捕获域；iv)功能域；和v)夹板寡核苷酸。在一些实施方式中，组合物包括a)转座酶二聚体，其包括i)与第一衔接子复合的转座酶单体，其包括1)转座子末端序列，2)与捕获域互补的序列，其中第一衔接子的5′末端被磷酸化；ii)与第二衔接子复合的转座酶第二单体，其包括1)转座子末端序列；2)第二衔接子序列，其中第二衔接子的5′末端被磷酸化；c)基因组dna；d)捕获探针，其包括i)空间条形码；ii)独特分子标识符；iii)捕获域；iv)功能域；和v)夹板寡核苷酸。[1484]空间转录组学[1485]在一些实施方式中，本文提供用于从生物样品(例如，存在于生物样品例如组织切片中)中空间检测分析物(例如，检测分析物如生物分析物的位置)的方法，其包括：(a)在基材上提供生物样品；(b)对基材上的生物样品进行染色，对染色后的生物样品进行成像，和选择生物样品或生物样品的切片进行空间分析；(c)提供阵列，其在基材上包含一组或多组多个捕获探针；(d)使生物样品与阵列接触，由此允许一组或多组多个捕获探针中的捕获探针捕获感兴趣的生物分析物；和(e)分析捕获的生物分析物，由此对感兴趣的生物分析物进行空间分析。可根据本文所述的方法使用本文所述的或本领域已知的任何种类的染色和成像技术。在一些实施方式中，染色包括如本文所述的光学标记物，包括但不限于荧光、放射性、化学发光、量热或比色可检测标记物。在一些实施方式中，染色包括针对生物样品中的目标分析物(例如，细胞表面或细胞内蛋白质)的荧光抗体。在一些实施方式中，染色包括针对生物样品中的目标分析物(例如，细胞表面或细胞内蛋白质)的免疫组织化学染色。在一些实施方式中，染色包括化学染色，例如苏木精和伊红(h&e)或高碘酸希夫(pas)。在一些实施方式中，在对生物样品进行染色和/或成像与进行空间转录组学分析之间可以经过相当长的时间(例如，数天、数月或数年)。在一些实施方式中，在阵列与生物样品接触之前、之时或之后将用于进行空间分析的试剂添加到生物样品中。在一些实施方式中，步骤(d)包括将阵列置于生物样品上。在一些实施方式中，阵列是柔性阵列，其中多个空间条码化特征(例如，捕获探针)附接到柔性基材。在一些实施方式中，在阵列与生物样品接触之前，采取措施以减慢反应(例如，在阵列与生物样品接触之前降低生物样品的温度或使用优先在与其最佳功能温度相比更低或更高温度下进行其主要功能的酶)。在一些实施方式中，在不使生物样品与阵列脱离接触的情况下进行步骤(e)。在一些实施方式中，在生物样品不再与阵列接触之后进行步骤(e)。在一些实施方式中，在生物样品的染色和/或成像之前、之时或之后用分析物捕获剂对生物样品加标。在这种情况下，在染色和/或成像与进行空间分析之间可相隔相当长的时间(例如，数天、数月或数年)。在一些实施方式中，使阵列适于促进生物分析物从染色和/或成像的生物样品迁移到阵列上(例如，使用本文所述的任何材料或方法)。在一些实施方式中，生物样品在与阵列接触之前被透化。在一些实施方式中，在生物样品与阵列接触之前减慢透化速率(例如，以限制分析物从其在生物样品中的原始位置扩散)。在一些实施方式中，调节透化速率(例如调节透化试剂的活性)可以通过调节生物样品所暴露的条件(例如调节温度、ph和/或光)来发生。在一些实施方式中，调节透化速率包括使用外部刺激(例如，小分子、酶和/或活化试剂)来调节透化率。例如，可以在与阵列接触之前向生物样品提供透化试剂，该透化试剂在条件(例如，温度、ph和/或光)改变之前或提供外部刺激(例如，小分子、酶和/或活化剂)之前是无活性的。[1486]侵袭性导管癌的空间解析基因表达和聚类[1487]对来自女性患者(er ，pr‑，her2 )的侵袭性导管癌组织的空间基因表达进行了概况分析(bioivt：asterand‑案件编号66320；样本编号116899f)。作为对照，获得邻近肿瘤的健康组织切片。每种组织类型使用4个重复。[1488]侵袭性导管癌中的空间解析基因表达和聚类揭示肿瘤内异质性显示在图75a‑h。图75a显示了由病理学家注释的侵袭性导管癌的组织切片。该切片包含大部分侵袭性癌(用粗黑线表示的22.344mm2部分(彩色图中黑色勾勒出的部分))，三个独立的导管原位癌区域(用中粗黑线表示的部分1.329mm2，1.242mm2和0.192mm2(在彩色图中以绿色勾勒出轮廓))和纤维组织。图75b显示了具有由转录物的无监督聚类着色的点的组织图。图75c显示了由转录物的无监督聚类着色的点的t‑sne图。图75d显示了9个鉴别的簇之间变化最大的基因的基因表达热图。定义为纤维组织的区域主要对应于簇1、7和8。有趣的是，病理学家注释为侵袭性癌的大区域包含分配至dcis(簇5)的空间点。此外，还鉴定了四种具有不同分子特性的侵袭性癌亚型(簇2、3、4和6)，揭示了肿瘤内的异质性。[1489]组织切片中人表皮生长因子受体2(her2)、雌激素受体(er)、孕激素受体(pgr)对应基因的表达水平见图75e。可以清楚地看到，her2和er在侵袭癌和dcis区域高表达，而pr不表达，与患者的诊断一致。选择来自侵袭癌区域中每个簇的最高差异表达基因之一(图75d中的矩形框)，且其表达水平定位于组织中，如图75f所示，并如图75g所示在一个图中重叠。除了pgr，与邻近的正常组织相比，所有这些基因在癌组织中都高度上调(图75h)。分析表明，所有这些上调基因都与癌症进展有关。有趣的是，在簇3的子集中，一种长非编码rna，其异常表达于最近发现与肿瘤发展有关(参见例如，zhangt等.长非编码rna和乳腺癌(longnon‑codingrnaandbreastcancer).technolcancerrestreat.2019，18，1533033819843889，通过引用其全文方式纳入本文)，是最为差异表达的基因之一。在胶质母细胞瘤中，linc00645通过诱导tgf‑β来促进上皮‑间质转化(参见例如，li，c.等.长非编码rnalinc00645通过调节胶质瘤中的mir‑205‑3p‑zeb1轴来促进tgf‑β诱导的上皮‑间质转化(longnon‑codingrnalinc00645promotestgf‑β‑inducedepithelial‑mesenchymaltransitionbyregulatingmir‑205‑3p‑zeb1axisinglioma).celldeath&dis.2019，10，272，通过引用其全文方式纳入本文)。[1490]在乳腺癌进展过程中，持续围绕浸润前原位癌的肌上皮细胞逐渐消失(参见例如，gudjonsson，t.等.肌上皮细胞：它们在乳腺形态发生和肿瘤中的起源和功能(myoepithelialcells：theiroriginandfunctioninbreastmorphogenesisandneoplasia).j.mammaryglandbiol.neoplasia.2009，10，261，其通过引用其全文的方式纳入本文)。这种现象在图75i和75j中清楚地观察到，其中krt14(肌上皮细胞的基因签名)在正常组织中的导管内衬周围高度表达，而它在idc组织中的dcis区域中消失(图75i))。在idc中，与侵袭和转移相关联的关键基因，胞外基质基因(例如col1a1和fn1)高度上调，而平滑肌和基底角蛋白下调(图75j)。[1491]序列表[1492]合成多肽序列[1493][1494]合成eak16多肽序列[1495][1496]合成kld12多肽序列[1497][1498]18scdna探针1(p1)[1499][1500]18scdna探针2(p2)[1501][1502]18scdna探针3(p3)[1503][1504]18scdna探针4(p4)[1505][1506]vi.用于成像的控制载玻片[1507]上述用于获得生物样品和/或特征阵列的图像的成像设备和系统(例如，标准落射荧光系统和共焦显微系统)在其分辨率和灵敏度方面可以是固有地可变的。评估成像设备和系统的质量和分辨率的方法可以使用本文公开的任何控制载玻片来实现。在本节中，描述了各种方法和控制载玻片的示例。然而，应当理解，一般来说，本文讨论的各种步骤和技术可以使用各种不同的装置和系统组件来进行，并非所有这些都被明确地阐述。[1508]在一些实施方式中，可以使用控制载玻片来执行评估成像设备和系统的质量和分辨率以及优化成像采集过程。控制载玻片可以包括一个或多个基材，所述基材提供了在其上沉积、印刷、蚀刻、压印和/或附着物质(例如，化合物或分子)的表面。基材可由光学透明材料形成，包括但不限于玻璃、透明聚合物和玻璃纤维。玻璃的非限制性示例包括钠钙玻璃、硅酸盐玻璃、硼硅酸盐玻璃和熔融石英。在一些实施方式中，基材具有约1毫米(mm)的厚度。在一些实施方式中，基材具有约0.17毫米(mm)的厚度。在一些实施方式中，基材具有约0.085mm至约2mm的厚度(例如，1.9mm或更小、1.7mm或更小、1.5mm或更小、1.35mm或更小、1mm或更小、0.9mm或更小、0.8mm或更小、0.7mm或更小、0.64mm或更小、0.43mm或更小、0.35mm或更小、0.23mm或更小、0.19mm或更小、0.18mm或更小、0.17mm或更小、0.16mm或更小，0.13mm或更小、0.1mm或更小、0.095mm或更小、0.09mm或更小)。在一些实施方式中，具有小于约1mm的厚度的基材可以使用户能够定性地评估成像系统(超出标准落射荧光和共聚焦显微镜)以包括全内反射荧光(tirf)显微镜和/或成像。tirf显微镜利用激发光的全内反射产生的倏逝波(evanescentwave)从基材表面激发约100nm的荧光团。[1509]透明聚合物的非限制性示例包括紫外线(uv)透光丙烯酸、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、丙烯酸、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、无定形共聚酯、聚氯乙烯(pvc)、环烯烃共聚物、聚乙烯(pe)、离聚物树脂、聚丙烯(pp)、氟化乙烯丙烯(fep)、苯乙烯甲基丙烯酸甲酯(smma)和聚苯乙烯。在一些实施方式中，基材是玻璃显微镜载玻片。[1510]在一些实施方式中，基材是玻璃盖玻片。在一些实施方式中，基材是盖玻片。在一些实施方式中，基材是浇铸丙烯酸基材。在一些实施方式中，基材具有表面覆层。表面覆层或处理的非限制性示例包括硅烷、气体等离子体、聚‑l‑赖氨酸、3‑氨基丙基三乙氧基硅烷和氨基烷基硅烷。在一些实施方式中，基材具有疏水性表面。在一些实施方式中，基材具有亲水性表面。在一些实施方式中，基材是灭菌(例如，伽马灭菌或高压灭菌)的。[1511]在一些实施方式中，基材包括荧光标志物。在一些实施方式中，阵列包括多个荧光标志物。在一些实施方式中，荧光标志物是非金属的。荧光标志物可以是可直接或间接偶联到基材表面的化合物和/或分子。荧光标志物可以以不同的图案(例如，以阵列形式)排列在基材的表面上。在一些实施方式中，荧光标志物被提供在基材的表面上。在一些实施方式中，基材包括布置在基材表面上的阵列。基材上具有已知光学特性的荧光标志物可用于定性评估成像设备或系统的兼容性、分辨率和灵敏度。[1512]在一些实施方式中，多个荧光标志物各自包括荧光团(例如，荧光探针)。荧光标志物可由包括但不限于荧光团(例如荧光染料和荧光蛋白)的材料形成。荧光标志物可以包括来自上述任何组的荧光团。荧光染料的非限制性示例包括吖啶染料、氟酮染料、花青染料、荧光素、噁嗪染料、菲啶染料和罗丹明染料。荧光蛋白的非限制性示例包括绿色荧光蛋白(gfp)、标签蓝色荧光蛋白(tagbfp)、天蓝色、红色荧光蛋白(rfp)、青色荧光蛋白(cfp)、金星、黄水晶、黄色荧光蛋白(yfp)、单体增强型绿色荧光蛋白(egfp)、mcherry、mkate2、光活化绿色荧光蛋白(pa‑gfp)、光活化mcherry(pa‑mcherry)和荧光蛋白融合蛋白。在一些实施方式中，荧光标志物具有约200纳米(nm)至约850nm的激发波长(例如，800nm或更小、750nm或更小、700nm或更小、600nm或更小、650nm或更小、600纳米或更小、550纳米或更小、500纳米或更小、450纳米或更小、400纳米或更小、350纳米或更小、300纳米或更小、250纳米或更小)。在一些实施方式中，荧光标志物具有约10nm至约850nm的发射波长(例如，800nm或更小、750nm或更小、600nm或更小、650nm或更小、600nm或更小、550nm或更小、500nm或更小、450nm或更小、400nm或更小、350nm或更小、300nm或更小、250nm或更小、200nm或更小、150nm或更小、100nm或更小、50nm或更小、15nm或更小)。[1513]在一些实施方式中，基材可包括非荧光标志物(例如，纳米颗粒)。非荧光标志物可由包括但不限于金属、反射、放射性、化学发光和比色探针的材料形成。[1514]在一些实施方式中，基材包括基准标志物。在一些实施方式中，基准标志物是蚀刻的基准标志物、模制的基准标志物或其它物理形成的基准标志物。在一些实施方式中，基准标志物是金属的。在一些实施方式中，基准标志物是非金属的。在一些实施方式中，多个金属基准标志物以在阵列周围形成周界的框架图案布置在基材的表面上。基准标志物可以是布置在成像系统的视场中并且在样品、阵列、基材或本文所述的任何其它方面的图像中捕获的任何一个或多个目标对象。基准标志物通常用作对准的参考点或测量标度(例如，以对准样品和阵列、以对准两个基材、以确定基材上样品或阵列相对于标志物的位置)和/或用于尺寸和/或距离的定量测量。[1515]基准标志物可以由包括但不限于金属、反射、荧光、放射性、化学发光和比色标记物的材料形成。在一些实施方式中，基准标志物不包括荧光材料。在一些实施方式中，基准标志物可存在于基材上以提供生物样品的取向。使用基准标志物来稳定和定向生物样品描述于例如美国专利号7,848,553，和美国专利公开号2003/0153850，其均通过引用其全文方式纳入本文。[1516]图23a‑23b显示了示例样品载玻片2300(例如，控制载玻片)，其具有标记物2302，所述标记物2302包括用于样品识别的条形码2304。具体地，基材2300包括至少一个阵列2306。图23a‑23b显示标记为“a1”、“a2”、“b1”、“b2”、“c1”、“c2”、“d1”和“d2”的阵列2306。[1517]在一些实施方式中，本文所述的基材可与样品载玻片2300一起使用。在一些实施方式中，本文所述的基材可以与上述基于空间阵列的一般分析方法一起使用。例如，用户可以获得本文描述的基材的图像，以便在获得样品载玻片2300的图像之前调整成像设备或成像系统的某些参数。因此，在一些实施方式中，本文所述的基材可具有与样品载玻片2300类似的物理尺寸。在一些实施方式中，样品载玻片2300具有约76mm的长度和约30mm的宽度。在一些实施方式中，样品载玻片2300具有约75mm的长度和约25mm的宽度。在一些实施方式中，样品2300具有范围从约20mm至约200mm的长度l(例如，175mm或更小、150mm或更小、125mm或更小、100mm或更小、75mm或更小、50mm或更小、30mm或更小)。在一些实施方式中，样品2300具有范围从约20mm至约200mm的宽度w(例如，175mm或更小、150mm或更小、125mm或更小、100mm或更小、75mm或更小、50mm或更小、30mm或更小)。[1518]如图23a‑23b所示，样品载玻片2300可以具有约28.5mm的长度a。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约21mm的长度a。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约10mm至约50mm的长度a(例如，45mm或更小，40mm或更小，35mm或更小，30mm或更小，25mm或更小，20mm或更小，15mm或更小)。具有长度a的样品载玻片2300的区段可以容纳标记物2302。样品载玻片2300可以具有约36mm的长度b。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约10mm至约40mm的长度b(例如，35mm或更小、30mm或更小、25mm或更小、20mm或更小、15mm或更小)。具有长度b的样品载玻片2300的区段可以容纳多个阵列2306。样品载玻片2300可以具有约11.5mm的长度c。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约5mm至约40mm的长度c(例如，35mm或更小、30mm或更小、25mm或更小、20mm或更小、15mm或更小、10mm或更小)。具有长度c的样品载玻片2300的区段阵列可以容纳具有与多个阵列2306的表面积基本相同的表面积的其它阵列。在一些实施方式中，具有长度c的样品载玻片2300的区段可以容纳具有大于图23a中所示的多个阵列2306的表面积的表面积的其它阵列。[1519]样品载玻片2300可具有约64.5mm的长度g。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约30mm至约70mm的长度g(例如，65mm或更小、60mm或更小、55mm或更小、50mm或更小、45mm或更小、40mm或更小、35mm或更小、30mm或更小、25mm或更小)。长度g可以是长度a和b的总和，并且可以包括标记物2302和四行阵列2306(例如，a1、a2、b1、b2、c1、c2、d1和d2)。具有长度g的样品载玻片2300的区段可容纳多于四行阵列或少于四行阵列。[1520]样品载玻片2300可以具有约3.5mm的宽度d。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约0.5mm至约20mm的长度c(例如，15mm或更小、10mm或更小、5mm或更小、1mm或更小)。具有宽度d的样品载玻片2300的区段可以定义为从样品载玻片2300的边缘到阵列2306的边缘的距离，如图23a‑23b所示。在一些实施方式中，宽度d可以根据阵列2306的尺寸而变化。同样，样品载玻片2300可以具有约3.5mm的宽度e。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约0.5mm至约20mm的宽度e(例如，15mm或更小、10mm或更小、5mm或更小、1mm或更小)。具有宽度e的样品载玻片2300的区段可以定义为从样品载玻片2300的边缘到阵列2306的边缘的距离。在一些实施方式中，宽度d和e是阵列2306的外边缘的相对侧上的距离。宽度e和d可以是相等的，如在图23a‑23b中说明。在一些实施方式中，距离d不同于距离e。[1521]样品载玻片2300可具有约18mm的宽度f。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约5mm至约30mm的长度f(例如，25mm或更小、20mm或更小、15mm或更小、10mm或更小、2.5mm或更小)。宽度f可以被定义为阵列2306的两列的宽度，如图23a中说明。在一些实施方式中，宽度f可以被定义为第一阵列2306(例如，阵列a1)的外边缘或侧边缘和第二阵列2306(例如，阵列a2)的外边缘之间的距离。在一些实施方式中，宽度何以根据阵列2306的尺寸和阵列2306的列数而变化。[1522]样品载玻片2300可以具有约55.5mm的长度h。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约30mm至约60mm的长度h(例如，55mm或更小、50mm或更小、45mm或更小、40mm或更小、35mm或更小、30mm或更小，25mm或更小)。长度h可以包括标记物2302和三行的阵列2306(例如，a1、a2、b1、b2、c1和c2)。具有长度g的样品载玻片2300的区段可以容纳多于三行的阵列或少于三行的阵列。[1523]样品载玻片2300可以具有约46.5mm的长度i。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约30mm至约50mm的长度i(例如，45mm或更小、40mm或更小、35mm或更小、30mm或更小、25mm或更小)。长度i可以包括标记物2302和两行的阵列2306(例如，a1、a2、b1和b2)。具有长度i的样品载玻片2300的区段可以容纳多于两行的阵列或少于两行的阵列。[1524]样品载玻片2300可以具有约28.5mm的长度j。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约20mm至约30mm的长度j(例如，29mm或更小、28mm或更小、27mm或更小、26mm或更小、25mm或更小、24mm或更小、23mm或更小、22mm或更小、21mm或更小)。长度j可以包括标记物2302和一行的阵列2306(例如，a1和a2)。具有长度j的样品载玻片2300的区段可以容纳多于一行的阵列或少于一行的阵列。[1525]样品载玻片2300可以具有约11.25mm的长度k。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约60mm至约5mm的长度j(例如，55mm或更小、50mm或更小、45mm或更小、40mm或更小、35mm或更小、30mm或更小、25mm或更小、20mm或更小、15mm或更小、10mm或更小)。长度k可以定义为阵列2306的底部边缘(例如，d1或d2)与载玻片2300的底部边缘之间的距离。长度k可以根据阵列2306的尺寸而变化。[1526]样品载玻片2300可具有约6.5mm的长度m。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约1mm至约76mm的长度m(例如，70mm或更小、65mm或更小、60mm或更小、36mm或更小、30mm或更小、29mm或更小、25mm或更小、20mm或更小、15mm或更小、12mm或更小、10mm或更小、5mm或更小)。[1527]样品载玻片2300可以具有约6.5mm的长度n。在一些实施方式中，样品玻片2300可具约1mm至约76mm的长度n(例如，70mm或更小，65mm或更小，60mm或更小，36个mm或更小，30mm或更小，29mm或更小、25mm或更小、20mm或更小、15mm或更小、12mm或更小、10mm或更小、5mm或更小)。[1528]各阵列2306(例如，a1)可以是四边形，其具有m×n的尺寸，如图23a和23b所示。在一些实施方式中，样品载玻片2300具有8个阵列。在一些实施方式中，样品载玻片2300具有20个阵列或更少、18个阵列或更少、16个阵列或更少、14个阵列或更少、12个阵列或更少、10个阵列或更少、8个阵列或更少、6个阵列或更少、4个阵列或更少、2个阵列或更少，或1个阵列。例如，在一些实施方式中，样品载玻片2300具有尺寸为约65mm×18mm的一个四边形阵列。在一些实施方式中，样品载玻片2300具有尺寸为约36mm×18mm的一个四边形阵列。在一些实施方式中，样品载玻片2300具有尺寸各自为约36mm×6.5mm的两个四边形阵列。在一些实施方式中，样品载玻片2300具有尺寸各自为约18mm×18mm的两个四边形阵列。在一些实施方式中，样品载玻片2300具有尺寸各自为约6.5mm×6.5mm的10个四边形阵列。在一些实施方式中，样品载玻片2300具有尺寸各自为约6.5mm×6.5mm的6个四边形阵列。在一些实施方式中，样品载玻片2300具有尺寸各自为约6.5mm×6.5mm的4个四边形阵列。在一些实施方式中，阵列可具有圆形、多边形、三角形或任何其它合适的几何或非几何形状。[1529]图24a和24b显示了具有包括基材区域2402a‑h的表面2401的基材2400的示例。在一些实施方式中，基材2400可以是控制载玻片(例如，样品载玻片)的部分。在一些实施方式中，基材2400是控制载玻片(例如，样品载玻片)。在一些实施方式中，基材2400可以是校准载玻片的部分。在一些实施方式中，基材2400是校准载玻片。基材2400可以包括第一基材区域2402a、第二基材区域2402b、第三基材区域2402c、第四基材区域2402d、第五基材区域2402e、第六基材区域2402f、第七基材区域2402g和第八基材区域2402h。在一些实施方式中，基材2400可具有少于八个基材区域或多于八个基材区域。每个基材区域可以被包围在框架2406的限定的周界内。[1530]八个基材区域2402a‑h可以位于基材2400的中心。例如，八个基材区域2402a‑h可以在基材2400上居中，从而使得从第一基材区域2402a、第二基材区域2402b、第三基材区域2402c或第四基材区域2402d之一的框架2406的外边缘延伸至基材2400的纵向边缘(即，沿长度l)的第一距离与从框架2406的外边缘延伸到第五基材区域2402e、第六基材区域2402f，第七基材区域2402g，或第八基材区域2402h之一的框架2406的外边缘延伸到基材2400的纵向边缘(即，沿长度l)的第二距离基本相同。例如，当基材如图24a所示垂直定向时，基材阵列可以定位在距离基材的顶部边缘2432约28.5mm、距离基材的底部边缘2434约11.25mm和距离基材的左边缘2436和右边缘2438约3.5mm的位置。[1531]在一些实施方式中，八个基材区域2402a‑h可以在基材2400上居中，从而使得从第一基材区域2402a、第二基材区域2402b、第三基材区域2402c或第四基材区域2402d之一的框架2406的外边缘延伸至基材2400的横向边缘(即，沿宽度w)的第一距离与从框架2406的外边缘延伸到第五基材区域2402e、第六基材区2402f，第七基材区域2402g，或第八基材区域2402h之一的框架2406的外边缘延伸到基材2400的横向边缘(即，沿宽度w)的第二距离基本相同。[1532]在一些实施方式中，基材2400具有与如上所述的样品载玻片2300(例如，控制载玻片)相同的尺寸。在一些实施方式中，基材2400可以是矩形形状。在一些实施方式中，基材2400具有约100mm至约10mm的长度l(例如，90mm或更小、85mm或更小、90mm或更小、75mm或更小、70mm或更小、65mm或更小、60mm或更小、55mm或更小、50mm或更小、45mm或更小、40mm或更小、35mm或更小、30mm或更小、25mm或更小、20mm或更小、15mm或更小)。在一些实施方式中，基材2400具有约100mm至约10mm的宽度w(例如，90mm或更小、85mm或更小、90mm或更小、75mm或更小、70mm或更小、65mm或更小、60mm或更小、55mm或更小、50mm或更小、45mm或更小、40mm或更小、35mm或更小、30mm或更小、25mm或更小、20mm或更小、15mm或更小)。在一些实施方式中，本公开的基材的形状可为正方形或圆形。在一些实施方式中，本公开的基材可为矩形、三角形、六边形、八边形、五边形或任何其它合适的二维几何形状。[1533]在一些实施方式中，基材2400包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个基材阵列。基材2400包括四个基材阵列2404，如图24a所示。基材2400可以包括布置在框架2406内的基材阵列2404。例如，基材阵列2404可以位于基材区域的中心。在一些实施方式中，基材阵列2404可以是相同的(例如，可以具有相同的图案)。在一些实施方式中，基材阵列2404可以是不同的(例如，可以具有不同的图案)。四个基材阵列2404，如图24a所示，可以是重复的并以格子(或方格)图案排列。也即，基材阵列2404位于第一基材区域2402a、第三基材区域2402c、第六基材区域2402f和第八基材区域2402h的中央。如图24a所示的格子图案对应于载玻片2300的阵列a1、b2、c1和d2。在一些实施方式中，该图案旨在占据基材表面的尽可能多的面积以确保在扫描基材的不同区域时图像采集的一致性。[1534]在一些实施方式中，基材区域2402a‑h可以垂直排列成两列，如图24a所示。在一些实施方式中，基材区域以一列的形式布置在基材上。在一些实施方式中，基材区域以3、4、5、6、7、8、9、10或更多列布置在基材上。在一些实施方式中，基材阵列2404可以彼此相邻放置。例如，在一些实施方式中，基材阵列2404可以垂直排列成一列(例如，位于前四个基材区域2402a‑2402d上)。或者，在其它实施方式中，基材阵列2404可位于基材区域2402a、2402b、2402e和2402f上。在一些实施方式中，基材阵列2404可以位于基材区域2402e、2402f、2402g和2402h上。在一些实施方式中，基材阵列2404可以位于基材区域2402c、2402d、2402e和2402h上。在一些实施方式中，基材阵列2404可以位于基材区域2402e、2402b、2402g和2402d上。在一些实施方式中，基材阵列2404不以特定图案布置。在一些实施方式中，基材阵列2404的尺寸个体地变化。例如，在一些实施方式中，第一基材阵列的尺寸可以大于第二基材阵列的尺寸。在一些实施方式中，第一基材阵列的尺寸可以小于第二基材阵列的尺寸。在一些实施方式中，基材阵列之间的距离可以变化并且不同。例如，在一些实施方式中，第一基材阵列和第二基材阵列之间的距离可以不同于第三基材阵列和第四基材阵列之间的距离。在各种实施方式中，基材2400可具有八个基材阵列2404或更少(例如，7个基材阵列或更少、6个基材阵列或更少、5个基材阵列或更少、4个基材阵列或更少、3个基材阵列或更少、2个基材阵列或更少)。在一些实施方式中，基材阵列以一列排列在基材上。在一些实施方式中，基材阵列以2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多列排列在基材上。[1535]图24a显示了包括阵列(例如，基材阵列)2404的基材区域2402f的放大图。在一些实施方式中，基材阵列是荧光阵列。在各种实施方式中，基材阵列是比色阵列。在一些实施方式中，基材阵列是非荧光阵列。在一些实施方式中，基材阵列是金属阵列。在一些实施方式中，基材阵列是反射阵列。在一些实施方式中，基材阵列是放射性阵列。在一些实施方式中，基材阵列是化学发光阵列。[1536]基材阵列2404可以具有设置在基材的表面2401上的多个荧光标志物2426。多个荧光标志物2426可以包括荧光探针或荧光染料。在各种实施方式中，荧光探针或荧光染料可以是四甲基罗丹明(tritc)、红色荧光蛋白(dsred)、吸收波长在约590nm处达到峰值的染料(例如，)、花青‑3(cy3)、吸收波长在约650nm处达到峰值的染料(例如)、花青‑5(cy5)或其任何组合。在一些实施方式中，多个荧光标志物2426可以包括来自上述任何组的任何荧光团。在一些实施方式中，荧光探针可与有机或无机化合物或分子偶联。在一些实施方式中，荧光探针包含寡核苷酸和荧光团。在一些实施方式中，荧光团连接到寡核苷酸的5′末端。在一些实施方式中，荧光团连接到寡核苷酸的3′末端。在一些实施方式中，寡核苷酸的5′末端附着于基材表面。在一些实施方式中，寡核苷酸的3′末端自由地任选地与荧光团偶联。在一些实施方式中，荧光染料与寡核苷酸偶联。在一些实施方式中，寡核苷酸是如上定义的dna寡核苷酸或rna寡核苷酸。在一些实施方式中，荧光探针由15个碱基的寡核苷酸组成，其中荧光分子连接到5′‑末端。在一些实施方式中，非荧光寡核苷酸可偶联至基材阵列2404的表面并可用于杂交任何合适的探针。[1537]基材阵列可以具有多个特征(例如荧光标志物)的特定排列，这些特征要么是不规则的，要么形成规则图案。基材阵列中的各个特征可以基于它们的相对空间位置、荧光探针的类型和荧光探针的浓度而彼此不同。基材阵列2404可以使用多种技术来制造，包括上述阵列制造技术和基于光刻的技术。此类技术包括但不限于“点样”、印刷、冲压和直接合成到基材上。在一些实施方式中，阵列用与荧光探针偶联的寡核苷酸“点样”或“印刷”，然后这些荧光标记的寡核苷酸附接至基材以形成荧光标志物。如上所述，荧光标记的寡核苷酸可以通过非接触印刷或接触印刷施加到基材表面上。除上述特征外，还可以使用多种其他特征来形成本文所述的阵列。例如，在一些实施方式中，由喷射印刷、丝网印刷或静电沉积在基材表面上的荧光共轭聚合物和/或生物聚合物形成的特征可用于形成基材阵列。在一些实施方式中，聚合物和生物聚合物是荧光偶联聚合物和生物聚合物。在一些实施方式中，还可以原位合成多个特征。[1538]在一些实施方式中，基材包括布置在基材表面上的阵列。在一些实施方式中，该阵列包括布置成形成第一图案的多个荧光标志物。在一些实施方式中，每个荧光标志物包括荧光探针。在一些实施方式中，多个基准标志物布置在表面上。在一些实施方式中，多个基准标志物的至少一个子集以第二图案布置。在一些实施方式中，第二图案不同于第一图案。[1539]荧光标志物2426具有圆形点的形状，如图24a‑24b中所示。在一些实施方式中，基材阵列2404的第一区段2428和第二区段2430个体地包含直径约100微米(μm)的荧光标志物2426。在一些实施方式中，荧光探针包含寡核苷酸和荧光团。在一些实施方式中，荧光团连接到寡核苷酸的3′末端。在其它实例中，荧光团连接到寡核苷酸的5′末端。通常，当在平行于基材的平面中观察时，荧光标志物可以具有多种二维形状。在一些实施方式中，荧光标志物2426以六边形、正方形、矩形、三角形、五边形、七边形、八边形、九边形、十边形、椭圆形、正多边形或任何其它规则或不规则的几何形状提供。在一些实施方式中，以非几何形状的形状提供荧光标志物2426。[1540]在一些实施方式中，当基材2400包括多于一个基材阵列时，多个基材阵列可包括具有基本相同形状的荧光标志物。在一些实施方式中，基材阵列2404的一些或全部荧光标志物具有相同或相似的形状。在一些实施方式中，当基材2400包括多于一个基材阵列时，多个基材阵列可包括具有实质上不同形状的荧光标志物。在一些实施方式中，基材阵列的一些荧光标志物具有第一形状，并且一些荧光标志物具有不同于第一形状的第二形状。在一些实施方式中，当基材2400包括多于一个基材阵列，多个基材阵列可以包括具有一种或多种形状图案的荧光标志物。在一些实施方式中，多个基材阵列可包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20个形状图案的荧光标志物。例如，基材阵列可以包括具有第一形状(例如，圆形点)的第一行荧光标志物和具有第二形状(例如，三角形)的第二行荧光标志物，它们在整个基材阵列行中交替。在另一个示例中，基材阵列可以包括重复单元，所述重复单元包括具有第一形状(例如，圆形点)的第一荧光标志物、具有第二形状(例如，三角形)的第二荧光标志物和具有在同一行内以图案交替的第三形状(例如，方形)的第三荧光标志物。在一些实施方式中，基材阵列可包括荧光标志物图案，其具有重复单元，所述重复单元包括不同形状的任何组合。在一些实施方式中，基材阵列的一些或全部荧光标志物可以具有相同的尺寸(例如，相同的直径)。在一些实施方式中，基材阵列的一些或全部荧光标志物可具有不同的尺寸(例如，第一直径不同于第二直径)。[1541]在一些实施方式中，荧光标志物2426具有第一浓度(或第一平均浓度)和第二浓度(或第二平均浓度)。换言之，在各种实施方式中，第一荧光标志物可以具有第一浓度的荧光偶联寡核苷酸，并且在与第一荧光标志物相同的基材阵列内的第二荧光标志物可以具有第二浓度的荧光偶联寡核苷酸。在一些实施方式中，第一浓度不同于第二浓度。在一些实施方式中，第一浓度范围(或第一平均浓度范围)为约0.01微摩尔(μm)至约100μm、约0.05μm至约50μm、约0.1μm至约10μm或约0.5μm至约5μm。在一些实施方式中，第二浓度范围(或第二平均浓度范围)为约0.01微摩尔(μm)至约100μm、约0.05μm至约50μm、约0.1μm至约10μm或约0.5μm至约5μm。在一些实施方式中，第一浓度(或第一平均浓度)大于第二浓度(或第二平均浓度)。在一些实施方式中，第一浓度(或第一平均浓度)小于第二浓度(或第二平均浓度)。[1542]个体荧光标志物2426或点(spot)可以包含荧光标记的寡核苷酸和空白寡核苷酸(即，未在5′‑末端或3′末端与荧光团偶联的寡核苷酸)的混合物。在一些实施方式中，荧光标记的寡核苷酸和空白寡核苷酸的混合物具有约50皮升(pl)的体积。在一些实施方式中，个体荧光标志物2426(其含有荧光标记的寡核苷酸和空白寡核苷酸的混合物)的体积为约10pl至约1000pl(例如，900pl或更少、800pl或更少、700pl或更少、600pl或更少、500pl或更少，400pl或更少、300pl或更少、200pl或更少、100pl或更少、50pl或更少、25pl或更少、15pl)。[1543]图24b图示了显示各荧光标志物2426的各种浓度的一行的区段2428的示例。例如，第一荧光标志物2426a和第十荧光标志物2426j具有相同浓度的荧光标记的寡核苷酸(例如，约50微摩尔(μm))。在一些实施方式中，第一荧光标志物2426a和第十荧光标志物2426j具有最高浓度的荧光标记的寡核苷酸。在一些实施方式中，第一荧光标志物2426a和第十荧光标志物2426j是允许用户容易地识别区段(例如，区段2428)的每一行的开始和结束的最暗点。荧光标记的寡核苷酸的浓度从第二荧光标志物2426b开始且通过第九荧光标志物2426i连续降低(例如，从约20μm到约0.5μm)。即，第二荧光标志物2426b具有约20μm的浓度，第三荧光标志物2426c具有约10μm的浓度，第四荧光标志物2426d具有约5μm的浓度，第五荧光标志物2426e具有具有约3μm的浓度，第六荧光标志物2426f具有约2μm的浓度，第七荧光标志物2426g具有约1μm的浓度，第八荧光标志物2426h具有约0.75μm的浓度，并且第九荧光标志物2426i具有约0.5μm的浓度。[1544]在一些实施方式中，荧光标记的寡核苷酸的浓度范围为约0.01μm至约100μm(例如，90μm或更小、80μm或更小、70μm或更小、60μm或更小、50μm或更小、40μm或更小、30μm或更小、20μm或更小、10μm或更小、1μm或更小、0.1μm或更小、0.05μm或更小)。在一些实施方式中，荧光标记的寡核苷酸的浓度从第二荧光标志物2426b开始且通过第九荧光标志物2426i连续增加(例如，从约0.5μm至约20μm)。[1545]第一区段2428和第二区段2430可以分别在y轴上具有25个荧光标志物并且在x轴上具有10个荧光标志物。水平地穿过x轴，每个荧光标志物可以用浓度降低(例如，约50μm至约0.5μm)的荧光标记的寡核苷酸印刷，其中第十荧光标志物(例如，2426j)用最高浓度(约50μm)再印刷以表示最后一个点。这种荧光标记的寡核苷酸浓度的组合和顺序可以在y轴上的25行荧光标志物中重复。[1546]在一些实施方式中，通过降低荧光标记的寡核苷酸的浓度，同时与空白寡核苷酸的浓度成比例地增加以维持均匀的总浓度，来产生递减的荧光浓度。在一些实施方式中，保持含有荧光标记的寡核苷酸和空白寡核苷酸的混合物的等体积以确保个体荧光标志物(即，点)的均匀分布和形状。[1547]类似地，在各种实施方式中，第一荧光标志物可以包括第一荧光探针，并且在与第一荧光标志物相同的基材阵列内的第二荧光标志物可以包括第二荧光探针。例如，图24a显示了具有荧光标志物的第一区段2428和第二区段2430的基材阵列2404。在该示例中，第一区段2428中的多个荧光标志物用第一荧光探针(例如，与花青‑3偶联的寡核苷酸)标记。另一方面，第二区段2430中的多个荧光标志物用第二荧光探针(例如，与花青‑5偶联的寡核苷酸)标记。因此，用户可以使用基材2400同时优化两个荧光团的图像采集。在一些实施方式中，用户可以使用基材2400同时优化3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100或更多个荧光团的图像采集。[1548]仍然参考图24a，双通道基材阵列2400可位于框架2406的中心。在一些实施方式中，基材阵列2400可以定位在距框架2406的顶侧2418的距离b′处以及在距框架2406的底侧2422的距离d′处。在一些实施方式中，基材阵列2400可以定位在距框架2406的左侧2416的距离a′处和距框架2406的右侧2420的距离c′处。在一些实施方式中，距离b′约为1300μm。在一些实施方式中，距离b′可以在约100至约2000μm的范围内(例如，约1900μm或更小、1800μm或更小、1700μm或更小、1600μm或更小、1500μm或更小、1400μm或更小、1300μm或更小、1200μm或更小、1100μm或更小、1000μm或更小、900μm或更小、800μm或更小、700μm或更小、600μm或更小、500μm或更小、400μm或更小，300μm或更小、200μm或更小、150μm或更小)。在一些实施方式中，距离d′约为1300μm。在一些实施方式中，距离d′可以在约100至约2000μm的范围内(例如，约1900μm或更小、1800μm或更小、1700μm或更小、1600μm或更小、1500μm或更小、1400μm或更小、1300μm或更小、1200μm或更小、1100μm或更小、1000μm或更小、900μm或更小、800μm或更小、700μm或更小、600μm或更小、500μm或更小、400μm或更小，300μm或更小、200μm或更小、150μm或更小)。[1549]在一些实施方式中，距离a′约为1400μm。在一些实施方式中，距离a′可以在约100至约2000μm的范围内(例如，约1900μm或更小、1800μm或更小、1700μm或更小、1600μm或更小、1500μm或更小、1400μm或更小、1300μm或更小、1200μm或更小、1100μm或更小、1000μm或更小、900μm或更小、800μm或更小、700μm或更小、600μm或更小、500μm或更小、400μm或更小，300μm或更小、200μm或更小、150μm或更小)。在一些实施方式中，距离c′为约1400μm。在一些实施方式中，距离c′可以在约100至约2000μm的范围内(例如，约1900μm或更小、1800μm或更小、1700μm或更小、1600μm或更小、1500μm或更小、1400μm或更小、1300μm或更小、1200μm或更小、1100μm或更小、1000μm或更小、900μm或更小、800μm或更小、700μm或更小、600μm或更小、500μm或更小、400μm或更小，300μm或更小、200μm或更小、150μm或更小)。[1550]在一些实施方式中，基材包括阵列，所述阵列包括设置在基材表面上的荧光标志物。在一些实施方式中，多个荧光标志物各自包括荧光探针。在一些实施方式中，多个基准标志物以框架图案布置在表面上，形成围绕阵列的周界。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为至少约50微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为至少约100微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为至少约500微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为至少约1,000微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为至少约1,500微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为至少约2,000微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为约50至约3,000微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为约500至约2,000微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为约1,000至约1,500微米。[1551]在一些实施方式中，基材阵列对于肉眼是不可见的。即，基材阵列可以通过成像设备或系统对人眼可见。成像设备或系统可以提供激发波长，该激发波长进而激发荧光探针并引起荧光发射。荧光发射的强度(即，荧光强度)可由用户定性地评估或可由成像设备或系统检测和测量。一般而言，荧光强度与荧光团浓度之间存在线性关系。在一些实施方式中，荧光强度和荧光团浓度之间存在对数关系[1552]在一些实施方式中，多个荧光标志物包括在第一激发波长下具有第一荧光强度的第一部分和在第二激发波长下具有第二荧光强度的第二部分。在各种实施方式中，多个荧光标志物包括在第一激发波长具有第一荧光发射的第一部分和在第二激发波长具有第二荧光发射的第二部分。[1553]在一些实施方式中，第一激发波长不同于第二激发波长。在一些实施方式中，第一激发波长为约488纳米(nm)至约768nm(例如，约488nm至约525nm、约531nm至约577nm或约568nm至约668nm)。在一些实施方式中，第一激发波长为约554nm。在一些实施方式中，第一激发波长为约618nm。在一些实施方式中，第一激发波长为约488nm。在一些实施方式中，第一激发波长为约550纳米(nm)至约600nm。[1554]在一些实施方式中，第二激发波长为约488纳米(nm)至约768nm(例如，约488nm至约525nm、约531nm至约577nm或约568nm至约668nm)。在一些实施方式中，第二激发波长为约554nm。在一些实施方式中，第二激发波长为约618nm。在一些实施方式中，第二激发波长为约488nm。在一些实施方式中，第二激发波长为约600纳米(nm)至约750nm。[1555]仍参考图24a，以框架2406的形式布置在基材2400的表面2401上的基准标志物2424勾勒出各基材区域2402a‑2402h的外周，从而使得各基材区域由多个基准标志物2424限定。框架2406提供允许将生物样品合适地放置在基材区域之一上或允许在图像采集过程期间正确放置基材的视觉指引。在一些实施方式中，基准标志物不包括荧光材料。[1556]通常，基材2400可以是本文所述的任何基材，并且基准标志物2424可以布置在基材2400的任何表面上。此外，生物样品通常可以是本文所述的任何不同类型的生物样品，包括(但不限于)组织切片。[1557]可以使用多种技术制造基准标志物2424。此类技术包括但不限于光刻、喷射印刷、丝网印刷、喷砂、蚀刻、气相沉积、光掩模和各种其它沉积工艺。[1558]如图29a所示，在一些实施方式中，基材2500可以任选地包括提供识别信息例如但不限于样品名称和/或样品编号的标记物2502。标记物2502可以以下方式实现：条形码标记物、激光划线标识符、电子识别标签和其它类型的标记物和/或它们的组合。[1559]图24a显示了第六基材区域2402f的放大图。第六基材区域2402f包括以多种图案布置的多个基准标志物2424以形成框架2406。在一些实施方式中，多个基准标志物以框架图案排列，形成围绕基材区域的周界。在一些实施方式中，多个基准标志物以框架图案排列，在包括多个荧光标志物的阵列周围形成周界。在一些实施方式中，框架图案为矩形或正方形。在一些实施方式中，框架2406可以提供用于将生物样品放置在合适位置的视觉指示器，从而使得生物样品将被定位在由框架2406限定的周界内的基材区域2402f上。在其它实施方式中，用户可以使用框架2406来调整和/或设置他们的成像系统的扫描和采集区域。成像系统包括但不限于独立显微镜(例如nikon、zeiss、olympus或leica)和载玻片扫描仪(例如hamamatsu、leica、zeiss或innopsys)。在一些实施方式中，左列上的四个基材区域(例如，基材区域2402a‑d)和/或两列上的八个基材区域(例如，基材区域2402a‑h)可以对应于载玻片(例如，用于基于空间阵列的分析中的显微镜载玻片)中的捕获区域的间隔和定位。[1560]框架2406可以包括左侧2416、顶侧2418、右侧2420和底侧2422。框架2406的各侧具有不同的基准标志物图案。例如，顶侧2418包括以形成二维斜格结构的三个交错行布置的基准标志物。在各种实施方式中，每一行可以以堆叠或交错布置相对于相邻行定位。[1561]在一些实施方式中，一行基准标志物2424可以包括间隔开设定距离的相邻基准标志物。在一些实施方式中，基准标志物到标记的距离是两个相邻基准标志物的几何中心之间的距离。在一些实施方式中，基准标志物2424的部分或全部与一个或多个相邻标志物等距。在一些实施方式中，至少一个或多个基准标志物2424可位于距一个或多个相邻标志物不同距离处。[1562]在一些实施方式中，行的一些或全部基准标志物2424可以以线性几何图案排列。在一些实施方式中，一行的一些或全部基准标志物2424可以以非线性几何图案布置，例如，交替交错设置，其中一个基准标志物在两个正交坐标方向(即，x和y方向)上从连续的基准标志物移位，如左侧2416所示。[1563]在一些实施方式中，顶侧2418具有以插入图案布置的三行基准标志物2424。类似地，右侧2420，底侧2422，和左侧2416包括布置在与顶侧2418的图案不同的几何图案的基准标志物。在一些实施方式中，第一基材区域2402a、第二基材区域2402b、第三基材区域2402c、第四基材区域2402d、第五基材区域2402e、第六基材区域2402f、第七基材区域2402g和第八基材区域2402h(图24a中所示)各自具有由基准标志物形成的不同框架(注意，框架的不同特征未在图24a中显示)，其使各阵列能够根据其相应基准标志物框的图案几何形状而被区分。[1564]在一些实施方式中，单个框的每一侧包含基准标志物的独特图案，该图案使特定侧与框中的其他侧自动区分，以便于确定阵列方向。可以由人类用户手动地识别各个侧或将其彼此区分开来，或者可替换地，通过捕获框的图像并使用执行基于软件的指令的电子处理器分析图像中的基准标识以将基准标识的特定图案与特定侧相关联，可以自动地识别单独侧或将其彼此区分开。在一些实施方式中，基准标志物2424的图案包括多个重复的图案区段，使基于软件的图案识别更容易，甚至在一些基准标志物被生物样品遮挡时也是如此。[1565]形成框的基准标志物的图案可以进一步包括框的角部中的图示符，如图24a所示。第一图示符2408显示为矩形形状并且可以定位在顶侧2418和左侧2416之间的角中。此外，第二图示符2410显示为具有空的六边形形状并且可以定位在顶侧2418和右侧2420之间的角中。类似地，第三图示符2412显示为具有填充的六边形形状并且可以定位在底侧2422和右侧2420之间的角中。第四图示符2414显示为三角形并且可以定位在左侧2416和底侧2422之间的角中。虽然图24a中说明的图示符具有用于说明目的的特定图案，但是应当理解，通常，对应于基准标志物的任何特定图案或形状的图示符可以定位在基材上的任何位置。图中所示的示例绝不意在暗示限制。[1566]一般来说，“图示符”是形成几何形状的基准标志物的独特图案。此类形状的示例包括但不限于圆形、沙漏形、六边形、正方形、矩形、三角形、五边形、七边形、八边形、九边形、十边形、椭圆形、规则多边形和/或任何其它非几何、规则或不规则形状。图示符也可以对应于上述任何形状的组合。图示符可以进一步对应于“空”或“填充”形状。[1567]在一些实施方式中，可以在图像(例如，亮场显微镜图像)中观察图示符，并由人类用户在手动分析过程中识别。在一些实施方式中，形成图示符和框架的基准标志物可以包括着色剂或标记物(包括上述任何标记物)，其允许定义图示符或框架的基准标志物的图案在有或没有放大倍数(例如，在光学显微镜中)辅助的情况下对肉眼可见。在某些实施方式中，基准标志物可以包括一种或多种荧光物质，从而使得图示符和框架可以被入射光激发并且可以观察和成像来自基准标志物的荧光发射。[1568]在一些实施方式中，一个或多个基准标志物2424可以印刷或沉积在基材的表面上。例如，在一些实施方式中，可以使用接触或非接触印刷来印刷一个或多个基准标志物2424。在另一示例中，一个或多个基准标志物2424可以光刻制造。在一些实施方式中，制造的基材具有暴露在表面上的羧基，并且基准标志物包括反应性化学基团(例如，胺基团或或任何其它合适的附接化学物)，其与基材表面上的所需官能团形成共价键。合适的表面改性化学的非限制性示例包括电化学改性、醛改性、基于物理吸附的改性、环氧改性、羧酸酯改性、重氮化改性、用超分子(例如杯芳烃)进行的表面改性、碳纳米管改性、胺改性、基于硫醇的改性、酰肼改性、静电改性、基于亲和的改性、生物素化、炔烃的改性、腺苷酸化和叠氮化物改性。[1569]在一些示例中，一个或多个基准标志物2424包括金属纳米颗粒。在一些实施方式中，金属基准标志物包括金。在一些实施方式中，金属基准标志物包括纳米颗粒。合适的金属纳米颗粒包括但不限于金纳米颗粒。在一些实施方式中，金属纳米颗粒具有约10纳米(nm)的平均直径。在一些实施方式中，金属纳米颗粒具有50nm的平均直径。在一些实施方式中，金属纳米颗粒具有15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm或45nm的平均直径。在一些实施方式中，金属纳米颗粒具有约1nm至约20nm，或约5nm至约15nm的平均直径。在一些实施方式中，金属纳米颗粒具有5nm至1微米的平均直径(例如，10nm至50nm、10nm至100nm、50nm至100nm、100nm至200nm、200nm至300nm、300至400nm、400至500nm、500至600nm、600至700nm、700至800nm、800至900nm、900nm1000nm、10nm至1微米、20nm至1微米、20nm至800nm、20nm至600nm、20nm至400nm、30nm至100nm)。在一些实施方式中，金纳米颗粒具有约1015个纳米颗粒/毫升的浓度。在一些实施方式中，金纳米颗粒的浓度为约101纳米颗粒/毫升至约1030纳米颗粒/毫升(例如，1025纳米颗粒/毫升或更少、1020纳米颗粒/毫升或更少、1015纳米颗粒/毫升或更少、1010纳米颗粒/毫升、105纳米颗粒/毫升)。[1570]在一些实施方式中，用涂层材料涂覆金属纳米颗粒。合适的覆层材料包括例如各种聚合物材料。在一些实施方式中，金属纳米颗粒可连接至聚合物配体。例如，金纳米颗粒可以连接到长度约为50nm的聚合物配体上。[1571]与金属纳米颗粒相连的聚合物配体，以及金属纳米颗粒本身，可以以各种方式官能化。在一些实施方式中，金属纳米颗粒连接至在末端具有胺基团的聚合物配体。在一些实施方式中，金属纳米颗粒可以用在其末端具有羧酸基团的化合物官能化，该羧酸基团能共价附接至与涂覆的金纳米颗粒相关联的胺基团。此外，在一些实施方式中，金属纳米颗粒是荧光的。[1572]在一些实施方式中，基准标志物由例如铬的金属材料形成，并且可以通过使用化学沉积来施加。例如，可以将离散标志物的图案或包含金属(例如铬)的薄膜/层电镀到基材上，从而为基材上的各个阵列建立可见框架。在一些实施方式中，基准标志物被激光蚀刻到基材的表面上。在某些实施方式中，基准标志物由tubewritertm360墨水、永久性标记墨水、钢笔墨水、喷墨打印机墨水或其组合形成。在一些实施方式中，基准标志物由有色和/或荧光微球或微珠形成。[1573]在一些实施方式中，基准标志物由胺官能化氧化铁纳米颗粒形成。在一些实施方式中，基准标志物由胺官能化的铥掺杂上转换纳米磷光体形成。在一些实施方式中，基准标志物由胺官能化的量子点形成，例如但不限于基于镉的量子点。在一些实施方式中，基准标志物包括比色标记物，例如荧光寡核苷酸(例如，具有荧光部分的寡核苷酸)。[1574]一般来说，当在平行于基材的平面上观察时，基准标志物可以具有各种二维形状。例如，在一些实施方式中，基准标志物2424具有圆形点的形状，如图24a所示。在一些实施方式中，基准标志物2424以六边形、正方形、矩形、三角形、五边形、七边形、八边形、九边形、十边形、椭圆形、正多边形或任何其它规则或不规则的几何形状提供。在一些实施方式中，框架的一些或全部基准标志物具有相同的形状。在一些实施方式中，框架的一些基准标志物具有第一形状，并且一些基准标志物具有不同于第一形状的第二形状。[1575]在一些实施方式中，基准标志物可以围绕阵列的全部或部分。在一些实施方式中，基准标志物可以完全包围阵列。或者，在一些实施方式中，基准标志物可以不完全包围阵列(例如，可以仅包围阵列的部分)。在一些实施方式中，基准标志物识别阵列的角或其它特定部分，例如阵列的中心。[1576]在一些实施方式中，形成框架的基准标志物的平均最大横截面尺寸为50微米至500微米(例如，50微米至400微米、50微米至300微米、100微米至500微米、100微米至300微米)。[1577]在一些实施方式中，基准标志物的排列方式使得一个基准标志物的中心距阵列周围最近的下一个基准标志物的中心在100微米和200微米之间(例如，在110微米和190微米之间，在120微米和170微米之间，在120微米和150微米之间)。在一些实施方式中，基准标志物以如下方式排列，即一个基准标志物的中心距阵列周围最近的下一个基准标志物的中心的距离为100纳米(nm)至200nm(例如，110nm至190nm、120nm至170nm、120nm至150nm)。在一些实施方式中，基准标志物以如下方式排列，即一个基准标志物的中心距阵列周围最近的下一个基准标志物的中心的距离为1厘米(cm)至5cm。[1578]在一些实施方式中，具有周围基准标志物的阵列在基材上的最大尺寸为30mm或更小(例如，25mm或更小、20mm或更小、15mm或更小、10mm或更小、9mm或更小、8mm或更小、6mm或更小、5mm或更小、4mm或更小、3mm或更小)。在一些实施方式中，阵列是边长为约8mm的正方形或矩形阵列。[1579]在一些实施方式中，基准标志物可存在于基材上以提供生物样品的取向。在一些实施方式中，微球可耦合至基材以帮助生物样品的定向。在一些示例中，耦合至基材的微球可产生光信号(例如，荧光)。在另一实例中，微球可以特定图案或设计(例如六角形图案)附接于阵列的部分(例如角部)，以帮助生物样品在基材上的特征阵列上的取向。[1580]在一些实施方式中，基准标志物可为固定化分子，可检测信号分子可与之相互作用以产生信号。例如，标志物核酸可连接或耦合到当接受特定波长(或波长范围)的光时能够发出荧光的化学部分。这种标志物核酸分子可以在组织样品染色之前、同时或之后与阵列接触，以使组织切片可视化或成像。尽管不是必需的，但是使用可使用用于检测标记的cdna的相同条件(例如成像条件)来检测的标志物可能是有利的。[1581]在一些实施方式中，包括基准标志物以促进组织样品或其图像相对于固定在基材上的捕获探针的定向。可以使用任何数量的用于对阵列进行标识的方法，使得仅当对组织切片成像时才可检测到基准标志物。例如，分子，例如产生信号的荧光分子，可以直接或间接地固定在基材的表面上。[1582]在一些实施方式中，基准标志物可以随机地位于基材表面上。例如，含有荧光团的寡核苷酸可在基材上的随机位置随机印刷、压印、合成或附接到基材(例如载玻片)上。组织切片可与基材接触，使得含有荧光团的寡核苷酸接触或接近来自组织切片的细胞或细胞的组分(例如，mrna或dna分子)。可以获得基材和组织切片的图像，并且可以确定荧光团在组织切片图像中的位置(例如，通过回顾覆盖有荧光团检测的组织切片的光学图像)。[1583]在一些实施方式中，基准标志物可以施加到在基材上的已知选择位置。例如，可以在基材上压印、附着或合成基准标志物。获得包括基准标志物的基材的图像，并且基准标志物在基材上的位置可以通过观察所述图像来定性地确定，和/或通过测量基准标志物在所述图像中的位置来定量地确定。[1584]如上所述，单个基材(例如，载玻片)可包括多个成框阵列，其中至少一个框具有使特定阵列与基材上的其他阵列区分的独特图案。特别地，与其它框架相比，至少一个框架的基准标志物的图案可以包含轻微的变化。在一些实施方式中，基准标志物图案中的特定基序可在框与框之间变化，以便区分同一载玻片内的个体阵列。在一些实施方式中，与第一框架的顶侧(例如，顶侧2418)中的第一基序对应的区域可以通过改变附加框架(例如，第二框架)的相应区域中的基准标志物的数量而变化。通过这样做，附加框架的相应区域中的图案包括独特的、可区分的基准标志物图案，其可用于区分每个框架。[1585]在一些实施方式中，可以改变框和/或图示符的任何一个或多个侧面内的一个或多个其他区域，以在每个阵列内生成基准标志物的独特图案。例如，位于框架的左侧或右侧的第一侧向基序，第二侧向基序，第三侧向基序和第四侧向基序(例如，2416、2420)可包括基准标志物的独特图案，作为各框架顶部基序的基准标志物的独特图案的附加或替代。基准标志物图案化的这种变化可以允许用户和/或分析软件确定四个阵列中的哪一个正在被扫描和/或评估。在一些实施方式中，终端用户和/或分析软件还可以确定阵列是否在方向上“移动”(例如，围绕与基材平面正交或平行的轴旋转)，从而允许在样品分析进行之前校正阵列旋转。[1586]在一些实施方式中，基材包括阵列，所述阵列包括设置在基材表面上的多个荧光标志物，多个荧光标志物包括荧光标志物的第一子集，其各自具有第一荧光探针，和荧光标志物的第二子集，其各自具有第二荧光探针。在一些实施方式中，第一探针不同于第二荧光探针。在一些实施方式中，基材包括阵列，所述阵列包括布置在基材表面上的多个非金属荧光标志物。在一些实施方式中，多个荧光标志物各自包括荧光染料。在一些实施方式中，多个基准标志物以框架图案布置在表面上，形成围绕阵列的周界。[1587]图25a‑e显示基材2400的显微图像。图25a显示了用成像系统采集的基材2400的明场图像。如图25a所示，框架2406通过透射白光的样品照明而可由眼睛观察到；因此，允许用户在不需要荧光显微术的情况下识别基材区域2402a‑h。在一些实施方式中，多个金属基准标志物的形状和尺寸被设计成使得框架图案(即，框架2406)对于肉眼可见。肉眼可以检测到具有至少0.1mm尺寸的物体。因此，在一些实施方式中，基材阵列包括各自具有约0.1mm或更大的尺寸(例如，约0.2mm、约0.3mm、约0.4mm、约0.5mm、约0.6mm、约0.7mm、约0.8mm、约0.9mm或1.0mm)的离散标志物。在一些实施方式中，基材阵列包括离散标志物，各标志物具有约0.1mm至约1.0mm、约0.2mm至约0.8mm或约0.04mm至约0.6mm的尺寸。在一些实施方式中，离散标志物的平均尺寸为约0.1mm或更大(例如，约0.2mm、约0.3mm、约0.4mm、约0.5mm、约0.6mm、约0.7mm、约0.8mm、约0.9mm，或1.0mm)。在一些实施方式中，离散标志物的平均尺寸为约0.1mm至约1.0mm、约0.2mm至约0.8mm或约0.04mm至约0.6mm。[1588]与多个基准标志物相反，在图25a中的明场显微镜下可能看不到基材阵列(例如，荧光阵列)。类似地，在一些实施方式中，基材阵列(例如，荧光阵列)对于肉眼可能不可见。肉眼可能无法检测到最大尺寸小于0.1mm的物体。因此，在一些实施方式中，基材阵列包括离散的标志物，其各自的最大尺寸小于0.1mm。在一些实施方式中，基材阵列包括离散标志物，其各自的最大尺寸小于0.075mm、小于0.05mm或小于0.001mm。在一些实施方式中，基材阵列包括离散标志物，其各自具有约0.001mm至约0.1mm、约0.005mm至约0.05mm或约0.01mm至约0.075mm的最大尺寸。[1589]图25b‑e显示了包括第一区段2428和第二区段2430的基材阵列2404的荧光显微图像。第一区段2428包括具有与第一荧光探针(例如，花青‑3或tritc)偶联的寡核苷酸的多个荧光标志物。第二区段2430包括多个具有与第二荧光探针(例如，花青‑5)偶联的寡核苷酸的荧光标志物。在这个例子中，基材阵列2404的第一区段2428用对应于花青‑3或tritc的激发波长的第一激发波长(例如，通过具有554±23nm的激发带通区域的荧光滤光器)照射。结果，多个荧光标志物发射出通过609±54nm发射荧光滤光器可见的荧光发射，如图25b所示。[1590]此外，基材阵列2404的第二区段2430用对应于花青‑5的激发波长的第二激发波长(例如，通过具有618±50nm激发带通区域的荧光滤光器)照射。因此，多个荧光标志物发射通过698±70nm发射荧光滤光器可见的荧光发射，如图25c所示。图25d显示了图25b‑25c的荧光显微镜合并图像。图25e显示了图25d所示的荧光显微图像的放大视图。[1591]如图25b‑e所示，在荧光显微镜下不容易看到多个基准标志物。然而，在一些实施方式中，用户可能能够通过检测多个基准标志物的低亮度反射来在荧光显微镜下识别框架。在一些实施方式中，多个荧光标志物在第一和/或第二激发波长下发荧光，而多个基准标志物在第一和/或第二激发波长下不发可检测得到的荧光。在一些实施方式中，多个基准标志物在第一和/或第二激发波长下不发可检测得到的荧光。在一些实施方式中，多个金属基准标志物在第一激发波长下不发可检测得到的荧光。在一些实施方式中，多个金属基准标志物在第二激发波长下不发可检测得到的荧光。[1592]如本文所用，术语“发可检测得到的荧光”是指可由标准光学显微镜或配备有滤光器立方体(例如，荧光滤光器立方体)的载玻片扫描仪检测到的荧光强度水平。因此，在一些实施方式中，多个金属基准标志物在第一和/或第二激发波长下不发可检测得到的荧光意味着多个金属基准标志物不发射可由标准光学显微镜或装有滤光器立方体(例如荧光滤光器立方体)的载玻片扫描仪检测得到的荧光强度水平。[1593]滤光器立方体可包括激发器滤光器立方体、屏障滤光器、二色分束器或它们的任何组合。滤光器立方体可以是带通滤光器立方体或长通滤光器立方体。可以使用一个或多个滤光器立方体，在这种情况下，滤光器立方体可以是带通滤光器立方体和长通滤光器立方体的组合、所有带通滤光器立方体或所有长通滤光器立方体。在一些实施方式中，滤光器立方体是dapi(4′，6‑二脒基‑2‑苯基吲哚)滤光器立方体、绿色荧光蛋白(gfp)滤光器立方体、异硫氰酸荧光素(fitc)滤光器立方体、四甲基罗丹明(tritc)过滤器立方体、德克萨斯红过滤器立方体、青色荧光蛋白(cfp)过滤器立方体、黄色荧光蛋白(yfp)过滤器立方体、cy3过滤器立方体、cy5过滤器立方体、mcherry过滤器立方体或其任何组合。[1594]在一些实施方式中，滤光器立方体具有激发滤光器，其允许约347nm至约680nm范围内的波长通过(例如，源自照明器的波长，在通向样品的途中通过激发滤光器)。在一些实施方式中，滤光器立方体具有允许约347nm至约403nm范围内的波长通过的激发滤光器(例如，375/28激发滤光器)。在一些实施方式中，滤光器立方体具有允许约430nm至约510nm范围内的波长通过的激发滤光器(例如，470/40激发滤光器)。在一些实施方式中，滤光器立方体具有允许约450nm至约510nm范围内的波长通过的激发滤光器(例如，480/30激发滤光器)。在一些实施方式中，滤光器立方体具有允许约515nm至约565nm范围内的波长通过的激发滤光器(例如，540/25激发滤光器)。在一些实施方式中，滤光器立方体具有允许约520nm至约600nm范围内的波长通过的激发滤光器(例如，560/40激发滤光器)。[1595]在一些实施方式中，滤光器立方体具有阻挡约400nm至约775nm范围的波长通过的屏障滤光器。在一些实施方式中，滤光器立方体具有允许约400nm至约520nm范围的波长通过的屏障滤光器(例如，460/60激发滤光器)。在一些实施方式中，滤光器立方体具有允许约485nm至约585nm范围的波长通过的屏障滤光器(例如，535/50激发滤光器)。在一些实施方式中，滤光器立方体具有允许约550nm至约660nm范围的波长通过的屏障滤光器(例如，605/55激发滤光器)。在一些实施方式中，滤光器立方体具有允许约515nm至约565nm范围的波长通过的屏障滤光器(例如，540/25激发滤光器)。在一些实施方式中，滤光器立方体具有允许约570nm至约690nm范围的波长通过的屏障滤光器(例如，630/60激发滤光器)。[1596]在一些实施方式中，为了增加稳定性，可以安装(例如，干式安装或湿式安装)基材并且可以将盖玻片施加到基材的表面上以覆盖框架、基材区域和基材阵列。在一些实施方式中，用盖玻片固定和覆盖使能够导致荧光团氧化和漂白的环境和大气接触最小化。[1597]参考图26a‑26b，基材2600在构造、设计和功能上类似于上述基材2400。例如，基材2600的设计可以通过基材2400顺时针旋转90度来获得。因此，基材2600包括第一基材区域2602a、第二基材区域2602b、第三基材区域2602c、第四基材区域2602d、第五基材区域2602e、第六基材区域2602f、第七基材区域2602g，以及第八基材区域2602h。每个基材区域可以被包围在框架2606的限定的周界内。八个基材区域2602a‑h可以位于基材2600的中心。虽然图24a和26a具有用于说明目的的特定图案，但是应理解，通常，对应于基准标志物和/或荧光标志物的任何特定图案或形状的基材可以定位在基材上的任何位置。图中所示的示例绝不意在暗示限制。[1598]在一些实施方式中，基材阵列2604可以定位在距框架2606的顶侧2618的距离b”处以及在距框架2606的底侧2622的距离d”处。在一些实施方式中，基材阵列2600可以定位在距框架2606的左侧2616的距离a”处和距框架2606的右侧2620的距离c”处。在一些实施方式中，距离b”约为1600μm。在一些实施方式中，距离b”可以在约100至约2000μm的范围内(例如，约1900μm或更小、1800μm或更小、1700μm或更小、1600μm或更小、1500μm或更小、1400μm或更小、1300μm或更小、1200μm或更小、1100μm或更小、1000μm或更小、900μm或更小、800μm或更小、700μm或更小、600μm或更小、500μm或更小、400μm或更小，300μm或更小、200μm或更小、150μm或更小)。在一些实施方式中，距离d”约为1600μm。在一些实施方式中，距离d”可以在约100至约2000μm的范围内(例如，约1900μm或更小、1800μm或更小、1700μm或更小、1600μm或更小、1500μm或更小、1400μm或更小、1300μm或更小、1200μm或更小、1100μm或更小、1000μm或更小、900μm或更小、800μm或更小、700μm或更小、600μm或更小、500μm或更小、400μm或更小，300μm或更小、200μm或更小、150μm或更小)。[1599]在一些实施方式中，距离a”约为1100μm。在一些实施方式中，距离a”可以在约100至约2000μm的范围内(例如，约1900μm或更小、1800μm或更小、1700μm或更小、1600μm或更小、1500μm或更小、1400μm或更小、1300μm或更小、1200μm或更小、1100μm或更小、1000μm或更小、900μm或更小、800μm或更小、700μm或更小、600μm或更小、500μm或更小、400μm或更小，300μm或更小、200μm或更小、150μm或更小)。在一些实施方式中，距离c”为约1600μm。在一些实施方式中，距离c”可以在约100至约2000μm的范围内(例如，约1900μm或更小、1800μm或更小、1700μm或更小、1600μm或更小、1500μm或更小、1400μm或更小、1300μm或更小、1200μm或更小、1100μm或更小、1000μm或更小、900μm或更小、800μm或更小、700μm或更小、600μm或更小、500μm或更小、400μm或更小，300μm或更小、200μm或更小、150μm或更小)。[1600]图26b图示了显示各荧光标志物2626的各种浓度的一列的区段2628的示例。例如，第一荧光标志物2626a和第九荧光标志物2426i具有相同浓度的荧光标记的寡核苷酸(例如，约100微摩尔(μm))。在一些实施方式中，第一荧光标志物2626a和第九荧光标志物2626i是允许用户容易地识别区段(例如，区段2630)的每一列的开始和结束的最暗点。荧光标记的寡核苷酸的浓度从第二荧光标志物2626b开始且通过第八荧光标志物2426h连续降低(例如，从约50μm到约0.01μm)。也即，第二荧光标志物2626b具有约50μm的浓度，第三荧光标志物2626c具有约20μm的浓度，第四荧光标志物2626d具有约10μm的浓度，第五荧光标志物2626e具有约5μm的浓度，第六荧光标志物2626f具有约1μm的浓度，第七荧光标志物2626g具有约0.1μm的浓度，和，第八荧光标志物2626h具有约0.01μm的浓度。[1601]在一些实施方式中，荧光标记的寡核苷酸的浓度范围为约0.001μm至约200μm(例如，190μm或更低，180μm或更低，170μm或更低，160μm或更低，150μm或更低，140μm或更低，130μm或更低，120μm或更低，110μm，100μm或更低，90μm或更低，80μm或更低，70μm或更低，60μm或更低，50μm或更低，40μm或更低，30μm或更低，20μm或更低，10μm或更低，1μm或更低，0.1μm或更低，0.05μm或更低，0.005μm或更低)。在一些实施方式中，荧光标记的寡核苷酸的浓度从第二荧光标志物2626b开始且通过第八荧光标志物2426h连续增加(例如，从约0.01μm至约50μm)。[1602]在一些实施方式中，多个非金属荧光标志物的第一子集各自具有第一浓度并且多个非金属荧光标志物的第二子集各自具有第二浓度。在一些实施方式中，多个非金属荧光标志物的第一子集具有第一平均浓度并且多个非金属荧光标志物的第二子集具有第二平均浓度。在一些实施方式中，第一浓度(或第一平均浓度)不同于第二浓度(或第二平均浓度)。第一区段2428和第二区段2430个体地可以在x轴上具有25个荧光标志物，在y轴上具有9个荧光标志物。垂直于y轴，每个荧光标志物可以递减浓度(例如，约100μm至约0.01μm)的荧光标记的寡核苷酸打印，其中第九个荧光标志物(例如，2426i)以最高浓度(约100μm)重印，以表示最后一个点。这种荧光标记的寡核苷酸浓度的组合和顺序可以在x轴上的25列荧光标志物中重复。[1603]图26c显示了包括第一区段2628和第二区段2630的基材阵列2604的荧光显微镜合并图像。第一区段2628包括具有与第一荧光探针(例如，花青‑3或tritc)偶联的寡核苷酸的多个荧光标志物。第二区段2630包括多个具有与第二荧光探针(例如，花青‑5)偶联的寡核苷酸的荧光标志物。在这个例子中，基材阵列2604的第一区段2628用对应于花青‑3或tritc的激发波长的第一激发波长(例如，通过具有554±23nm的激发带通区域的荧光滤光器)照射。结果，多个荧光标志物发射通过609±54nm发射荧光滤光器可见的荧光发射。在一些实施方式中，多个非金属荧光标志物包括在第一激发波长具有第一荧光强度峰值的第一子集和在第二激发波长具有第二荧光强度峰值的第二子集。在一些实施方式中，第一激发波长不同于第二激发波长。[1604]此外，基材阵列2604的第二区段2630用对应于花青‑5的激发波长的第二激发波长(例如，通过具有618±50nm激发带通区域的荧光滤光器)照射。结果，多个荧光标志物发射通过698±70nm发射荧光滤光器可见的荧光发射。[1605]图27a显示了在明场显微镜下观察的包括尺寸校准阵列2702和动态范围阵列2704的基材2700。尺寸校准阵列2702可以解决成像系统的空间分辨率，其包括但不限于检测器(例如，照相机)、显微镜物镜和采集软件(例如，用于图像输出)。在一些实施方式中，预期低分辨率图像不能分辨较小尺寸点的边界。尺寸校准阵列2702可以包括不同尺寸的六个点2706。例如，2706a可具有约100μm的直径，2706b可具有约200μm的直径，2706c可具有约300μm的直径，2706d可具有约400μm的直径，2706e可以具有约500μm的直径，2706f可具有约600μm的直径。水平地，各个点2706可以以约1000μm的几何中心到中心水平距离2710隔开。垂直地，各个点2706可以以约1800μm的几何中心到中心垂直距离2712间隔开，以用于附加间隔校准。在一些实施方式中，点2706a‑f可以利用微阵列印刷头印刷。[1606]在一些实施方式中，尺寸校准阵列2702包括至少一个点至约100个点(例如，90个点或更少、80个点或更少、70个点或更少、60个点或更少、50个点或更少、40个点或更少、30个或更少、20个或更少、10个或更少、5个或更少)。在一些实施方式中，尺寸校准阵列2702包括直径范围为约10μm至约1500μm的点(例如，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小)。在一些实施方式中，一个或多个点可具有相同或不同的尺寸。[1607]在一些实施方式中，点可具有非圆形点的形状。此类形状的示例包括但不限于圆形、沙漏形、六边形、正方形、矩形、三角形、五边形、七边形、八边形、九边形、十边形、椭圆形、规则多边形和/或任何其它非几何、规则或不规则形状。点也可以对应于上述任何形状的组合。在一些实施方式中，点可以具有不同的形状(例如，第一点具有第一形状，其不同于第二点的第二形状)。[1608]在一些示例中，一个或多个点2706包括金属纳米颗粒。合适的金属纳米颗粒包括但不限于金纳米颗粒。在一些实施方式中，用涂层材料涂覆金属纳米颗粒。合适的覆层材料包括例如多种聚合物材料。在一些实施方式中，金属纳米粒子可连接至聚合物配体。例如，金纳米颗粒可以连接到长度约为50nm的聚合物配体上。在一些实施方式中，点2706包括直径为约10nm的多个金纳米颗粒。[1609]与金属纳米颗粒相连的聚合物配体，以及金属纳米颗粒本身，可以以各种方式官能化。与金属纳米颗粒相连的聚合物配体以及金属纳米颗粒本身可以通过多种方式进行功能化。在一些实施方式中，金属纳米颗粒可以用在其末端具有羧酸基团的化合物官能化，该羧酸基团能共价连接至与涂覆的金纳米颗粒相关联的胺基团。此外，在一些实施方式中，金属纳米颗粒是荧光的。[1610]在一些实施方式中，点2706由例如铬的金属材料形成，并且可以通过使用化学沉积来施加。例如，可以将离散标志物的图案或包含金属(例如铬)的薄膜/层电镀到基材上，从而为基材上的各个阵列建立可见框架。在一些实施方式中，基准标志物被激光蚀刻到基材的表面上。在某些实施方式中，基准标志物由tubewritertm360墨水、永久性标记墨水、钢笔墨水、喷墨打印机墨水或其组合形成。在一些实施方式中，基准标志物由有色和/或荧光微球或微珠形成。[1611]在一些实施方式中，点2706在荧光显微镜下是不可见的。在一些实施方式中，点2706是人肉眼可见的。[1612]仍然参考图27a，基材2700包括动态范围阵列2704，其可以相对于尺寸校准阵列2702以交替图案布置。动态范围阵列2704可以评估成像系统的动态范围。例如，动态范围阵列2704可以评估检测器(例如，照相机)、显微镜物镜、显微镜滤光器和/或采集软件(用于图像输出)的动态范围。在一些实施方式中，动态范围阵列2704是比色动态范围阵列。动态范围阵列2704可以包括多个比色标志物2708。类似于以荧光标志物为特征的基材阵列，比色动态范围阵列可包含浓度递减的染料、颜料、微球和/或纳米颗粒(例如金属或聚合物纳米颗粒)，以评估明场成像的动态范围。可以使用染料和颜料的组合来复制已知的组织化学染色。例如，粉红色和蓝色染料和/或颜料的组合可用于评估苏木精和曙红成像的理想成像条件。在一些实施方式中，比色标志物2708包括金纳米颗粒。在一些实施方式中，比色标志物2708包括与荧光探针偶联的金纳米颗粒。在一些实施方式中，比色标志物2708包括具有约10nm直径的金纳米颗粒。在一些实施方式中，比色标志物2708包括第一荧光探针和第二荧光探针。在一些实施方式中，第一荧光探针不同于第二荧光探针。[1613]在一些实施方式中，尺寸校准阵列2702和动态范围阵列2704可以包括形成框架图案的多个基准标志物，类似于上述基材阵列的框架。[1614]图27b‑d显示基材2700的显微图像。图27b显示了在约488nm的激发下观察到的动态范围阵列2704的荧光显微图像，所述动态范围阵列2704包括含第一荧光探针(例如，异硫氰酸荧光素(fitc))的第一组荧光标志物2708a。图27c显示了在约594nm的激发下观察到的动态范围阵列2704的荧光显微图像，所述动态范围阵列2704包括含第二荧光探针(例如，花青‑3或tritc)的第二组荧光标志物2708b。图27d显示了在约647nm的激发下观察到的动态范围阵列2704的荧光显微图像，所述动态范围阵列2704包括含第三荧光探针(例如，花青‑5)的第三组荧光标志物2708c。[1615]图28a‑d显示了基材2800的又一个示例的图像。如图28a所示，基材2800包括两个动态范围阵列2804，其进一步包括多个动态荧光标志物2810。各个动态范围阵列2804可以被包围在框架2808的限定的周界内。框架2808可以包括多个基准标志物，类似于上文讨论的基材阵列的框架。基材2800还包括样品区域2806。各个样品区域2806被配置为在框架2808的限定周长内接收生物样品2802。在一些实施方式中，组织(小鼠脑、小鼠肾、小鼠肝脏、组织培养物、人体活检物等)可以放置在样品区域2806上、经染色(例如，组织化学染色、免疫组织化学染色或荧光染色)，并用盖玻片封固。在一些实施方式中，基材不包括样品区域2806。即，在一些实施方式中，将生物样品放置在基材上是可任选的。在一些实施方式中，将生物样品放置在样品区域2806上有助于成像装置的校准(例如，在明场显微镜的校准中)。在一些实施方式中，样品区域2806提供具有由框架2808限定的周界的区域，用户可以任选地使用该区域来练习将生物样品2802(例如，组织切片)定位在框架2808内。在一些实施方式中，用户不在样品区域2806内放置任何样品。[1616]图28b‑d显示基材2800的显微图像。图28b显示了在约594nm的激发下观察到的动态范围阵列2804的荧光显微图像，所述动态范围阵列2804包括含第一荧光探针(例如，花青‑3或tritc)的第一组荧光标志物2810a。图28c显示了在约488nm的激发下观察到的动态范围阵列2804的荧光显微图像，所述动态范围阵列2804包括含第二荧光探针(例如，异硫氰酸荧光素(fitc))的第二组荧光标志物2810b。图28d显示了在约647nm的激发下观察到的动态范围阵列2804的荧光显微图像，所述动态范围阵列2804包括含第三荧光探针(例如，花青‑5)的第三组荧光标志物2810c。[1617]图29a‑29d示出具有包括四个阵列的表面2901的示例基材2900。具体地说，基材2900包括第一阵列2904a、第二阵列2904b、第三阵列2904c和第四阵列2904d，其中每个阵列被配置成在阵列的限定周界内接收生物样品2928。即，第一阵列2904a、第二阵列2904b、第三阵列2904c和第四阵列2904d是如上所述的特征阵列。[1618]以框架2934的形式布置在基材2900的表面2901上的基准标志物2932勾勒出各个阵列2904a‑2904d的外周界，从而使得各个阵列由多个基准标志物2932定义，如图29b‑d所示。框架2934提供允许将生物样品2928正确放置在阵列之一上(或允许将样品正确放置在多个阵列上)的视觉指引。[1619]通常，基材2900可以是本文所述的任何基材，并且基准标志物2932可以布置在基材2900的任何表面上。此外，生物样品2928通常可以是本文所述的任何不同类型的生物样品，包括(但不限于)组织切片。[1620]可以使用多种技术制造基准标志物2932。此类技术包括但不限于光刻、喷射印刷、丝网印刷、喷砂、蚀刻、气相沉积、光掩模和各种其它沉积工艺。[1621]在一些实施方式中，基材2900可任选地包括提供例如但不限于样品名称和/或样品编号的识别信息的标志物2902。标志物2902可以以下方式实现：条形码标志物、激光划线标识符、电子识别标签和其它类型的标志物和/或其组合。[1622]图29b示出了第一阵列2504a的放大视图。第一阵列2504a包括以多种图案布置以形成框架2534的多个基准标志物2532。框2534提供了一个视觉指示器，用于将生物样品2528放置在适当的位置，使得样品将位于框2534定义的周界内的阵列2504a上。[1623]图29c‑d显示框2534或其部分的放大视图(为了说明目的，排除了阵列2504a的其余部分)。框架2934包括第一侧2520、第二侧2522、第三侧2524和第四侧2526。框架2534的各侧具有不同的基准标志物图案。例如，第一侧2520包括布置成形成二维斜格结构的三个交错行2506(在图29d中的虚线部分中描绘)的基准标志物。在各种实施方式中，每一排可以以堆叠或交错布置相对于相邻排定位。[1624]在一些实施方式中，基准标志物2532的行2506可以包括间隔距离e的邻近标志物，如图29d所示。在一些实施方式中，标志物到标志物的距离是两个邻近标志物的几何中心之间的距离。在一些实施方式中，行2506的标志物2532的部分或全部与一个或多个邻近标志物等距。在一些实施方式中，至少一个或多个标志物2532可以定位在与一个或多个邻近标志物不同的距离处。[1625]在一些实施方式中，行的一些或全部基准标志物2532可以以线性几何图案排列。在一些实施方式中，一行的一些或全部基准标志物2532可以以非线性几何图案布置，例如，交替交错设置，其中一个基准标志物在两个正交坐标方向(即，x和y方向)上从连续的基准标志物移位，如第四侧2526所示。[1626]仍参考图29c‑d，第一侧2520具有以插入模式排列的三排基准标志物2532。类似地，第二侧2522，第三侧2524，和第四侧2526包括布置成与第一侧2520的图案不同的几何图案的基准标志物。在一些实施方式中，第一阵列2504a、第二阵列2504b、第三阵列2504c和第四阵列2504d(如图29a所示)各自具有由基准标志物形成的不同框架(注意，图29a中未显示第二、第三和第四阵列的框架的不同特征)，这使得各个阵列能够基于其对应的基准标志物框架的图案几何形状而被区分。[1627]在一些实施方式中，单个框的每一侧包含基准标志物的独特图案，该图案使特定侧与框中的其他侧自动区分，以便于确定阵列方向。可以由人类用户手动地识别各个侧或将其彼此区分开来，或者可替换地，通过捕获框的图像并使用执行基于软件的指令的电子处理器分析图像中的基准标识以将基准标识的特定图案与特定侧相关联，可以自动地识别单独侧或将其彼此区分开。在一些实施方式中，基准标志物2932的图案包括多个重复的图案区段，使基于软件的图案识别更容易，甚至一些基准标志物被生物样品遮挡时也是如此。[1628]形成框的基准标志物的图案可以进一步包括框的角部中的图示符，如图29b‑c所示。第一图示符2512显示为矩形形状并且可以定位在第一侧2520和第四侧2526之间的角中。此外，第二图示符2514显示为具有填充的六边形形状并且可以定位在第一侧2520和第二侧2522之间的角中。类似地，第三图示符2516显示为三角形形状，并且可以位于第四侧2526和第三侧2524之间的角中。第四图示符2518显示为具有空的六边形形状并且可以位于第二侧2522和第三侧2524之间的角中。虽然图29b‑c中说明的图示符具有用于说明目的的特定图案，但是应当理解，通常，对应于基准标志物的任何特定图案或形状的图示符可以定位在基材上的任何位置。图中所示的示例绝不意在暗示限制。[1629]一般来说，“图示符”是形成几何形状的基准标志物的独特图案。此类形状的示例包括但不限于圆形、沙漏形、六边形、正方形、矩形、三角形、五边形、七边形、八边形、九边形、十边形、椭圆形、规则多边形和/或任何其它规则或不规则形状。图示符也可以对应于上述任何形状的组合。图示符可以进一步对应于“空”或“填充”形状。[1630]在一些实施方式中，可以在图像(例如，亮场显微镜图像)中观察图示符，并由人类用户在手动分析过程中识别。在一些实施方式中，形成图示符和框架的基准标志物可以包括着色剂或标签(包括上述任何标签)，其允许定义图示符或框架的基准标志物的图案在有或没有放大倍数(例如，在光学显微镜中)辅助的情况下对肉眼可见。在某些实施方式中，基准标志物可以包括一种或多种荧光物质，从而使得图示符和框架可以被入射光激发并且可以观察和成像来自基准标志物的荧光发射。[1631]在一些实施方式中，一个或多个基准标志物2532可以印刷或沉积在基材的表面上。例如，在一些实施方式中，可以使用接触或非接触印刷来印刷一个或多个基准标志物2532。在另一示例中，一个或多个基准标志物2532可以光刻制造。在一些实施方式中，制造的基材具有暴露在表面上的羧基，并且基准标志物包括反应性化学基团(例如，胺基团)，其与基材表面上的所需官能团形成共价键。[1632]在一些示例中，一个或多个基准标志物2532包括金属纳米颗粒。合适的金属纳米颗粒包括但不限于金纳米颗粒。在一些实施方式中，金属纳米颗粒的平均直径为5nm至1微米(例如，10nm至1微米，20nm至1微米，20nm至800nm，20nm至600nm，20nm至400nm，30nm至100nm)。[1633]在一些实施方式中，用涂层材料涂覆金属纳米颗粒。合适的覆层材料包括例如多种聚合物材料。在一些实施方式中，金属纳米颗粒可连接至聚合物配体。例如，在图29c中，金纳米颗粒2530联接至具有约50nm长度的聚合物配体。[1634]与金属纳米颗粒相连的聚合物配体，以及金属纳米颗粒本身，可以以各种方式官能化。与金属纳米颗粒相连的聚合物配体以及金属纳米颗粒本身可以通过多种方式进行功能化。在一些实施方式中，金属纳米颗粒(例如，金纳米颗粒2530)可以用在其末端具有羧酸基团的化合物官能化，该羧酸基团能共价附接至与涂覆的金纳米颗粒2530相关联的胺基团。此外，在一些实施方式中，金属纳米颗粒是荧光的。[1635]在一些实施方式中，基准标志物由诸如铬的金属材料形成，并且可以通过使用化学沉积来施加。例如，可以将离散标志物的图案或包含金属(例如铬)的薄膜/层电镀到基材上，从而为基材上的各个阵列建立可见框架。在一些实施方式中，基准标志物被激光蚀刻到基材的表面上。在某些实施方式中，基准标志物由tubewritertm360墨水、永久性标记墨水、钢笔墨水、喷墨打印机墨水或其组合形成。在一些实施方式中，基准标志物由有色和/或荧光微球或微珠形成。[1636]在一些实施方式中，基准标志物由胺官能化氧化铁纳米颗粒形成。在一些实施方式中，基准标志物由胺官能化的铥掺杂上转换纳米磷光体形成。在一些实施方式中，基准标志物由胺官能化的量子点形成，例如但不限于基于镉的量子点。在一些实施方式中，基准标志物包括比色标记物，例如荧光寡核苷酸(例如，具有荧光部分的寡核苷酸)。[1637]一般来说，当在平行于基材的平面上观察时，基准标志物可以具有各种二维形状。例如，在一些实施方式中，基准标志物2532具有圆形点的形状，如图29a‑d所示。在一些实施方式中，基准标志物2532以六边形、正方形、矩形、三角形、五边形、七边形、八边形、九边形、十边形、椭圆形、正多边形或任何其它规则或不规则的几何形状提供。在一些实施方式中，框架的一些或全部基准标志物具有相同的形状。在一些实施方式中，框架的一些基准标志物具有第一形状，并且一些基准标志物具有不同于第一形状的第二形状。[1638]在一些实施方式中，基准标志物可以围绕阵列的全部或部分。在一些实施方式中，基准标志物可以完全包围阵列。或者，在一些实施方式中，基准标志物可以不完全包围阵列(例如，可以仅包围阵列的部分)。在一些实施方式中，基准标志物识别阵列的角或其它特定部分，例如阵列的中心。[1639]在一些实施方式中，形成框架的基准标志物的平均最大横截面尺寸为50微米至500微米(例如，50微米至400微米、50微米至300微米、100微米至500微米、100微米至300微米)。[1640]在一些实施方式中，基准标志物的排列方式使得一个基准标志物的中心距阵列周围最近的下一个基准标志物的中心在100微米和200微米之间(例如，在110微米和190微米之间，在120微米和170微米之间，在120微米和150微米之间)。[1641]在一些实施方式中，具有周围基准标志物的阵列在基材上具有10mm或更小(例如，8mm或更小、6mm或更小、5mm或更小、4mm或更小、3mm或更小)的最大尺寸。在一些实施方式中，阵列是边长为约8mm的正方形或矩形阵列。[1642]在一些实施方式中，基准标志物可存在于基材上以提供生物样品的取向。在一些实施方式中，微球可耦合至基材以帮助生物样品的定向。在一些示例中，耦合至基材的微球可产生光信号(例如，荧光)。在另一实例中，微球可以特定图案或设计(例如六角形图案)附接于阵列的部分(例如角部)，以帮助生物样品在基材上的特征阵列上的取向。[1643]在一些实施方式中，基准标志物可为固定化分子，可检测信号分子可与之相互作用以产生信号。例如，标志物核酸可连接或耦合到当接受特定波长(或波长范围)的光时能够发出荧光的化学部分。这种标志物核酸分子可以在组织样品染色之前、同时或之后与阵列接触，以使组织切片可视化或成像。尽管不是必需的，但是使用可使用用于检测标记的cdna的相同条件(例如成像条件)来检测的标志物可能是有利的。[1644]在一些实施方式中，包括基准标志物以促进组织样品和基材(例如，玻璃载玻片)或其图像相对于固定在基材上的捕获探针的定向和定位。可以使用任何数量的用于对阵列进行标识的方法，使得仅当对组织切片成像时才可检测到基准标志物。例如，分子，例如产生信号的荧光分子，可以直接或间接地固定在基材的表面上。[1645]在一些实施方式中，基准标志物可以随机地位于基材表面上。例如，含有荧光团的寡核苷酸可在基材上的随机位置随机印刷、压印、合成或附接到基材(例如载玻片)上。组织切片可与基材接触，使得含有荧光团的寡核苷酸接触或接近来自组织切片的细胞或细胞的组分(例如，mrna或dna分子)。可以获得基材和组织切片的图像，并且可以确定荧光团在组织切片图像中的位置(例如，通过回顾覆盖有荧光团检测的组织切片的光学图像)。[1646]在一些实施方式中，基准标志物可以施加到在基材上的已知选择位置。例如，可以在基材上压印、附着或合成基准标志物。获得包括基准标志物的基材的图像，并且基准标志物在基材上的位置可以通过观察所述图像来定性地确定，和/或通过测量基准标志物在所述图像中的位置来定量地确定。[1647]如上所述，单个基材(例如，载玻片)可包括多个成框阵列，其中至少一个框具有使特定阵列与基材上的其他阵列区分的独特图案。特别地，与其它框架相比，至少一个框架的基准标志物的图案可以包含轻微的变化。例如，图30示出由第一框3010包围的第一阵列3002、由第二框3012包围的第二阵列3004、由第三框3016包围的第三阵列3006和由第四框3014包围的第四阵列3008。在一些实施方式中，基准标志物图案中的特定基序可在框与框之间变化，以便区分同一载玻片内的个体阵列。如图30所示，对应于框3010中的第一顶部基序3018a的区域可通过改变基准标志物在框3012、3014和3016的对应区域的数量而不同。通过这样的方式，第二顶部基序3018b、第三顶部基序3018c和第四顶部基序3018d包括可用于区分各个阵列的独特的、可区分的基准标志物图案。[1648]在一些实施方式中，可以改变框和/或图示符的任何一个或多个侧面内的一个或多个其他区域，以在每个阵列内生成基准标志物的独特图案。例如，第一侧基序3020a、第二侧基序3020b、第三侧基序3020c和第四侧基序3020d可以包括除了每个框的顶部基序的基准标志物的独特图案之外的或作为每个框的顶部基序的基准标志物的独特图案的替代品的基准标志物的独特图案。基准标志物图案化的这种变化可以允许用户和/或分析软件确定四个阵列中的哪一个正在被扫描和/或评估。在一些实施方式中，终端用户和/或分析软件还可以确定阵列是否在方向上“移动”(例如，围绕与基材平面正交或平行的轴旋转)，从而允许校正样品分析进行之前的阵列旋转。[1649]vii.使用控制载玻片和基材的方法[1650]在一些实施方式中，本文所述的控制载玻片和基材可用于调整成像设备或系统的设置的方法中。在一些实施方式中，本文所述的基材可用于校准成像设备或系统的方法中。在一些实施方式中，本文所述的基材可用于评估显微镜的成像分析兼容性的方法。即，在一些实施方式中，基材阵列可以被设计成建立基线荧光条件，用户可以参考该基线荧光条件来进行本文所述的生物样品的基于空间阵列的分析的cdna足迹观察。在一些实施方式中，成像设备或系统是独立显微镜(例如nikon、zeiss、olympus或leica)或载玻片扫描仪(例如hamamatsu、leica、zeiss或innopsys)。[1651]在第一步骤中，该方法可以包括将基材加载到成像设备的台架上。在下一步骤中，所述方法可包括识别包括多个基准标志物的框架，所述基准标志物布置在基材的表面上。例如，用户(例如人类用户)可启动白光向基材上的传输，并且在亮光显微镜下检测框架。在下一步骤中，所述方法可包括使基材经历激发波长。例如，该方法可以包括照射基材或使基材暴露于第一波长的辐射。在一些实施方式中，激发波长为约488纳米(nm)至约768nm(例如，约488nm至约525nm、约531nm至约577nm或约568nm至约668nm)。在一些实施方式中，激发波长为约554nm。在一些实施方式中，激发波长为约618nm。在一些实施方式中，激发波长为约488nm。[1652]接着，所述方法可包括检测由设置在由框架限定的周界内的表面上的阵列发射的发射波长。例如，该方法可以包括测量由基材阵列发射的光。在一些实施方式中，阵列包括多个荧光标志物。在一些实施方式中，阵列包括具有第一浓度和第二浓度的荧光探针。在一些实施方式中，第一和第二浓度不同。接下来，所述方法可以包括在目标对象的视觉表示上验证多个荧光标志物的存在或不存在，其中所述目标对象的视觉表示包括至少两个正交空间维度中的相对维度信息。在一些实施方式中，目标对象是基材阵列。如本文所用，术语“图像”可定义为由光学装置(例如透镜或镜子)或电子装置产生的目标对象的光学对应物。接下来，所述方法可以包括基于图像的定性分析来调节显微镜的参数。[1653]在一些实施方式中，用户可以查看基材(例如，基材2400)的图像并调节成像设备或系统的参数(例如，过滤器、曝光时间、激发光强度和/或增益)，从而使得十个“点”(例如，荧光标志物2426a‑2426i)中的十个在限定的通道处可见。在一些实施方式中，如果全部十个点都可见，则用户具有基线以参考并相应地调节，以观察cdna足迹。或者，在其它实施方式中，如果用户无法识别十个点(例如，荧光标志物2426a‑2426j)中的十个，那么这表明用户的成像系统可能难以观察cdna足迹。[1654]viii.采用用于成像的基材和控制载玻片的系统[1655]在一些实施方式中，本文所述的控制载玻片和基材可用于调节或优化成像设备或成像系统的设置的系统中。在一些实施方式中，本文所述的控制载玻片和基材可用于校准成像设备或成像系统的系统中。例如，校准系统可以是自动化系统，其检测本文所述的基材的图像并基于可测量的因素(例如，荧光发射强度)自动调节参数。[1656]在一些实施方式中，所述系统包括阵列，所述阵列还包括设置在基材表面上的多个荧光标志物。在一些实施方式中，多个荧光标志物包括在第一激发波长具有第一荧光发射的第一部分和在第二激发波长具有第二荧光发射的第二部分。在一些实施方式中，第一荧光发射不同于第二荧光发射。在一些实施方式中，多个基准标志物以框架图案布置在表面上，形成围绕阵列的周界。在一些实施方式中，所述系统包括计算装置，所述计算装置包括操作性地联接到显微镜的处理器。在一些实施方式中，计算装置包括具有计算机程序的非暂时性计算机可读存储介质，所述计算机程序包括可由处理器执行的指令。在一些实施方式中，指令使处理器：生成包括至少两个正交空间维度中的相对维度信息的目标对象的视觉表示。在一些实施方式中，指令使处理器基于对象的视觉表示来调节显微镜的参数。在一些实施方式中，指令使处理器生成目标对象的视觉表示的定性和/或定量分析。在一些实施方式中，目标对象包括至少一种框架图案和至少一种荧光阵列。[1657]成像测试载玻片的大小、定位和方向与基因表达载玻片和组织优化载玻片一致。最左边的四个区域对应于基因表达载玻片，而所有八个区域对应于组织优化载玻片。用户可以将这些排列用作模板，用于调整扫描区域、位置、采集分辨率、放大倍数、曝光质量等。这些参数可以在执行实际基因表达和组织之前预先设置和预先建立优化实验。用户可以确保捕获的区域将完全包含基准框，并且最终图像的拼接是合适的，以便整个框架是直的，并且个体点是对准的。利用该方法，用户也能使成像系统自动化以在实验之前捕获多个捕获区域和/或多个载玻片。[1658]本文提供的装置可用于确保在样品制备和/或分析方案期间均匀且一致地控制基材和支持在基材表面上的任何样品和/或试剂的温度。在此类方案中，加热不均会导致样品制备失败。此外，即使样品加热相对均匀，接触样品的冷凝也可能会损害作为方案部分的某些反应，或以其它方式影响发生的化学反应。在各种实施方式中，所描述的装置提供基材的多个表面(例如，在载玻片盒或基材保持器中)的加热，并且可以包括能够促进从加热元件到基材的热传递的特征，并且可以减少或防止在基材的某些区域(例如，在样品孔或基材表面上的区域)中形成冷凝。[1659]一般地参考图31‑43，用于加热基材的系统3102可以包括板3110和基材保持器3150。板3110可以被配置为能被加热装置(例如，热循环仪)接收并且在加热装置和基材保持器3150之间提供热传递。基材保持器3150保持一个或多个基材(例如一个或多个显微镜载玻片)，并且可以可移除方式连接到板3110以促进从板3110到一个或多个基材的热传递。[1660]参考图32和33，板3110可以包括具有第一表面3314和第二表面3216的平台3212。板3110还可包括从第一表面3314延伸的多个构件3318。在一些实施方式中，板3110可包括一个或多个支持构件3220。[1661]板3110通常由导热材料形成，以促进加热装置和基材保持器3460之间的热传递。在一些实施方式中，板3110可由金属制成，例如(但不限于)铝和/或不锈钢。[1662]通常，平台3212被配置为能被加热装置接收。更具体地，平台3212通常被配置为使得在加热装置的加热元件和平台3212之间能够发生热传递。传递到平台3212的热量然后被进一步传递到基材，如下文将更详细地讨论的。[1663]多个构件3318的尺寸可设计成由加热装置的不同区域接收。例如，在一些实施方式中，多个构件3318的尺寸可被设计成被接收在热循环仪的各个样品孔中(例如，热循环仪孔的尺寸通常被设计成接收例如200μl管的小体积试管)。通常，平台3212可以包括任何数量的构件3318。例如，在一些实施方式中，平台3212包括4个到96个构件。通常，当构件3318的数量更大时，热量被更均匀地传递到平台3212，并且它们在表面3314上分布相对均匀。[1664]支持构件3220可以从平台3212延伸并且被配置为联接到基材保持器3150。在一些实施方式中，支持构件3220可以包括一个或多个凹部或凸部，所述凹部或凸部联接到基材保持器3150上的一个或多个互补凸部或凹部，以帮助将基材保持器3150联接到板3110。在一些实施方式中，支持构件3220可以完全由基材保持器3150的部分接收。在一些实施方式中，支持构件3220的部分可以被基材保持器3150的部分接收。在一些实施方式中，支持构件3220在顶面上可以是基本上平坦的。在一些实施方式中，支持构件3220的尺寸和定位可以使得板3110可以包括多个支持构件3220。例如，在一些实施方式中，板3110可以包括两个支持构件3220。[1665]一般地参考图34‑43，基材保持器3150可以包括底部构件3460和顶部构件3480。在一些实施方式中，基材保持器3150还可包括载玻片3452。在一些实施方式中，基材保持器3150可包括衬垫3454(也参见图41)。[1666]参考图35和36，底部构件3460可包括基部3562、第一侧壁3566和第二侧壁3568。底部构件3460可以被配置为安装载玻片52。[1667]在一些实施方式中，基部3562可包括标志物3564。标志物3564可以帮助以特定取向联接底部构件3460和顶部构件3480。例如，在一些实施方式中，底部构件3460和顶部构件3480可能仅能够以单一方向联接在一起。在一些实施方式中，标志物3564可以是线，沟槽，凹痕，凸部，符号，颜色等，以区分基部3562的一侧与基部3562的另一侧。[1668]第一侧壁3566和第二侧壁3568可定位在基部3562的相对纵向侧上。侧壁3566和3568可以从基部3562基本垂直地延伸。在一些实施方式中，侧壁3566和3568在基部3562的边缘上轻微偏移，从而使得基部3562的部分暴露在侧壁3566和3568两者中的任一侧上。侧壁3566和3568可以帮助将载玻片3452固定在底部构件3460中。在一些实施方式中，当载玻片3452固定在底部构件3460中时，载玻片3452可以搁置在基部3562上。在一些实施方式中，侧壁3566和3568可被配置为与顶部构件3480接合。例如，在一些实施方式中，侧壁3566和3568可包括一个或多个凹部3570。在一些实施方式中，侧壁3566可包括单个凹部3570，而侧壁3568包括多个凹部(例如，两个凹部)。这种配置可以提供底部构件3460和顶部构件3480的单向联接以便于使用。[1669]基部3562还可包括用于固定载玻片3452的装置。例如，在一些实施方式中，基部3562可以包括紧固件外壳3572和端部固定构件3574。端部固定构件3574可以帮助将载玻片3452固定在底部构件3460中。在一些实施方式中，端部固定构件3574可包括脊以限制载玻片3452远离基部3452的运动。紧固件外壳3572可为紧固件3458提供外壳(参见例如图39和40)。紧固件3458可以是夹子、脊或将载玻片3452以可移除方式联接到底部构件3460的其它装置。在一些实施方式中，紧固件3458可包括弹簧，使得将载玻片3452推靠在紧固件3458上导致紧固件3458移动经过端部固定构件3574的脊，从而允许载玻片3452进入底部构件3460。一旦载玻片3452被释放，弹簧可以将紧固件3458返回到更中间的位置，使载玻片3452邻接端部固定构件3574。[1670]底部构件3460可以包括用于联接到板3220的支持构件3220的装置。例如，在一些实施方式中，基部3562可以包括在侧壁3566和3568内延伸穿过基部3562的孔口3576。参考图37和38，底部构件3460显示为联接到板3110。在一些实施方式中，孔口3576的尺寸可设计成使得支持构件3220基本上填充孔口3576(见图37)。在一些实施方式中，孔口3576可大于支持构件3822，从而使得支持构件3220仅填充孔口3576的部分(见图38)。在一些实施方式中，支持构件3220、底部构件3460和孔口3576被配置为使得载玻片3452紧邻支持构件3220。在一些实施方式中，支持构件3220、底部构件3460和孔口3576被配置为使得载玻片3452与支持构件直接接触3220。在一些实施方式中，支持构件3220、底部构件3460和孔口3576被配置为使得载玻片3452的样品区域的部分靠近支持构件3220。在一些实施方式中，载玻片3452的样品区域的部分是样品区域的50％至100％。在一些实施方式中，样品区域的部分是样品区域的至少60％。在一些实施方式中，样品区域的部分是样品区域的至少75％。在一些实施方式中，样品区域的部分是样品区域的至少80％。在一些实施方式中，样品区域的部分是样品区域的至少85％。[1671]回转参考图34‑43，底部构件3460可以包括用于将底部构件3460联接到顶部构件3480的接合机构。在一些实施方式中，接合机构包括螺钉3496。因此，基部3562可包括一个或多个螺纹孔3578，其被配置为接收螺钉3496。基部3562的尺寸可以设计成使得螺钉3496不突出基部3562的下侧。[1672]衬垫3454可以定位在基材保持器3150内部。衬垫3454可以包括多个孔口4156(也参见图41)，其中，当衬垫3454邻接载玻片3452时，这些孔口可以产生多个孔。在一些实施方式中，衬垫3454可由橡胶、硅树脂或类似材料制成，以与载玻片3452形成密封。在一些实施方式中，衬垫3454可由疏水材料制成。因此，可以在衬垫3454的各个孔中进行不同的反应。在一些实施方式中，底部构件3460和顶部构件3480的接合产生足够的压力以维持由孔口4156产生的孔之间的分隔。[1673]参考图42和43，顶部构件3480可包括具有壁4284的主体4282。在一些实施方式中，主体4282和/或壁4284的一侧可以包括标志物4286。标志物4286可以帮助以特定取向联接底部构件3460和顶部构件3480。例如，在一些实施方式中，底部构件3460和顶部构件3480可能仅能够以单一方向联接在一起。在一些实施方式中，标志物4286可以是线，沟槽，凹痕，凸部，符号，颜色等，以区分主体4282的一侧与主体4282的另一侧。[1674]在一些实施方式中，壁4284可被配置为与底部构件3460接合。例如，在一些实施方式中，壁4284可包括一个或多个凸部4388。在一些实施方式中，第一壁4284可包括单一凸部4388，而第二壁4284可包括多个凸部4388(例如，两个凸部)。这种配置可以提供底部构件3460和顶部构件3480的单向联接以便于使用。[1675]主体4282还可包括用于将顶部构件3480联接到底部构件3460的接合机构。在一些实施方式中，接合机构包括螺钉3496。因此，主体4282可包括一个或多个螺纹孔4290，其被配置为接收螺钉3496。主体4282可被配置以使得当孔口4290接受螺钉3496时，螺钉3496的头部齐平或低于主体4282的上表面。因此，顶部构件3480可被配置以使得加热装置的顶板能够邻接顶部构件3480，以提供对基材保持器3150的加热。[1676]在一些实施方式中，主体4282可包括位于主体4282下侧的凹部4392。在一些实施方式中，凹部4392可以接收衬垫3454。在一些实施方式中，凹部4392可以可移除方式联接衬垫3454。在一些实施方式中，主体4282可包括衬垫3454，从而使得衬垫3454与主体4282成为一体。[1677]在一些实施方式中，主体4282可包括多个孔口4294。在一些实施方式中，多个孔口4294可以被配置为使得试剂能够被添加到载玻片3452上的基材。在一些实施方式中，多个孔口4294可被配置为与衬垫3454的多个孔口4156对准。在一些实施方式中，多个孔口4294可以被配置为具有能够与多通道移液管一起使用的格式和间距。在一些实施方式中，多个孔口4294可以仅位于主体4282的部分上。在一些实施方式中，主体4282可包括与多个孔口4294相邻的标记物或标记。[1678]虽然基材保持器3150被描述为包括多件(例如，底部构件3460、顶部构件3480、载玻片3452、衬垫3454等)，但基材保持器3150的部件可彼此整合。例如，在一些实施方式中，衬垫3454可以与顶部构件3480整合。又例如，顶部构件3480和底部构件3460可以是被配置为接收载玻片3452的多个单件。[1679]在一些实施方式中，基材保持器3150可由可重复使用的材料制成。例如，在一些实施方式中，基材保持器3150可经清洗和消毒以重新使用。任选地，在这样的实施方式中，衬垫3454可以是可重复使用或可更换的。在一些实施方式中，基材保持器3150可以被制成用于单次使用并且可以是一次性的。[1680]一般地参考图44‑46，装置4498的另一个实施方式可以包括基材保持器4400、衬垫3454和基材安装件，例如载玻片3452。载玻片3452包括第一表面和第二表面。在一些实施方式中，载玻片3452的第一表面可联接(或被联接)到支持构件(例如，如图32中所示的支持构件3220)。在一些实施方式中，基材保持器4400被配置为接收载玻片3452。在一些实施方式中，基材保持器4400包括附接机构以将载玻片3452联接到基材保持器4400。载玻片3452的第二表面可以提供用于接收样品的基材。在一些实施方式中，基材保持器4400是塑料部件(例如，注模塑料部件)。在一些实施方式中，衬垫3454被配置为定位在基材保持器4400和载玻片3452之间。在一些实施方式中，装置4498(或其任何一个组件)可以是一次性装置(或组件)。在一些实施方式中，装置4498完全是一次性的或至少部分地由一次性组件组成。[1681]图44a显示了处于组装状态的装置4498。特别地，图44a显示了接收衬垫3454和载玻片3452的基材保持器4400。基材保持器4400具有纵向侧4505和横向侧4407。基材保持器4400可以包括一个或多个紧固件，例如用于卡扣接合的侧面安装的压锁4410。可以使用允许可释放接合的任何类型的紧固件，例如螺钉和压配合型连接器。压锁4410可以安装在基材保持器4400的纵向侧4505，如图44a‑44c所示。或者，在一些实施方式中，压锁4410可安装在基材保持器4400的横向侧4407中。在一些实施方式中，基材保持器4400可包括两个、三个或四个压锁。压锁4410可以被配置为用于接合载玻片3452。在一些实施方式中，压锁4410可以是杠杆、夹子或夹。在一些实施方式中，压锁4410还可以包括一个或多个弹簧。[1682]基材保持器4400还可包括一个或多个接合特征，例如第一接片4412a和第二接片4412b。第一和第二接片4412a和4412b可以分别从基材保持器4498的纵向侧4505突出，该纵向侧4505与具有压锁4410的纵向侧相对。在一些实施方式中，基材保持器4498包括三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个接片。在一些实施方式中，接片从纵向侧4505或横向侧4407突出基材保持器4400。第一和第二接片4412a和4412b可被配置以接合载玻片3452。在一些实施方式中，第一和第二接片4412a和4412b是刚性的并且在接合载玻片3452时不弯曲。在一些实施方式中，接片4412a和4412b可以是柔性的。[1683]参考图44b，基材保持器4400包括底表面4401。底表面4401包括多个横向肋部4414和纵向肋部4416，其被配置为当装置4498被组装时支持载玻片3452和衬垫3454。底表面4401进一步限定多个孔口4294，当装置4498被组装时，这些孔口4294被配置为与由衬垫3454限定的多个孔口4156对准。基材保持器4400还包括c形接片4422，其形状为用户提供符合人体工程学的抓握表面以帮助促进与压锁4410的接合。[1684]参考图44c，载玻片3452包括第一表面4446、第二表面4448和侧边缘4418。当将载玻片3452插入基材保持器4400时，可首先插入侧边缘4418，使得第一和第二接片4412a和4412b在载玻片3452搁置在衬垫3454上和多个横向肋部4414上时接合侧边缘4418。在一些实施方式中，侧面4418可以测量约3英寸。在一些实施方式中，比侧面4418短的侧面可以测量约1英寸。在一些实施方式中，载玻片3452可测量约75毫米(mm)×25mm。在一些实施方式中，载玻片3452可测量约75毫米(mm)×50mm。在一些实施方式中，载玻片3452可测量约75毫米(mm)×28mm。在一些实施方式中，载玻片3452可测量约46毫米(mm)×27mm。在一些实施方式中，载玻片3452是玻璃载玻片。[1685]参考图45a，基材保持器4400包括顶表面4503。顶表面4503限定了多个孔口4294。此外，顶表面4503包括标志4502、第一标识符4504和第二标识符4506。第一标识符4504可以识别多个孔口4294的列。第二标识符4506可以识别多个孔口4294的行。在一些实施方式中，第一标识符4504和第二标识符4506是字母或数字。在一些实施方式中，第一标识符4504和第二标识符4506可以帮助将载玻片3452以特定方向对准和/或插入到基材保持器4400中。在一些实施方式中，载玻片3452可以在其表面的部分上包括与多个孔4294中的一个或多个对准的样品(例如，生物材料样品)。在一些实施方式中，样品(例如，生物材料样品)可以以与多个孔口4294中的对应孔口相同的方式识别。例如，在一些实施方式中，载玻片3452可以包括名为“a1”的样品，其对应于图45a中由第一标识符4504和第二标识符4506标记为“a1”的孔口4511。因此，在一些实施方式中，第一标识符4504和第二标识符4506引导用户将载玻片3452正确地放置到基材保持器4400中。在一些实施方式中，第一标识符4504和第二标识符4506可以是线、凹部、缩进、凸部、符号、颜色等，以区分多个孔口4294的行和列。[1686]参考图45b，基材保持器4400包括第一横向肋部4414a，第二横向肋部4414b，第三横向肋部4414c，第四横向肋部4414d和第五横向肋部4414e，其具有宽度w。多个横向肋部4414被配置为支持载玻片3452。第一、第二、第三、第四和第五横向肋部4414a、4414b、4414c、4414d和4414e可以具有相等的宽度w，如图45b所示。在一些实施方式中，多个横向肋部的宽度可以变化。第一、第二和第三横向肋部4414a、4414b和4414c分别从靠近基材保持器4400的第一端4515a的底表面4401垂直延伸。第五横向肋部4414e从靠近基材保持器4400的第二端4515b的底表面4401基本垂直地延伸。在一些实施方式中，基材保持器4400可以包括6、7、8、9、10、15、20或更多个横向肋部。[1687]基材保持器4400还包括从底表面4401基本垂直地延伸的第一纵向肋部4416a、第二纵向肋部4416b、第三纵向肋部4416c和第四纵向肋部4416d。多个纵向肋部4416被配置为向衬垫3454提供纵向支持。例如，在一些实施方式中，多个纵向肋部4416邻接衬垫3454的纵向侧。此外，连同第四和第五横肋部4414c和4414e，多个纵向肋部框住底表面4401的区域(例如，足够大小和配置以接收衬垫3454的衬垫区域)。第一纵向肋部4416a，第二纵向肋部4416b，第三纵向肋部4416c，和第四纵向肋部4416d可被设置为平行于沿侧边缘的纵向侧4505。第一纵向肋部4416a、第二纵向肋部4416b、第三纵向肋部4416c和第四纵向肋部4416d具有第二高度4426，如图44b所示。第一、第二、第三、第四和第五横向肋部4414a、4414b、4414c、4414d和4414e具有第一高度4424，如图44b所示。第一高度4424可以大于第二高度4426，如图44‑45所示。在一些实施方式中，第一高度4424等于第二高度4426。在一些实施方式中，第一高度4424小于第二个高度4426。第一和第二纵向肋部4416a和4416b具有长度l′。第三和第四纵向肋部4416c和4416d具有长度l″。长度l′可以大于长度l″，如图45b所示。在一些实施方式中，长度l′等于长度l″。在一些实施方式中，长度l′小于长度l″。在一些实施方式中，基材保持器4400可包括5、6、7、8、9、10、15、20或更多个纵向肋部。[1688]基材保持器4400还包括帮助用户定位和/或定向基材保持器4400的第三标识符4508。例如，在一些实施方式中，第三标识符4508帮助识别第一端4515a或帮助区分第一端4515a和第二端4515b。而在进一步的实施方式中，第三标识符可以是帮助用户将载玻片3452正确地定位到基材保持器4400中的线、凹部、凹痕、凸部、符号、颜色等。[1689]参考图45c，基材保持器包括第一柔性接片4513a和第二柔性接片4513b。第一和第二柔性接片4513a和4513b可以分别从与具有第一和第二接片4412a和4412b的纵向侧105相对的压锁4410的顶部4517突出。第一和第二柔性接片4513a和4513b可以从压锁4410的顶部4517的内表面45109突出。为了使用基材保持器4400，用户可以在底表面4401朝上(即，面向用户)的情况下用一只手握住基材保持器4400。接下来，用户可以将衬垫3454放置在多个孔口4294之上。接下来，用户可以用一只手压下压锁4410，这使得第一和第二柔性接片4513a和4513b在一个纵向侧4505上沿箭头a的方向弯曲打开。因此，用户可以先将载玻片3452加载到第一和第二接片4412a和4412b，然后将载玻片3452铰接进入相对的纵向侧(即，具有第一和第二柔性接片4513a和4513b的侧)。最后，用户可以释放压锁4410，从而使得载玻片3452可以卡入第一和第二柔性接片4513a和4513b。[1690]参考图46，衬垫3454包括多个孔口4156。在一些实施方式中，衬垫3454包括八个孔口。在一些实施方式中，衬垫3454包括十六个孔口。在一些实施方式中，衬垫3454包括24个孔口。在一些实施方式中，衬垫3454包括96个孔口。在一些实施方式中，衬垫3454由可承受高达约60摄氏度的温度的材料制成。在一些实施方式中，衬垫3454由耐热材料制成。在一些实施方式中，衬垫3454由柔性或柔韧材料制成。柔性或柔韧材料的非限制性示例包括橡胶、硅树脂和聚氨酯。[1691]参考图47，基材加载器4728包括限定凹部4730的第一表面4734a和第二表面4734b，凹部4730被配置为接收基材保持器4400。第一和第二表面4434a和4434b接合基材保持器4400的纵向侧4505。基材加载器4728可用作工具以帮助用户通过接合压锁4410且将基材保持器4400保持在打开位置来将载玻片3452加载到第一和第二接片4412a和4412b。基材加载器4728由足够柔顺的材料制成，其允许用户充分弯曲基材加载器4728以将基材保持器4400插入到凹部4730中。基材加载器4728还包括可以帮助弯曲基材加载器4728的槽4732。在一些实施方式中，槽4732可被配置于载玻片。[1692]图48a和48b显示了与基材保持器4400和载玻片3452一起使用的基材加载器4728。参考图48a，基材保持器4400显示为处于打开位置；即，压锁4410被基材加载器4728的第一表面4734a压下。此外，图48a显示了以一定角度且未完全插入第一和第二突片4412a和4412b中的载玻片3452。通过这种方式，用户可以将载玻片3452插入第一和第二接片4412a和4412b，而无需用手连续压下压锁4410以将其保持在打开状态。图48b显示了在其已经完全插入第一和第二接片4412a和4412b并且搁置在衬垫3454的顶部之后的载玻片3452。[1693]基材加载器在几个方面的构造和功能可以与上文讨论的基材加载器4728基本相似，但是可以不包括槽4732，如图49a、49b和49c所示。为了使用第二基材加载器4944，用户可以开始将基材保持器4400插入凹部47130中，从而使得基材保持器4400的纵向侧邻接第二表面4734b并且载玻片3452处于一定角度。接下来，用户按下基材保持器的相对纵向侧4400以将基材保持器4400完全插入到凹部47130中。因此，第一表面4734a接合压锁4410并将第一和第二柔性接片4513a和4513b向远侧撬开。接下来，用户可以用一只手或两只手将载玻片3452插入基材保持器4400，同时第一和第二柔性接片4513a和4513b被基材加载器49144向远侧拉离多个孔口4294。在一些实施方式中，基材加载器可以降低在插入基材保持器4400期间使载玻片3452断裂或碎裂的风险。[1694]参考图50a、50b和50c，基材保持器工具5036包括刀片5038和终止于尖端5040的锥形端5042。基材保持器工具5036可以帮助将载玻片3452推入基材保持器4400和/或从基材保持器4400移出载玻片3452。例如，当处于组装配置时，尖端5040可用于从基材保持器4400拾取载玻片3452。在另一个示例中，刀片5038可用于将载玻片3452向下推入基材保持器4400。在一些实施方式中，基材保持器工具5036由塑料或金属材料制成。[1695]基材保持器在结构和功能的几个方面可以与上文讨论的基材保持器4400基本相似，但是可以包括替代的载玻片加载机构，如图72‑74所示，来代替上述利用压锁4410，第一和第二柔性接片4513a和4513b，以及第一和第二接片4412a和4412b的基材加载机构(如图44‑45所示)。下面描述了示例替代基材加载机构的特征。[1696]图72a显示了具有处于组装状态的基材的又一示例基材保持器。所示基材保持器的该实施方式可有利地提供单件式部件，当需要时，该单件式部件可布置成打开配置或闭合配置。具体地，图72a显示了处于关闭位置的基材保持器7200的顶表面7293(其可以放置在加热装置的顶表面上)。类似于图44‑45所示的实施方式，基材保持器7200包括多个孔口7256。基材保持器7200的基材加载机构由第一接片7250a和第二接片7250b便利化，并且在下文更详细地描述。在一些实施方式中，可以使用允许以可释放方式接合的任何类型的紧固件或接合特征来代替第一和第二接片7250a和7250b，例如螺钉和压配合型连接器。在一些实施方式中，基材保持器7200包括5个或更少的接片(例如，4个或更少的接片、3个或更少的接片、2个或更少的接片，或1个接片)。在一些实施方式中，基材保持器7200是单一模制单元。任何合适的塑料或聚合物都可以用作合适的模塑材料。[1697]在一些实施方式中，支持性保持器7200(例如，支持装置)包括具有第一表面和第二表面的基材安装件，其中基材安装件的第二表面是被配置用于接收样品的基材。支持性保持器还可以包括基材保持器，该基材保持器包括构造成接收衬垫的第一部分，第一部分包括从基材保持器的表面延伸的多个肋部；以及第二部分，第二部分被配置为接收基材安装件，其中第一和第二部分通过铰链联接在一起，从而使得当基材保持器处于关闭状态时，第一部分被配置为折叠在第二部分上以固定基材安装件在第一和第二部分之间。在一些实施方式中，基材安装件是玻璃载玻片。在一些实施方式中，基材保持器包括设置在基材保持器的第一部分和第二部分之间的衬垫。在一些实施方式中，基材保持器的第一部分包括可释放的接合机构，其被配置为当基材保持器处于关闭状态时将第一部分固定到第二部分。在一些实施方式中，基材安装件的第一表面与从基材保持器的表面延伸的多个肋部中的至少一个接合。在一些实施方式中，第二部分限定了形成在基材保持器中的凹腔，该凹腔被配置为接收基材安装件。在一些实施方式中，第二部分限定被配置为接收基材安装件的腔。[1698]图72b显示了包括衬垫7254和接收载玻片7252的基材保持器7200的底表面7297(例如，当放置在加热装置的顶表面上时)。基材保持器7200具有纵向侧7205和横向侧7207。第一和第二接片7250a和7250b分别可以从基材保持器7200的纵向侧7205突出。在一些实施方式中，基材保持器7200是包括衬垫7254的单一模制单元。即，在一些实施方式中，基材保持器7200和衬垫7254是一个部件。在一些实施方式中，基材保持器7200是“包覆成型的(overmold)”。在一些实施方式中，基材保持器7200是第一注模塑料部件，其上模制有第二部件(例如，柔韧材料)。在一些实施方式中，柔韧材料是弹性体。在一些实施方式中，柔韧材料是硅橡胶。在一些实施方式中，衬垫7254是不与基材保持器7200一起模制的单独部件。[1699]图73a显示了处于打开位置的基材保持器7200的顶视图。基材保持器7200的打开和关闭机构是铰接的机构。基材保持器7200的底部组件7362可以通过铰链7360被铰接到基材保持器7200的顶部部件7364。在一些实施方式中，铰链7360是活动铰链。在一些实施方式中，基材保持器7200包括10个或更少铰链(例如，9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少或1个铰链)。基材保持器7200可以包括的铰链的非限制性示例包括直或平的活动铰链、蝶形活动铰链、儿童安全铰链、双活动铰链和三活动铰链。[1700]基材保持器7200还包括一个或多个接合特征，例如第一凹口7358a和第二凹口7358b。当压在一起时，第一和第二凹口7358a和7358b分别接合第一和第二接片7250a和7250b。第一和第二凹口7358a和7358b分别可以从基材保持器7200的顶部组件7364的纵向侧7205突出。在一些实施方式中，基材保持器7200包括三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个凹口。在一些实施方式中，凹口从基材保持器7200的横向侧7207突出。在一些实施方式中，第一和第二凹口7358a和7358b分别是刚性的并且在分别接合第一和第二接片7250a和7250b时不弯曲。在一些实施方式中，第一和第二凹口7358a和7358b分别可以是柔性的。[1701]图73b显示了横向侧7207的侧视图。第一和第二凹口7358a和7358b，分别可以向上突出，并包括接合接片凸缘7368的凹口凸缘7366，如图73c所示。或者，在一些实施方式中，基材保持器7200包括用于以可释放方式接收和以可释放方式固定载玻片7252的搭扣配合锁定机构。待在基材保持器7200的锁定机构中使用的其它类型的紧固件的非限制性示例包括卡扣、突出部、公连接器和母连接器。[1702]图74a和74b图示了将载玻片7252放置到基材保持器7200中。在一些实施方式中，载玻片7252可以被“加载”到基材保持器7200的底部部件7362的内缘或内边缘上。一旦加载，顶部部件7364通过将第一凹口7358a和第二凹口7358b分别压靠在第一和第二接片7250a和7250b上而被关闭，从而与载玻片7252形成紧密密封。在一些实施方式中，用户不需要在接片7250或任何其它接片下方倾斜载玻片。在一些实施方式中，基材保持器7200包括一个或多个接片以帮助将载玻片加载到基材保持器7200的底部部件7362的内缘或内边缘上。[1703]一方面，本公开描述了用于生物样品的空间分析的装置、系统、方法和组合物。组织和细胞可以从任何来源获得。例如，组织和细胞可以从单细胞或多细胞生物体(例如哺乳动物)获得。从哺乳动物(例如，人)获得的组织和细胞通常具有不同的分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)，这可导致细胞形态和/或功能的差异。细胞在组织中的位置可以影响细胞的命运、行为、形态以及与组织中其他细胞的信号转导和串扰。关于哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平(基因和/或蛋白质表达)的差异的信息也可以帮助医生基于检测到的组织中不同细胞内分析物水平的差异来选择或给予对单细胞或多细胞生物体(例如哺乳动物)有效的治疗。哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平的差异也可以提供组织(例如，健康和患病组织)如何发挥功能和/或发展的信息。哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平的差异也可以提供组织中疾病发病机制的不同信息以及组织内治疗作用机制的信息。哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平的差异也可以提供有关耐药机制以及哺乳动物组织中耐药机制发展的信息。多细胞生物体(例如哺乳动物)组织中不同细胞内存在或不存在分析物的差异可提供多细胞生物体组织中耐药性机制及其发展的信息。[1704]空间分析方法用于检测哺乳动物组织中的不同细胞内或哺乳动物的单个细胞内的分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)的差异。例如，空间分析方法可用于检测组织切片样品中不同细胞内分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)的差异，来自其中的数据可重组以生成从哺乳动物获得的组织样品的分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)的三维图，例如以一定程度的空间分辨率(例如单细胞分辨率)。[1705]发育系统中的空间异质性通常是通过rna杂交、免疫组织化学、荧光报告物、预定义的亚群的纯化或诱导以及随后的基因组概况分析(例如rna‑seq)来研究的。然而，这类方法依赖于一组相对较小的预定义标志物，因此引入了限制发现的选择偏差。这些先前的方法也依赖于先验知识。传统上，空间rna分析依赖于有限数量的rna物质的染色。相比之下，单细胞rna测序允许对细胞基因表达(包括非编码rna)进行深度概况分析，但已建立的方法将细胞从其天然空间环境(nativespatialcontext)中分离出来。[1706]当前的空间分析方法以高空间分辨率为样品中的多种分析物提供大量分析物水平和/或表达数据，例如，同时保留天然空间环境。空间分析方法包括，例如，使用捕获探针，该捕获探针包括空间条形码(例如，提供关于捕获探针在细胞或组织样品(例如，哺乳动物细胞或哺乳动物组织样品)内的位置的信息的核酸序列)和能够结合到由细胞产生或存在于细胞中的分析物(例如，蛋白质和/或核酸)的捕获域。如本文所述，空间条形码可以是具有独特序列、独特荧光团或荧光团的独特组合、独特氨基酸序列、独特重金属或重金属的独特组合，或任何其他独特可检测试剂的核酸。捕获域可以是能够结合到由细胞产生和/或存在于细胞中的分析物的任何试剂(例如，能够与来自细胞的核酸(例如，mrna、基因组dna、线粒体dna或mirna)杂交的核酸)、分析物的基材或结合伴侣，或能与分析物特异性结合的抗体)。捕获探针还可以包括与通用正向和/或通用反向引物序列互补的核酸序列。捕获探针还可包括裂解位点(例如，限制性核酸内切酶的裂解识别位点)、光不稳定键、热敏键或化学敏感键。[1707]可使用多种不同方法检测分析物与捕获探针的结合，例如，核酸测序、荧光团检测、核酸扩增、核酸连接检测和/或核酸裂解产物检测。在一些示例中，检测用于将特定空间条形码与由细胞(例如哺乳动物细胞)产生和/或存在于细胞中的特定分析物相关联。[1708]捕获探针可以例如附接在表面上，例如固体阵列、珠或盖玻片。在某些示例中，捕获探针未附接到表面。在一些示例中，捕获探针可封装于可透化组合物(例如，本文所述的任一基材)的表面内、嵌入该表面内或分层于该表面上。例如，捕获探针可被封装或布置在可透化珠(例如，凝胶珠)内。在一些示例中，捕获探针可封装于基材(例如，本文所述的任一示例性基材，例如水凝胶或多孔膜)的表面内、嵌入该表面内或分层于该表面上。[1709]在一些实施方式中，使细胞或包括细胞的组织样品与附接于基材(例如，基材的表面)的捕获探针接触，并且细胞或组织样品被透化以使分析物从细胞释放并结合到附接于基材的捕获探针。在一些示例中，可使用多种方法(例如，电泳、化学梯度、压力梯度、流体流、磁场，或被动运输(例如，扩散))将从细胞释放的分析物主动引导至附接于基材的捕获探针。[1710]在其它示例中，可使用多种方法引导捕获探针与细胞或组织样品相互作用，例如，包括捕获探针中的脂质锚定剂、包括能与捕获探针中膜蛋白特异性结合或与膜蛋白形成共价键的试剂、流体流、压力梯度、化学梯度、或磁场。[1711]例如，在2019年8月27日提交的pct专利申请号pct/us2019/048428中描述了空间分析方法的一般非限制性方面，其全部内容通过引用方式纳入本文。空间分析方法的其它非限制性方面在wo2011/127099、wo2014/210233、wo2014/210225、wo2016/162309、wo2018/091676、wo2012/140224、wo2014/060483、美国专利号10,002,316、美国专利号9,727,810、美国专利申请公开号2017/0016053、rodriques等，science363(6434)：1463‑1467，2019；wo2018/045186、lee等，nat.protoc.10(3)：442‑458，2015；wo2016/007839、wo2018/045181、wo2014/163886、trejo等，plosone14(2)：e0212031，2019、美国专利申请公开号2018/0245142、chen等，science348(6233)：aaa6090，2015、gao等，bmcbiol.15：50，2017、wo2017/144338、wo2018/107054、wo2017/222453、wo2019/068880、wo2011/094669、美国专利号7,709,198、美国专利号8,604,182、美国专利号8,951,726、美国专利号9,783,841、美国专利号10,041,949、wo2016/057552、wo2017/147483、wo2018/022809、wo2016/166128、wo2017/027367、wo2017/027368、wo2018/136856、wo2019/075091、美国专利号10,059,990、wo2018/057999、wo2015/161173、和gupta等，naturebiotechnol.36：1197‑1202，2018中描述，其各自的完整内容通过引用方式纳入本文，并且其可以任何组合用于本文中。本文描述了空间分析方法的进一步非限制性方面。[1712]样品和阵列对准装置和方法[1713]空间分析工作流程通常涉及将样品与特征阵列联系起来。在一些实施方式中，为了实现样品和阵列之间的接触，样品在第一基材(例如，载玻片)上制备并且阵列在第二基材(例如，载玻片)上制备，并且将两个载玻片靠近，从而使得第一基材上的样品与第二基材上的特征阵列对准并接触。图51是显示安装在第一基材5102上的样品5100和第二基材5106上的特征阵列5104的示意图。[1714]在某些工作流程中，对准和接触操作是手动执行的。然而，手动对准容易出现操作员误差和不一致：样品5100和特征阵列5104之间的对准操作可能不一致和/或不完美。由于多种原因，样品5100和特征阵列5104的不正确对准可能是不利的。例如，如果发生接触时样品和阵列未完全对准，则可能无法成功移出样品并尝试重新对准，并且阵列可能无法使用。对于昂贵的特征阵列，这会导致分析成本显著增加。[1715]此外，某些测定涉及通过特征阵列对样品进行成像。如果样品和阵列未正确对准，成像可能会不完美，并且可能会受到未对准引起的缺陷的不利影响。[1716]此外，许多组织样品都以存档(即载玻片封固)的形式提供。因此，依赖于将组织样品直接物理放置在特征阵列上的工作流程可能无法容纳此类样品。这将此类工作流程的适用性限制至仅为可用样品的子集。[1717]本公开的特征在于用于对准样品5100和特征阵列5104的装置和方法。所述装置和方法确保样品和特征阵列之间的正确对准和接触，从而可以以不受对准误差的系统变化的显著影响的方式进行可再现的空间分析。所述装置和方法减少了耗材浪费(即浪费的特征阵列)和成本，并且还减少了样品浪费。在一些实施方式中，特征阵列5104包括印刷点、条码化凝胶、条码化微球、凝胶膜或其任何组合。特征阵列5104也可以是探针的均匀覆层，例如在组织优化载玻片中。[1718]图52a是一个样品保持器5200的一例的示意性俯视图且图52b和52c是样品保持器5200的示意性侧视图。样品保持器5200包括第一构件5202，该第一构件5202包括第一保持机构5204，该第一保持机构5204保留具有样品5100的基材5102。样品保持器5200还包括第二构件5206，其包括第二保持机构5208，该第二保持机构5208保留具有特征阵列5104的第二基材5106。对准机构5210被连接到第一和第二构件5202和5206中的至少一个(至图52a和52b中所示的第一和第二部件5202和5206两者)。在对准和接触操作中，对准机构5210用于对准第一和第二构件5202和5206，由此确保样品5100和特征阵列5104也被对准并接触，以促进样品5100的分析。[1719]如图52a‑52c所示，在一些实施方式中，对准机构5210可以实施为连接到第一和第二构件5202和5206的旋转致动器。这种旋转致动器的一个例子是铰链。如图52b所示，一旦基材安装的样品5100定位在第一构件5202中并且基材安装的特征阵列5104定位在第二构件5206中，所述构件之一围绕铰链轴的旋转对准构件5202和5206，并且还对准样品5100和特征阵列5104。构件可以围绕铰链轴线旋转，直到，如图52c所示，样品5100和特征这列5104被对准且接触。[1720]虽然在一些实施方式中，旋转致动器可以以铰链形式实施，如图52a‑52c所示，其它实现方式也是可行的。例如，在某些实施方式中，旋转致动器被实施为折叠构件。图52d显示了示例样品保持器5200的示意性侧视图，其包括连接到第一和第二构件5202和5206的折叠构件5212。折叠构件5212以类似于上述铰链的方式起作用，对准构件5202和5206，以及样品5100和特征阵列5104。折叠构件可由多种材料形成，包括柔性材料，例如橡胶和乙烯基、金属和金属合金以及塑料。[1721]在某些实施方式中，旋转致动器5210可包括至少一个臂。图52e显示了示例样品保持器5200的示意性侧视图，其包括实施为连接到第一和第二构件5202和5206的臂5214的旋转致动器。臂5214包括内部枢转机构5216(例如，销)，其允许臂5214折叠，使构件5202和5206对准，从而对准样品5100和特征阵列5104。虽然图52e中仅显示一个臂5214，更一般地旋转致动器5210可以包括多个臂(例如，2个或更多、3个或更多、4个或更多，或甚至更多)。[1722]在上文讨论的样品保持器5200的各个示例中，样品保持器5200作为一体式(即，一件式)装置形式实施。样品保持器5200也可以作为两件式装置被实施，其中第一和第二构件5202和5206是分开的但可通过对准机构5210可重复地连接。图52f显示了两件式样品保持器5200的示例的示意性侧视图。对准机制可以以各种方式实现。在图52f中，对准机构由定位在第二构件5206上的连接器5218和定位在第一构件5202上的接收器5220组成。当第一和第二构件5202和5206接近时，连接器5218与接收器5220接合，对准第一和第二构件5202和5206，并且也将样品5100与特征阵列5104对准。应该注意的是，虽然在图52f中，连接器5218位于第二构件5206上并且接收器5220位于第一构件上5202，反过来也是可行的。此外，第一和第二构件5202和5206可以各自具有一个或多个连接器5218和一个或多个接收器5220。[1723]第一保持机构5204可以以各种方式实施。在一些实施方式中，第一保持机构5204可对应于尺寸设计成接收第一基材5102的凹部。此外，衬垫可以任选地定位在凹部内以保持凹部的边缘和第一基材5102之间的过盈配合。[1724]在某些实施方式中，第一保持机构5204可以对应于被定位以向第一基材5102施加力，特别是以保持第一基材5102和第一构件5202之间的接触的一个或多个构件。这种构件的示例包括但不限于夹子、螺钉和其它螺纹保持紧固件，以及与第一构件5202卡扣紧固或以其它方式接合的构件。构件可以将力施加到第一基材5102的样品支承表面和/或第一基材5102的一个或多个侧表面。[1725]一般而言，第二保持机构5208可对应于上文联合第一保持机构5204讨论的任何不同类型的保持机构。第一和第二保持机构5204和5208可以不同或相同。[1726]在一些实施方式中，第一构件5202包括第一孔口5222。第一孔口5222可以被定位，例如，使得当第一基材5102被保持在第一构件5202中时，第一孔口5222与第一基材5102的样品区域(例如，样品5100通常位于的区域，或被指定用于放置样品5100的区域)对准。孔口5222可以定位成使得可以从第一构件5202的后表面(即，与支持第一基材5102的表面相对的表面)通过第一孔口5222观察样品5100，并且可以通过第一孔口5222获得样品5100的一个或多个图像。[1727]如上所述，特征阵列5104可以定位在第二基材5106上。然而，更一般地，第二基材5106支持用于分析样品5100的试剂介质。在一些实施方式中，试剂介质对应于特征阵列5104。在某些实施方式中，试剂介质包括特征阵列5104和一种或多种附加组分。例如，附加组分可包括透化试剂(例如，固体、液体、凝胶或干燥的透化试剂)。作为其它例子，其它组分可以包括具有嵌入的透化试剂的水凝胶化合物或层。[1728]在一些实施方式中，第二构件5206包括至少一个孔口。图53显示了样品保持器5200的示例的示意性侧视图，其中第二构件5206包括孔口5224。更一般地，第二构件5206可包括一个或多个(例如，2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、8个或更多、10个或更多、15个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多，甚至更多)第二孔口5224。在某些实施方式中，当第一和第二构件5202和5206对准时，第二孔口5224与基材5102上的样品区域的至少部分对准。[1729]第二孔口5224可用于各种目的。在一些实施方式中，例如，特征阵列5104和/或样品5100可以通过第二孔口5224被观察或成像。例如，观察/成像可用于调节特征阵列5104和样品5100的相对位置以改进对准。[1730]在某些实施方式中，第二孔口5224的一个或多个边界表面和第二基材5106的后表面(即，与第二基材5106的面向样品5100的表面相对并且支持特征阵列5104的第二基材5106的表面)配合，以形成试剂孔。添加到试剂孔的试剂溶液5226(例如，包含透化试剂)被第二孔口5224的边界表面所包含。如果第二基材5106由可透过性或半透过性材料形成，则试剂溶液5226可以透过(例如，通过扩散)第二基材5106的背表面并接触样品5100。[1731]在一些实施方式中，样品保持器5200包括连接到第一构件5200的第一调节机构5228。第一调节机构5228在平行于第一基材的表面5102(其支持样品5100)的至少一个方向平移第一基材5102。在一些实施方式中，第一调节机构5228以平行于第一基材5102的表面的两个方向平移第一基材5102。[1732]第一调节机构5228可以以各种方式实施。在一些实施方式中，例如，第一调节机构5228包括一个或多个翼形螺钉(例如，如图52a所示)或可用于平移第一基材5102的线性致动器。[1733]除了对准第一和第二构件5202和5206之外，对准机构5210还被配置为当基材(和构件)对准时保持第一和第二基材5102和5106(以及第一和第二构件5202和5206)之间的间隔。例如，可以保持间隔以使样品5100的至少部分接触试剂介质(例如，具有试剂介质的特征阵列5104)。[1734]第一和第二基材5102和5106之间的间隔可以保持在50微米至1mm(例如，50微米至800微米，50微米至700微米，50微米至600微米，50微米至500微米，50微米至400微米、50微米至300微米、50微米至200微米、50微米至100微米)，在垂直于支持样品5100的第一基材5102的表面的方向上测量。[1735]在某些实施方式中，当基材(以及第一和第二构件5202和5206)对准时，对准机构5210将第一和第二基材5102和5106保持在近似平行的关系中。在这种情况下，第一和第二基材5102和5106之间的夹角可以是2度或更小(例如，1度或更小、0.5度或更小、0.25度或更小)。[1736]在一些实施方式中，样品保持器5200可以包括一个或多个间隔构件5230，其有助于保持第一和第二基材5102和5106的间隔和/或近似平行布置。这种间隔构件5230的示例在图52c中显示。间隔构件5230可以连接到第一和第二构件5202和5206之一或两者。[1737]在某些实施方式中，样品保持器5200包括第二调节机构5232，如图52c所示。第二调节机构5232调节第一和第二基材5102和5106之间的间隔的距离(即，以正交于第一基材的表面5102(其支持样品5100)的方向)。如图52c所示，在一些实施方式中，第二调节机构5232连接至第一构件5202和第二构件5206中的至少一个；在某些实施方式中，调节机构5232连接到构件5202和5206两者。第二调节机构5232可以是调节机构5210的一个部件，或者替代地，可以作为如图52c中所示的单独部件形式实现。[1738]第二调节机构5232可以以各种方式实施。在一些实施方式中，第二调节机构5232包括一个或多个翼形螺钉或可调节销或柱。在某些实施方式中，第二调节机构5232包括一个或多个线性致动器。在一些实施方式中，第二调节机构5232包括定位在第一和第二构件5202和5206之间的可膨胀或可扩展膜、衬垫或层。[1739]作为分析工作流程中的后续步骤，在样品保持器5200使样品5100和特征阵列5104接触之后，样品保持器5200可被引入热循环仪，以促进特征阵列5104从样品5100中捕获分析物。为此，可将样品保持器5200直接插入合适的热循环仪中。或者，在一些实施方式中，样品保持器5200可以联接到热循环仪适配器并且将联接的保持器和适配器插入到热循环仪中。适用于样品保持器5200的热循环仪适配器例如，在2019年4月26日提交的美国临时专利申请第62/839,575号中进行了描述，其全部内容通过引用方式纳入本文。[1740]样品保持器5200与用于使样品5100与透化试剂接触以促进分析物捕获的多种不同方案兼容。在一些实施方式中，透化试剂溶液直接沉积在第二基材5106上(例如，形成包括透化试剂和特征阵列5104的试剂介质)和/或直接沉积在第一基材5102上，然后样品5100与特征阵列5104接触(例如，通过关闭样品保持器5200，如图52c所示)。[1741]在某些实施方式中，在接触样品5100和特征阵列5104之前，干燥的透化试剂被施加或形成为第一基材5102或第二基材5106或两者上的层。例如，可以将试剂以溶液形式沉积在第一基材5102或第二基材5106或两者上，然后干燥。干燥方法包括但不限于旋涂试剂的稀溶液，然后蒸发包含在试剂中的溶剂或试剂本身。或者，在其它实施方式中，可以将试剂以干燥形式直接施加到第一基材5102或第二基材5106或两者上。在一些实施方式中，可以在分析工作流程之前完成被覆过程并且第一基材5102和第二基材5106可预先被覆以存储。或者，被覆过程可以作为分析工作流程的部分来完成。在一些实施方式中，试剂是透化试剂。在一些实施方式中，试剂是透化酶、缓冲液、去污剂或其任何组合。在一些实施方式中，透化酶是胃蛋白酶。在一些实施方式中，试剂是干燥的试剂(例如，不含水分或液体的试剂)。[1742]图68显示了在包括特征阵列5104的第一基材5102上使用干燥透化试剂6801的示例分析工作流程。在第一步骤6802中，可以用干燥的透化试剂6804涂覆第一基材5102。如上所述，透化试剂可以溶液形式沉积在第一基材5102上，然后干燥。或者，在其它实施方式中，透化试剂可以以干燥形式直接施加到第一基材5102上。在一些实施方式中，干燥的透化试剂6804覆盖至少包括特征阵列5104的第一基材5102的表面区域。在一些实施方式中，干燥的透化试剂6804覆盖第一基材5102的表面积，该表面积大于包括特征阵列5104的表面积。在一些实施方式中，干燥的透化试剂6804是干燥的胃蛋白酶。在一些实施方式中，干燥的透化试剂6804是干燥的透化酶、干燥的缓冲液、干燥的去污剂或其任何组合。在一些实施方式中，干燥的去污剂是干燥的辛基苯酚乙氧基化物。[1743]在第二步骤6806中，包括样品5100(例如，组织学切片)的第二基材5106被水合。可以通过使样品5100与不包括透化试剂的缓冲液6810接触来水合样品5100。在一些实施方式中，缓冲液6810是盐酸。在一些实施方式中，缓冲液6810是溶剂。在一些实施方式中，缓冲液6810是不包含任何透化试剂的透化缓冲液。例如，第二基材5106上的样品5100可以在盐酸中水合，而第一基材5102可用干燥胃蛋白酶被覆。[1744]在第三步骤6812中，可以将第一基材5102和第二基材5104布置在夹心组件中，如图68所示。当与缓冲液6810接触时，第一基材5102上的干燥透化试剂6804被溶解。在一些实施方式中，当样品5100和干燥的透化试剂6804与缓冲液6810接触时，组织透化过程开始。在透化过程中，分析物可以从样品5100中释放出来。在一些实施方式中，从透化样品释放的分析物扩散到第一基材5102的表面并被捕获在特征阵列5104上(例如，在条码化探针上)。在一些实施方式中，第一基材5102可以被放置为与第二基材5104上的样品5100直接接触，确保没有扩散空间分辨率损失。[1745]在第四步骤6814中，第一基材5102和第二基材5106分离(例如，拉开)。在一些实施方式中，可以在第一基材5102和第二基材5106分离之后，在第一基材5102上进行样品分析(例如，cdna合成)。在一些实施方式中，在第一基材5102和第二基材5106分离之后，第二基材5106可以被丢弃或存档。[1746]分析工作流程在几个方面可以与图68所示的示例分析工作流程基本相似，但可以包括在整个分析过程中控制第一和第二基材5102和5106的温度而不是不控制温度的替代方法。图69显示了分别使用样品保持器5200的温度控制的第一和第二构件5202和5206的示例分析工作流程。在一些实施方式中，使第一和第二构件5202和5206的温度降低到低于室温(例如，25摄氏度)的第一温度(例如，20摄氏度或更低、15摄氏度或更低、10摄氏度或更低、5摄氏度或更低、4摄氏度或更低、3摄氏度或更低、2摄氏度或更低、1摄氏度或更低、0摄氏度或更低、‑1摄氏度或更低、‑5摄氏度或更低)。在一些实施方式中，样品保持器5200包括温度控制系统(例如，加热和冷却导电线圈)，其允许用户控制样品保持器5200的温度。或者，在其它实施方式中，样品保持器5200的温度由外部控制(例如，通过制冷或加热板)。在第一步骤6908中，设置为或处于第一温度的第二构件5206接触第一基材5102，并且设置为或处于第一温度的第一构件5202接触第二基材5104，从而降低第一基材5102和第二基材5104的温度至第二温度。在一些实施方式中，第二温度等于第一温度。在一些实施方式中，第一温度低于室温(例如，25摄氏度)。在一些实施方式中，第二温度范围从约‑10摄氏度到约4摄氏度。在一些实施方式中，第二温度低于室温(例如，25摄氏度)(例如，20摄氏度或更低、15摄氏度或更低、10摄氏度或更低、5摄氏度或更低、4摄氏度或更低)、3摄氏度或更低、2摄氏度或更低、1摄氏度或更低、0摄氏度或更低、‑1摄氏度或更低、‑5摄氏度或更低)。[1747]包括特征阵列5104的第一基材5102与干燥的透化试剂6804接触。在一些实施方式中，第一基材5102与为凝胶或液体形式的透化试剂接触。同样在第一步骤6908中，样品5100与缓冲液6810接触。第一和第二基材5102和5106均置于较低温度下以减慢扩散和透化效率。或者，在一些实施方式中，样品5100可以直接与液体透化试剂接触，而不会由于基材处于第二温度而引起不希望的透化起始。在一些实施方式中，低温减慢或阻止透化起始。[1748]在第二个步骤6910中，将样品保持器5200和基材保持在低温(例如，在第一或第二温度)继续减慢或防止样品5100的透化。在第三步骤6912中，样品保持器5200(以及因此第一和第二基材5102和5106)被加热以开始透化。在一些实施方式中，样品保持器5200被加热到第三温度。在一些实施方式中，第三温度高于室温(例如，25摄氏度)(例如，30摄氏度或更高、35摄氏度或更高、40摄氏度或更高、50摄氏度或更高、60摄氏度或更高)。在一些实施方式中，从样品5100的透化组织释放的分析物扩散到第一基材5102的表面并被捕获在第二基材5106的特征阵列5104(例如，条码化探针)上。在第四步骤6914中，第一基材5102和第二基材5106被分离(例如，拉开)并且温度控制被停止。[1749]在一些实施方式中，其中第一基材5102或第二基材5106(或两者)包括孔，透化溶液可被引入一些或全部孔中，然后样品5100和特征阵列5104可通过关闭样品保持器5200而接触，以透化样品5100。在某些实施方式中，可将透化溶液浸入直接施加到样品5100的水凝胶膜中，和/或浸入形成特征阵列5104的特征(例如，珠)中。当样品5100和特征阵列5104通过关闭样品保持器5200而接触时，透化溶液促进分析物从样品5100迁移到特征阵列5104。[1750]在某些实施方式中，不同的透化剂或不同浓度的透化剂可被注入阵列特征(例如珠)或如上所述的水凝胶层。通过局部改变透化试剂的性质，可以在空间上调节从样品5100捕获分析物的过程。[1751]还应注意，结合任何上述透化方法，在一些实施方式中，透化剂向样品5100的迁移可以是被动的(例如，通过扩散)。或者，在某些实施方式中，透化剂向样品5100的迁移可以主动进行(例如，电泳，通过施加电场以促进迁移)。[1752]图70a‑70d显示了经历电泳透化的基材和样品5100的不同示例配置。电场“‑e”的施加导致第一分析物7002(例如，带负电的分析物)在图70a‑70d中所示的箭头方向上向第二分析物7004(例如，带正电的分析物)移动。在一些实施方式中，第一分析物7002是蛋白质或核酸。在一些实施方式中，第一分析物7002是带负电荷的蛋白质或核酸。在一些实施方式中，第一分析物7002是带正电荷的蛋白质或核酸。在一些实施方式中，第二分析物7004是蛋白质或核酸。在一些实施方式中，第二分析物7004是带正电荷的蛋白质或核酸。在一些实施方式中，第二分析物7004是带负电荷的蛋白质或核酸。在一些实施方式中，第一分析物7002是带负电荷的转录物。在一些实施方式中，第一分析物7002是多聚a转录物。在一些实施方式中，第二分析物7004是捕获探针。在一些实施方式中，第二分析物7004是与覆层7010接触的覆层。在一些实施方式中，第二分析物7004是特征阵列。在一些实施方式中，第一分析物7002朝向第二分析物7004移动距离“h”。在一些实施方式中，透化试剂7012可与样品5100、第一基材7006、第二基材7008或其任何组合接触。透化试剂7012可包括上文公开的任何透化试剂，包括但不限于干燥透化试剂、透化缓冲液、不含透化试剂的缓冲液、透化凝胶和透化溶液。[1753]图70a显示了在具有覆层7010的第二基材7008上的样品5100。如图70a所示，样品5100与第一基材7006的表面之间可存在间隙7014。在一些实施方式中，覆层7010是导电覆层。在一些实施方式中，覆层7010是氧化铟锡覆层。图70b展示另一实例配置，其中样品5100在第一基材7006上，且在样品5100和覆层7010之间存在间隙7014。图70c显示了另一示例配置，其中样品5100在第二基材7008的覆层7010上，但样品5100和基材之间不存在间隙。图70d显示了另一示例配置，其中样品5100在第一基材7006上，但是样品5100和基材之间不存在间隙。[1754]图71显示了用于样品5100的电泳透化的示例设置。第一和第二基材7006和7008可以包括导电环氧树脂7104。来自电源7102的电线7016可以连接到导电环氧树脂7104，从而允许用户在第一和第二基材7006和7008之间施加电流并产生电场。在一些实施方式中，仅第一基材7006包括覆层7010。在一些实施方式中，仅第二基材7008包括覆层7010。在一些实施方式中，第一基材7006和第二基材7008都包括覆层7010。在一些实施方式中，7102是高压电源7102。间隔体7106可以放置在样品5100附近并且在第一基材7006和第二基材7008之间，如图71所示。通过这样做，间隔体7106可以建立一个腔室，在整个电泳透化过程中，透化试剂7012包含在该腔室中。在一些实施方式中，与在不施加电场的情况下随机扩散到匹配基材上(例如，通过两个基材的手动对准)相比，电泳透化导致更高的分析物捕获效率和捕获的分析物(例如，在特征阵列上)的更好的空间保真度)。[1755]在样品保持器5200的前述描述中，如图52c所示的样品保持器5200的组装或关闭可以手动进行。或者，在一些实施方式中，样品保持器5200可以使用一个或多个电动致动器(例如，作为对准机构5210)关闭，由专用控制器或通过运行在包括一个或多个电子设备的专用或通用计算装置上的软件控制，所述通用计算装置包括一个或多个电子处理器、专用整合电路和/或专用可编程控制器。[1756]虽然第一和第二基材5102和5106在图52a中显示为具有相同的尺寸，更一般地，第一和第二构件5202和5206可以容纳不同尺寸和/或形状的第一和第二基材5102和5106。在某些实施方式中，第一和/或第二保持机构5204和5208成形为适应第一和第二基材5102和5106的特定尺寸和/或形状。在某些实施方式中，第一和/或第二保持机构5204和5208是可调节的，并且可以容纳具有不同尺寸和/或形状的基材。[1757]在一些实施方式中，第一和第二基材5102和5106在一个横向上比在另一个横向上更长，如图51所示，样品保持器5200可以被配置为接收第一和第二基材5102和5106，从而使得当样品保持器5200关闭时，基材的较长尺寸正交对准。这种布置在图54中示意性地显示。因为在图54中，第一调节机构5228允许第一基材5102平行于方向5402平移，样品5100可以定位在基材5102上的几乎任何位置并且仍然与特征阵列5104对准(通过调节第一调节机构5228)。[1758]为了确保样品5100和特征阵列5104被样品保持器5200对准，在一些实施方式中，第一基材5102和/或第二基材5106上的基准标志物可以被观察或成像(例如，通过第一孔口5222和/或第二孔口5224，且第一调节机构5228可以被调节以使得基准标志物彼此对准。[1759]即使当第一和第二基材5102和5106不包括基准标志物时，也可以调节第一和第二基材5102和5106之间的对准。图55是样品保持器5200的第一和第二构件5202和5206的示意图，各个构件包括基准标志物5240和5242(例如，边界)。第一调节机构可被调节以确保当样品保持器5200关闭时基准标志物5240和5242对准。当第一基材5102被引入第一构件5202时，第一保持机构5204被调节，从而使得样品5100与基准标志物5240对准。类似地，当第二基材5106被引入到第二构件5206中时，特征阵列5104与基准标志物5242对准。以此方式，当样品保持器5200关闭时，自动确保样品5100与特征阵列5104之间的对准。[1760]在一些实施方式中，第二基材5106可以包括用于分析多个样品的多个特征阵列5104。第一基材5102可以包括对应于样品放置位置的多个对应基准标志物5250。图56是显示与该分析方法相关联的工作流程的示意图。如图56所示，一些或全部基准标志物5250填充有样品，然后第一基材5102与第二基材5106一起安装在样品保持器5200中(包括多个对应的特征阵列5104)。当样品保持器5200关闭时，第一基材5102上的各个样品与第二基材5106上的特征阵列中的不同的一个对准。[1761]当分析物从样品5100迁移到特征阵列5104并且扩散迁移的分量(component)发生在横向(例如，侧向)方向上时(大致平行于其上安装有样品5100的第一基材5102的表面)，可能会出现空间分辨率的损失。为了解决这种分辨率损失，在一些实施方式中，可以将通过各向异性扩散沉积在或注入材料中的透化剂应用于样品5100或特征阵列5104。图57a是显示使用具有各向异性扩散的材料的示例分析工作流程的示意图。第一基材和第二基材5102和5106由样品保持器5200对准并接触。包括注入各向异性材料的透化溶液的透化层位于第二基材5106上。[1762]图57b是说明分析物从样品5100到特征阵列5104的流动的示意图。分析物只能通过在透化剂承载层5702中形成的某些通道迁移到特征阵列5104。结果，分析物的横向扩散——否则会在没有透化剂承载层5702的情况下发生——显著减少。图57c显示了形成在透化剂承载层5702中的单个通道的放大示意图。样品5100中的分析物被限制为通过通道迁移，没有从通道向外扩散，朝向特征阵列5104。[1763]在一些实施方式中，特征阵列5104可以构建在灌注有透化剂的水凝胶层顶上。水凝胶层可以安装在第二基材5106上，或者，水凝胶层本身可以用作第二基材5106。图58显示了安装在水凝胶层5802顶上的示例特征阵列5104。当第一和第二基材5102和5106对准时，透化剂扩散出水凝胶层5802并穿过或围绕特征阵列5104到达样品5100。来自样品5100的分析物迁移到特征阵列5104。特征阵列5104和样品5100之间的直接接触有助于减少分析物的横向扩散，减轻在分析物的扩散路径更长时会发生的空间分辨率损失。[1764]在一些实施方式中，在样品5100和透化剂之间的初始接触之后，透化剂可以在短于样品5100完全透化的时间的时间之后从与样品5100的接触中移开(例如，通过打开样品保持器5200)。实际上，只有部分样品5100被透化，并且只有部分样品5100中的分析物可以被特征阵列5104捕获。[1765]然而，由于样品5100的不完全透化导致横向扩散的减少，可以抵消捕获和可用于检测的分析物的减少的量。一般而言，测定的空间分辨率由分析物在横向方向(即，与样品5100的表面的法线方向正交)的扩散程度确定。样品5100和特征阵列5104之间的距离越大，横向扩散的程度越大，从而造成分辨率损失。分析物仅从最靠近特征阵列5104的样品5100的上部释放具有较短的扩散路径，因此不会像来自样品5100的离特征阵列5104最远的部分的分析物那样横向扩散。结果，样品5100的不完全透化(通过减少透化剂和样品5100之间的接触间隔)可用于在测定中保持足够的空间分辨率。[1766]信息标记物[1767]如本文所用，术语“信息标记物”通常是指贴在固体支持物如载玻片上的一张印刷纸、塑料、乙烯基或其它包含书面或印刷信息的材料。在一些实施方式中，直接印刷在固体支持物或产品上的信息被认为是信息标记性的。在一些实施方式中，信息标记物提供关于产品或物品的信息。此外，信息标记物还可用于标识、信息、警告、使用说明、环境建议或广告的任意组合。它们可能是贴纸、永久或临时标记物或印刷包装。[1768]在一些实施方式中，信息标记物可以通过热活化粘合剂附接。热活化粘合剂在常温下不会粘合，但一旦加热到一定温度，化学物质就会被激活以形成粘合。在一些实施方式中，热活化粘合剂需要在升高的温度(通常为180°f或更高)下经过一段确定的时间以达到最终的粘合强度。它们可用于粘合多种材料组合(例如，塑料、金属和木材)。从热源激活后，热活化的粘合剂可以经历两个阶段，第一阶段发生在热活化和粘合发生后几秒钟内，粘合剂开始冷却，第二阶段发生在粘合剂开始冷却、化学物质开始结晶后，显著增加了材料的粘合强度。[1769]在一些实施方式中，信息标记物可以通过压敏粘合剂附接。压敏粘合剂是一种非反应性粘合剂，当施加压力以将粘合剂与被粘物粘合时形成粘合。在一些实施方式中，不需要溶剂、水或热来活化粘合剂。粘合程度受用于将粘合剂施加到表面的压力量的影响，而表面因素如光滑度、表面能和污染物的去除对于正确粘合也很重要。压敏粘合剂通常设计用于形成粘合并在室温下正确保持。然而，它们会在低温下降低或失去粘性，并在高温下降低其剪切保持能力。[1770]在一些实施方式中，信息标记物可以通过静电粘附来附着，其中静电粘附标记物具有静电荷，使它们能够在没有化学粘合剂的情况下粘附到光滑且无孔的表面，例如玻璃。静电粘附标记物可以由薄塑料薄膜(例如，非邻苯二甲酸酯、聚乙烯、烯烃、聚烯烃、聚丙烯、聚氯乙烯)制成，并且由于它们不含粘合剂，因此可以很容易地移除、重新定位和重复使用。这些材料附着在最光滑的光滑表面上，例如玻璃、光滑的塑料和闪亮的金属。在一些实施方式中，静态粘附标记物在被压到类似的内聚力或表面上时以类似微型吸盘的模式作用。材料的两面都能够粘附在无孔表面上。[1771]在一些实施方式中，信息标记物是永久性的。在一些实施方式中，信息标记物是可移除的。有许多不同类型的可移除粘合剂，有些几乎是永久性的，有些非常容易去除。可移除信息标记物在正常情况下不会脱落，但是信息标记物可以相对容易地移除而不会损坏或在固体支持物上留下粘合剂。在一些实施方式中，容易移除的信息标记物主要设计用于超光滑的无孔表面，例如玻璃，并且当移除这些粘性信息标记物时，不会留下任何残留物。[1772]带有印刷指引的信息标记物旨在帮助用户将组织放置到载玻片上。基准标志物(例如，点、数字和字母)可以为载玻片上印刷的阵列位置提供视觉指引。点可以指示阵列的中心，而数字和字母可以标识个体孔。在一些实施方式中，带有印刷指引的信息标记物通过以载玻片和其它表面之间的物理屏障模式作用来减少表面污着，并减少与低温恒温器表面的直接接触。在一些实施方式中，信息标记物是一次性的。[1773]在一些实施方式中，信息标记物可以是透明的。信息标记物可能具有用墨水(例如，白色墨水、黑色墨水、彩色墨水或荧光墨水)印刷的印刷指引。在一些实施方式中，信息标记物可以使用热印刷来印刷，该热印刷使用热量将印记转移到信息标记物上。在一些实施方式中，蚀刻可用于在信息标记物上印刷指引。信息标记物的纹理可以通过在信息标记物表面印刷不同的图案来改变。在一些实施方式中，信息标记物具有哑光饰面。在一些实施方式中，信息标记物具有光泽饰面。信息标记物的内部可以有孔洞或切口。在一些实施方式中，信息标记物占据所有固体支持物。在一些实施方式中，信息标记物占据固体支持物的部分。在一些实施方式中，信息标记物能够具有导热性和导电性。在一些实施方式中，信息标记物能够导热。在一些实施方式中，信息标记物能够导电。在一些实施方式中，信息标记物包含元数据。元数据的非限制性示例包括组织放置指引、阵列/孔标识、载玻片标识条形码、载玻片方向、失效日期、载玻片类型、载玻片尺寸或其它用户指令。在一些实施方式中，可以使用固定装置将载玻片保持在适当位置以施加信息标记物并防止损坏载玻片。使用这种固定装置来施加信息标记物可以在将信息标记物施加到载玻片时减少表面污迹。[1774]实施例[1775]实施例1[1776]为了评估使用样品保持器5200的不同透化方案，进行了一系列实验。在第一个实验中，将透化溶液施加到第二基材5106的表面，并且使第一和第二基材5102和5106对准，从而使得样品5100接触特征阵列5104，并且透化溶液扩散到样品5100中，促进释放来自样品5100的分析物。分析物被阵列5104捕获。共使用20μl4x透化溶液，在37℃下进行透化和分析物迁移6分钟。[1777]在打开样品保持器5200和拆卸第一和第二基材5102和5106之后，对两个基材进行成像。图60a是用苏木精和伊红(h&e)染色的组织学切片的明场图像。图60b和60c分别是第一基材5102和第二基材5106的组织样品的组织切片的图像。图60d是显示图60b和60c的图像的比较信号强度的图，关于图61b和61c将在下文进行讨论。[1778]图61a是用h&e染色的另一个组织学切片的明场图像。图61b和61c分别是透化和分析物迁移后第一基材5102和第二基材5106的组织样品的另一个组织切片的图像。图61d是显示图60b和60c，以及61b和61c的图像的比较信噪比(snr)的图。[1779]从这些结果可以明显看出，可以从第一和第二基材5102和5106两者获得样品图像，虽然从第一基材5102获得的图像比从第二基材5106获得的图像明显更亮。这可能表明需要增加样品5100的透化。观察到空间分辨率的损失，尽管这种影响并不严重。[1780]在另一个实验中，阵列特征(凝胶珠)浸泡在透化溶液中，并且特征阵列5104和样品5100对准并接触以促进分析物从样品5100迁移到特征阵列5104。图62是说明与该实验相关联的工作流程的示意图。不存在流体渗透层；透化剂扩散出珠并进入样品5100。对于相对较短的透化和分析物捕获间隔，扩散损失显著减少。[1781]在另一实验中，将浸泡在透化溶液中的150μm厚的水凝胶膜6302应用于样品5100的表面，并且在37℃下进行透化和分析物捕获6分钟。图63是说明与该实验相关联的工作流程的示意图。透化剂从膜6302扩散到样品5100。[1782]图64a显示了一系列不同的分析的组织样品的图像(如图63所示)。上行中的图像是明场组织学图像，而下行中的图像是第一和第二基材5102和5106的图像。图64b是显示下行图像之间的比较信号强度的图。[1783]这些结果表明样品5100可以成功地被水凝胶膜6302透化，并且虽然膜6302的厚度约为150微米，然而甚至更薄的水凝胶膜也可能用于样品5100的透化。[1784]实施例2‑使用带有印刷指引的可移除信息标记物进行组织切片放置[1785]在非限制性示例中，带有印刷指引的可移除透明静态粘附信息标记物(例如，图65中所示的示例性标记物)提供用于印刷阵列位置和组织切片放置的视觉指引。信息标记物上的印刷指引包括指示阵列中心的点和围绕个体微阵列的框，其中一张载玻片包括多个微阵列。用户使用打印的指引在印刷的盒内定向和放置组织切片，从而将组织切片放置在阵列上。如果载玻片包含多个微阵列，则用户能够在载玻片上放置多个组织切片，其中各个组织切片都在印刷的盒内。然后用户对载玻片进行成像并在载玻片上进行空间转录组学。信息标记物包含元数据，包括在成像期间捕获的载玻片/阵列序列号，因此利用特定的信息标记的阵列识别特定生物样品。图66和67显示了在应用于载玻片之前清晰的静态粘附信息标记物的附加示例性变化形式。[1786]其它实施方式[1787]应理解，虽然结合具体说明描述了本发明，但上述说明旨在阐释而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书来限定。[1788]公开了系统、装置(例如，装置)、方法和组合物，其可以用于、可以结合使用、可以用于制备所公开的方法和组合物或者是所公开的方法和组合物的产品。本文公开了这些和其它系统、设备、方法和组合物，并且应当理解公开了这些系统、设备、方法和组合物的组合、子集、相互作用、组等。也即，虽然可能没有明确公开对这些系统、装置组合物和方法的各个不同的个体和集体组合和排列的具体参考，但在本文中对它们进行了具体考虑和描述。例如，如果公开和讨论了特定系统、设备、物质组成或特定方法并且讨论了许多系统，装置、组合物或方法，则系统、装置、组合物和方法的每一种组合和排列都是具体考虑的，除非具体相反地指示的情况。同样地，还特别考虑和公开了这些的任何子集或组合。[1789]其他方面、优点和改进也在下述权利要求书的范围内。当前第1页12当前第1页12
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：：4.对象组织内的细胞由于不同细胞内的不同分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)而在细胞形态和/或功能上存在差异。细胞在组织内的特定位置(例如，细胞相对于邻近细胞的位置或细胞相对于组织微环境的位置)可以影响，例如，细胞的形态、分化、命运、活力、增殖、行为以及与组织中其它细胞的信号转导和串扰。5.空间异质性先前被研究过，所述研究使用的技术仅提供完整组织或部分组织接触中的少量分析物的数据，或提供单细胞的大量分析物数据，但无法提供有关单细胞在母体生物样品(例如，组织样品)中位置的信息。6.此外，用于空间分析物数据的成像系统在分辨率和灵敏度方面具有固有的变化性。这在很大程度上归因于除成像设备的布置、各种类型的成像设备之间的差异以及各种图像采集软件之外，成像系统组件的制造商的变化性。图像质量还受到用户执行的图像采集的变化的影响。当尝试对未知荧光强度的样品进行成像或由不同经验的用户对样品进行成像时，这个问题变得更加明显。7.此外，在实验室环境中，使用各种处理方案来制备用于分析的样品。这些方案可以在试管中、在载玻片上，或更一般地，在由基材支持的样品上进行。某些方案在稳定、受控的温度下进行，以确保样品和方案试剂的保真度。其它方案涉及温度循环和其它步骤，其中以受控方式调整样品的温度。为了在方案进行期间加热样品及其支持性基材，可以使用热循环仪、加热板或其它加热装置。例如，热循环仪可以作为聚合酶链反应方案的一部分用于核酸扩增以及转录和逆转录分析序列。例如，还可以在热循环仪和其它加热装置中对样品进行受控加热，以促进用于限制酶消化和快速诊断的温度敏感反应。8.此外，可以将生物样品放置在固体支持物上以进行分析，以鉴定或表征样品内的分析物，例如dna、rna或其它遗传物质。印刷的指示可有助于改善样品在固体支持物上的放置。技术实现要素：9.用于评估成像设备和成像系统的质量和分辨率的控制载玻片、方法和系统可以使用多种基材来实现。如本文所用，术语“基材”是指具有表面的支持物(例如，载玻片、水凝胶、膜、层、多孔膜、流动池、固体材料等)。10.如本文所用的“基材”，当前面没有修饰语“化学”或“序列分析”时，是指具有至少一个表面的构件，该表面通常起到为本文所述的生物样品、分析物和/或任何其它化学和/或物理部分、试剂和结构提供物理支持。基材可由多种固体材料、凝胶基材料、胶体材料、半固体材料(例如，至少部分交联的材料)、完全或部分固化的材料和经历相变或过渡的材料形成以提供物理支持。可用于本文所述的方法和系统的基材的示例包括但不限于载玻片(例如由各种玻璃形成的载玻片、由各种聚合物形成的载玻片)、水凝胶、层和/或薄膜，膜(例如多孔膜)、流动池、比色皿、晶片、板。在一些实施方式中，基材可以任选地包括功能元件，例如凹槽、突出结构、微流体元件(例如，通道、储器、电极、阀、密封件)和各种标识，如下文将进一步详细讨论的那些。11.在本节中，描述了此类基材的示例和使用此类基材的方法。然而，应当理解，一般来说，本文讨论的各种步骤和技术可以使用各种不同的装置和系统组件来进行，并非所有这些都被明确地阐述。12.此外，本公开的各种实施方式涉及控制载玻片(controlslide)和相关基材、使用控制载玻片的方法以及优选地意在用于评估图像质量和/或分辨率的控制载玻片系统。更具体地，实施方式包括控制载玻片及其基材、方法和系统以测试和评估空间基因表达技术中使用的成像系统的质量和/或分辨率。在一些实施方式中，本文提供的控制载玻片的明显优势在于其可用于在对样品进行成像和/或分析之前评估成像系统的可行性(viability)。例如，成像系统可能足以或可能不足以以预定或要求的分辨率检测样品。可以在处理样品之前对与本公开一致的控制载玻片或基材成像以确定成像系统是否提供足够的分辨率。又例如，传统的成像采集方法(例如，在空间基因表达技术中)除了通过对样品进行成像和/或分析之外可能没有其它方法来验证分辨率，这可能相当昂贵且低效。换言之，例如，获得空间基因表达图像的常规方法无法使用户在对样品进行成像和分析之前验证图像的分辨率和/或质量。但是与本公开的实施方式一致的控制载玻片和/或基材在这种情况下可能更高效，因为它可以允许用户定性和/或定量地评估他们的成像系统的兼容性并优化他们的图像采集而不浪费实验资源。这种控制载玻片和/或基材将适于测试和/或校准各种成像设备和系统，包括不涉及空间基因表达成像和分析的系统。13.在一些实施方式中，本文提供的控制载玻片和基材的附加优点是它为用户提供成像能力以评估具有多于一种组织化学染色和/或多于一种荧光染色的样品的图像质量。例如，用户可能有包含两个或更多个荧光团的样品。因此，通过同时对包含两个或更多个荧光标志物的一个基材进行成像，用户可以评估成像系统的图像质量并对所有荧光通道的参数进行任何必要的调整。即，成像能力可以是成像设备对样品充分成像的能力。在一些实施方式中，基材的附加优点在于它通过多个基准标志物和图示符(glyph)为用户提供对基材区域的快速参考。例如，利用空间基因表达方法中使用的显微镜载玻片(例如，具有空间条码化阵列的显微镜载玻片)的用户可能能够在图像处理过程中高效地将基材区域与显微镜载玻片中的感兴趣区域(例如，包含空间条码化阵列或样品的区域)对准。因此，用户能够正确地将样品区域和/或阵列区域与基材的基材区域对准。此外，多个基准标志物允许快速识别方向和载玻片放置。因此，本公开范围内的控制载玻片和基材能够减少实验时间并改进成像系统的校准。此外，通过与基因表达载玻片匹配的基准点(fiducial)的排列和定位，用户可以使用控制载玻片作为图像采集自动化的参考。14.本文提供的装置可以为基材表面提供一致且均匀的加热。均匀加热对于确保在基材支持的样品上进行的制备反应根据既定的方案发生并达到预期的结果也至关重要。15.此外，如果在没有上盖(upperlid)的情况下加热基材，则加热至高于室温的温度会导致在封闭的基材孔的上表面上形成冷凝。冷凝会改变基材孔中反应混合物的组成，抑制制备反应和/或产生不可预测的结果。本公开中描述的装置可用于减少或防止在基材孔中形成冷凝。16.某些类型的热循环仪和加热装置是专门为特定类型的基材(例如多孔基材)构建的。将其它类型的基材(例如标准显微镜载玻片)装入此类设备会导致基材加热不均匀。本公开中描述的装置可用于在并非为此类基材设计的加热装置内支持基材，确保对基材进行充分且均匀的热传递。具体地，这些装置可用于调整设计为接受多孔基材的热循环仪，以便其它类型的基材可以在热循环仪内有效加热，作为样品制备方案的部分。17.在一些实施方式中，本公开的装置允许基材的表面直接接触加热装置(例如，热循环仪)的表面，从而允许遍及基材的均匀加热。即，在一些实施方式中，不需要将其它基材或外壳元件定位在热源和待加热的基材之间。此外，由于本发明的装置允许基材的表面直接接触加热装置(例如热循环仪)的表面，因此用户可以更容易地控制基材的温度，并且，与使用不允许基材和加热装置(例如，热循环仪)之间的表面接触的装置相比，可以将基材的温度在更短的时间内加热到所需温度。因此，基材上的样品(例如，生物样品)可以被均匀且受控地加热。18.在一些实施方式中，所描述的装置的另一个优点是它们的设计可以是便于设置并减少用户在组装装置和基材时所花费的时间的一件式设计(one‑piecedesign)。在一些实施方式中，用户可以容易地将基材插入到所述装置中而无需固定多个部件。例如，用户可以使用单个可选工具，例如刀片，来帮助将基材插入装置中或帮助将基材从装置中移出。在一些实施方式中，用户不使用任何工具来帮助将基材插入装置中或帮助从装置中移出基材。19.在一些实施方式中，装置可以是可在使用后丢弃的一次性装置，从而防止由基材支持的样品(例如，生物样品)的任何污染或无菌性问题。例如，可以为用户对装置进行消毒和预包装，以降低样品污染的风险。20.本公开进一步描述了用于保持或支持基材的装置。特别地，所描述的装置包括分别接收第一和第二基材的第一和第二构件。在一些实施方式中，本公开的装置可用于将第一和第二基材夹在一起以用于空间转录组学应用。在一些实施方式中，第一基材可在其表面上支持样品(例如，生物基材)。在一些实施方式中，第二基材可包括多个条码化的探针和/或透化剂。21.所描述的用于保持或支持基材的装置还包括对准机构(alignmentmechanism)，该对准机构连接到所述构件中的至少一个并且对准所述第一构件和第二构件。因此，本公开的装置可以有利地将第一基材和第二基材对准可能在第一基材和第二基材的表面上的任何样品、条码化探针或透化剂。即，本公开的装置可以通过使第一基材和第二基材以对准方式彼此接触来促进样品(例如，生物样品)的分析。第一和第二基材的对准是空间转录组学应用中的关键，因为样品(例如，生物样品)可能需要与基材的条码化区域对准。22.在空间转录组学分析中将生物样品与条码化区域对准的当前方法涉及用户小心地将生物样品放置在包括多个条码化探针的基材上。因此，在一些实施方式中，所描述的装置的优点是为用户提供对准工具以将样品与条码化区域对准。本公开的装置可以减少测定分析过程中的用户误差，从而也降低样品分析成本。在一些实施方式中，本公开的装置的另一个优点是减少了可能由于用户在将生物样品与基材的条码化区域对准时出现的误差而产生的像差或成像缺陷的数量。在一些实施方式中，本公开的装置允许针对感兴趣区域进行样品预筛选。在一些实施方式中，本公开的装置允许检查存档的样品。23.一方面，本公开涉及一种基材，其包括设置在基材表面上的阵列。该阵列包括多个非金属荧光标志物。多个非金属荧光标志物中的非金属荧光标志物包括荧光探针。基材包括多个金属基准标志物，它们以框架图案布置在表面上，形成围绕阵列的周边。24.在一些实施方式中，金属基准标志物包括金。在一些实施方式中，金属基准标志物包括纳米颗粒。在一些实施方式中，框架图案为矩形或正方形。在一些实施方式中，多个金属基准标志物中的金属基准标志物具有至少0.1mm的尺寸。在一些实施方式中，非金属荧光标志物的最大尺寸小于0.1mm。在一些实施方式中，阵列包括第一非金属荧光标志物，其包括具有第一平均浓度的第一荧光探针，和，第二非金属荧光标志物，其包括具有第二平均浓度的第二荧光探针；其中第一平均浓度不同于第二平均浓度。在一些实施方式中，第一平均浓度为约0.01微摩尔(μm)至约100μm。25.在一些实施方式中，多个非金属荧光标志物包括在第一激发波长处具有第一荧光强度峰值的非金属荧光标志物的第一子集和在第二激发波长处具有第二荧光强度峰值的非金属荧光标志物的第二子集。在一些实施方式中，第一激发波长不同于第二激发波长。在一些实施方式中，多个金属基准标志物在第一激发波长下不发荧光。在一些实施方式中，多个金属基准标志物在第二激发波长下不发荧光。在一些实施方式中，第一激发波长为约560纳米(nm)至约610nm。在一些实施方式中，第二激发波长为约600纳米(nm)至约700nm。在一些实施方式中，多个非金属荧光标志物的第一子集在第一激发波长下发荧光，而多个非金属荧光标志物的第二子集在第一激发波长下不以可检测的方式发荧光。26.在一些实施方式中，荧光探针与寡核苷酸偶联。在一些实施方式中，荧光探针包括四甲基罗丹明(tritc)，红色荧光蛋白(dsred)，具有在约590nm处达到峰值的吸收波长的染料，花青‑3(cy3)，具有在约650nm处达到峰值的吸收波长的染料，花青‑5(cy5)，或其组合。27.在另一方面，本公开涉及包括阵列的基材，所述阵列包括布置在基材表面上的多个荧光标志物，所述多个荧光标志物包括荧光标志物的第一子集，其中第一子集的荧光标志物具有第一荧光探针，和荧光标志物的第二子集，其中第二子集的荧光标志物具有第二荧光探针。第一荧光探针不同于第二荧光探针。28.在一些实施方式中，第一荧光探针或第二荧光探针包括荧光染料、荧光蛋白或其组合。在一些实施方式中，第一荧光探针或第二荧光探针包括选自下组的荧光染料：吖啶染料、氟酮染料、花青染料、荧光素、噁嗪染料、菲啶染料、罗丹明染料，及其组合。在一些实施方式中，第一荧光探针或第二荧光探针包括选自下组的荧光蛋白：绿色荧光蛋白(gfp)、标签蓝色荧光蛋白(tagbfp)、蔚蓝(cerulean)、青色荧光蛋白(cfp)、金星(venus)、黄水晶(citrine)、黄色荧光蛋白(yfp)、单体增强型绿色荧光蛋白(egfp)、mcherry、mkate2、光活化型绿色荧光蛋白(pa‑gfp)、光活化型mcherry(pa‑mcherry)、荧光蛋白融合蛋白，及其组合。在一些实施方式中，多个荧光标志物是非金属的。在一些实施方式中，多个荧光标志物中的荧光标志物具有小于0.1mm的最大尺寸。29.在另一方面，本公开涉及包括阵列的基材，所述阵列包括设置在基材表面上的多个荧光标志物，和多个基准标志物以框架图案排列在表面上，形成围绕阵列的周界。多个荧光标志物中的荧光标志物包括荧光染料。30.在一些实施方式中，荧光染料与寡核苷酸偶联。在一些实施方式中，荧光染料选自下组：吖啶染料、氟酮染料、花青染料、荧光素、噁嗪染料、菲啶染料、若丹明染料及其组合。在一些实施方式中，荧光染料选自下组：四甲基罗丹明(tritc)，红色荧光蛋白(dsred)，具有在约590nm处达到峰值的吸收波长的染料，花青‑3(cy3)，具有在约650nm处达到峰值的吸收波长的染料，花青‑5(cy5)，及其组合。31.在另一方面，本公开涉及包括阵列的基材，所述阵列包括设置在基材表面上的荧光标志物，和多个基准标志物以框架图案排列在表面上，形成围绕阵列的周界。多个荧光标志物中的荧光标志物包括荧光探针。荧光标志物与多个基准标志物中的基准标志物之间的最小间距为至少50微米。32.在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为至少100微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为至少500微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为至少1,000微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为至少1,500微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为至少2,000微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为约50至约3,000微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为约500至约2,000微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为约1,000至约1,500微米。33.在另一方面，本公开涉及基材，所述基材包括设置在基材表面上的多个荧光标志物，和排列在所述表面上的多个基准标志物。多个基准标志物包括以第一图案排列的基准标志物的第一子集和以第二图案排列的基准标志物的第二子集。第二图案不同于第一图案。34.在一些实施方式中，多个基准标志物还包括以与表面上的第一和第二图案相邻的第三图案排列的基准标志物的第三子集。在一些实施方式中，基准标志物的第三子集是图示符。在一些实施方式中，第三图案是几何形状。在一些实施方式中，第三图案是圆形、沙漏形、六边形、正方形、矩形、三角形、五边形、七边形、八边形、九边形、十边形、椭圆形或正多边形。在一些实施方式中，第一图案形成第一侧并且第二图案形成第二侧。在一些实施方式中，第三图案形成第三侧，其中第三图案不同于第一图案和第二图案。在一些实施方式中，多个基准标志物还包括以形成第四侧的第四图案排列的基准标志物的第四子集，其中第四图案不同于第一、第二和第三图案。在一些实施方式中，排列第一侧、第二侧、第三侧和第四侧以在基材的表面上形成框架。在一些实施方式中，基准标志物的第一子集以与基准标志物的第二子集不同的周期彼此间隔开。在一些实施方式中，基准标志物的第一子集以比基准标志物的第二子集更高的周期性在基材的表面上彼此间隔开。在一些实施方式中，基准标志物的第一子集以比基准标志物的第二子集更低的周期性在基材的表面上彼此间隔开。在一些实施方式中，基准标志物的第一子集以形成二维斜格结构的三个交错行排列在基材的表面上。35.在另一方面，本公开涉及一种载玻片，该载玻片包括上述基材中的任一个。36.在另一方面，本公开涉及一种评估成像系统的成像能力的方法。该方法包括识别框架，该框架包括布置在基材表面上的多个金属基准标志物，使用第一波长的辐射照射基材，测量由布置在由框架界定的周界内的表面上的阵列发射的光，其中阵列包括多个非金属荧光标志物，其中多个非金属荧光标志物中的非金属荧光标志物包括荧光探针，和，在目标对象(object)的视觉呈现(visualrepresentation)上确定非金属荧光标志物的存在或不存在，包括至少两个正交空间维度中的相对维度信息，其中视觉呈现由成像系统基于阵列发射的光而生成。37.在另一方面，本公开涉及一种系统，该系统包括至少一个阵列，该阵列包括设置在基材表面上的多个非金属荧光标志物，其中多个非金属荧光标志物中的非金属荧光标志物包括荧光探针，以至少一个框架图案排列在表面上的多个金属基准标志物，形成围绕阵列的周界，以及计算装置，其包括操作性地联接到显微镜的处理器，以及具有计算机程序的非暂时性计算机可读存储介质，该计算机程序包括可由处理器执行的指令，使得处理器生成目标对象的视觉呈现，该目标对象包括至少两个正交空间维度中的相对维度信息，其中，目标对象包括至少一个框架图案和至少一个阵列。38.在另一方面，本公开涉及一种用于基材的支持装置，所述基材包括样品区域，所述支持装置包括板，所述板包括平台、连接到平台的第一表面的多个构件，和连接到平台的第二表面的支持构件，以及基材保持器(substrateholder)，所述基材保持器包括基材安装件(substratemount)和将基材保持器联接到支持构件的附接机构(attachmentmechanism)。基材保持器被配置为使当基材由基材安装件固定并且基材保持器联接到支持构件时，至少60％的样品区域被支持构件覆盖。39.在一些实施方式中，多个构件中的构件的尺寸被设计成能由加热装置的区域接收。在一些实施方式中，加热装置的区域包括热传递元件，该热传递元件被配置为将热量传递到多孔基材的孔。在一些实施方式中，热传递元件包括加热构件中的凹部。在一些实施方式中，多个构件在第一表面上形成二维阵列，并且多个构件间隔开以使得它们与多孔基材上的孔对准。在一些实施方式中，基材安装件包括形成在基材保持器中的凹部。在一些实施方式中，基材安装件包括至少一个紧固件，该紧固件被配置为将基材固定在凹部内。在一些实施方式中，附接机构包括被配置为能接收支持构件的孔口。在一些实施方式中，附接机构包括一个或多个延伸部，所述延伸部被配置为能与支持构件中的对应凹部接合。在一些实施方式中，样品区包括基材上的多个孔。在一些实施方式中，基材保持器包括尺寸设计成能接收衬垫的凹部。在一些实施方式中，基材保持器包括定位成使当基材由基材安装件固定时，在基材保持器和基材之间形成气密密封的衬垫。在一些实施方式中，样品区包括基材上的多个孔，并且衬垫包括多个孔口(aperature)，其中多个孔口中的孔口被定位成使当基材由基材安装件固定时，孔口与孔对准。在一些实施方式中，衬垫被配置为当基材由基材安装件固定时防止孔口之间的流体传输。40.在一些实施方式中，基材保持器包括多个孔口，其中多个孔口中的孔口与衬垫的孔口对准。在一些实施方式中，样品区域被支持构件完全覆盖。在一些实施方式中，基材保持器被配置为使当基材由基材安装件固定并且基材保持器联接到支持构件时，基材的至少部分接触支持构件。在一些实施方式中，接触支持构件的基材的部分包括样品区域的至少部分或在基材的与样品区域相对的一侧上的基材的部分。在一些实施方式中，支持件接触整个基材。在一些实施方式中，附接机构被配置为使得基材保持器以单一取向联接到支持构件。41.在一些实施方式中，基材保持器包括第一构件、第二构件和构造成将第一构件固定到第二构件的接合机构(engagementmechanism)。基材安装件位于第一构件或第二构件中。在一些实施方式中，接合机构是可调节的。在一些实施方式中，接合机构包括一个或多个翼形螺钉。在一些实施方式中，第一构件包括基材安装件，并且其中基材安装件包括形成在第一构件中的凹部。在一些实施方式中，第一构件包括至少一个紧固件，该紧固件被配置为将基材固定在凹部内。在一些实施方式中，第一构件包括附接机构，并且其中附接机构包括构造成能接收支持构件的孔口。在一些实施方式中，第二构件包括尺寸设计成能接收衬垫的凹部。在一些实施方式中，第二构件包括定位成使当基材由基材安装件固定并且第一构件固定至第二构件时，在基材保持器和基材之间形成气密密封的衬垫。42.在一些实施方式中，样品区包括基材上的多个孔，衬垫包括多个孔口，其中多个孔口中的孔口被定位成使当基材由基材安装件固定时，孔口对准孔。在一些实施方式中，当基材由基材安装件固定并且第一构件固定到第二构件时，衬垫被配置为防止衬垫孔口之间的流体传输。在一些实施方式中，第二构件包括多个孔口，其中所述多个孔口中的孔口与衬垫的多个孔口中的孔口对准。43.在另一方面，本公开内容涉及一种孵育布置在基材的样品区域上的样品的方法。该方法包括将基材安装在支持装置上，将基材和支持装置定位在加热装置中，和，启动加热装置以将热量传递给样品。该支持装置包括板，所述板包括平台、连接到平台的第一表面的多个构件和连接到平台的第二表面的支持构件，以及基材保持器，所述基材保持器包括基材安装件和将所述基材保持器联接至支持构件的附接机构。基材保持器被配置为使当基材由基材安装件固定并且基材保持器联接到支持构件时，至少60％的样品区域被支持构件覆盖。44.在另一方面，本公开涉及一种用于包括样品区域的基材的支持装置。该支持装置包括板，所述板包括平台，连接到平台的第一表面的多个构件以及连接到平台的第二表面的支持构件，包括第一表面和第二表面的基材安装件，所述第一表面联接到支持构件，以及基材保持器，所述基材保持器包括附接机构以将基材安装件联接到基材保持器。基材安装件的第二表面是用于接收样品的基材。45.在一些实施方式中，基材安装件是载玻片。在一些实施方式中，当基材保持器联接到支持构件时，至少60％的样品区域被支持构件覆盖。在一些实施方式中，当基材保持器联接到支持构件时，至少75％的样品区域被支持构件覆盖。在一些实施方式中，当基材保持器联接到支持构件时，至少90％的样品区域被支持构件覆盖。在一些实施方式中，当基材保持器联接到支持构件时，样品区域完全被支持构件覆盖。在一些实施方式中，多个构件中的构件的尺寸被设计成由加热装置的区域接收。在一些实施方式中，加热装置的区域包括热传递元件，该热传递元件被配置为将热量传递到多孔基材的孔。在一些实施方式中，热传递元件包括加热构件中的凹部。在一些实施方式中，多个构件在第一表面上形成二维阵列，并且多个构件间隔开以使得它们与多孔基材上的孔对准。在一些实施方式中，附接机构包括被配置为接合基材安装件的紧固件。在一些实施方式中，附接机构包括被配置为能接收支持构件的孔口。在一些实施方式中，附接机构包括被配置为与基材安装件接合的一个或多个凸片。在一些实施方式中，样品区包括基材上的多个孔。在一些实施方式中，基材保持器包括定位成使当基材由基材安装件固定时，在基材保持器和基材之间形成气密密封的衬垫。在一些实施方式中，样品区包括基材上的多个孔，并且其中所述衬垫包括多个孔口，其中多个孔口中的孔口被定位成使当基材由基材安装件固定时，所述衬垫的孔口对准孔。在一些实施方式中，衬垫被配置为当基材由基材安装件固定时防止衬垫的孔口之间的流体传输。在一些实施方式中，基材保持器包括多个孔口，其中基材保持器的多个孔口中的孔口与衬垫的孔口对准。在一些实施方式中，样品区域被支持构件完全覆盖。在一些实施方式中，基材保持器被配置为使当基材由基材安装件保持并且基材保持器联接到支持构件时，基材的至少部分接触支持构件。在一些实施方式中，接触支持构件的基材的部分包括样品区域的至少部分或在基材的与样品区域相对的一侧上的基材的部分。在一些实施方式中，支持构件接触整个基材。在一些实施方式中，附接机构被配置为使得基材保持器以单一方向联接到支持构件。46.在另一方面，本公开涉及用于包括样品区域的基材的支持装置。支持装置包括基材安装件，该基材安装件包括第一表面和第二表面，第一表面联接到支持构件，基材保持器包括将基材安装件联接至基材保持器的附接机构，衬垫，与基材保持器的底表面正交延伸的多个肋部，以及配置为将基材安装件固定到衬垫的接合机构。基材安装件的第二表面是用于接收样品的基材，并且衬垫位于基材安装件和基材保持器的底表面之间。47.在一些实施方式中，接合机构是可调节的。在一些实施方式中，接合机构包括一个或多个凸片。在一些实施方式中，接合机构包括一个或多个压闩。在一些实施方式中，基材保持器包括至少一个紧固件，该紧固件被配置为将基材安装件固定在凹部内。在一些实施方式中，基材保持器包括尺寸设计成接收衬垫的凹部。在一些实施方式中，称垫被定位成使得当基材保持器由基材保持器固定时，在基材保持器和基材保持器之间形成气密密封。在一些实施方式中，样品区域包括在基材安装件上的多个孔，并且衬垫包括第一组孔口，其中第一组孔口中的孔口被定位成使当基材安装件由基材保持器固定时，孔口与孔对准。在一些实施方式中，衬垫被配置为当基材安装件由基材保持器固定时防止第一组孔口之间的流体传输。在一些实施方式中，基材保持器包括第二组孔口，其中第二组孔口中的孔口与第一组孔口中的孔口对准。48.在另一方面，本公开内容涉及一种孵育布置在基材的样品区域上的样品的方法。该方法包括将基材安装在支持装置上，将基材和支持装置定位在加热装置中，和，启动并加热装置以将热量传递给样品。该支持装置包括板，所述板包括平台，连接到平台的第一表面的多个构件以及连接到平台的第二表面的支持构件，包括第一表面和第二表面的基材安装件，所述第一表面联接到支持构件，以及基材保持器，所述基材保持器包括附接机构以将基材安装件联接到基材保持器。基材安装件的第二表面包括用于接收样品的基材。49.在一些实施方式中，基材安装件是载玻片。在一些实施方式中，当基材保持器联接到支持构件时，至少60％的样品区域被支持构件覆盖。50.在另一方面，本公开涉及一种用于包括样品区域的基材的支持装置。支持装置包括基材安装件，所述基材安装件包括第一表面和第二表面，基材安装件的第二表面是配置用于接收样品的基材，基材保持器，所述基材保持器包括配置用于接收衬垫的第一部分，所述第一部分包括从基材保持器的表面延伸的多个肋部；以及第二部分，其被配置为接收基材安装件。第一部分和第二部分通过铰链联接在一起，从而当基材保持器处于关闭状态时，第一部分被配置为折叠在第二部分上以将基材安装件固定在第一和第二部分之间。51.在一些实施方式中，基材安装件是载玻片。在一些实施方式中，基材保持器包括设置在基材保持器的第一部分和第二部分之间的衬垫。在一些实施方式中，基材保持器的第一部分包括可释放的接合机构，其被配置为当基材保持器处于关闭状态时将第一部分固定到第二部分。在一些实施方式中，基材安装件的第一表面与从基材保持器的表面延伸的多个肋部中的至少一个接合。在一些实施方式中，第二部分限定了形成在基材保持器中的凹腔，该凹腔被配置为接收基材安装件。在一些实施方式中，第二部分限定被配置为接收基材安装件的腔。在一些实施方式中，第二部分限定凹腔内的开口(opening)，并且其中当基材保持器处于关闭状态时，开口暴露基材安装件的一侧的至少部分。52.在另一方面，本公开涉及一种样品保持器，包括第一构件和第二构件，所述第一构件包括第一保持机构(retainingmechanism)，所述第一保持机构被配置为保持包括样品的第一基材，所述第二构件包括第二保持机构，所述第二保持机构被配置为保持包括试剂介质的第二基材，和对准机构(alignmentmechanism)，所述对准机构连接到第一和第二构件中的一或两者，并且被配置为对准第一和第二构件，从而使得当第一和第二构件对准时，样品接触试剂介质的至少部分。53.在一些实施方式中，对准机构包括连接到第一和第二构件的旋转致动器。在一些实施方式中，对准机构包括位于第一和第二构件之一或两者上的一个或多个连接器，以及位于第一和第二构件之一或两者上的一个或多个接收器，其中一个或多个接收器被定位成与一个或多个连接器接合。在一些实施方式中，旋转致动器包括铰链。在一些实施方式中，旋转致动器包括折叠构件。在一些实施方式中，旋转致动器包括至少一个臂。在一些实施方式中，第一保持机构包括尺寸设计成接收第一基材的凹部。在一些实施方式中，样品保持器还包括位于凹部内的衬垫，所述衬垫被配置为保持凹部和第一基材之间的过盈配合(interferencefit)。在一些实施方式中，第一保持机构包括一个或多个构件，其被配置为向第一基材施加力以保持第一基材与第一构件之间的接触。54.在一些实施方式中，第二保持机构包括尺寸设计成接收第二基材的凹部。在一些实施方式中，第二保持机构包括一个或多个构件，所述构件被配置为向第二基材施加力以保持第二基材与第二构件之间的接触。在一些实施方式中，试剂介质包括以下中的至少一种：包含透化剂的溶液、固体透化剂和包含透化剂的水凝胶化合物。在一些实施方式中，包含透化剂的溶液包括大于约2w/v％的十二烷基硫酸钠(sds)。在一些实施方式中，包含透化剂的溶液包含约8w/v％至约12w/v％的sds。在一些实施方式中，包括透化剂的溶液包括蛋白酶k。在一些实施方式中，包括透化剂的溶液包括大于2w/v％n‑月桂酰肌氨酸或其钠盐。在一些实施方式中，第一构件包括开孔，所述开孔被定位成使得当第一基材被保持时，所述开孔与第一基材的样品区域对准。在一些实施方式中，第二构件包括至少一个开孔，所述开孔被定位成使得当第一基材被保持并且第一和第二构件被对准机构对准时，所述至少一个开孔的开孔与第一基材的样品区域的至少部分对准。55.在一些实施方式中，样品保持器还包括由至少一个开孔的一个或多个边界表面(boundingsurface)和由第二基材的后表面形成的试剂孔，其中添加到试剂孔的试剂溶液被边界表面包含并透过第二基材的背表面。在一些实施方式中，第二基材的背表面与面向第一基材上的样品的第二基材的正表面相对。在一些实施方式中，样品保持器还包括第一调节机构(adjustmentmechanism)，所述第一调节机构连接到第一构件并且被配置为在平行于支持样品的第一基材的表面的至少一个方向上平移第一基材。在一些实施方式中，对准机构被配置为当第一和第二基材对准时保持第一和第二基材之间的间隔。在一些实施方式中，对准机构被配置为保持该间隔，从而使得第一基材上的样品的至少部分接触第二基材上的试剂介质的至少部分。在一些实施方式中，当在与支持样品的第一基材的表面正交的方向上测量时，第一和第二基材之间的间隔为50μm‑1mm。56.在一些实施方式中，第一和第二基材之间的间隔为50μm‑500μm。在一些实施方式中，对准机构被配置为当第一和第二基材对准时保持第一和第二基材大致平行，从而使得第一和第二基材之间的角度为两度或更小。在一些实施方式中，该角度为0.5度或更小。在一些实施方式中，样品保持器还包括一个或多个间隔构件，所述间隔构件连接到第一和第二构件中之一或两者，所述第一和第二构件被定位成使得当第一和第二基材对准时，一个或多个间隔构件位于第一和第二构件之间。在一些实施方式中，样品保持器还包括第二调节机构，所述第二调节机构被配置为在与支持样品的第一基材的表面正交的方向上调节间隔距离。在一些实施方式中，第二调节机构是对准机构的部件。在一些实施方式中，第二调节机构连接到第一构件和第二构件之一或两者。57.在另一方面，本公开涉及一种用于包括样品的基材的支持装置。支持装置包括上述任一样品保持器；和板，所述板包括平台、连接到平台的第一表面的多个构件和连接到平台的第二表面的支持构件。所述板被配置为连接到样品保持器。58.在一些实施方式中，样品保持器和板被配置为使得当样品保持器和板连接时，接触样品的第一基材的区域的至少75％被支持构件覆盖。在一些实施方式中，多个构件中的构件的尺寸被设计成由加热装置的区域接收。在一些实施方式中，加热装置的区域包括热传递元件，该热传递元件被配置为将热量传递到多孔基材的孔。在一些实施方式中，热传递元件包括加热构件中的凹部。在一些实施方式中，支持装置还包括附接机构(attachmentmechanism)，所述连接机构被配置为将支持构件连接到样品保持器。在一些实施方式中，附接机构包括形成于样品保持器的第一构件中并被配置为接收支持构件的开孔和凹部之一或两者。59.在一些实施方式中，附接机构包括一个或多个延伸构件，所述延伸构件连接到样品保持器的第一构件并被配置为与支持构件中的相应凹部接合。在一些实施方式中，附接机构包括一个或多个延伸构件，所述延伸构件连接到支持构件并且被配置为与样品保持器的第一构件中的相应凹部接合。在一些实施方式中，多个构件在平台的第一表面上形成二维阵列，并且多个构件间隔开，从而使得它们与多孔基材上的孔对准。在一些实施方式中，接触样品的第一基材的区域被支持构件完全覆盖。在一些实施方式中，样品保持器和板被配置成使得当样品保持器和板连接时，第一基材的至少部分接触支持构件。在一些实施方式中，接触支持构件的第一基材的部分包括位于第一基材的与接触样品的第一基材的区域相对的一侧的基材的部分。在一些实施方式中，接触支持构件的第一基材的部分包括与接触样品的第一基材的表面相对的基材的表面的至少90％。在一些实施方式中，附接机构被配置为使得样品保持器以单一方向联接到支持构件。60.在另一方面，本公开内容涉及一种为印刷的阵列位置提供视觉指引的方法，包括利用带有印刷的指引的信息标记物将生物样品放置在固体支持物上，和，分析样品，其中印刷的指引为印刷的阵列位置提供视觉指引。61.在另一方面，本公开内容涉及将生物样品放置在阵列上的方法，包括利用带有印刷的指引的信息标签将生物样品放置在固体支持物上，分析生物样品，其中印刷的指引提供印刷的阵列位置的视觉指引；和，从固体支持物上取下信息标记物。62.在一些实施方式中，信息标记物是透明的。在一些实施方式中，移除信息标记物的步骤发生在分析生物样品的步骤之前。在一些实施方式中，固体支持物是载玻片。在一些实施方式中，生物样品是组织切片。在一些实施方式中，信息标记物是可移除的。在一些实施方式中，信息标记物是机械粘附的。在一些实施方式中，信息标记物用墨水印刷。在一些实施方式中，墨水是白色墨水、黑色墨水、彩色墨水、荧光墨水或其组合。在一些实施方式中，信息标记物是无光泽的。在一些实施方式中，信息标记物是有光泽的。在一些实施方式中，信息标记物包括信息标记物内部的孔洞(hole)或切口(cutout)。在一些实施方式中，信息标记物能够具有导热性和导电性。在一些实施方式中，印刷的指引是基准标志物。在一些实施方式中，基准标志物包括围绕阵列的框和标识阵列中心的点。在一些实施方式中，信息标记物包含元数据。在一些实施方式中，信息标记物占据固体支持物的部分。在一些实施方式中，信息标记物占据所有固体支持物。63.在一个方面，一种用于产生阵列上某一位置的空间rna完整性数的方法包括：(a)将用组织学染色剂染色的组织样品与阵列接触，其中所述阵列包括附接到所述阵列上某个位置的捕获探针，和，所述捕获探针包括特异性结合至来自组织样品的生物分析物的捕获域；(b)从与捕获域特异性结合的生物分析物生成cdna分子；(c)通过将标记的寡核苷酸探针与所述cdna杂交来标记所述cdna；(e)生成标记的cdna的图像和组织学染色的图像，和，利用标记的cdna的图像和组织学染色的图像生成阵列上所述位置的空间rna完整性数。64.在一些实施方式中，组织样品包括组织切片、组织内的区域或组织内的单细胞。在一些实施方式中，组织学染色剂是苏木精和伊红。在一些实施方式中，捕获域包含聚(t)序列。在一些实施方式中，生物分析物是18srrna。在一些实施方式中，标记的寡核苷酸探针是荧光标记的。在一些实施方式中，步骤(c)包括将至少四种不同的标记的寡核苷酸探针与cdna杂交。在一些实施方式中，至少四种标记的寡核苷酸探针在cdna内的不同位点处顺序杂交。在一些实施方式中，标记的寡核苷酸探针是荧光标记的。在一些实施方式中，生成标记的cdna的图像的步骤包括测量至少四种标记的寡核苷酸探针中每一种的荧光信号。在一些实施方式中，来自至少四个标记的寡核苷酸探针中的每一个的荧光信号用于产生阵列上所述位置的空间rna完整性数。65.在另一方面，确定空间分析工作流程中的工艺偏差的方法包括：(a)提供包含一种或多种测试分析物的基材，其中一种或多种测试分析物以已知量布置在基材上的已知位置；(b)在允许一种或多种捕获探针与一种或多种测试分析物相互作用的条件下，使基材与包含一种或多种捕获探针的阵列接触，其中捕获探针包含空间条形码和捕获域；(c)检测与一种或多种捕获探针相互作用的一种或多种测试分析物；和(d)基于步骤(c)中的检测确定空间分析工作流程是否准确地检测到一种或多种测试分析物的存在、数量、位置或其组合，由此确定空间分析工作流程中的工艺偏差。66.在一些实施方式中，基材包括半多孔材料。在一些实施方式中，半多孔材料包括硝化纤维素膜、水凝胶、尼龙过滤器或其组合中的至少一种。在一些实施方式中，一种或多种测试分析物包括核酸、蛋白质、脂质或其组合中的至少一种。在一些实施方式中，一种或多种测试分析物是rna。在一些实施方式中，一种或多种测试分析物以限定的图案布置在基材上。在一些实施方式中，限定的图案包括一个或多个点。67.本说明书中提到的可在因特网上获得的所有发表物、专利和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的发表物、专利、专利申请和信息项目专门和单独地通过引用纳入本文那样。对于通过引用纳入的出版物、专利、专利申请和信息项目与本说明书中所含公开内容相矛盾的内容，均意于以本说明书为准和/或本说明书优先于任何相矛盾的材料。68.在以范围来描述值的情况下，应当理解的是，该描述包括在该范围内的所有可能的子范围的公开，以及在该范围内的特定数值的公开，而不管是否明确地说明了特定数值或特定子范围。69.术语“每个”提及一组物品时，意在识别该集合中的一个单独物品，但不一定指该集合中的每一项物品，除非另有明确说明，或除非用法的上下文另有明确说明。70.本文描述了本发明的特征的各种实施方式。然而，应当理解，这些实施方式仅作为示例提供，并且在不脱离本公开的范围的情况下，本领域技术人员可以作出许多变化、改变和替换。还应理解，本文所描述的特定实施方式的各种替代方案也在本公开的范围内。附图说明71.以下附图说明了本发明的特征和优点的某些实施方式。这些实施方式无意以任何方式限制所附权利要求的范围。附图中的相同附图标记表示相同的元素。72.图1示出了示例性空间分析工作流。73.图2示出了示例性空间分析工作流。74.图3示出了示例性空间分析工作流。75.图4示出了示例性空间分析工作流。76.图5示出了示例性空间分析工作流。77.图6是示出如本文所述的条码化捕获探针的示例的示意图。78.图7是说明可裂解捕获探针的示意图，其中裂解的捕获探针可进入非透化细胞并结合到样品内的目标分析物。79.图8是示例性多重空间条码化特征的示意图。80.图9是示例性分析物捕获剂的示意图。81.图10是描绘特征固定的(feature‑immobilized)捕获探针1024和分析物捕获剂1026之间的示例性相互作用的示意图。82.图11a、11b和11c是图示如何在基于阵列的系统中利用链霉亲和素细胞标签来产生空间条码化的细胞或细胞内容物的示意图。83.图12是示出阵列内的条码化特征的布置的示意图。84.图13是示出抗扩散介质(例如盖)的侧视图的示意图。85.图14a和14b是图示电泳转移系统的展开图14a和侧视图14b的示意图，所述电泳转移系统被设置成将转录物分析物导向空间条码化捕获探针阵列。86.图15是示出利用电泳转移系统的示例性工作流方案的示意图。87.图16示出用于划分解离样品(例如来自样品的生物颗粒或个体细胞)的微流体通道结构1600的示例。88.图17a示出了微流体通道结构1700的示例，该微流体通道结构1700用于将携带空间条形码的珠递送到液滴。89.图17b示出了具有用于受控划分的几何特征的微流体通道结构1750的另一示例的截面图。90.图17c显示了工作流程示意图的示例。91.图18是使用分析物结合部分与细胞表面的共价偶联或与细胞膜元件的非共价相互作用来描绘细胞加标(celltagging)的示意图。92.图19是描绘使用细胞穿透肽或递送系统进行细胞加标的示意图。93.图20a是说明用于“像素化”样品的示范性、非限制性、非穷尽性步骤的工作流示意图，其中样品通过空心针或微针切割、压印、显微解剖或转移，将样品的一小部分移动到个体分区或孔中。94.图20b是描绘多针像素化(multi‑needlepixilation)的示意图，其中一组针头穿过支架上的样品并穿入下面含有凝胶珠和试剂的纳米孔中。一旦针进入纳米孔，细胞就会弹出。95.图21示出了用于解离空间条码化样品以通过液滴或流动池分析方法进行分析的示例性、非限制性、非穷举步骤的工作流示意图。96.图22a是示出可用于实现本文所述的各种步骤和方法的示例性样品处理装置的示意图。97.图22b是示出可用于获得生物样品、分析物和特征阵列的图像的示例成像设备的示意图。98.图22c是图22a和图22b的设备的控制单元的示例的示意图。99.图23a是显示样品载玻片(例如，控制载玻片)的示例的示意图。100.图23b是显示图23a中未显示的附加测量的样品载玻片的示例的示意图。101.图24a是说明样品载玻片的示例和选择区域的放大视图的示意图。102.图24b是说明图24a中说明的荧光标志物的浓度范围的示例的示意图。103.图25a是样品载玻片的明场显微图像。104.图25b是用594纳米(nm)激发波长采集的样品载玻片的荧光显微图像。105.图25c是用647nm激发波长采集的样品载玻片的荧光显微图像。106.图25d是通过合并图25b和25c中所示的图像获得的样品载玻片的荧光显微图像。107.图25e是图25d所示的荧光显微图像的放大图。108.图26a是说明样品载玻片的示例和选择区域的放大视图的示意图。109.图26b是说明图26a中说明的荧光标志物的浓度范围的示例的示意图。110.图26c是图26a所示阵列的荧光显微图像。111.图27a是说明样品载玻片的示例以及尺寸校准阵列和比色动态范围阵列的放大视图的示意图。112.图27b是用488nm激发波长获得的比色动态范围阵列的荧光显微图像。113.图27c是用594nm激发波长获得的比色动态范围阵列的荧光显微图像。114.图27d是用647nm激发波长获得的比色动态范围阵列的荧光显微图像。115.图28a是说明包括样品和比色动态范围阵列的样品载玻片的示意图。116.图28b是用488nm激发波长采集的样品载玻片的荧光显微图像。117.图28c是用594nm激发波长采集的样品载玻片的荧光显微图像。118.图28d是用647nm激发波长采集的样品载玻片的荧光显微图像。119.图29a‑29d显示了包括基准标志物的载玻片的示例。120.图30显示了基准标志物框内的不同图案的示例。121.图31是根据本文提供的一些实施方式的包括板和用于加热基材的基材保持器的装置的透视图。122.图32是根据本文提供的一些实施方式的图31的板的顶部透视图。123.图33是根据本文提供的一些实施方式的图31的板的底部透视图。124.图34是根据本文提供的一些实施方式的图31的基材保持器的分解图。125.图35是根据本文提供的一些实施方式的图34的基材保持器的底部构件的顶部透视图。126.图36是根据本文提供的一些实施方式的图35的底部构件的底部透视图。127.图37是根据本文提供的一些实施方式，与图31的板联接的图35的底部构件的透视图。128.图38是根据本文提供的一些实施方式，与第二板实施方式联接的图35的底部构件的透视图。129.图39是根据本文提供的一些实施方式，与图35的底部构件一起使用的紧固件的前透视图。130.图40是根据本文提供的一些实施方式，图39的紧固件的后透视图。131.图41是根据本文提供的一些实施方式，与图34的基材保持器一起使用的衬垫的透视图。132.图42是根据本文提供的一些实施方式，图34的基材保持器的顶部构件的顶部透视图。133.图43是根据本文提供的一些实施方式，图42的顶部构件的底部透视图。134.图44a、44b和44c显示了根据本文提供的一些实施方式的用于加热基材的基材保持器。图44a是基材保持器的透视图。图44b是图44a的基材保持器的分解图。图44c是图44a的基材保持器的局部透视图。135.图45a是根据本文提供的一些实施方式，图44a的基材保持器的顶部透视图。图45b是根据本文提供的一些实施方式，图44a的基材保持器的底部透视图。图45c是根据本文提供的一些实施方式，图44a的基材保持器的侧透视图。136.图46是根据本文提供的一些实施方式的衬垫的透视图。137.图47是根据本文提供的一些实施方式的基材加载器工具的顶部透视图。138.图48a‑48b是根据本文提供的一些实施方式，插入到图47的基材加载器工具中的基材保持器的侧透视图和顶部透视图。139.图49a‑c是根据本文提供的一些实施方式的基材加载器工具的另一个示例的各种透视图。140.图50a‑c是根据本文提供的一些实施方式的基材保持器工具的透视图。141.图51是显示分别支持样品和特征阵列的两个基材的示意图。142.图52a是样品保持器的示例的示意性俯视图。143.图52b‑52f是样品保持器的示例的示意性侧视图。144.图53是样品保持器的一个示例的示意侧视图。145.图54是显示基材成直角对准的示意图。146.图55是显示基材保持器上的基准标识的示意图。147.图56是显示与分析单个基材上的多个样品相关联的工作流程的示意图。148.图57a是显示使用各向异性透化层的工作流程的示意图。149.图57b是在各向异性透化层存在的情况下与特征阵列接触的样品的示意性局部视图。150.图57c是图57b的部分的示意性放大图。151.图58是显示使用包含透化剂的水凝胶层顶上的特征阵列的工作流程的示意图。152.图59是显示使用透化流体层来分析样品的工作流程的示意图。153.图60a‑60c是从图59的工作流程获得的样品的图像。154.图60d是显示图60b与图60c之间的比较图像强度的图。155.图61a‑61c是从图59的工作流程获得的另一个样品的图像。156.图61d是显示图61b和图61c之间的比较信噪比的图表。157.图62是显示使用特征阵列分析样品的工作流程的示意图，特征阵列包括浸泡在透化溶液中的珠。158.图63是显示使用注入透化溶液的水凝胶层来分析样品的工作流程的示意图。159.图64a是根据图63的工作流程分析的不同组织样品的一系列图像。160.图64b是显示图64a中底行图像之间的比较信号强度的图表。161.图65显示了带有印刷的指引的信息标记物的样品设计，以帮助用户在冷冻切片期间放置组织。点表示阵列的中心，而数字和字母表示可以放置组织样品的个体孔。162.图66显示了在将透明静态粘贴信息标记物应用于幻灯片之前的三种变化形式。这三种变化形式的尺寸不同，但由相同的材料制成。变化形式1显示没有标识的清晰信息标记物，变化形式2显示带有白色字母的清晰信息标记物，而变化形式3显示带有黑色字母的清晰信息标记物。163.图67显示了当在红色和绿色通道pmt增益600、5个像素/微米中扫描时施加了三个信息标记物中的每一个的载玻片。图像显示了具有信息标记物的每个通道中背景的差异。该图像还显示了应用于每个通道中的载玻片时每个信息标记物上字母的可见性。164.图68显示了使用干燥透化试剂的示例分析工作流程。165.图69显示了使用示例样品保持器的温度受控的第一和第二构件的示例分析工作流程。166.图70a显示了使用样品和第一基材的表面之间的间隙的分析物的示例电泳迁移的示意图。167.图70b显示了使用样品和覆层之间的间隙的分析物的示例电泳迁移的示意图。168.图70c显示分析物的示例电泳迁移的示意图，其中样品与第二基材的覆层接触。169.图70d显示分析物的示例电泳迁移的示意图，其中样品与第一基材接触。170.图71显示了用于样品电泳透化的示例设置。171.图72a显示了示例基材保持器的顶表面的透视图。172.图72b显示了示例基材保持器的底表面的透视图。173.图73a显示了处于打开位置的示例基材保持器的俯视图。174.图73b显示了处于打开位置的示例基材保持器的侧视图。175.图73c显示了示例基材保持器的示例锁定机构的侧视图。176.图74a显示了示例基材保持器和载玻片的分解透视图。177.图74b显示了处于打开位置的示例基材保持器和载玻片的透视图。178.图75a显示了由病理学家注释的侵袭性导管癌的组织切片。179.图75b显示了具有通过无监督聚类着色的点的组织图。180.图75c是由无监督聚类着色的点的tsne图。181.图75d显示了9个簇之间变化最大的基因的基因表达热图。182.图75e显示了组织切片中对应于人表皮生长因子受体2(her2)、雌激素受体(er)和孕激素受体(pr)的基因的表达水平。183.图75f显示了来自各个图上的9个簇中每一个的最高差异表达基因的基因表达水平。184.图75g显示了来自单个图上的9个簇中每一个的最高差异表达基因的基因表达水平。185.图75h是侵袭性导管细胞癌(idc)和正常乳腺组织中来自9个簇中每一个的最高差异表达基因的表达水平的图。186.图75i显示了idc和匹配正常组织中krt14的表达。187.图75j是idc和正常组织中胞外基质基因表达水平的图。188.附图中的各种附图标记表示相似的元素。具体实施方式189.i.引言190.本发明描述用于生物样品的空间分析的设备、系统、方法和组合物。本部分描述了某些通用术语、分析物、样品类型和制备步骤，这些将在本发明的后面部分中提及。191.(a)空间分析192.组织和细胞可以从任何来源获得。例如，组织和细胞可以从单细胞或多细胞生物体(例如哺乳动物)获得。从哺乳动物(例如，人)获得的组织和细胞通常具有不同的分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)，这可导致细胞形态和/或功能的差异。细胞在组织中的位置可以影响细胞的命运、行为、形态以及与组织中其他细胞的信号转导和串扰。关于哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平(基因和/或蛋白质表达)的差异的信息也可以帮助医生基于检测到的组织中不同细胞内分析物水平的差异来选择或给予对单细胞或多细胞生物体(例如哺乳动物)有效的治疗。哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平的差异也可以提供组织(例如，健康和患病组织)如何发挥功能和/或发展的信息。哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平的差异也可以提供组织中疾病发病机制的不同信息以及组织内治疗作用机制的信息。哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平的差异也可以提供有关耐药机制以及哺乳动物组织中耐药机制发展的信息。多细胞生物体(例如哺乳动物)组织中不同细胞内存在或不存在分析物的差异可提供多细胞生物体组织中耐药性机制及其发展的信息。193.本文提供的空间分析方法用于检测哺乳动物组织中的不同细胞内或哺乳动物的单个细胞内的分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)的差异。例如，空间分析方法可用于检测组织切片样品中不同细胞内分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)的差异，来自其中的数据可重组以生成从哺乳动物获得的组织样品的分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)的三维图，例如以一定程度的空间分辨率(例如单细胞分辨率)。194.发育系统中的空间异质性通常是通过rna杂交、免疫组织化学、荧光报告物、预定义的亚群的纯化或诱导以及随后的基因组概况分析(例如rna‑seq)来研究的。然而，这类方法依赖于一组相对较小的预定义标志物，因此引入了限制发现的选择偏差。这些先前的方法也依赖于先验知识。传统上，空间rna分析依赖于有限数量的rna物质的染色。相比之下，单细胞rna测序允许对细胞基因表达(包括非编码rna)进行深度概况分析，但已建立的方法将细胞从其天然空间环境(nativespatialcontext)中分离出来。195.当前的空间分析方法以高空间分辨率为样品中的多种分析物提供大量分析物水平和/或表达数据，例如，同时保留天然空间环境。空间分析方法包括，例如，使用捕获探针，该捕获探针包括空间条形码(例如，提供关于捕获探针在细胞或组织样品(例如，哺乳动物细胞或哺乳动物组织样品)内的位置的信息的核酸序列)和能够结合到由细胞产生或存在于细胞中的分析物(例如，蛋白质和/或核酸)的捕获域。如本文所述，空间条形码可以是具有独特序列、独特荧光团或荧光团的独特组合、独特氨基酸序列、独特重金属或重金属的独特组合，或任何其他独特可检测试剂的核酸。捕获域可以是能够结合到由细胞产生和/或存在于细胞中的分析物的任何试剂(例如，能够与以下杂交的核酸：来自细胞的核酸(例如，mrna、基因组dna、线粒体dna或mirna)、包含分析物的基材、分析物的结合伴侣或特异性结合至分析物的抗体)。捕获探针还可以包括与通用正向和/或通用反向引物序列互补的核酸序列。捕获探针还可包括裂解位点(例如，限制性核酸内切酶的裂解识别位点)、光不稳定键、热敏键或化学敏感键。196.可使用多种不同方法检测分析物与捕获探针的结合，例如，核酸测序、荧光团检测、核酸扩增、核酸连接检测和/或核酸裂解产物检测。在一些示例中，检测用于将特定空间条形码与由细胞(例如哺乳动物细胞)产生和/或存在于细胞中的特定分析物相关联。197.捕获探针可以例如附接在表面上，例如固体阵列、珠或盖玻片。在某些示例中，捕获探针未附接到表面。在一些示例中，捕获探针可封装于可透化组合物(例如，本文所述的任一基材)的表面内、嵌入该表面内或分层于该表面上。例如，捕获探针可被封装或布置在可透化珠(例如，凝胶珠)内。在一些示例中，捕获探针可封装于基材(例如，本文所述的任一示例性基材，例如水凝胶或多孔膜)的表面内、嵌入该表面内或分层于该表面上。198.在一些实施方式中，使细胞或包括细胞的组织样品与附接于基材(例如，基材的表面)的捕获探针接触，并且细胞或组织样品被透化以使分析物从细胞释放并结合到附接于基材的捕获探针。在一些示例中，可使用多种方法(例如，电泳、化学梯度、压力梯度、流体流或磁场)将从细胞释放的分析物主动引导至附接于基材的捕获探针。199.在其它示例中，可使用多种方法引导捕获探针与细胞或组织样品相互作用，例如，包括捕获探针中的脂质锚定剂、包括能与捕获探针中膜蛋白特异性结合或与膜蛋白形成共价键的试剂、流体流、压力梯度、化学梯度、或磁场。200.空间分析方法的非限制性方面在wo2011/127099、wo2014/210233、wo2014/210225、wo2016/162309、wo2018/091676、wo2012/140224、wo2014/060483、美国专利号10,002,316、美国专利号9,727,810、美国专利申请公开号2017/0016053、rodriques等，science363(6434)：1463‑1467，2019；wo2018/045186、lee等，nat.protoc.10(3)：442‑458，2015；wo2016/007839、wo2018/045181、wo2014/163886、trejo等，plosone14(2)：e0212031，2019、美国专利申请公开号2018/0245142、chen等，science348(6233)：aaa6090，2015、gao等，bmcbiol.15：50，2017、wo2017/144338、wo2018/107054、wo2017/222453、wo2019/068880、wo2011/094669、美国专利号7,709,198、美国专利号8,604,182、美国专利号8,951,726、美国专利号9,783,841、美国专利号10,041,949、wo2016/057552、wo2017/147483、wo2018/022809、wo2016/166128、wo2017/027367、wo2017/027368、wo2018/136856、wo2019/075091、美国专利号10,059,990、wo2018/057999、wo2015/161173、和gupta等，naturebiotechnol.36：1197‑1202，2018中描述，并可在本文中以任何组合使用。本文描述了空间分析方法的进一步非限制性方面。201.(b)一般术语202.在本发明中使用特定术语来解释所描述的设备、系统、方法和组合物的各个方面。本小节包括对本发明后面章节中出现的某些术语的解释。如果本节中的描述与本发明其他章节中的用法明显冲突，则以本节中的定义为准。203.(i)条形码[0204]“条形码”是一种标签或标识符，它传递或能够传递信息(例如，关于样品中分析物、珠和/或捕获探针的信息)。条形码可以是分析物的部分，也可以独立于分析物。条形码可以附接于分析物。特定条形码相对于其他条形码可能是独特的。[0205]条形码可以有多种不同的形式。例如，条形码可以包括多核苷酸条形码、随机核酸和/或氨基酸序列以及合成核酸和/或氨基酸序列。条形码可以以可逆或不可逆的方式附接到分析物或另一部分或结构上。例如，在对样品进行测序之前或期间，可以将条形码添加到脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)样品的片段中。条形码可以允许识别和/或定量个体测序读取结果(例如，条形码可以是或可以包括独特分子标识符或“umi”)。[0206]条形码可以在空间上解析在生物样品中存在的分子组分，例如，以单细胞分辨率(例如，条形码可以是或可以包括“空间条形码”)。在一些实施方式中，条形码同时包括umi和空间条形码。在一些实施方式中，条形码包括两个或更多个子条形码，它们一起用作单个条形码。例如，多核苷酸条形码可以包括由一个或多个非条形码序列分隔的两个或更多个多核苷酸序列(例如，子条形码)。[0207](ii)核酸和核苷酸[0208]“术语核酸”和“核苷酸”旨在与其在本领域中的用途一致，并包括天然存在的物质或其功能类似物。特别有用的核酸功能类似物能够以序列特异性方式与核酸杂交(例如，能够与两种核酸杂交，使得两种杂交的核酸之间可以发生连接)，或者能够用作复制特定核苷酸序列的模板。天然存在的核酸通常具有含有磷酸二酯键的主链。类似物结构可以具有其他主链连接，包括本领域已知的各种连接中的任何一种。天然存在的核酸通常具有脱氧核糖(例如，存在于脱氧核糖核酸(dna)中)或核糖(例如，存在于核糖核酸(rna)中)。[0209]核酸可包含具有本领域已知的这些糖部分的各种类似物中的任何一种的核苷酸。核酸可以包括天然或非天然核苷酸。就此而言，天然脱氧核糖核酸可以具有选自腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)或鸟嘌呤(g)的一个或多个碱基，并且核糖核酸可以具有选自尿嘧啶(u)，腺嘌呤(a)，胞嘧啶(c)或鸟嘌呤(g)的一个或多个碱基。本领域已知可包含在核酸或核苷酸中的有用非天然碱基。[0210](iii)探针和靶标[0211]“探针”或“靶标”，当用于核酸或核酸序列时，意指在方法或组合物的上下文中作为核酸或序列的语义标识符，并且不限制核酸或序列的结构或功能超出明确指示的范围。[0212](iv)寡核苷酸和多核苷酸[0213]术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换地用于指长度为约2至约500个核苷酸的核苷酸单链多聚体。寡核苷酸可以合成的，酶法(例如通过聚合)制备的，或使用“拆分‑汇集(split‑pool)”方法制备。寡核苷酸可以包括核糖核苷酸单体(即，可以是寡核糖核苷酸)和/或脱氧核糖核苷酸单体(即，寡脱氧核糖核苷酸)。在一些示例中，寡核苷酸可包括寡核苷酸中脱氧核糖核苷酸单体及核糖核苷酸单体的组合(例如，脱氧核糖核苷酸单体及核糖核苷酸单体的随机或有序组合)。例如，寡核苷酸的长度可以是4到10、10到20、21到30、31到40、41到50、51到60、61到70、71到80、80到100、100到150、150到200、200到250、250到300、300到350、350到400、或400到500个核苷酸。寡核苷酸可包括(例如，共价或非共价)附接到多聚体结构的一个或多个功能部分。例如，寡核苷酸可以包括一个或多个可检测的标记(例如，放射性同位素或荧光团)。[0214](v)对象[0215]“对象”是一种动物，如哺乳动物(如人或非人猿)，或禽类(如鸟)，或其他生物体，如植物。对象的示例包括但不限于哺乳动物，例如啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、有蹄类动物、马、绵羊、猪、山羊、牛、猫、狗、灵长类动物(即人类或非人灵长类动物)；植物，例如拟南芥(arabidopsisthaliana)、玉米、高粱、燕麦、小麦、水稻、油菜或大豆；藻类，例如莱茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)；线虫，如秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans)；昆虫，如黑腹果蝇(drosophilamelanogaster)、蚊子、果蝇或蜜蜂；蛛形纲动物，如蜘蛛；鱼类，如斑马鱼；爬行动物；两栖动物，如青蛙或非洲爪蟾(xenopuslaevis)；盘基网柄菌(dictyosteliumdiscoideum)；真菌，如卡氏肺孢子虫(pneumocystiscarinii)、红鳍东方鲀(takifugurubripes)、酵母，酿酒酵母(saccharamoycescerevisiae)或庞贝裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)；或恶性疟原虫(plasmodiumfalciparum)。[0216](vi)基因组[0217]“基因组”通常指来自对象的基因组信息，例如，可以是对象基因编码的遗传信息的至少部分或全部。基因组可以包括编码区(例如，编码蛋白质的区域)以及非编码区。基因组可以包括对象部分或全部染色体的序列。例如，人类基因组通常总共有46条染色体。这些的部分或全部序列可以构成基因组。[0218](vii)衔接子(adaptor)，接合物(adapter)和标签[0219]“衔接子(adaptor)”、“接合物(adapter)”和“标签(tag)”是在本公开中可以互换使用的术语，并且是指可以使用包括(但不限于)连接、杂交和标签化(tagmentation)的许多不同技术中的任一种来(在称为“加标(tagging)”的过程中)耦合到多核苷酸序列的物质。衔接子也可以是添加功能的核酸序列，例如间隔子序列、引物序列/位点、条形码序列、独特分子标识符序列。[0220](viii)杂合、杂交、退火(annealing)和链重组(anneal)[0221]术语“杂合”、“杂交”、“退火”和“链重组”在本公开中可交换地使用，并指两个不同分子内基本互补或互补核酸序列的配对。配对可以通过任何过程实现，其中核酸序列通过碱基配对与基本互补或完全互补的序列连接以形成杂交复合物。为了杂交的目的，如果两个核酸序列中至少60％(例如，至少70％、至少80％或至少90％)的个体碱基彼此互补，则两个核酸序列是“基本互补的”。[0222](ix)引物[0223]“引物”是具有3′末端的单链核酸序列，可在核酸延伸反应中用作核酸聚合酶的化学底物。rna引物由rna核苷酸形成，用于rna合成，而dna引物由dna核苷酸组成，用于dna合成。引物还可以包括rna核苷酸和dna核苷酸(例如，以随机或设计的模式)。引物还可以包括本文所述的具有其它功能性的其他天然或合成核苷酸。在一些示例中，dna引物可用于引发rna合成，反之亦然(例如，rna引物可用于引发dna合成)。引物的长度可以不同。例如，引物可以是约6个碱基到约120个碱基。例如，引物可包括多达约25个碱基。[0224](x)引物延伸[0225]“引物延伸”是指其中两个核酸序列(例如，来自两个不同捕获探针中每一个的恒定区域)通过其各自末端互补核酸序列(例如，3′末端)的重叠而连接(例如，杂交)的任何方法。在这种连接之后，可以使用另一个核酸序列作为延伸模板来进行一个或两个末端的核酸延伸(例如，酶延伸)。酶延伸可由包括但不限于聚合酶和/或逆转录酶的酶来进行。[0226](xi)邻近连接[0227]“邻近连接”是通过酶手段(例如连接酶)连接彼此邻近的两个(或更多)核酸序列的方法。在一些实施方式中，邻近连接可包括“间隙填充”步骤，该步骤涉及基于模板核酸分子的核酸序列通过聚合酶在跨越两个感兴趣核酸分子之间的距离上纳入一个或多个核酸(参见，例如，美国专利号7264929，其全部内容通过引用纳入本文)。[0228]各种不同的方法可用于邻近连接核酸分子，包括(但不限于)“粘端”和“钝端”连接。此外，单链连接可用于对单链核酸分子进行邻近连接。粘端邻近连接是在连接事件发生之前，将待连接的两个核酸分子之间的互补单链序列杂交。钝端邻近连接通常不包括来自每个核酸分子的互补区域的杂交，因为两个核酸分子在连接位点都缺乏单链突出端。[0229](xii)核酸延伸[0230]“核酸延伸”通常涉及以模板依赖的方式将一个或多个核酸(例如，a、g、c、t、u、核苷酸类似物或其衍生物)纳入分子(例如但不限于核酸序列)中，使得连续的核酸被酶(例如聚合酶或逆转录酶)纳入，从而生成新合成的核酸分子。例如，通过使用互补核酸序列作为核酸合成的模板，可以使用与互补核酸序列杂交的引物来合成新的核酸分子。类似地，与多聚(dt)序列(例如，捕获域)杂交的mrna转录物的3′多聚腺苷酸化尾可以用作相应cdna分子的单链合成的模板。[0231](xiii)pcr扩增[0232]“pcr扩增”是指利用聚合酶链反应(pcr)生成遗传物质的拷贝，包括dna和rna序列。例如，在美国专利号4683202、4683195、4800159、4965188和5512462中描述了实施pcr的合适试剂和条件，其全部内容通过引用纳入本文中。在典型的pcr扩增中，反应混合物包括待扩增的遗传物质、酶、用于引物延伸反应的一个或多个引物以及用于反应的试剂。寡核苷酸引物的长度足以在退火条件下与互补遗传物质杂交。引物的长度通常取决于扩增结构域的长度，但通常为至少4个碱基、至少5个碱基、至少6个碱基、至少8个碱基、至少9个碱基、至少10个碱基对(bp)、至少11bp、至少12bp、至少13bp、至少14bp、至少15bp、至少16bp、至少17bp、至少18bp，至少19bp，至少20bp，至少25bp，至少30bp，至少35bp，可以长达40bp或更长，其中引物的长度一般在18‑50bp之间。遗传物质可与单个引物或一组两个引物(正向和反向引物)接触，这取决于是否需要对遗传物质进行引物延伸、线性或指数扩增。[0233]在一些实施方式中，pcr扩增过程使用dna聚合酶。dna聚合酶活性可由一种或多种不同的dna聚合酶提供。在某些实施方式中，dna聚合酶来自细菌，例如，dna聚合酶是细菌dna聚合酶。例如，dna聚合酶可以来自大肠杆菌属、芽孢杆菌属、嗜热杆菌属或热球菌属的细菌。[0234]可使用的dna聚合酶的合适示例包括但不限于：大肠杆菌dna聚合酶i、bsudna聚合酶、bstdna聚合酶、taqdna聚合酶、venttmdna聚合酶，deepventtmdna聚合酶，taqdna聚合酶，热启动taqdna聚合酶，crimsontaqdna聚合酶，crimsontaqdna聚合酶，dna聚合酶，quickdna聚合酶，hemodna聚合酶，dna聚合酶，dna聚合酶，高保真dna聚合酶，铂pfxdna聚合酶、accuprimepfxdna聚合酶、phi29dna聚合酶、klenow片段、pwodna聚合酶、pfudna聚合酶、t4dna聚合酶和t7dna聚合酶。[0235]术语“dna聚合酶”不仅包括天然存在的酶，还包括其所有修饰衍生物，还包括天然存在的dna聚合酶的衍生物。例如，在一些实施方式中，dna聚合酶可经修饰以移除5′‑3′核酸外切酶活性。可使用的dna聚合酶的序列修饰衍生物或突变体包括但不限于保留至少部分功能的突变体，例如野生型序列的dna聚合酶活性。在不同的反应条件下，如温度、模板浓度、引物浓度等，突变可影响酶的活性概况，如提高或降低聚合速率。突变或序列修饰也可能影响酶的核酸外切酶活性和/或热稳定性。[0236]在一些实施方式中，pcr扩增可包括例如但不限于链置换扩增反应、滚环扩增反应、连接酶链反应、转录介导的扩增反应、等温扩增反应和/或环介导的扩增反应的反应。[0237]在一些实施方式中，pcr扩增使用与靶dna片段的3′标签互补的单个引物。在一些实施方式中，pcr扩增使用第一和第二引物，其中第一引物的至少3′末端部分与目标核酸片段的3′标签的至少部分互补，以及其中所述第二引物的至少3′末端部分展示所述靶核酸片段的5′标签的至少部分的序列。在一些实施方式中，第一引物的5′末端部分与目标核酸片段的3′标签不互补，并且第二引物的5′末端部分不展示目标核酸片段的5′标签的至少部分的序列。在一些实施方式中，第一引物包括第一通用序列和/或第二引物包括第二通用序列。[0238]在一些实施方式中(例如，当pcr扩增对捕获的dna进行扩增时)，可以使用dna连接酶将pcr扩增产物连接到其它序列。dna连接酶活性可由一种或多种不同的dna连接酶提供。在一些实施方式中，dna连接酶来自细菌，例如，dna连接酶是细菌dna连接酶。在一些实施方式中，dna连接酶来自病毒(例如，噬菌体)。例如，dna连接酶可以是t4dna连接酶。适用于连接步骤的其他酶包括但不限于tthdna连接酶、taqdna连接酶、热球菌属(菌株9on)dna连接酶(9ontmdna连接酶，可从马萨诸塞州伊普斯维奇的新英格兰生物实验室(newenglandbiolabs)获得)和ampligasetm(可从威斯康星州麦迪逊的艾匹森特生物技术公司(epicentrebiotechnologies)获得)。也可以使用衍生物，例如序列修饰的衍生物和/或其突变体。[0239]在一些实施方式中，通过逆转录聚合酶链反应(rt‑pcr)扩增遗传物质。期望的逆转录酶活性可由一种或多种不同的逆转录酶提供，其合适示例包括但不限于：m‑mlv、mulv、amv、hiv、arrayscripttm、multiscribetm、thermoscripttm、和i、ii、iii和iv酶。“逆转录酶”不仅包括天然存在的酶，而且包括其所有此类修饰衍生物，还包括天然存在的逆转录酶的衍生物。[0240]此外，可以使用m‑mlv、mulv、amv和hiv逆转录酶的序列修饰衍生物或突变体来进行逆转录，包括保留野生型序列的至少一些功能性(例如逆转录酶)活性的突变体。所述逆转录酶可作为包含其他组分的组合物的部分提供，例如增强或改善所述逆转录酶活性的稳定组分，例如rna酶抑制剂、dna依赖性dna合成的抑制剂，例如，放线菌素d。许多逆转录酶的序列修饰衍生物或突变体，例如m‑mlv，以及包括未修饰和修饰酶的组合物，例如arrayscripttm、multiscribetm、thermoscripttm、和i、ii、iii和iv酶是市售可得的。[0241]某些逆转录酶(例如禽成髓细胞增多症病毒(amv)逆转录酶和莫罗尼鼠白血病病毒(m‑mulv，mmlv)逆转录酶)可以使用rna(cdna合成)和单链dna(ssdna)作为模板来合成互补dna链。因此，在一些实施方式中，逆转录反应可使用能够使用rna和ssdna两者作为延伸反应模板的酶(逆转录酶)，例如amv或mmlv逆转录酶。[0242]在一些实施方式中，rna和/或dna的定量通过实时pcr(也称为定量pcr或qpcr)，使用本领域众所周知的技术进行，例如但不限于“taqmantm”或或在毛细管上(“毛细管”)。在一些实施方式中，通过光吸收率和实时pcr来确定遗传物质的定量。在一些实施方式中，通过数字pcr来确定遗传物质的定量。在一些实施方式中，所分析的基因可对应于表达(mrna)和数量(dna)与参考核酸提取物(dna和rna)进行比较，以便比较靶核酸的表达水平。[0243](xiv)抗体[0244]“抗体”是一种多肽分子，其识别并结合互补的靶抗原。抗体通常具有类似y形的分子结构形状。自然产生的抗体，被称为免疫球蛋白，属于免疫球蛋白类igg、igm、iga、igd和ige之一。抗体也可以人工合成。例如，作为单克隆抗体的重组抗体可以通过从源细胞中回收抗体基因、扩增到适当的载体中并将载体引入宿主以使宿主表达重组抗体来使用合成基因来合成。一般来说，可以使用合适的寡核苷酸引物和/或杂交探针从任何抗体产生动物物种中克隆重组抗体。重组技术可用于生成抗体和抗体片段，包括非内源性物质。[0245]合成抗体可以从非免疫球蛋白来源获得。例如，抗体可由核酸(例如适配子)和非免疫球蛋白支架(例如肽适配子)产生，其中插入高变环以形成抗原结合位点。基于核酸或肽结构的合成抗体可以比免疫球蛋白衍生的抗体小，从而导致更大的组织透化。[0246]抗体还可以包括亲和体蛋白(affimerprotein)，亲和体蛋白是通常具有约12‑14kda分子量的亲和试剂。亲和体蛋白通常以高亲和力和特异性结合靶标(例如，靶蛋白)。此类靶标的示例包括但不限于泛素链、免疫球蛋白和c‑反应蛋白。在一些实施方式中，亲和体蛋白衍生自半胱氨酸蛋白酶抑制剂，并且包括肽环和提供结合位点的可变n‑末端序列。[0247]抗体还可以包括单域抗体(vhh结构域和vnar结构域)、scfv和fab片段。[0248](xv)亲和基团[0249]“亲和基团”是具有与另一特定或具体分子或部分缔合或结合的高亲和性或偏好的分子或分子部分。与另一特定或具体分子或部分的缔合或结合可以通过非共价相互作用，例如氢键、离子力和范德华相互作用。例如，亲和基团可以是生物素，其具有与蛋白亲和素或链霉亲和素缔合或结合的高亲和性或偏好。例如，亲和基团也可指与生物素具有亲和性的亲和素或链霉亲和素。亲和基团及其结合或缔合的特定或具体分子或部分的其它示例包括但不限于抗体或抗体片段及其各自的抗原，例如地高辛和抗地高辛抗体、凝集素和碳水合合物(例如，糖、单糖、双糖或多糖)，以及受体和受体配体。[0250]任何一对亲和基团及其与之结合或缔合的特定或具体分子或部分可使其作用逆转，例如，在第一分子和第二分子之间，在第一示例中，第一分子被表征为第二分子的亲和基团，在第二示例中，第二分子被表征为第一分子的亲和基团。[0251](xvi)标记物，可检测标记物和光学标记物[0252]术语“可检测标记物”、“光学标记物”和“标记物”在本文中可互换使用以指与待检测分子(例如，捕获探针或分析物)相关联(例如，偶联)的直接或间接可检测部分。可检测标记物可由其自身而可直接检测(例如，放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者，在酶标记物的情况下，可以是可间接检测的，例如，通过催化化学底物化合物或组合物的化学改变，该化学底物化合物或组合物可直接检测。可检测标记物可适于小规模检测和/或适于高通量筛选。因此，合适的可检测标记物包括但不限于放射性同位素、荧光团、化学发光化合物、生物发光化合物和染料。[0253]可检测标记物可被定性检测(例如，光学或光谱)，或可被定量。定性检测通常包括确认可检测标记物的存在或出现的检测方法，而可定量检测通常包括具有可定量(例如，数字可报告)值的检测方法，例如强度、持续时间、偏振和/或其他性质。在一些实施方式中，可检测标记物被结合到特征或与特征相关联的捕获探针。例如，被可检测标记的特征可包括附接于珠的荧光、比色或化学发光标记物(参见例如，rajeswari等，j.microbiolmethods139：22‑28，2017，和forcucci等，j.biomedopt.10：105010，2015，其全部内容通过引用纳入本文)。[0254]在一些实施方式中，可将多个可检测标记物附接到待检测的特征、捕获探针或组合物。例如，可检测标记物可在核酸聚合或扩增期间纳入(例如，可检测标记物可在核酸聚合或扩增期间纳入(例如，例如)。可以使用任何合适的可检测标记物。在一些实施方式中，可检测标记物是荧光团。例如，荧光团可来自以下组：7‑aad(7‑氨基放线菌素d)、吖啶橙( dna)、吖啶橙( rna)、rna)、rna)、rna)、alexaalexaalexaalexa别藻蓝蛋白(apc)、amca/amca‑x、7‑氨基放线菌素d(7‑aad)、7‑氨基‑4‑甲基香豆素、6‑氨基喹啉、苯胺蓝、ans、apc‑cy7、atto‑tagtmcbqca，atto‑tagtmfq、金胺o‑feulgen、bcecf(高ph)、bfp(蓝色荧光蛋白)、bfp/gfpfret、bobotm‑1/bo‑protm‑1、bobotm‑3/bo‑protm‑3、3、3、btc、钙黄绿素、钙黄绿素蓝、calciumcrimsontm，calciumgreen‑1tm，calciumorangetm，白，5‑羧基荧光素(5‑fam)，5‑羧基萘荧光素，6‑羧基罗丹明6g，5‑羧基四甲基罗丹明(5‑tamra)，羧基‑x‑罗丹明(5‑rox)，cascadecascadeyellowtm，ccf2(geneblazertm)、cfp(青色荧光蛋白)、cfp/yfpfret、色霉素a3、cl‑nerf(低ph)、cpm、6‑cr6g、ctc‑甲cychrome(pe‑cy5)、丹磺酰胺、丹磺酰尸胺、丹氨酰氯、dapi、达考氧基(dapoxyl)、dcfh、dhr、dia(4‑di‑16‑asp)、did(dilc18(5))、dids、dil(dilc18(3))、dio(dioc18(3))、dir(dilc18(7))、di‑4anepps、di‑8anepps、dm‑nerf(4.5‑6.5ph)、dsred(红色荧光蛋白)、ebfp、ecfp、egfp、醇、曙红、红霉素、溴化乙锭、乙锭同二聚体‑1(ethd‑1)、氯化铕(iii)、5‑fam(5‑羧基荧光素)、快蓝、荧光素dt磷酰胺、fitc、f1uo‑3、fluo‑4、fluoro‑goldtm(高ph)，fluoro‑goldtm(低ph)、f1uoro‑jade、1‑43、fura‑2(高钙)、fura‑2/bcecf、furaredtm(高钙)，furaredtm/fluo‑3，geneblazertm(ccf2)，gfp红移(rsgfp)，gfp野生型，gfp/bfp‑fret，gfp/dsred‑fret，hoechst33342&33258，7‑羟基‑4‑甲基香豆素(ph9)，1，5‑吲哚乙酸，indo‑1(高钙)，indo‑1(低钙)，吲哚二碳菁，吲哚三碳菁，jc‑1，6‑joe，jojotm‑1/jo‑protm‑1，lds751( dna)，lds751( rna)，lolotm‑1/lo‑protm‑1，路西法黄，lysosensortm蓝(ph5)，lysosensortm绿(ph5)，lysosensortm黄/蓝(ph4.2)、绿、红、黄、mag‑fura‑2、mag‑indo‑1、magnesiumgreentm，marina4‑甲基伞形酮，米特拉霉素，绿，橙，红，nbd(胺)，尼罗红，oregonoregonoregon太平洋蓝，pbf1，pe(r‑藻红蛋白)，pe‑cy5，pe‑cy7，pe‑德州红，percp(多甲藻黄素叶绿素蛋白质)，percp‑cy5.5(trured)，pharred(apc‑cy7)，c‑藻蓝蛋白、r‑藻蓝蛋白、r‑藻红蛋白(pe)、pi(碘化丙啶)、pkh26、pkh67、popotm‑1/po‑protm‑1，popotm‑3/po‑protm‑3，碘化丙啶(pi)，pympo，芘，吡咯啉y，量子红(pe‑cy5)，喹吖因氮芥，r670(pe‑cy5)，red613(pe‑德州红)，红色荧光蛋白(dsred)，试卤灵，rh414，rhod‑2，罗丹明b，rhodaminegreentm，rhodamineredtm，罗丹明鬼笔环肽，罗丹明110，罗丹明123，5‑rox(羧基‑x‑罗丹明)，s65a，s65c，s65l，s65t，sbfi，sits，(高ph)，(高ph)，(低ph)，sodiumgreentm，，蓝，绿，橙，5‑tamra(5‑羧基四甲基罗丹明)，四甲基罗丹明(tritc)，texastexas(nhs酯)，硫杂二羰花青，噻唑橙，噻唑橙，三色(pe‑cy5)、tritc(四甲基罗丹明)、trured(percp‑cy5.5)、ww781、x‑罗丹明(xritc)、y66f、y66h、y66w、yfp(黄色荧光蛋白)、6‑fam(荧光素)、6‑fam(nhs酯)、6‑fam(叠氮化物)、hex、tamra(nhs酯)，yakima黄，max，tet，tex615，atto488，atto532，atto550，atto565，attorho101，atto590，atto633，atto647n，tye563，tye665，tye705，(nhs酯)，wellredd4染料，wellredd3染料，wellredd2染料，(nhs酯)和dy750(nhs酯)。[0255]如上所述，在一些实施方式中，可检测标记物是或包括发光或化学发光部分。常见的发光/化学发光部分包括但不限于过氧化物酶，例如辣根过氧化物酶(hrp)、大豆过氧化物酶(sp)、碱性磷酸酶和荧光素酶。这些蛋白质部分可在给定适当化学底物(例如氧化试剂加化学发光化合物)的情况下催化化学发光反应。许多化合物家族已知在各种条件下提供化学发光。化学发光化合物家族的非限制性示例包括2，3‑二氢‑1，4‑酞嗪二酮鲁米那，5‑氨基‑6，7，8‑三甲氧基‑和二甲氨基[ca]苯类似物。这些化合物在碱性过氧化氢或次氯酸钙和碱存在下能发光。化学发光化合物家族的其它示例包括(例如)2，4，5‑三苯基咪唑、对二甲氨基和‑甲氧基取代基、草酸盐(例如草酰基活性酯)、对硝基苯基、n‑烷基吖啶酯、荧光素、光泽精或吖啶酯。[0256](xvii)模板转换寡核苷酸[0257]“模板转换寡核苷酸”是一种寡核苷酸，在逆转录过程中与通过逆转录酶(例如，具有末端转移酶活性的酶)添加的未模板化的核苷酸杂交。在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸与通过逆转录酶添加的未模板化的多聚(c)核苷酸杂交。在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸向用于cdna扩增的全长cdna添加共同5′序列。[0258]在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸将共同序列添加到正被逆转录的rna的5′端。例如，模板转换寡核苷酸可与添加到cdna分子末端的未模板化的多聚(c)核苷酸杂交，并为逆转录酶提供模板以继续复制到模板转换寡核苷酸的5′末端，从而生成能够进行进一步扩增的全长cdna。在一些实施方式中，一旦生成全长cdna分子，模板转换寡核苷酸可作为cdna扩增反应中的引物。[0259]在一些实施方式中，在逆转录或其他基于末端转移酶的反应之前、同时或之后添加模板转换寡核苷酸。在一些实施方式中，捕获探针中包括模板转换寡核苷酸。在某些实施方式中，使用模板转换寡核苷酸的样品分析方法可涉及从组织样品的分析物生成核酸产物，随后使用模板转换寡核苷酸进一步处理核酸产物。[0260]模板转换寡核苷酸可以包括杂交区和模板区。杂交区可以包括能够与靶标杂交的任何序列。在一些实施方式中，杂交区例如可包括连续g碱基以与cdna分子3′端的突出端c碱基互补。连续g碱基可包括1个g碱基、2个g碱基、3个g碱基、4个g碱基、5个g碱基或超过5个g碱基。模板序列可以包括待纳入cdna的任何序列。在其它实施方式中，除了至少一个g碱基之外，杂交区可包括至少一个碱基。在其它实施方式中，杂交可包括非g碱基的碱基。在一些实施方式中，模板区包括至少1个(例如，至少2个、3个、4个、5个或更多)标签序列和/或功能序列。在一些实施方式中，模板区和杂交区由间隔子分开。[0261]在一些实施方式中，模板区包括条形码序列。条形码序列可以作为空间条形码和/或作为独特分子标识符发挥作用。模板转换寡核苷酸可包括脱氧核糖核酸；核糖核酸；修饰的核酸，包括2‑氨基嘌呤、2，6‑二氨基嘌呤(2‑氨基‑da)、反向dt、5‑甲基dc、2′‑脱氧肌苷、超t(5‑羟基丁基‑2′‑脱氧尿苷)、超g(8‑氮杂‑7‑脱氮鸟苷)、锁核酸(lna)、解锁核酸(una，例如，una‑a、una‑u、una‑c、una‑g)、iso‑dg、iso‑dc、2′氟碱基(例如，氟c、氟u、氟a和氟g)或上述的任何组合。[0262]在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸的长度可至少为约1、2、10、20、50、75、100、150、200或250个核苷酸或更长。在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸的长度最多可为约2、10、20、50、100、150、200或250个核苷酸或更长。[0263](xviii)夹板寡核苷酸[0264]“夹板寡核苷酸”是一种寡核苷酸，当与其他多核苷酸杂交时，它起到“夹板”的作用，使多核苷酸彼此相邻，以便它们可以连接在一起。在一些实施方式中，夹板寡核苷酸是dna或rna。夹板寡核苷酸可以包括与来自两个或更多个不同寡核苷酸的核苷酸序列部分互补的核苷酸序列。在一些实施方式中，夹板寡核苷酸协助连接“供体”寡核苷酸和“受体”寡核苷酸。一般来说，rna连接酶、dna连接酶或其他种类的连接酶用于将两个核苷酸序列连接在一起。[0265]在一些实施方式中，夹板寡核苷酸的长度在10到50个寡核苷酸之间，例如，长度在10到45个、10到40个、10到35个、10到30个、10到25个或10到20个寡核苷酸之间。在一些实施方式中，夹板寡核苷酸的长度介于15和50、15和45、15和40、15和35、15和30、15和30或15和25个核苷酸之间。[0266](c)分析物[0267]本公开中描述的设备、系统、方法和组合物可用于检测和分析多种不同的分析物。就本发明而言，“分析物”可包括任何待分析的生物物质、结构、部分或组分。术语“靶标”可以类似地指感兴趣的分析物。[0268]分析物可大致分为两类：核酸分析物和非核酸分析物。非核酸分析物的示例包括但不限于脂质、碳水合合物、肽、蛋白质、糖蛋白(n‑连接或o‑连接)、脂蛋白、磷蛋白、蛋白质的特定磷酸化或乙酰化变体、蛋白质的酰胺化变体、蛋白质的羟基化变体、蛋白质的甲基化变体，蛋白质泛素化变体、蛋白质硫酸化变体、病毒外壳蛋白、胞外和胞内蛋白质、抗体和抗原结合片段。在一些实施方式中，分析物可以是细胞器(例如，细胞核或线粒体)。[0269]对应于分析物的细胞表面特征可包括但不限于受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白通道、蛋白泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞‑细胞相互作用蛋白复合物，抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化t细胞受体、t细胞受体、b细胞受体、嵌合抗原受体、胞外基质蛋白、细胞表面蛋白的翻译后修饰(例如，磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝化、甲基化、乙酰化或脂质化)状态、间隙连接和粘附连接。[0270]分析物可来自特定类型的细胞和/或特定的亚细胞区。例如，分析物可以来自细胞质、细胞核、线粒体、微粒体，更一般地说，来自细胞的任何其他隔室、细胞器或部分。特定靶向某些细胞室和细胞器的透化剂可用于选择性地从细胞释放分析物以进行分析。[0271]核酸分析物的示例包括dna分析物，例如基因组dna、甲基化dna、特定甲基化dna序列、片段化dna、线粒体dna、原位合成pcr产物和rna/dna杂合体。[0272]核酸分析物的示例还包括rna分析物，例如各种类型的编码和非编码rna。不同类型的rna分析物包括信使rna(mrna)、核糖体rna(rrna)、转移rna(trna)、小rna(mirna)和病毒rna。rna可以是转录物(例如，存在于组织切片中)。rna可以是小的(例如，长度小于200个核酸碱基)或大的(例如，长度大于200个核酸碱基的rna)。小rna主要包括5.8s核糖体rna(rrna)、5srrna、转移rna(trna)、微小rna(mirna)、小干扰rna(sirna)、小核仁rna(snrna)、piwi相互作用rna(pirna)、trna衍生的小rna(tsrna)和小rdna衍生的rna(srrna)。rna可以是双链rna或单链rna。rna可以是环状rna。rna可以是细菌rrna(例如，16srrna或23srrna)。[0273]分析物的其他示例包括mrna和细胞表面特征(例如，使用本文所述的标记剂)、mrna和胞内蛋白质(例如，转录因子)、mrna和细胞甲基化状态、mrna和可获得的染色质(例如，atac‑seq、dna酶‑seq和/或微球菌酶‑seq)、mrna和代谢物(例如，使用本文所述的标记剂)、条码化的标记剂(例如，本文所述的寡核苷酸标记抗体)和免疫细胞受体(例如，t细胞受体)的v(d)j序列、mrna和扰动剂(例如，crisprcrrna/sgrna、talen、锌指核酸酶、和/或如本文所述的反义寡核苷酸)。在一些实施方式中，扰动剂可以是小分子、抗体、药物、适体、mirna、物理环境(例如，温度变化)，或任何其它已知扰动剂。[0274]分析物可包括具有编码免疫细胞受体(例如tcr或bcr)的v(d)j序列的至少部分的核酸序列的核酸分子。在一些实施方式中，核酸分子是首先使用含多聚(t)的引物从相应mrna的逆转录生成的cdna。然后可以使用捕获探针对生成的cdna进行条码化，该捕获探针具有与所生成的cdna的至少部分杂交的条形码序列(和可选的umi序列)。在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸与通过逆转录酶添加到cdna3′端的多聚(c)尾杂交。原始的mrna模板和模板转换寡核苷酸可以从cdna中变性，然后条码化捕获探针可以与cdna杂交并生成cdna的互补物。在2017年10月18日提交的pct专利申请pct/us2017/057269和2017年11月29日提交的美国专利申请序列号15/825,740中描述了适用于对从mrna转录物生成的cdna进行条码化的其他方法和组合物，所述mrna转录物包括编码免疫细胞受体的v(d)j区域的那些，和/或包括模板转换寡核苷酸的组合物和条码化方法，二者均通过引用全文纳入本文。v(d)j分析也可以通过使用一种或多种与免疫细胞特定表面特征结合并与条形码序列相关联的标记剂来完成。一种或多种标记剂可包括mhc或mhc多聚体。[0275]如上所述，所述分析物可包括能够作为基因编辑反应的组分发挥作用的核酸，例如，基于规律成簇的间隔短回文重复序列(crispr)的基因编辑。因此，捕获探针可包括与分析物互补的核酸序列(例如，可与crisprrna(crrna)、单向导rna(sgrna)杂交的序列，或工程化到crrna或sgrna中的衔接子序列)。[0276]在某些实施方式中，可从活细胞中提取分析物。可以调整加工条件，以确保生物样品在分析过程中保持活性，并从样品的活细胞中提取(或释放)分析物。活细胞衍生的分析物只能从样品中获得一次，或者可以从继续保持存活状态的样品中每隔一段时间获得。[0277]一般而言，所述系统、设备、方法和组合物可用于分析任意数量的分析物。例如，所分析的分析物的数量可为至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约20，至少约25、至少约30、至少约40、至少约50、至少约100、至少约1000、至少约10000、至少约100000或更多种不同分析物存在于样品区域中或基材的个体特征内。用于进行多重分析以分析两个或更多不同分析物的方法将在本发明的后续部分中讨论。[0278](d)生物样品[0279](i)生物样品的类型[0280]从对象处获取“生物样品”，以使用各种技术中的任一种进行分析，包括但不限于活检、手术和激光捕获显微镜(lcm)，并且通常包括来自对象的细胞和/或其他生物材料。除上述对象之外，生物样品可获自非哺乳动物生物体(例如，植物、昆虫、蜘蛛、线虫(例如，秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans))、真菌、两栖动物或鱼(例如，斑马鱼))。生物样品还可获自原核生物，例如细菌，例如大肠杆菌(escherichiacoli)、葡萄球菌(staphylococci)或肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)；古细菌；病毒，例如丙型肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒；或类病毒。生物样品可获自真核生物，例如患者来源的类器官(pdo)或患者来源的异种移植物(pdx)。生物样本可以包括类器官，一种在体外产生的器官的微型化和简化版本，可在三个维度上显示出逼真的显微解剖结构。类器官可产生自组织的一种或多种细胞、胚胎干细胞和/或诱导多能干细胞，由于它们的自我更新和分化能力，它们可以在三维培养中自我组织(self‑organize)。在一些实施方式中，类器官是脑类器官、肠类器官、胃类器官、舌类器官、甲状腺类器官、胸腺类器官、睾丸类器官、肝类器官、胰腺类器官、上皮类器官、肺类器官、肾类器官、原肠胚、心脏类器官或视网膜类器官。可从中获得生物样品的对象可以是健康或无症状的个体、患有或怀疑患有疾病(例如，癌症)的个体或对疾病有预处置的个体，和/或需要治疗或怀疑需要治疗的个体。[0281]生物样品可来自本文所述的对象或生物体的同质培养物或群体，或可替代地来自例如群落或生态系统中的若干不同生物体的集合。[0282]生物样品可以包括一个或多个病变细胞。病变细胞可以具有改变代谢特性、基因表达、蛋白质表达和/或形态特征。疾病的例子包括炎症紊乱、代谢紊乱、神经系统紊乱和癌症。癌细胞可以来源于实体瘤、血液系统恶性肿瘤、细胞系，也可以以循环肿瘤细胞形式获得。[0283]生物样品也可以包括胎儿细胞。例如，可以进行例如羊膜穿刺术之类的操作以从母体循环获得胎儿细胞样品。胎儿细胞测序可用于鉴定许多遗传疾病中的任何一种，包括例如非整倍体，例如唐氏综合征、爱德华兹综合征和帕陶综合征。此外，胎儿细胞的细胞表面特征可用于识别多种疾病或病症中的任一种。[0284]生物样品也可以包括免疫细胞。对这类细胞的免疫功能进行序列分析，包括基因组学、蛋白质组学和细胞表面特征，可以提供丰富的信息，有助于了解免疫系统的状态和功能。举例来说，在自体干细胞移植后确定多发性骨髓瘤(mm)患者中最小残留病(mrd)的状态(例如阴性或阳性)被认为是mm患者中mrd的预测因素(参见，例如，美国专利申请公开号2018/0156784，其通过引用全文纳入本文)。[0285]生物样品中的免疫细胞的示例包括但不限于b细胞、t细胞(例如，细胞毒性t细胞、自然杀伤性t细胞、调节性t细胞和辅助性t细胞)、自然杀伤细胞、细胞因子诱导的杀伤(cik)细胞、髓样细胞，例如粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞/多节核中性粒细胞)、单核细胞/巨噬细胞、肥大细胞、血小板/巨核细胞和树突状细胞。[0286]生物样品可以包括任何数量的大分子，例如细胞大分子和细胞器(例如线粒体和细胞核)。生物样品可以是核酸样品和/或蛋白质样品。生物样品可以是碳水合合物样品或脂质样品。生物样品可以作为组织样品获得，例如组织切片、活检、核心活检、针吸或细针吸。样品可以是液体样品，例如血液样品、尿液样品或唾液样品。样品可以是皮肤样品、结肠样品、颊拭子、组织学样品、组织病理学样品、血浆或血清样品、肿瘤样品、活细胞、培养细胞、临床样品，例如全血或血液衍生产品、血细胞或培养组织或细胞，包括细胞悬浮液。[0287]无细胞生物样品可包括胞外多核苷酸。胞外多核苷酸可以从身体样品，例如血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜排泄物、痰、粪便和眼泪中分离出来。[0288]如上所述，生物样品可包括单个感兴趣的分析物或多个感兴趣的分析物。在本发明的后续部分中讨论用于进行多重分析以分析单个生物样品中的两个或更多个不同分析物的方法。[0289](ii)生物样品的制备[0290]可以进行各种步骤来制备用于分析的生物样品。除非另有说明，以下描述的制备步骤通常可以以任何方式组合以适当地制备用于分析的特定样品。[0291](1)组织切片[0292]生物样品可以从对象身上获取(例如，通过外科活检、整个对象切片)，作为细胞群在生长基材或培养皿上体外生长，或作为组织薄片或组织切片制备。生长的样品可以足够薄，无需进一步的处理步骤即可进行分析。或者，生长的样品和通过活检或切片获得的样品可以使用机械切割设备(例如振动刀片切片机)制备为薄组织切片。作为另一替代方案，在一些实施方式中，可以通过向合适的基材材料施用生物样品印片(toughimprint)来制备薄组织切片。[0293]组织切片的厚度可以是细胞最大截面尺寸的分数(例如，小于0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1)。然而，也可以使用厚度大于最大截面细胞尺寸的组织切片。例如，可以使用例如10‑20微米厚的低温恒温切片。[0294]更一般地，组织切片的厚度通常取决于用于制备切片的方法和组织的物理特性，因此可以制备和使用具有多种不同厚度的切片。例如，组织切片的厚度可以为至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、1.0、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、20、30、40或50微米。如果需要或方便，也可以使用更厚的切片，例如，至少70、80、90或100微米或更大。通常，组织切片的厚度在1‑100微米、1‑50微米、1‑30微米、1‑25微米、1‑20微米、1‑15微米、1‑10微米、2‑8微米、3‑7微米或4‑6微米之间，但是如上所述，也可以分析厚度大于或小于这些范围的切片。[0295]也可以从单个生物样品中获得多个切片。例如，通过使用切片刀片对活检样品进行连续切片，可以从外科活检样品获得多个组织切片。以这种方式可以保存连续切片之间的空间信息，并且可以连续分析切片以获得关于生物样品的三维信息。[0296](2)冷冻[0297]在一些实施方式中，生物样品(例如，如上所述的组织切片)可通过在适合于维持或保持组织结构的完整性(例如，物理特性)的温度下的深度冷冻来制备。例如，该温度可低于‑20℃，或低于‑25℃、‑30℃、‑40℃、‑50℃、‑60℃、‑70℃、‑80℃、‑90℃、‑100℃、‑110℃、‑120℃、‑130℃、‑140℃、‑150℃、‑160℃、‑170℃、‑180℃、‑190℃或‑200℃。冷冻组织样品可使用任何数量的合适方法切(例如，薄切)到基材表面上。例如，可使用冷冻切片机(例如，低温恒温器)制备组织样品，所述冷冻切片机设置在适于维持组织样品的结构完整性和样品中核酸的化学性质的温度。例如，这种温度可以低于‑15℃、低于‑20℃或低于‑25℃。样品可以在异戊烷和液氮中速冻。冷冻样品可以在包埋之前储存在密封容器中。[0298](3)甲醛固定和石蜡包埋[0299]在一些实施方式中，可以使用甲醛固定和石蜡包埋(ffpe)来制备生物样品，这是已确立的方法。在一些实施方式中，可以使用甲醛固定和石蜡包埋制备细胞悬浮液和其他非组织样品。固定样品并将其包埋在石蜡或树脂块中后，样品可按上述方法进行切片。在分析之前，石蜡包埋材料可通过在适当溶剂(例如二甲苯)中孵育组织切片并随后冲洗(例如99.5％乙醇2分钟、96％乙醇2分钟和70％乙醇2分钟)从组织切片中移除(例如，脱石蜡)。[0300](4)固定[0301]作为上述甲醛固定的替代方法，可以将生物样品固定在各种其他固定剂中的任一种中，以在分析之前保持样品的生物结构。例如，可以通过浸入乙醇、甲醇、丙酮、甲醛(例如，2％甲醛)、多聚甲醛‑曲通、戊二醛或它们的组合来固定样品。[0302]在一些实施方式中，丙酮固定与新鲜冷冻样品一起使用，新鲜冷冻样品可包括但不限于皮质组织、小鼠嗅球、人脑肿瘤、人死后大脑和乳腺癌样品。在一些实施方式中，基于期望的工作流程选择和/或优化相容的固定方法。例如，可以选择甲醛固定为与使用ihc/if方案进行蛋白质可视化的工作流程相容。作为另一个示例，可以为重视rna/dna文库质量的工作流程选择甲醇固定。在一些应用中可以选择丙酮固定来透过组织。当进行丙酮固定时，可以不进行预透化步骤(如下所述)。或者，丙酮固定可结合透化步骤进行。[0303](5)包埋[0304]作为上述石蜡包埋的替代方法，生物样品可以包埋在各种其他包埋材料中的任一种中，以便在切片和其他处理步骤之前为样品提供基材。一般来说，在分析从样品中获得的组织切片之前，先移除包埋材料。合适的包埋材料包括但不限于蜡、树脂(例如甲基丙烯酸树脂)、环氧树脂和琼脂。[0305](6)染色[0306]为了便于可视化，生物样品可以使用多种染色剂和染色技术进行染色。在一些实施方式中，可使用任意数量的生物染色剂对样品进行染色，包括但不限于吖啶橙、俾斯麦棕、胭脂红、考马斯蓝、甲酚紫、dapi、曙红、溴化乙锭、酸性品红、苏木精、霍氏染色剂、碘、甲基绿、亚甲基蓝、中性红、尼罗蓝、尼罗红、四氧化锇、碘化丙啶、罗丹明或藏红。[0307]样品可以使用已知的染色技术染色，包括坎格伦瓦染色(can‑grunwald)、姬姆萨染色(giemsa)、苏木精和伊红(h&e)、哲纳尔氏染色(jenner′s)、利什曼染色(leishman)、马松(masson′s)三色、巴氏(papanicolaou)、罗曼落司基染色(romanowsky)、银染(silver)、苏丹(sudan)、瑞氏染色(wright′s)和/或pas染色法染色技术。pas染色通常在甲醛或丙酮固定后进行。[0308]在一些实施方式中，可以使用如本文他处所述的可检测标记物(例如，放射性同位素、荧光团、化学发光化合物、生物发光化合物和染料)对生物样品进行染色。在一些实施方式中，仅使用一种类型的染色剂或一种技术对生物样品进行染色。在一些实施方式中，染色包括生物染色技术，例如h&e染色。在一些实施方式中，染色包括使用荧光偶联抗体鉴定分析物。在一些实施方式中，使用两种或更多种不同类型的染色剂或两种或更多种不同的染色技术对生物样品进行染色。例如，可以通过使用一种技术(例如，h&e染色和明场成像)进行染色和成像，然后使用另一种技术(例如，ihc/if染色和荧光显微镜)对同一生物样品进行染色和成像，来制备生物样品。[0309]在一些实施方式中，生物样品可以脱色。生物样品的去污或脱色方法在本领域是已知的，并且通常取决于应用于样品的染色剂的性质。例如，h&e染色可以通过在hcl中清洗样品来脱色。在一些实施方式中，脱色可以包括在hcl中的1、2、3或更多次洗涤。在一些实施方式中，脱色可包括将hcl添加到下游溶液(例如透化溶液)中。作为另一个示例，在一些实施方式中，通过抗体偶联将一种或多种免疫荧光染色剂施用于样品。这些染色剂可以使用例如通过还原剂和洗涤剂洗涤处理的二硫键的裂解、潮变性盐处理、抗原回收溶液处理和酸性甘氨酸缓冲液处理等技术移除。例如，bolognesi等，j.histochem.cytochem.2017；65(8)：431‑444，lin等，natcommun.2015；6：8390，pirici等，j.histochem.cytochem.2009；57：567‑75，和glass等，j.histochem.cytochem.2009；57：899‑905中描述了多重染色和脱色的方法，其全部内容通过引用纳入本文。[0310](7)水凝胶包埋[0311]在一些实施方式中，水凝胶形成发生在生物样品内。在一些实施方式中，生物样品(例如，组织切片)包埋在水凝胶中。在一些实施方式中，将水凝胶亚基注入生物样品中，并且水凝胶的聚合由外部或内部刺激引发。如本文所述的“水凝胶”可包括亲水聚合物链的交联3d网络。″水凝胶亚基″可以是可聚合(例如交联)以形成三维(3d)水凝胶网络的亲水单体、分子前体或聚合物。[0312]水凝胶可以在有水的情况下溶胀。在一些实施方式中，水凝胶包含天然材料。在一些实施方式中，水凝胶包含合成材料。在一些实施方式中，水凝胶包括杂化材料，例如，水凝胶材料包括同时具有合成聚合物和天然聚合物的成分。可以使用在水凝胶或包含本文所述的基于多肽的材料的水凝胶中使用的任何材料。以这种方式包埋样品通常涉及将生物样品与水凝胶接触，使得生物样品被水凝胶包围。例如，可以通过将样品与合适的聚合物材料接触并活化聚合物材料以形成水凝胶来包埋样品。在一些实施方式中，形成水凝胶，使得水凝胶在生物样品内被内化。[0313]在一些实施方式中，通过形成水凝胶的聚合物材料的交联将生物样品固定在水凝胶中。交联可以通过化学和/或光化学方式进行，或者通过本领域已知的任何其他水凝胶形成方法进行。例如，生物样品可以通过聚丙烯酰胺交联固定在水凝胶中。此外，生物样品的分析物可以通过交联(例如聚丙烯酰胺交联)固定在水凝胶中。[0314]水凝胶的组成和对生物样品的应用通常取决于生物样品的性质和制备(例如，切片的、非切片的、新鲜冷冻组织、固定的类型)。水凝胶可以是任何合适的水凝胶，其中在生物样品上形成水凝胶后，生物样品变得锚固或包埋水凝胶中。水凝胶的非限制性示例在本文中描述或在本领域中是已知的。作为一个示例，其中生物样品是组织切片，水凝胶可包括单体溶液和过硫酸铵(aps)引发剂/四甲基乙二胺(temed)促进剂溶液。作为另一个例子，当生物样品由细胞(例如，培养细胞或与组织样品分离的细胞)组成时，细胞可与单体溶液和aps/temed溶液一起孵育。对于细胞，水凝胶形成于隔室中，包括但不限于用于培养、维持或运输细胞的装置。例如，水凝胶可以使用单体溶液加上aps/temed形成，其添加到隔室中的深度在约0.1μm到约5mm之间。[0315]在一些实施方式中，水凝胶包括允许将生物样品锚固至水凝胶的接头。在一些实施方式中，水凝胶包括允许将生物分析物锚固到水凝胶的接头。在这种情况下，可以在水凝胶形成之前、同时或之后将接头添加到水凝胶中。将核酸锚固至水凝胶的接头的非限制性示例可包括6‑((丙烯酰基)氨基)己酸(丙烯酰基‑xse)(可获自赛默飞世尔公司(thermofisher)，马萨诸塞州沃尔瑟姆)、label‑it胺(可获自mirusbio公司，威斯康星州麦迪逊)和labelx)。[0316]在一些实施方式中，可以使用官能化化学。在一些实施方式中，官能化化学包括水凝胶组织化学(htc)。适用于htc的任何水凝胶组织骨架(例如，合成的或天然的)可用于锚定生物大分子和调节官能化。使用htc骨架变体的方法的非限制性示例包括clarity、pact、exm、switch和epact。在一些实施方式中，生物样品内的水凝胶形成是永久的。例如，生物大分子可以永久地粘附在水凝胶上，从而使进行多轮询查。在一些实施方式中，生物样品内的水凝胶形成是可逆的。[0317]在一些实施方式中，在聚合之前、同时和/或之后向水凝胶亚基添加其它试剂。例如，其它试剂可包括但不限于寡核苷酸(例如，捕获探针)、用于片段化dna的核酸内切酶、用于dna的片段化缓冲液、dna聚合酶、用于扩增核酸和将条形码附接到扩增片段上的dntp。可以使用其他酶，包括但不限于rna聚合酶、转座酶、连接酶、蛋白酶k和dna酶。其它试剂还可以包括逆转录酶，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和转换寡核苷酸。在一些实施方式中，在聚合之前、同时和/或之后向水凝胶亚基添加光学标记。[0318]在一些实施方式中，在聚合之前、同时和/或之后向水凝胶添加htc试剂。在一些实施方式中，在聚合之前、同时和/或之后将细胞加标剂添加到水凝胶中。在一些实施方式中，在聚合之前、同时和/或之后将细胞穿透剂添加到水凝胶中。[0319]在一些实施方式中，生物样品被嵌入水凝胶中以促进样品转移至另一个位置(例如，到阵列)。例如，存档的生物样品(例如，ffpe组织切片)可以从存储转移至空间阵列以进行空间分析。在一些实施方式中，基材上的生物样品可以用本文所述的任何预聚物溶液覆盖。在一些实施方式中，可以聚合预聚物溶液，从而在生物样品的上方和/或周围形成水凝胶。水凝胶形成可以以足以将生物样品锚固(例如，包埋进入)到水凝胶的方式发生。在水凝胶形成之后，生物样品被锚固到(例如，包埋进入)水凝胶，其中将水凝胶与基材(例如，载玻片)分离导致生物样品与水凝胶一起从基材中分离。然后可以将包含在水凝胶中的生物样品与空间阵列接触，并对生物样品进行空间分析。[0320]任何种类的特性都可以确定给定生物样品所需的转移条件。可能影响转移条件的特点的非限制性示例包括样品(例如，厚度、固定和交联)和/或感兴趣的分析物(用于保存和/或转移不同分析物(例如dna、rna和蛋白质)的不同条件)。[0321]在一些实施方式中，在生物样品与空间阵列接触之后移除水凝胶。例如，本文所述的方法可包括事件依赖性(例如，光或化学)解聚性水凝胶，其中在施加事件(例如，外部刺激)时，水凝胶解聚。在一个示例中，生物样品可以锚固在dtt敏感型水凝胶上，其中加入dtt可以导致水凝胶解聚并释放锚固的生物样品。[0322]包埋在生物样品中的水凝胶可以用任何合适的方法清除。例如，电泳组织清除方法可用于移除水凝胶包埋样品中的生物大分子。在一些实施方式中，水凝胶包埋的样品在水凝胶清除之前或之后存储在介质(例如，固定介质、甲基纤维素或其他半固体介质)中。[0323]在一些实施方式中，可以调整水凝胶化学以特异性结合(例如，保留)特定种类的分析物(例如，rna、dna、蛋白质等)。在一些实施方式中，水凝胶包括允许将生物样品锚固至水凝胶的接头。在一些实施方式中，水凝胶包括允许将生物分析物锚固到水凝胶的接头。在这种情况下，可以在水凝胶形成之前、同时或之后将接头添加到水凝胶中。将核酸锚固至水凝胶的接头的非限制性示例可包括6‑((丙烯酰)氨基)己酸(丙烯酰‑xse)，label‑it胺和labelx。可能影响转移条件的特点的非限制性示例包括样品(例如，厚度、固定和交联)和/或感兴趣的分析物(用于保存和/或转移不同分析物(例如dna、rna和蛋白质)的不同条件)。[0324]生物样品的水凝胶包埋的其他方法和方面例如在chen等，science347(6221)：543‑548，2015中描述，其全部内容通过引用纳入本文。[0325](8)生物样品转移[0326]在一些实施方式中，使用水凝胶将固定在基材上的生物样品(例如，利用甲醇固定或福尔马林固定和石蜡包埋(ffpe)制备的生物样品)转移至空间阵列。在一些实施方式中，水凝胶形成在基材(例如，载玻片)上的生物样品的上方。例如，水凝胶形成可以以足以将生物样品锚固(例如，嵌入)到水凝胶的方式发生。在水凝胶形成之后，生物样品被锚固到(例如，包埋进入)水凝胶，其中将水凝胶与基材分离导致生物样品与水凝胶一起从基材中分离。然后可以使生物样品与空间阵列接触，从而允许对生物样品进行空间分析。在一些实施方式中，在生物样品与空间阵列接触后移除水凝胶。例如，本文所述的方法可包括事件依赖性(例如，光或化学)解聚性水凝胶，其中在施加事件(例如，外部刺激)时，水凝胶解聚。在一个示例中，生物样品可以锚固在dtt敏感型水凝胶上，其中加入dtt可以导致水凝胶解聚并释放锚固的生物样品。水凝胶可以是任何合适的水凝胶，其中在生物样品上形成水凝胶后，生物样品变得锚固或包埋水凝胶中。水凝胶的非限制性示例在本文中描述或在本领域中是已知的。在一些实施方式中，水凝胶包括允许将生物样品锚固至水凝胶的接头。在一些实施方式中，水凝胶包括允许将生物分析物锚固到水凝胶的接头。在这种情况下，可以在水凝胶形成之前、同时或之后将接头添加到水凝胶中。将核酸锚固至水凝胶的接头的非限制性示例可包括6‑((丙烯酰基)氨基)己酸(丙烯酰基‑xse)(可获自赛默飞世尔公司(thermofisher)，马萨诸塞州沃尔瑟姆)、label‑it胺(可获自mirusbio公司，威斯康星州麦迪逊)和labelx)。任何种类的特性都可以确定给定生物样品所需的转移条件。可能影响转移条件的特点的非限制性示例包括样品(例如，厚度、固定和交联)和/或感兴趣的分析物(用于保存和/或转移不同分析物(例如dna、rna和蛋白质)的不同条件)。在一些实施方式中，水凝胶形成可以以足以将生物样品中的分析物锚固(例如，包埋)到水凝胶的方式发生。在一些实施方式中，水凝胶可以与存在于生物样品中的锚固的分析物(例如，包埋在水凝胶中)一起内陷(例如，收缩)。在一些实施方式中，水凝胶可以与存在于生物样品中的锚固的分析物(例如，包埋在水凝胶中)一起扩展(例如，等距扩展)。在一些实施方式中，水凝胶可以被内陷(例如，收缩)并且随后随着生物样品中存在的锚固的分析物(例如，包埋入水凝胶中)而扩展。[0327](9)等距扩展(isometricexpansion)[0328]在一些实施方式中，包埋在水凝胶中的生物样品可以等距扩展。可用的等距扩展方法包括水合，这是扩展显微镜检中的一个制备步骤，如以下文献中所述，chen等，science347(6221)：543‑548，2015；asano等.currentprotocols.2018，80：1，doi：10.1002/cpcb.56和gao等.bmcbiology.2017，15：50，doi：10.1186/s12915‑017‑0393‑3，wassie，a.t.等，扩展显微镜检：生物研究原理及应用(expansionmicroscopy：principlesandusesinbiologicalresearch)，naturemethods，16(1)：33‑41(2018)，其各自通过引用其全文方式纳入本文。[0329]一般而言，用于进行生物样品等距扩展的步骤可取决于样品的特性(例如，组织切片的厚度、固定、交联)和/或感兴趣的分析物(例如，将rna、dna和蛋白质锚定到凝胶的不同条件)。[0330]等距扩展可以通过将生物样品的一个或多个组分锚定到凝胶上，然后进行凝胶形成、蛋白质水解和溶胀来实现。生物样品的等距扩展可以在生物样品固定在基材上之前发生，或者在生物样品固定在基材上之后发生。在一些实施方式中，可在使扩展的生物样品与空间条形码阵列(例如，基材上的空间条码化的捕获探针)接触之前，从基材移除等距扩展的生物样品。[0331]在一些实施方式中，生物样品中的蛋白质锚定在可溶胀凝胶(例如聚电解质凝胶)上。抗体可在锚定到可溶胀凝胶之前、之后或结合锚定到可溶胀凝胶时定向到蛋白质。生物样品中的dna和/或rna也可以通过合适的接头锚定在可溶胀凝胶上。此类接头的示例包括但不限于6‑((丙烯酰基)氨基)己酸(丙烯酰基‑x‑se)(可从马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞(thermofisher)获得)、labelit胺(可从威斯康辛州麦迪逊的mirusbio获得)和labelx(例如在chen等，nat.methods13：679‑684，2016中描述，其全部内容通过引用纳入本文)。[0332]样品的等距扩展可以提高样品后续分析的空间分辨率。例如，生物样品的等距扩展可导致空间分析(例如，单细胞分析)的分辨率增加。在空间剖面图中增加的分辨率可以通过比较等距扩展的样品和未等距扩展的样品来确定。[0333]在一些实施方式中，生物样品等距扩展至其非扩展的量的至少2x、2.1x、2.2x、2.3x、2.4x、2.5x、2.6x、2.7x、2.8x、2.9x、3x、3.1x、3.2x、3.3x、3.4x、3.5x、3.6x、3.7x、3.8x、3.9x、4x、4.1x、4.2x、4.4x、4.5x、4.6x、4.7x、4.8x或4.9x。在一些实施方式中，样品等距扩展至其非扩展的量的至少2倍且小于20倍。[0334]在一些实施方式中，包埋进入水凝胶的生物样品等距扩展至其非扩展的量的至少2x，2.1x，2.2x，2.3x，2.4x，2.5x，2.6x，2.7x，2.8x，2.9x，3x，3.1x，3.2x，3.3x，3.4x，3.5x，3.6x，3.7x，3.8x，3.9x，4x，4.1x，4.2x，4.3x，4.4x，4.5x，4.6x，4.7x，4.8x，或4.9x。在一些实施方式中，包埋在水凝胶中的生物样品等距扩展至其非扩展的量的至少2x且小于20x。[0335](10)基材附接[0336]在一些实施方式中，生物样品可附接至水凝胶基材。下面详细描述适用于此目的的基材的示例。生物样品的附接可以是不可逆的或可逆的，这取决于样品的性质和分析方法中的后续步骤。[0337]在某些实施方式中，可通过将适当的聚合物覆层施加到基材上并使样品与聚合物覆层接触，将样品可逆地附接到基材上。然后可以使用至少部分溶解聚合物覆层的有机溶剂将样品从基材上分离。水凝胶是适用于此目的的聚合物的例子。[0338]更一般地，在一些实施方式中，可以用一种或多种物质涂覆或官能化基材以促进样品附接到基材上。可用于涂覆基材或使基材功能化的合适物质包括但不限于凝集素、聚赖氨酸、抗体和多糖。[0339](11)未聚集的细胞[0340]在一些实施方式中，生物样品对应于细胞(例如，来自细胞培养物或组织样品)。在具有多个细胞的细胞样品中，多个个体细胞可以自然地不聚集的。例如，细胞可来自细胞悬浮液和/或来自组织或组织切片的分离或解聚的细胞。[0341]或者，样品中的细胞可以聚集，并且可以使用例如酶或机械技术解聚成多个个体细胞。用于酶解聚的酶的示例包括但不限于分散酶、胶原酶、胰蛋白酶或其组合。例如，可以使用组织匀浆器来进行机械解聚。[0342]在未聚集的细胞或解聚的细胞的一些实施方式中，细胞分布在基材上，从而至少一个细胞占据基材上的不同空间特征。细胞可以固定在基材上(例如，以防止细胞的横向扩散)。在一些实施方式中，细胞固定剂可用于在分析物捕获之前将非聚集或解聚的样品固定在空间条码化阵列上。“细胞固定剂”可以指附着于基材的抗体，其可以结合至细胞表面标志物。在一些实施方式中，基材上的多个细胞的分布遵循泊松统计。[0343]在一些实施方式中，来自多个细胞的细胞被固定在基材上。在一些实施方式中，细胞被固定以防止横向扩散，例如通过添加水凝胶和/或通过施加电场。[0344](12)悬浮和贴壁细胞[0345]在一些实施方式中，生物样品可从体外生长的细胞培养物中获得。来自细胞培养物的样品可包括一个或多个悬浮细胞，其在细胞培养物内是锚定独立的。此类细胞的示例包括但不限于衍生自造血细胞及衍生自以下细胞系的细胞系：colo205、ccrf‑cem、hl‑60、k562、molt‑4、rpmi‑8226、sr、hop‑92、nci‑h322m及malme‑3m。[0346]来自细胞培养物的样品可以包括生长在含有培养基的容器表面上的一个或多个贴壁细胞。贴壁细胞的非限制性示例包括du145(前列腺癌)细胞、h295r(肾上腺皮质癌)细胞、hela(宫颈癌)细胞、kbm‑7(慢性粒细胞白血病)细胞、lncap(前列腺癌)细胞、mcf‑7(乳腺癌)细胞、mda‑mb‑468(乳腺癌)细胞、pc3(前列腺癌)细胞、saos‑2(骨癌)细胞、sh‑sy5y(神经母细胞瘤，克隆自骨髓瘤)细胞、t‑47d(乳腺癌)细胞、thp‑1(急性髓系白血病)细胞、u87(胶质母细胞瘤)细胞、国家癌症研究所60癌细胞系小组(nci60)、vero(非洲绿猴肾上皮细胞系)细胞、mc3t3(胚胎颅骨)细胞、gh3(垂体瘤)细胞，pc12(嗜铬细胞瘤)细胞、狗mdck肾上皮细胞、爪蟾a6肾上皮细胞、斑马鱼ab9细胞和sf9昆虫上皮细胞。[0347]贴壁细胞的其他示例如表1所示，并在例如“体外细胞系、可移植动物和人类肿瘤及酵母目录(acatalogofinvitrocelllines，transplantableanimalandhumantumorsandyeast)”，美国国家癌症研究所癌症治疗与诊断司(dctd)(2013年)和abaan等的“nci‑60小组的外显子组：一种用于研究的基因组资源(theexomesofthenci‑60panel：agenomicresourceforcancerbiologyandsystemspharmacology)”，cancerresearch73(14)：4372‑82，2013中进行了分类，其全部内容通过引用纳入本文。[0348]表1：贴壁细胞的示例[0349][0350][0351]在一些实施方式中，贴壁细胞是对应于以下一个或多个细胞系的细胞：bt549、hs578t、mcf7、mda‑mb‑231、mda‑mb‑468、t‑47d、sf268、sf295、sf539、snb‑19、snb‑75、u251、colo205、hcc2998、hct‑116、hct‑15、ht29、km12、sw620、786‑o、a498、achn、caki、rxf393、sn12c、tk‑10、uo‑31、a549、ekvx、hop‑62、hop‑92，nci‑h226、nci‑h23、nci‑h460、nci‑h522、loximvi、m14、malme‑3m、mda‑mb‑435、sk‑、el‑2、sk‑mel‑28、sk‑mel‑5、uacc‑257、uacc‑62、igrov1、ovcar‑3、ovcar‑4、ovcar‑5、ovcar‑8、sk‑ov‑3、nci‑adr‑res、du145、pc‑3、du145、h295r、hela、kbm‑7、lncap、mcf‑7、mda‑mb‑468、pc3、saos‑2、sh‑sy5y、t‑47d、thp‑1、u87、vero、mc3t3、gh3、pc12、狗mdck肾上皮、爪蟾a6肾上皮、斑马鱼ab9和sf9昆虫上皮细胞系。[0352](13)组织透化[0353]在一些实施方式中，生物样品可被透化以促进分析物从样品转移出去，和/或促进物质(例如捕获探针)转移到样品中。如果样品透化不够，则从样品中捕获的分析物量可能过低，无法进行充分的分析。相反，如果组织样品透化性太强，则组织样品内分析物的相对空间关系可能会丢失。因此，在充分透化组织样品以获得良好信号强度同时仍保持样品中分析物分布的空间分辨率之间的平衡是理想的。[0354]一般来说，生物样品可通过将样品暴露于一种或多种透化剂来透化。用于此目的的合适试剂包括但不限于有机溶剂(例如丙酮、乙醇和甲醇)、交联剂(例如多聚甲醛)、洗涤剂(例如皂甙、tritonx‑100tm或tween‑20tm)，或十二烷基硫酸钠(sds)，和酶(如胰蛋白酶、蛋白酶(例如，蛋白酶k))。在一些实施方式中，去污剂是阴离子去污剂(例如sds或n‑月桂酰肌氨酸钠盐溶液)。在一些实施方式中，在酶处理(例如，用本文所述的任何酶，例如胰蛋白酶、蛋白酶(例如胃蛋白酶和/或蛋白酶k)处理)之前或之后，可以使用本文描述的任何方法(例如，使用本文描述的任何去污剂，例如sds和/或n‑月桂酰肌氨酸钠盐溶液)对生物样品进行透化。[0355]在一些实施方式中，生物样品可通过如下方式透化：将样品暴露于大于约1.0w/v％(例如，大于约2.0w/v％、大于约3.0w/v％、大于约4.0w/v％，大于约5.0w/v％，大于约6.0w/v％，大于约7.0w/v％，大于约8.0w/v％，大于约9.0w/v％，大于约10.0w/v％，大于约11.0w/v％，大于约12.0w/v％，或大于约13.0w/v％)十二烷基硫酸钠(sds)和/或n‑月桂酰肌氨酸或n‑月桂酰肌氨酸钠盐。在一些实施方式中，生物样品可通过如下方式透化：(例如，在约4％至约35℃，约4℃至约25℃，约4℃至约20℃，约4℃至约10℃，约10℃至约25℃，约10℃至约20℃，约10℃至约15℃，约35℃至约50℃，约35℃至约45℃，约35℃至约40℃，约40℃至约50℃，约40℃至约45℃，或约45℃至约50℃的温度下)，使所述样品暴露于约1.0w/v％至约14.0w/v％(例如，约2.0w/v％至约14.0w/v％，约2.0w/v％至约12.0w/v％，约2.0w/v％至约10.0w/v％，约4.0w/v％至约14.0w/v％，约4.0w/v％至约12.0w/v％，约4.0w/v％至约10.0w/v％，约6.0w/v％至约14.0w/v％，约6.0w/v％至约12.0w/v％，约6.0w/v％至约10.0w/v％，约8.0w/v％至约14.0w/v％，约8.0w/v％至约12.0w/v％，约8.0w/v％至约10.0w/v％，约10.0％w/v％至约14.0w/v％，约10.0w/v％至约12.0w/v％，或约12.0w/v％至约14.0w/v％)的sds和/或n‑月桂酰肌氨酸盐溶液和/或蛋白酶k(例如，持续约5分钟至约1小时，约5分钟至约40分钟，约5分钟至约30分钟，约5分钟至约20分钟，或约5分钟至约10分钟)。[0356]在一些实施方式中，生物样品可与透化剂一起孵育以促进样品的透化。例如，在jamur等，methodmol.biol.588：63‑66，2010中描述了样品透化的其他方法，其全部内容通过引用纳入本文。[0357]裂解试剂[0358]在一些实施方式中，可通过向样品中添加一种或多种裂解剂使生物样品透化。合适的裂解剂的示例包括但不限于生物活性试剂，例如用于裂解不同细胞类型的裂解酶，例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物，例如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌素、labiase酶、基他酶(kitalase)、溶细胞酶和多种其它市售的裂解酶。[0359]其他裂解剂可另外或替代地添加到生物样品中以促进透化。例如，基于表面活性剂的裂解溶液可用于裂解样品细胞。裂解溶液可包括离子表面活性剂，例如肌氨酰和十二烷基硫酸钠(sds)。更一般而言，化学裂解剂可包括但不限于有机溶剂、螯合剂、洗涤剂、表面活性剂和离液剂。[0360]在一些实施方式中，生物样品可通过非化学透化方法进行透化。本领域已知非化学透化方法。例如，可使用的非化学透化方法包括但不限于物理溶解技术，例如电穿孔、机械透化方法(例如，使用均质器和研磨球机械破坏样品组织结构的珠磨)、声学透化(例如，超声)和热分解技术，例如加热以诱导样品的热透化。[0361]蛋白酶[0362]在一些实施方式中，培养基、溶液或透化溶液可含有一种或多种蛋白酶。在一些实施方式中，用能够降解组蛋白的蛋白酶处理的生物样品可导致产生片段化的基因组dna。可以使用用于捕获mrna的相同捕获域(例如，具有多聚(t)序列的捕获域)来捕获片段化的基因组dna。在一些实施方式中，在空间概况分析之前用能够降解组蛋白的蛋白酶和rna保护剂处理生物样品，以促进基因组dna和mrna的捕获。[0363]在一些实施方式中，通过将样品暴露于能够降解组蛋白的蛋白酶来透化生物样品。如本文所用，术语“组蛋白”通常是指接头组蛋白(例如，h1)和/或核心组蛋白(例如，h2a、h2b、h3和h4)。在一些实施方式中，蛋白酶能降解接头组蛋白、核心组蛋白或接头组蛋白和核心组蛋白。可以使用能够降解生物样品中的组蛋白的任何合适的蛋白酶。能够降解组蛋白的蛋白酶的非限制性示例包括被亮抑酶肽和tlck(甲苯磺酰‑l‑赖氨酰‑氯甲烷盐酸盐)抑制的蛋白酶，由来自沙眼衣原体血清型a(chlamydiatrachomatisserovara)的euo基因编码的蛋白酶，颗粒酶a，丝氨酸蛋白酶(例如，胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶，中性丝氨酸蛋白酶，弹性蛋白酶，组织蛋白酶g)，天冬氨酰蛋白酶(例如，组织蛋白酶d)，肽酶家族c1酶(例如，组织蛋白酶l)，胃蛋白酶，蛋白酶k，被重氮甲烷抑制剂z‑phe‑phe‑chn(2)或环氧化物抑制剂e‑64抑制的蛋白酶，溶酶体蛋白酶或嗜天青酶(例如组织蛋白酶g、弹性蛋白酶、蛋白酶3，中性丝氨酸蛋白酶)。在一些实施方式中，丝氨酸蛋白酶是胰蛋白酶、胰蛋白酶样酶或其功能变体或衍生物(例如，p00761；c0hk48；q8iyp2；q8bw11；q6ie06；p35035；p00760；p06871；q90627；p16049；p07477；p00762；p35031；p19799；p35036；q29463；p06872；q90628；p07478；p07146；p00763；p35032；p70059；p29786；p35037；q90629；p35030；p08426；p35033；p35038；p12788；p29787；p35039；p35040；q8nhm4；p35041；p35043；p35044；p54624；p04814；p35045；p32821；p54625；p35004；p35046；p32822；p35047；c0hka5；c0hka2；p54627；p35005；c0hka6；c0hka3；p52905；p83348；p00765；p35042；p81071；p35049；p51588；p35050；p35034；p35051；p24664；p35048；p00764；p00775；p54628；p42278；p54629；p42279；q91041；p54630；p42280；c0hka4)，或其组合。在一些实施方式中，胰蛋白酶是p00761、p00760、q29463或其组合。在一些实施方式中，能够降解一种或多种组蛋白的蛋白酶包含与p00761、p00760或q29463具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，能够降解一种或多种组蛋白的蛋白酶包含与p00761、p00760或q29463具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。如果蛋白酶相对处于该酶最佳条件下的蛋白酶的活性而言具有至少50％，例如至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性，则认为该蛋白酶是功能性变体。在一些实施方式中，用胃蛋白酶或胃蛋白酶样酶的酶处理可包括：p03954/pepa1_macfu；p28712/pepa1_rabit；p27677/pepa2_macfu；p27821/pepa2_rabit；p0djd8/pepa3_human；p27822/pepa3_rabit；p0djd7/pepa4_human；p27678/pepa4_macfu；p28713/pepa4_rabit；p0djd9/pepa5_human；q9d106/pepa5_mouse；p27823/pepaf_rabit；p00792/pepa_bovin；q9n2d4/pepa_calja；q9gmy6/pepa_canlf；p00793/pepa_chick；p11489/pepa_macmu；p00791/pepa_pig；q9gmy7/pepa_rhife；q9gmy8/pepa_sorun；p81497/pepa_sunmu；p13636/pepa_ursth及其功能性变体和衍生物，或其组合。在一些实施方式中，胃蛋白酶可包括：p00791/pepa_pig；p00792/pepa_bovin，功能性变体，衍生物或其组合。[0364]此外，蛋白酶可以包含在反应混合物(溶液)中，其还包括其它成分(例如缓冲液、盐、螯合剂(例如edta)和/或去污剂(例如sds、n‑月桂酰肌氨酸钠盐溶液))。反应混合物可以带缓冲，具有约6.5‑8.5，例如约7.0‑8.0的ph。此外，反应混合物可以在任何合适的温度下使用，例如约10至50℃，例如约10至44℃、11至43℃、12至42℃、13至41℃、14至40℃、15至39℃、16至38℃、17至37℃，例如约10℃、12℃、15℃、18℃、20℃、22℃，25℃、28℃、30℃、33℃、35℃或37℃，优选约35至45℃，例如约37℃。[0365]其它试剂[0366]在一些实施方式中，透化溶液可以包含其它试剂或者可以用其它试剂处理生物样品以优化生物样品的透化。在一些实施方式中，其它试剂是rna保护剂。如本文所用，术语“rna保护剂”通常是指保护rna免受rna核酸酶(例如，rna酶)影响的试剂。可以使用保护rna免于降解的任何合适的rna保护剂。rna保护剂的非限制性示例包括有机溶剂(例如，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％v/v有机溶剂)，其包括但不限于，乙醇、甲醇、丙‑2‑醇、丙酮、三氯乙酸、丙醇、聚乙二醇、乙酸或它们的组合。在一些实施方式中，rna保护剂包括乙醇、甲醇和/或丙‑2‑醇，或其组合。在一些实施方式中，rna保护剂包括rnalaterice(赛墨飞世尔科学公司(thermofisherscientific))。在一些实施方式中，rna保护剂包含至少约60％的乙醇。在一些实施方式中，rna保护剂包含约60‑95％的乙醇、约0‑35％的甲醇和约0‑35％的丙‑2‑醇，其中培养基中有机溶剂的总量不超过约95％.在一些实施方式中，rna保护剂包含约60‑95％的乙醇、约5‑20％的甲醇和约5‑20％的丙‑2‑醇，其中培养基中有机溶剂的总量不超过约95％.[0367]在一些实施方式中，rna保护剂包括盐。所述盐可包括硫酸铵、硫酸氢铵、氯化铵、乙酸铵、硫酸铯、硫酸镉、硫酸铯铁(ii)、硫酸铬(iii)、硫酸钴(ii)、硫酸铜(ii)、氯化锂、醋酸锂、硫酸锂、硫酸镁、氯化镁、硫酸锰、氯化锰、氯化钾、硫酸钾、氯化钠、醋酸钠、硫酸钠、氯化锌、醋酸锌和硫酸锌。在一些实施方式中，盐是硫酸盐，例如硫酸铵、硫酸氢铵、硫酸铯、硫酸镉、硫酸铯铁(ii)、硫酸铬(iii)、硫酸钴(ii)、硫酸铜(ii)、硫酸锂、硫酸镁、硫酸锰、硫酸钾、硫酸钠，或硫酸锌。在一些实施方式中，盐是硫酸铵。盐可以约20g/100ml培养基或更低的浓度存在，例如约15g/100ml、10g/100ml、9g/100ml、8g/100ml、7g/100ml、6g/100ml、5g/100ml或更低，例如约4g、3g、2g或1g/100ml。[0368]此外，rna保护剂可被包含在还包含螯合剂(例如，edta)、缓冲液(例如，柠檬酸钠、乙酸钠、柠檬酸钾或乙酸钾，优选乙酸钠)和/或缓冲至ph在约4‑8之间(例如，约5)的培养基中。[0369]在一些实施方式中，在透化之前、同时或之后用一种或多种rna保护剂处理生物样品。例如，在用一种或多种透化试剂(例如，一种或多种蛋白酶)处理之前，用一种或多种rna保护剂处理生物样品。在另一个示例中，用包含一种或多种rna保护剂和一种或多种透化试剂(例如，一种或多种蛋白酶)的溶液处理生物样品。在又一个示例中，在生物样品已经用一种或多种透化试剂(例如，一种或多种蛋白酶)处理之后，用一种或多种rna保护剂处理生物样品。在一些实施方式中，生物样品在固定之前用一种或多种rna保护剂处理。[0370]在一些实施方式中，识别生物样品中捕获的分析物的位置包括核酸延伸反应。在捕获探针捕获片段化基因组dna分子的一些实施方式中，核酸延伸反应包括dna聚合酶。例如，核酸延伸反应包括用捕获的分析物(例如，片段化的基因组dna)作为模板，利用dna聚合酶来延伸与捕获的分析物(例如，片段化的基因组dna)杂交的捕获探针。延伸反应的产物包括空间条码化分析物(例如，空间条码化的片段化的基因组dna)。空间条码化分析物(例如，空间条码化的片段化的基因组dna)可用于识别分析物在生物样品中的空间位置。能够使用捕获的分析物作为模板来延伸捕获探针的任何dna聚合酶都可用于本文所述的方法。dna聚合酶的非限制性示例包括t7dna聚合酶；bsudna聚合酶；和大肠杆菌dna聚合酶poli。[0371]防扩散介质[0372]在一些实施方式中，通常用于限制分析物扩散的抗扩散介质可以包括至少一种透化试剂。例如，抗扩散介质(例如，水凝胶)可以包括含有透化缓冲液或试剂的孔(例如，微孔、纳米孔或皮孔或孔)。在一些实施方式中，在将水凝胶与样品接触之前，将抗扩散介质(例如，水凝胶)浸泡在透化缓冲液中。在一些实施方式中，当抗扩散介质应用于生物样品时，水凝胶或其他抗扩散介质可包含干燥试剂或单体以递送透化试剂。在一些实施方式中，抗扩散介质(例如，水凝胶)共价地附接到固体基材(例如，丙烯酸玻璃载玻片)。[0373]在一些实施方式中，水凝胶可以被改性为既递送透化试剂又包含捕获物。例如，水凝胶膜可经改性以包括空间条码化捕获探针。然后在将空间条码化水凝胶膜与样品接触之前，将空间条码化水凝胶膜浸泡在透化缓冲液中。在另一个示例中，水凝胶可以被改性为包括空间条码化捕获探针，并被设计成当暴露于透化缓冲液或任何其它生物样品制备试剂时用作多孔膜(例如，可透过水凝胶)。透化试剂通过空间条码化可透过水凝胶扩散，并使水凝胶另一侧的生物样品透化。在暴露于透化试剂后，随后分析物扩散到空间条码化水凝胶中。在这种情况下，空间条码化水凝胶(例如，多孔膜)促进生物样品中的生物分析物扩散到水凝胶中。在一些实施方式中，生物分析物先扩散到水凝胶中，然后暴露于透化试剂(例如，当分泌的分析物存在于生物样品之外时，或者在加入透化试剂之前通过其它方式溶解或透化生物样品的情况下)。在一些实施方式中，透化试剂以可变流速(例如，促进透化试剂扩散穿过空间条码化水凝胶的任何流速)流过水凝胶。在一些实施方式中，透化试剂流过空间条码化水凝胶上的微流体室或通道。在一些实施方式中，在利用流动将透化试剂引入生物样品之后，可以使生物样品制备试剂流过水凝胶以进一步促进生物分析物扩散到空间条码化的水凝胶中。因此，空间条码化水凝胶膜将透化试剂输送到与空间条码化水凝胶接触的样品表面，增强分析物迁移和捕获。在一些实施方式中，将空间条码化水凝胶应用于样品并放置在大量透化溶液中。在一些实施方式中，浸泡在透化试剂中的水凝胶膜夹在样品和空间条码化阵列之间。在一些实施方式中，目标分析物能够扩散穿过透化试剂浸泡的水凝胶，并在水凝胶的另一侧杂交或结合捕获探针。在一些实施方式中，水凝胶的厚度与分辨率损失成比例。在一些实施方式中，孔(例如，微米孔、纳米孔或皮米孔)可包含空间条码化捕获探针和透化试剂和/或缓冲液。在一些实施方式中，空间条码化捕获探针和透化试剂保持在间隔物之间。在一些实施方式中，样品被打孔、切割或转移到孔中，其中目标分析物通过透化试剂/缓冲液扩散到空间条形化捕获探针。在一些实施方式中，分辨率损失可与间隙厚度成比例(例如，样品和捕获探针之间的透化缓冲液的量)。在一些实施方式中，抗扩散介质(例如水凝胶)的厚度在约50‑500微米之间，包括500、450、400、350、300、250、200、150、100或50微米的厚度，或在50和500微米内的任何厚度。[0374]在一些实施方式中，使生物样品暴露于多孔膜(例如，可透化水凝胶)以帮助透化并限制扩散分析物损失，同时允许透化试剂到达样品。膜化学和孔体积可以控制，以尽量减少分析物损失。在一些实施方式中，多孔膜可由玻璃、硅、纸、水凝胶、聚合物整体或其他材料制成。在一些实施方式中，材料可以是天然多孔的。在一些实施方式中，该材料可具有蚀刻到固体材料中的孔或洞。在一些实施方式中，透化试剂流过多孔膜上的微流体腔室或通道。在一些实施方式中，流控制样品对透化试剂的可及性。在一些实施方式中，多孔膜是可透过的水凝胶。例如，当透化试剂和/或生物样品制备试剂可以利用扩散穿过水凝胶时，水凝胶是可透化的。本文所述的任何合适的透化试剂和/或生物样品制备试剂可以在足以从生物样品中释放分析物(例如，核酸、蛋白质、代谢物、脂质等)的条件下使用。在一些实施方式中，水凝胶在一侧暴露于生物样品而在另一侧暴露于透化试剂。透化试剂扩散通过可透过水凝胶并使水凝胶另一侧的生物样品透化。在一些实施方式中，使透化试剂以可变流速(例如，促进透化试剂穿过水凝胶扩散的任何流速)流过水凝胶。在一些实施方式中，透化试剂流过水凝胶上方的微流体腔室或通道。使透化试剂流经水凝胶的操作允许控制试剂的浓度。在一些实施方式中，可以调整水凝胶化学和孔体积以增强透化并限制扩散分析物损失。[0375]在一些实施方式中，多孔膜夹在空间条码化阵列和样品之间，其中透化溶液施加在多孔膜上。透化试剂通过膜孔扩散进入生物样品。在一些实施方式中，生物样品可以放置在基材(例如，载玻片)上。然后生物分析物通过多孔膜扩散并进入包含捕获探针的空间。在一些实施方式中，多孔膜被改性为包括捕获探针。例如，可以使用本文所述的任何方法将捕获探针连接到多孔膜的表面。在另一个示例中，捕获探针可以以允许与生物分析物相互作用的任何深度嵌入多孔膜中。在一些实施方式中，多孔膜以允许多孔膜上的捕获探针与来自生物样品的生物分析物之间相互作用的构造放置在生物样品上。例如，捕获探针位于多孔膜靠近生物样品的一侧。在这种情况下，多孔膜另一侧的透化试剂通过多孔膜扩散到包含生物样品和捕获探针的位置，以促进生物样品的透化(例如，也促进捕获探针对生物分析物的捕获)。在一些实施方式中，多孔膜位于样品和捕获探针之间。在一些实施方式中，透化试剂流过多孔膜上的微流体腔室或通道。[0376]选择性透化/选择性裂解[0377]在一些实施方式中，可根据已建立的方法处理生物样品以从细胞的亚细胞区选择性地释放分析物。在一些实施方式中，本文提供的方法可包括检测生物样品中细胞的亚细胞区中存在的至少一种生物分析物。如本文所用，“亚细胞区”可指任何亚细胞区。例如，亚细胞区可以指细胞质、线粒体、细胞核、核仁、内质网、溶酶体、囊泡、高尔基体、质体、液泡、核糖体、细胞骨架或其组合。在一些实施方式中，亚细胞区包含胞质溶胶、细胞核、线粒体和微粒体中的至少一种。在一些实施方式中，亚细胞区是胞质溶胶。在一些实施方式中，亚细胞区是细胞核。在一些实施方式中，亚细胞区是线粒体。在一些实施方式中，亚细胞区是微粒体。[0378]例如，生物分析物可以通过选择性透化或选择性裂解从细胞的亚细胞区选择性释放。在一些实施方式中，“选择性透化”可以指可以透化亚细胞区的膜同时保持不同亚细胞区基本完整的透化方法(例如，生物分析物不会因所应用的透化方法而从亚细胞区释放)。选择性透化方法的非限制性示例包括使用电泳和/或应用透化试剂。在一些实施方式中，“选择性裂解”可以指可以裂解亚细胞区的膜同时保持不同亚细胞区基本完整的裂解方法(例如，生物分析物不会因所应用的裂解方法而从亚细胞区释放)。用于选择性透化或裂解的几种方法是本领域技术人员已知的，包括以下所述的方法：lu等.labchip.2005年1月；5(1)：23‑9；niklas等.analbiochem.2011年9月15日；416(2)：218‑27；cox和emili.natprotoc.2006；1(4)：1872‑8；chiang等.jbiochem.biophys.methods.2000年11月20日；46(1‑2)：53‑68；和yamauchi和herr等.microsyst.nanoeng.2017；3.pii：16079；其各自通过引用其全文的方式纳入本文。[0379]在一些实施方式中，“选择性透化”或“选择性裂解”是指特定细胞类型的选择性透化或选择性裂解。例如，“选择性透化”或“选择性裂解”可以指裂解一种细胞类型同时保持不同细胞类型基本完整(例如，生物分析物不会因应用的透化或裂解方法而从细胞中释放)。与另一细胞“不同的细胞类型”的细胞可以指来自不同分类界的细胞、原核细胞对比真核细胞、来自不同组织类型的细胞等。本领域技术人员已知用于选择性透化或裂解不同细胞类型的许多方法。非限制性示例包括应用透化试剂、电穿孔和/或超声处理。参见例如，国际申请号wo2012/168003；han等，microsystnanoeng.2019年6月17日；5：30；gould等.oncotarget.2018年3月20日；9(21)：15606‑15615；oren和shai.biochemistry.1997年2月18日；36(7)：1826‑35；algayer等.molecules.2019年5月31日；24(11).pii：e2079；hipp等.leukemia.2017年10月；31(10)：2278；国际申请号wo2012/168003；和，美国专利号7,785,869；它们均通过引用其全文的方式纳入本文。[0380]在一些实施方式中，应用选择性透化或裂解试剂包括使生物样品与包含透化或裂解试剂的水凝胶接触。[0381]在一些实施方式中，生物样品与两个或更多个阵列(例如，如本文所述的柔性阵列)接触。例如，在亚细胞区被透化并且来自亚细胞区的生物分析物被第一阵列捕获之后，可以移除第一阵列，并且可以在第二阵列上捕获来自不同亚细胞区的生物分析物。[0382](14)rna物质的选择性富集[0383]在其中rna是分析物的一些实施方式中，可以选择性地富集一种或多种感兴趣的rna分析物种类(例如，adiconis等，用于降解和低输入样品的rna测序方法的比较分析(comparativeanalysisofrnasequencingmethodsfordegradedandlow‑inputsamples)，nature，第10卷，2013年7月，623‑632，通过引用其全文纳入本文)。例如，可以通过向样品中添加一个或多个寡核苷酸来选择一种或多种rna。在一些实施方式中，其它寡核苷酸是用于通过聚合酶引发反应的序列。例如，与一种或多种感兴趣的rna具有序列互补性的一种或多种引物序列可用于扩增一种或多种感兴趣的rna，从而选择性地富集这些rna。在一些实施方式中，与捕获的rna(例如cdna)的互补链具有序列互补性的寡核苷酸可结合到cdna。例如，具有与一种或多种感兴趣的cdna互补的序列的生物素化寡核苷酸能够结合到cdna并且可以利用生物素化‑链霉亲和素亲和力，使用本领域已知的各种方法中的任何一种(例如，链霉亲和素珠)来选择。[0384]或者，可以使用多种方法中的任一种来向下选择(例如，移除、消耗)一种或多种rna(例如，核糖体和/或线粒体rna)。核糖体rna消耗的杂交和捕获方法的非限制性示例包括ribominustm、ribocoptm和ribo‑zerotm。另一种非限制性rna消耗方法包括，将互补dna寡核苷酸与不需要的rna杂交，然后使用rna酶h降解rna/dna杂交体。杂交和降解方法的非限制性示例包括消耗、nugenanydeplete、truseqtm。另一种非限制性核糖体rna消耗方法包括zaprtm消化，例如smarter。在smarter方法中，随机核酸接合物与rna杂交，用于通过逆转录酶进行第一链合成和加尾，然后通过逆转录酶进行模板转换和延伸。此外，第一轮pcr扩增添加全长illumina测序接合物(sequencingadapter)(例如，illumina索引)。核糖体rna被zaprv2和r探针v2裂解。进行第二轮pcr，扩增非rrna分子(例如，cdna)。这些核糖体消耗方案/试剂盒的部分或步骤可以进一步与本文所述的方法组合以优化用于特定生物样品的方案。[0385]在消耗方案中，可以将探针给予选择性地与核糖体rna(rrna)杂交的样品，从而减少样品中rrna的汇集(pool)和浓度。可以将探针施用于与线粒体rna(mtrna)选择性杂交的生物样品，从而减少样品中mtrna的汇集和浓度。在一些实施方式中，可以在cdna合成过程中添加与线粒体rna互补的探针，或者可以在cdna合成过程中添加与核糖体和线粒体rna两者均互补的探针。随后将捕获探针应用于样品可能会导致由于样品中存在的非特异性rna(例如，向下选择的rna)的减少所致的对其他类型rna的捕获的改善。另外或者，双链特异性核酸酶(dsn)处理可移除rrna(参见，例如，archer等，在cdna阶段从rna‑seq文库选择性和灵活移除有问题的序列(selectiveandflexibledepletionofproblematicsequencesfromrna‑seqlibrariesatthecdnastage)，bmcgenomics，15401，(2014)，其全部内容通过引用纳入本文)。此外，羟基磷灰石色谱法可移除丰富的物质(例如，rrna)(参见，例如，vandernoot，v.a.，羟基磷灰石色谱法cdna标准化以丰富rna‑seq应用中的转录组多样性(cdnanormalizationbyhydroxyapatitechromatographytoenrichtranscriptomediversityinrna‑seqapplications)，biotechniques，53(6)373‑80，(2012)，其全部内容通过引用纳入本文)。[0386](15)其他试剂[0387]在分析样品之前，可以向生物样品中添加其它试剂以进行各种功能。在一些实施方式中，可以将核酸酶抑制剂例如dna酶和rna酶失活剂或蛋白酶抑制剂和/或螯合剂例如edta添加到生物样品中。在其它实施方式中，向样品中加入核酸酶，例如dna酶或rna酶，或蛋白酶，例如胃蛋白酶或蛋白酶k。在一些实施方式中，可将其它试剂溶解在溶液中或作为介质施用于样品。在一些实施方式中，其它试剂(例如胃蛋白酶)可以在施用于样品之前溶解在hcl中。[0388]在一些实施方式中，生物样品可以用一种或多种酶处理。例如，可以添加一种或多种用于片段化dna的核酸内切酶、dna聚合酶和用于扩增核酸的dntp。也可添加到生物样品中的其他酶包括但不限于聚合酶、转座酶、连接酶、dna酶和rna酶。[0389]在一些实施方式中，可将逆转录酶添加到样品中，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和模板转换寡核苷酸(tso)。模板转换可用于增加cdna的长度，例如，通过将预定义的核酸序列附加到cdna。在一些实施方式中，附加的核酸序列包含一个或多个核糖核苷酸。[0390]在一些实施方式中，可以添加其它试剂以提高一种或多种靶分子(例如，edna分子、mrna转录物)的回收率。例如，在rna样品工作流程中添加运载体rna可以提高从生物样品中提取的rna/dna杂交体的产量。在一些实施方式中，当输入或目标分子的浓度与剩余分子相比较低时，运载体分子是有用的。通常，单个目标分子无法形成沉淀，加入运载体分子有助于形成沉淀。一些目标分子回收方案使用运载体rna来防止样品中存在的少量目标核酸不可逆地结合。在一些实施方式中，运载体rna可以在紧接在第二链合成步骤之前添加。在一些实施方式中，在从阵列释放的寡核苷酸上合成第二链edna之前，可以立即添加运载体rna。在一些实施方式中，可以在体外转录后净化步骤之前立即添加运载体rna。在一些实施方式中，可以在扩增的rna纯化和定量之前添加运载体rna。在一些实施方式中，可以在rna定量之前添加运载体rna。在一些实施方式中，运载体rna可以在第二链edna合成和体外转录后净化步骤之前立即添加。[0391](16)用于捕获探针相互作用的预处理[0392]在一些实施方式中，生物样品中的分析物可在与捕获探针相互作用之前进行预处理。例如，在与捕获探针相互作用之前，在生物样品中进行由聚合酶(例如dna聚合酶或逆转录酶)催化的聚合反应。在一些实施方式中，用于聚合反应的引物包括增强与捕获探针杂交的官能团。捕获探针可包括适当的捕获域以捕获感兴趣的生物分析物(例如，多聚(dt)序列以捕获多聚(a)mrna)。[0393]在一些实施方式中，通过下一代测序对生物分析物进行预处理以产生文库。例如，可以通过添加修饰物(例如，连接使与捕获探针相互作用的序列)来预处理分析物。在一些实施方式中，使用片段化技术(例如，使用转座酶和/或片段化缓冲液)片段化分析物(例如，dna或rna)。[0394]片段化后可对分析物进行修饰。例如，修饰可以是通过连接使与捕获探针杂交的衔接子序列来添加。在一些实施方式中，其中感兴趣的分析物是rna，进行多聚(a)加尾。将多聚(a)尾添加到不包含多聚(a)尾的rna可促进与包含具有功能量的多聚(dt)序列的捕获域的捕获探针的杂交。[0395]在一些实施方式中，在与捕获探针相互作用之前，在生物样品中进行由连接酶催化的连接反应。在一些实施方式中，可以通过化学连接来进行连接。在一些实施方式中，可以使用点击化学来进行连接，如下所述。在一些实施方式中，捕获域包括与rna分子具有互补性的dna序列，其中rna分子与第二dna序列具有互补性，并且其中rna‑dna序列互补性用于将第二dna序列连接到捕获域中的dna序列。在这些实施方式中，可以直接检测rna分子。[0396]在一些实施方式中，在与捕获探针相互作用之前，在生物样品中进行靶特异性反应。靶特异性反应的示例包括但不限于靶向特异性衔接子、探针和/或其他寡核苷酸的连接、使用对一种或多种分析物特异性引物的靶特异性扩增、以及使用原位杂交、dna显微镜和/或抗体检测的靶特异性检测。在一些实施方式中，捕获探针包括被靶向到靶特异性产物的捕获域(例如，扩增或连接)。[0397]ii.一般基于空间阵列的分析方法[0398]本文提供用于生物样品的基于空间阵列的分析的方法、装置、系统和组合物。[0399](a)空间分析方法[0400]基于阵列的空间分析方法涉及将一种或多种分析物从生物样品转移到基材上的特征阵列，其中各特征与阵列上的独特空间位置相关。转移分析物的后续分析包括确定分析物的相同性以及生物样品中每种分析物的空间位置。每种分析物在生物样品中的空间位置是基于阵列中每个分析物所结合的特征以及特征在阵列上的相对空间位置来确定的。[0401]存在至少两种将空间条形码与一个或多个相邻细胞相关联的一般方法，使得空间条形码将一个或多个细胞和/或一个或多个细胞的内容标识为与特定空间位置相关联。一种一般方法是促进分析物出细胞并朝向空间条码化阵列。图1描绘了该一般方法的示例性实施方式。在图1中，使聚集有捕获探针(如本文进一步描述)的空间条码化阵列与生物样品101接触，并且生物样品被透化，使分析物从样品迁移到阵列。分析物与空间条码化阵列102上的捕获探针相互作用。一旦分析物杂交/结合到捕获探针，则任选地从阵列移出样品并且分析捕获探针以获得空间解析的分析物信息103。[0402]另一种一般方法是从阵列裂解空间条码化捕获探针，并促进空间条码化捕获探针朝向生物样品和/或至生物样品中或至生物样品上。图2描绘了该一般方法的示例性实施方式，使聚集有捕获探针(如本文进一步描述的)的空间条码化阵列可以与样品201接触。空间条码化捕获探针被裂解，然后与所提供生物样品202内的细胞相互作用。这种相互作用可以是共价或非共价的细胞表面相互作用。该相互作用可以是由递送系统或细胞穿透肽促进的细胞内相互作用。一旦空间条码化捕获探针与特定细胞相关联，就可以任选地移出样品以进行分析。样品在分析前可以选择性地分离。一旦标记的细胞与空间条码化捕获探针相关联，就可以分析捕获探针以获得关于标记的细胞203的空间解析信息。[0403]图3示出了包括在空间条码化阵列301上制备生物样品的示例性工作流。样品制备可包括将样品放置在载玻片上、固定样品和/或染色生物样品以供成像。然后可使用亮场(对样品苏木精和伊红染色成像)和荧光(对特征成像)模式在阵列302上对染色样品成像。可选地，样品可以在透化之前脱色。在一些实施方式中，然后从样品中释放分析物，并且形成空间条码化阵列的捕获探针杂交或结合释放的分析物303。然后从阵列304移出样品，并且从阵列305中裂解捕获探针。然后在两种模式305b中任选地对生物样品和阵列进行第二成像，同时将分析物反向转录成cdna，并且制备扩增子文库306并测序307。这两组图像随后在空间上重叠，以便关联在空间上识别的生物样品信息308。当样品和阵列没有第二成像305b时，换而提供点坐标文件。点坐标文件替换第二成像步骤305b。此外，可以使用独特pcr衔接子和测序307来进行扩增子文库制备306。[0404]图4显示了另一个示例性工作流程，其利用基材上的空间条码化阵列，其中空间条码化捕获探针聚集在称为特征的区域。空间条码化捕获探针可以包括裂解结构域、一个或多个功能结构域、空间条形码、独特分子标识符和捕获域。空间条码化捕获探针还可以包括5′端修饰，用于可逆地附接到基材。空间条码化阵列与生物样品401接触，并且通过应用透化试剂402使样品透化。透化试剂可通过将阵列/样品组件放置在大量溶液中来给予。或者，可经由抗扩散介质和/或物理屏障(例如盖)向样品给予透化试剂，其中样品夹在抗扩散介质和/或屏障与包含阵列的基材之间。使用本文公开的任何数量的技术将分析物迁移到空间条码化捕获阵列。例如，分析物迁移可以使用抗扩散介质盖和被动迁移进行。作为另一示例，例如，使用电泳转移系统，分析物迁移可以是主动迁移。一旦分析物接近空间条码化捕获探针，捕获探针可杂交或以其他方式结合目标分析物403。可以任选地从阵列404移出生物样品。[0405]捕获探针可任选地从阵列405裂解，并且捕获的分析物可通过进行逆转录酶第一链cdna反应来被空间条码化。第一链cdna反应可任选地使用模板转换寡核苷酸来进行。例如，模板转换寡核苷酸可与通过逆转录酶添加到cdna3′端的多聚(c)尾以模板非依赖方式杂交。原始的mrna模板和模板转换寡核苷酸可以从cdna中变性，然后空间条码化捕获探针可以与cdna杂交并可生成cdna的互补物。然后可以纯化第一链cdna并收集用于下游扩增步骤。可使用pcr406扩增第一链cdna，其中正向和反向引物侧接感兴趣的空间条形码和分析物区域，产生与特定空间条形码相关联的文库。在一些实施方式中，cdna包含合成测序(sbs)引物序列。对文库扩增子进行测序和分析以解码空间信息407。[0406]使用本文所述的方法、组合物、系统、试剂盒和装置，生物样品(例如，组织样品)中存在的rna转录物可用于空间转录组分析。特别地，在一些情况下，条码化寡核苷酸可被设置为从rna模板或其衍生物引发、复制并因此产生条码化延伸产物。例如，在一些情况下，条码化的寡核苷酸可以包括mrna特异性引发序列，例如允许在逆转录反应中引发和复制mrna的聚‑t引物片段或其它靶向引发序列。或者或另外，随机rna引发可使用条码化寡核苷酸的随机n‑聚物(n‑mer)引物区段进行。逆转录酶(rt)可以使用rna模板和与rna模板3′端互补的引物来指导第一链互补dna(cdna)的合成。许多rt可用于该逆转录反应，包括例如禽成髓细胞瘤病毒(amv)逆转录酶、莫洛尼鼠白血病病毒(m‑mulv或mmlv)及其其它变体。一些重组m‑mulv逆转录酶，例如逆转录酶，与其野生型对应物相比可能会具有降低的rna酶h活性和增加的热稳定性，并提供更高的特异性、更高的cdna产量和更完整的长度可达12千碱基(kb)的cdna产物。在一些实施方式中，逆转录酶是突变逆转录酶，例如，但不限于，突变的mmlv逆转录酶。在另一个实施方式中，逆转录酶是突变的mmlv逆转录酶，例如但不限于美国专利公开号20180312822中描述的一种或多种变体，其通过引用其全文方式纳入本文。[0407]图5描述了一个示例性工作流，其中生物样品从空间条码化阵列移出，并且空间条码化捕获探针从阵列移出，用于条码化分析物扩增和文库制备。另一实施方式包括在空间条码化阵列上使用模板转换寡核苷酸进行第一链合成而不切割捕获探针。在本实施方式中，样品制备501和透化502如本文别处所述进行。一旦捕获探针捕获分析物，通过模板转换和逆转录酶503产生的第一链edna随后被变性，并且第二链随后被延伸504。然后将第二链edna从第一链edna变性、中和并转移到管505。edna定量和扩增可以使用本文讨论的标准技术来进行。然后，edna可经历文库制备506和索引化507，包括片段化、末端修复和a‑加尾以及索引化pcr步骤。[0408]在上述工作流程的非限制性示例中，生物样品(例如，组织切片)可以用甲醇固定、用苏木精和伊红染色并成像。可选地，样品可以在透化之前脱色。这些图像可用于将空间基因表达模式映射回生物样品。透化酶可用于直接在载玻片上透化生物样品。从生物样品的上覆细胞(overlyingcell)释放的分析物(例如，聚腺苷酸化的mrna)可以被基材上的捕获区域内的捕获探针捕获。可以将逆转录(rt)试剂添加到透化的生物样品中。与rt试剂一起孵育可以从捕获的分析物(例如，聚腺苷酸化的mrna)产生空间条码化的全长edna。第二链试剂(例如，第二链引物、酶)可被添加到载玻片上的生物样品中以起始第二链合成。所得的cdna可以从捕获探针模板变性并转移(例如，转移至干净的管中)用于扩增和/或文库构建。空间条码化的全长cdna可以在文库构建之前通过pcr进行扩增。然后可以对cdna进行酶促片段化和大小选择，以优化cdna扩增子的大小。p5、p7、i7和i5可作为样品索引(sampleindex)，truseqread2可通过末端修复(endrepair)、a‑加尾、衔接子延长(adapterligation)、pcr等方式添加。然后可以使用truseqread1和truseqread2作为测序引物位点，使用双端测序(paired‑endedsequencing)对cdna片段进行测序。[0409]在一些实施方式中，对由该工作流和本文描述的其他工作流产生的数据进行相关分析可以产生跨两个捕获区域表达的基因的95％以上的相关性(例如，95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)。当使用细胞核的单细胞rna测序来进行所述工作流时，在一些实施方式中，数据的相关分析可产生跨两个捕获区域表达的基因的超过90％(例如超过90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的相关性。[0410]在一些实施方式中，在(例如，通过逆转录)产生cdna之后，可以直接在基材表面上扩增所述cdna。通过直接在基材表面上扩增来生成cdna(例如，从捕获的分析物合成的cdna)的多个拷贝可以提高最终测序文库的复杂性。因此，在一些实施方式中，cdna可以通过等温核酸扩增直接在基材表面上扩增。在一些实施方式中，等温核酸扩增可扩增rna或dna。[0411]在一些实施方式中，等温扩增可以比标准pcr反应更快。在一些实施方式中，等温扩增可以是线性扩增(例如，与单个引物不对称)或指数扩增(例如，与两个引物)。在一些实施方式中，等温核酸扩增可以通过模板转换寡核苷酸引物进行。在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸将共同序列添加到正被逆转录的rna的5′端。例如，在捕获探针与分析物(例如，mrna)相互作用并进行逆转录后，将其它核苷酸添加到cdna的末端，产生如本文所述的3′突出端。在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸与逆转录酶添加的非模板化多聚(c)核苷酸杂交，以继续向模板转换寡核苷酸的5′端的复制，从而生成准备用于进一步扩增的全长cdna。在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸向用于cdna扩增的全长cdna添加共同的5′序列(例如，模板转换寡核苷酸的反向互补物)。[0412]在一些实施方式中，一旦生成全长cdna分子，模板转换寡核苷酸可作为cdna扩增反应(例如，采用dna聚合酶)中的引物。在一些实施方式中，双链cdna(例如，第一链cdna和第二链反向互补cdna)可以通过用解旋酶或重组酶，然后是链置换dna聚合酶等温扩增。链置换dna聚合酶可产生置换的第二条链，从而产生扩增产物。[0413]在本文所述的任何等温扩增方法中，条形码交换(例如，空间条形码)可在第一扩增循环之后发生，其中在基材表面上存在未使用的捕获探针。在一些实施方式中，未使用的捕获探针的游离3′oh末端可以通过任何合适的3′oh封闭方法封闭。在一些实施方式中，可以通过发夹连接封闭3′oh。[0414]等温核酸扩增可用作标准pcr反应的补充或替代(例如，需要加热至约95℃以使双链dna变性的pcr反应)。等温核酸扩增通常不需要使用热循环仪，然而在一些实施方式中，等温扩增可以在热循环仪中进行。在一些实施方式中，等温扩增可在约35℃至75℃进行。在一些实施方式中，等温扩增可在约40℃，约45℃，约50℃，约55℃，约60℃，约65℃，或约70℃，或介于两者之间的任何温度进行，这取决于使用的聚合酶和辅助酶。[0415]等温核酸扩增技术是本领域已知的，并且可以单独使用或与本文所述的任何空间方法联合使用。例如，合适的等温核酸扩增技术的非限制性示例包括：转录介导的扩增，基于核酸序列的扩增，信号介导的rna扩增技术，链置换扩增，滚环扩增，环介导的dna等温扩增(lamp)，等温多重置换扩增，重组酶聚合酶扩增，解旋酶依赖性扩增，单引物等温扩增和环状解旋酶依赖性扩增(参见，例如，gill和ghaemi，核酸等温扩增技术：综述(nucleicacidisothermalamplificationtechnologies：areview)，nucleosides，nucleotides，&nucleicacids，27(3)，224‑43，doi：10.1080/15257770701845204(2008)，其通过引用其全文的方式纳入本文。[0416]在一些实施方式中，等温核酸扩增是解旋酶依赖性核酸扩增。解旋酶依赖性等温核酸扩增描述于，vincent等，解旋酶依赖性等温dna扩增(helicase‑dependentisothermaldnaamplification)，emborep.，795‑800(2004)和美国专利号7,282,328，这两者通过引用其全文的方式纳入本文。基质上(例如芯片上)的解旋酶依赖性核酸扩增描述于andresen等，解旋酶依赖性扩增：用于onchip扩增和床旁诊断的潜力(helicase‑dependentamplification：useinonchipamplificationandpotentialforpoint‑of‑carediagnostics)，expertrevmoldiagn.，9，645‑650，doi：10.1586/erm.09.46(2009)，其通过引用其全文方式纳入本文。在一些实施方式中，等温核酸扩增是重组酶聚合酶核酸扩增。重组酶聚合酶核酸扩增描述于piepenburg等，采用重组蛋白的dna检测(dnadetectionusingrecombinantproteins)，plosbiol.，4，7e204(2006)和li等，综述：十年发展的重组酶聚合酶扩增的综合性概述(review：acomprehensivesummaryofadecadedevelopmentoftherecombinasepolymeraseamplification)，analyst，144，31‑67，doi：10.1039/c8an01621f(2019)，两者均通过引用其全文方式纳入本文。[0417]通常，等温扩增技术使用本领域已知的标准pcr试剂(例如缓冲液、dntp等)。一些等温扩增技术可能需要其它试剂。例如，解旋酶依赖性核酸扩增使用单链结合蛋白和辅助蛋白。在另一个示例中，重组酶聚合酶核酸扩增使用重组酶(例如，t4uvsx)、重组酶加载因子(例如，tfuvsy)、单链结合蛋白(例如，t4gp32)、拥挤剂(例如，peg‑35k)和atp。[0418]在通过本文中的任何方法描述的全长cdna的等温核酸扩增后，等温扩增的cdna(例如，单链或双链)可以从基材回收，并且任选地随后在微量离心管中进行采用典型cdnapcr的扩增。然后可以将样品与本文所述的任何空间方法一起使用。[0419](i)免疫组织化学和免疫荧光[0420]在一些实施方式中，免疫荧光或免疫组织化学方案(直接和间接染色技术)可以作为本文呈现的示例性空间工作流程的部分或附加部分来执行。例如，可以根据本文所述的方法固定组织切片。可以将生物样品转移至阵列(例如，捕获探针阵列)，其中使用免疫荧光方案探测分析物(例如，蛋白质)。例如，可以对样品进行再水合、封闭和透化(3xssc、2％bsa、0.1％tritonx、1u/μlrna酶抑制剂，4℃持续10分钟)，然后用荧光一抗染色(1∶100于3xssc，2％bsa、0.1％tritonx、1u/μlrna酶抑制剂，4℃持续30分钟)。可对生物样品进行洗涤、加盖玻片(在甘油 1u/μlrna酶抑制剂中)、成像(例如，使用共聚焦显微镜或其他能够进行荧光检测的装置)、洗涤和处理(根据本文所述的分析物捕获或空间工作流程)。[0421]如本文所用，“抗原修复缓冲液”可改善if/ihc方案中的抗体捕获。抗原修复的示例性方案可以是预热抗原修复缓冲液(例如，至95℃)，将生物样品浸入加热的抗原修复缓冲液中持续预定时间，然后从抗原修复缓冲液中取出生物样品并洗涤生物样品。[0422]在一些实施方式中，优化透化对于鉴定细胞内分析物可能是有用的。透化优化可以包括选择透化剂、透化剂的浓度和透化持续时间。组织透化在本文别处讨论。[0423]在一些实施方式中，在标记(1abeling)生物样品的准备过程中封闭阵列和/或生物样品能降低抗体与阵列和/或生物样品的非特异性结合(减低背景)。一些实施方式提供了可以在施用标记物之前和/或期间施加的封闭缓冲液/封闭溶液，其中封闭缓冲液可以包括封闭剂和任选的表面活性剂和/或盐溶液。在一些实施方式中，封闭剂可以是牛血清白蛋白(bsa)、血清、明胶(例如鱼明胶)、牛奶(例如脱脂奶粉)、酪蛋白、聚乙二醇(peg)、聚乙烯醇(pva)，或聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、生物素封闭剂、过氧化物酶封闭剂、左旋咪唑、卡诺伊溶液(carnoy′ssolution)、甘氨酸、赖氨酸、硼氢化钠、泮胺天蓝(pontamineskyblue)、苏丹黑、台盼蓝、fitc封闭剂和/或醋酸。封闭缓冲液/封闭溶液可以在对生物样品进行标记(例如，应用偶联了荧光团的抗体)之前和/或期间施用于阵列和/或生物样品。[0424]在一些实施方式中，在联合空间阵列进行if/ihc方案中可以包括其它步骤或优化。在进行本文讨论的空间加标的分析物捕获剂工作流程中可以包括其它步骤或优化。[0425]在一些实施方式中，本文提供用于对来自生物样品(例如，存在于生物样品，例如组织切片中的分析物)的分析物(例如，检测分析物，例如生物分析物)进行空间检测的方法，所述方法包括：(a)在基材上提供生物样品；(b)对基材上的生物样品进行染色，对染色后的生物样品进行成像，和选择生物样品或生物样品的亚区(subsection)(例如感兴趣的区域)进行分析；(c)提供在基材上包含一组或多组多个捕获探针的阵列；(d)使生物样品与阵列接触，从而允许一组或多组多个捕获探针中的捕获探针捕获感兴趣的分析物；和(e)分析捕获的分析物，从而对感兴趣的分析物进行空间分析。可根据本文所述的方法使用本文所述的或本领域已知的任何种类的染色和成像技术。在一些实施方式中，染色包括如本文所述的光学标记物，包括但不限于荧光标记物、放射性标记物、化学发光标记物、量热或比色可检测标记物。在一些实施方式中，染色包括针对生物样品中的目标分析物(例如，细胞表面或细胞内蛋白质)的荧光抗体。在一些实施方式中，染色包括针对生物样品中的目标分析物(例如，细胞表面或细胞内蛋白质)的免疫组织化学染色。在一些实施方式中，染色包括化学染剂，例如苏木精和伊红(h&e)或高碘酸希夫(pas)。在一些实施方式中，在对生物样品进行染色和/或成像与进行分析之间可以相隔相当长的时间(例如，数天、数月或数年)。在一些实施方式中，在阵列与生物样品接触之前、同时或之后，将用于进行分析的试剂添加到生物样品中。在一些实施方式中，步骤(d)包括将阵列放置在生物样品上。在一些实施方式中，阵列是柔性阵列，其中多个空间条码化特征(例如，具有捕获探针的基材、具有捕获探针的珠)附接到柔性基材。在一些实施方式中，在阵列与生物样品接触之前，采取措施以减慢反应(例如，降低生物样品的温度或使用优先在与其最佳功能温度相比更低或更高温度下进行其主要功能的酶)。在一些实施方式中，在不使生物样品与阵列脱离接触的情况下进行步骤(e)。在一些实施方式中，在生物样品不再与阵列接触之后进行步骤(e)。在一些实施方式中，在生物样品的染色和/或成像之前、同时或之后用分析物捕获剂对生物样品加标。在这种情况下，在染色和/或成像与进行分析之间可相隔相当长的时间(例如，数天、数月或数年)。在一些实施方式中，阵列适于促进生物分析物从染色和/或成像的生物样品迁移到阵列上(例如，使用本文所述的任何材料或方法)。在一些实施方式中，生物样品在与阵列接触之前被透化。在一些实施方式中，在生物样品与阵列接触之前减慢透化速率(例如，以限制分析物从其在生物样品中的原始位置扩散)。在一些实施方式中，调节透化速率(例如调节透化试剂的活性)可以通过调节生物样品所暴露的条件(例如调节温度、ph和/或光)来实现。在一些实施方式中，调节透化速率包括使用外部刺激(例如，小分子、酶和/或活化试剂)来调节透化速率。例如，可以在与阵列接触之前向生物样品提供透化试剂，该透化试剂在条件(例如，温度、ph和/或光)改变或提供外部刺激(例如，小分子、酶和/或活化剂)之前无活性。[0426]在一些实施方式中，本文提供用于对来自生物样品(例如，存在于生物样品，例如组织切片中的分析物)的分析物(例如，检测分析物，例如生物分析物)进行空间检测的方法，所述方法包括：(a)在基材上提供生物样品；(b)对基材上的生物样品进行染色，对染色后的生物样品进行成像，和选择生物样品或生物样品的亚区(subsection)(例如感兴趣的区域)进行空间转录组学分析；(c)提供在基材上包含一组或多组多个捕获探针的阵列；(d)使生物样品与阵列接触，从而允许一组或多组多个捕获探针中的捕获探针捕获感兴趣的生物分析物；和(e)分析捕获的生物分析物，从而对感兴趣的生物分析物进行空间分析。[0427](b)捕获探针[0428]“捕获探针”是指能够捕获(直接或间接)和/或标记生物样品中的分析物(例如，感兴趣的分析物)的任何分子。在一些实施方式中，捕获探针是核酸或多肽。在一些实施方式中，捕获探针是偶联物(例如，寡核苷酸‑抗体偶联物)。在一些实施方式中，捕获探针包括条形码(例如，空间条形码和/或独特分子标识符(umi))和捕获域。[0429]图6是示出如本文所述的捕获探针的示例的示意图。如图所示，捕获探针602任选地通过例如二硫键接头的裂解域603耦合到特征601。捕获探针可包括对后续处理有用的功能性序列，例如功能性序列604，其可包括测序仪特异性流动池附接序列，例如p5序列，以及功能性序列606，其可包括测序引物序列，例如r1引物结合位点。在一些实施方式中，序列604是p7序列，序列606是r2引物结合位点。空间条形码605可包括在捕获探针内以用于对目标分析物条码化。通常可选择功能性序列以与各种不同测序系统中的任何一种兼容，例如454测序、离子激流质子(iontorrentproton)或pgm、illuminax10、pacbio、纳米孔(nanopore)等及其要求。在一些实施方式中，可选择功能性序列以与非商业化测序系统兼容。可使用适当功能性序列的此类测序系统和技术的示例包括(但不限于)roche454测序、离子激流质子或pgm测序、illuminax10测序、pacbiosmrt测序和oxford纳米孔测序。此外，在一些实施方式中，可以选择功能性序列以与其他测序系统(包括非商业化测序系统)兼容。[0430]在一些实施方式中，空间条形码605、功能性序列604(例如，流动池附接序列)和606(例如，测序引物序列)可以是附接到给定特征的所有探针所共用的。空间条形码还可包括捕获域607以促进目标分析物的捕获。[0431](i)捕获域[0432]如上所述，每个捕获探针包括至少一个捕获域。“捕获域”可以是寡核苷酸、多肽、小分子或其任何组合，其特异性结合到所需分析物。在一些实施方式中，捕获域可用于捕获或检测所需分析物。[0433]在一些实施方式中，捕获域是配置成与一种或多种分析物，例如一种或多种不同类型的核酸(例如，rna分子和dna分子)相互作用的功能性核酸序列。在一些实施方式中，功能性核酸序列可包括n‑聚体序列(例如，随机n‑聚体序列)，其中n‑聚体序列经配置以与多个dna分子相互作用。在一些实施方式中，功能性序列可包括多聚(t)序列，其多聚(t)序列经配置以经由mrna转录物的多聚(a)尾与信使rna(mrna)分子相互作用。在一些实施方式中，功能性核酸序列是蛋白质(例如，转录因子、dna结合蛋白质或rna结合蛋白质)的结合靶标，其中感兴趣的分析物是蛋白质。[0434]捕获探针可以包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸以及能够参与watson‑crick型或类似碱基对相互作用的合成核苷酸残基。在一些实施方式中，捕获域能够引发逆转录反应以产生与捕获的rna分子互补的cdna。在一些实施方式中，捕获探针的捕获域可引发dna延伸(聚合酶)反应以产生与捕获的dna分子互补的dna。在一些实施方式中，捕获域可以作为捕获的dna分子和直接或间接固定在基材上的表面探针之间的连接反应的模板。在一些实施方式中，捕获域可连接到捕获的dna分子的一条链。例如，splintr连接酶连同rna或dna序列(例如，简并rna)一起可用于将单链dna或rna连接到捕获域。在一些实施方式中，具有rna模板化连接酶活性的连接酶(例如，splintr连接酶、t4rna连接酶2或kod连接酶)可用于将单链dna或rna连接到捕获域。在一些实施方式中，捕获域包括夹板寡核苷酸。在一些实施方式中，捕获域捕获夹板寡核苷酸。[0435]在一些实施方式中，捕获域位于捕获探针的3′端并且包括自由的3′端，其可例如通过模板依赖聚合来延伸以形成如本文所述的延伸的捕获探针。在一些实施方式中，捕获域包括能够与存在于与阵列接触的生物样品的细胞中的核酸(例如rna或其他分析物)杂交的核苷酸序列。在一些实施方式中，捕获域可被选择或设计为选择性地或特异地结合到靶核酸。例如，捕获域可被选择或设计成通过与mrna多聚(a)尾杂交的方式捕获mrna。因此，在一些实施方式中，捕获域包括多聚(t)dna寡核苷酸，例如，通过磷酸二酯键连接的一系列连续脱氧胸苷残基，其能够与mrna的多聚(a)尾杂交。在一些实施方式中，捕获域可包括在功能上或结构上类似于多聚(t)尾的核苷酸。例如，多聚(u)寡核苷酸或包含脱氧胸苷类似物的寡核苷酸。在一些实施方式中，捕获域包括至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方式中，捕获域包括至少25、30或35个核苷酸。[0436]在一些实施方式中，捕获探针包括具有能够结合mrna和/或基因组dna的序列的捕获域。例如，捕获探针可以包括捕获域，其包括能够结合到mrna的多聚(a)尾和/或基因组dna中存在的多聚(a)均聚序列的核酸序列(例如，多聚(t)序列)。在一些实施方式中，利用末端转移酶将均聚序列添加至mrna分子或基因组dna分子，以产生具有多聚(a)或多聚(t)序列的分析物。例如，可以将多聚(a)序列添加到分析物(例如基因组dna的片段)，从而使分析物能够被多聚(t)捕获域捕获。[0437]在一些实施方式中，随机序列(例如，随机六聚体或类似序列)可用于形成捕获域的全部或部分。例如，随机序列可以与多聚(t)(或多聚(t)类似物)序列一起使用。因此，在捕获域包括多聚(t)(或“多聚(t)‑样”)寡核苷酸的情况下，其还可以包括随机寡核苷酸序列(例如，“多聚(t)‑随机序列”探针)。例如，这可以位于多聚(t)序列的5′或3′处，例如在捕获域的3′端。多聚(t)‑随机序列探针可促进mrna多聚(a)尾的捕获。在一些实施方式中，捕获域可以是完全随机的序列。在一些实施方式中，可以使用简并捕获域。[0438]在一些实施方式中，两个或更多个捕获探针的集形成混合物，其中一个或多个捕获探针的捕获域包括多聚(t)序列，并且一个或多个捕获探针的捕获域包括随机序列。在一些实施方式中，两个或更多个捕获探针的集形成混合物，其中一个或多个捕获探针的捕获域包括多聚(t)样序列，并且一个或多个捕获探针的捕获域包括随机序列。在一些实施方式中，两个或更多个捕获探针的集形成混合物，其中一个或多个捕获探针的捕获域包括多聚(t)随机序列，并且一个或多个捕获探针的捕获域包括随机序列。在一些实施方式中，具有简并捕获域的探针可以添加到本文所列的任何前述组合中。在一些实施方式中，具有简并捕获域的探针可以替换本文所描述的每对中的探针之一。[0439]捕获域可基于其被设计以捕获的特定基因序列或特定基序序列或共同/保守序列(即，序列特异性捕获域)。因此，在一些实施方式中，捕获域能够选择性地结合到期望的核酸亚型或子集，例如特定类型的rna，例如mrna、rrna、trna、srprna、trna、snrna、snrna、smyrna、sarna、grna、rna酶p、rna酶mrp、terc、slrna、arna、cis‑nat、crrna、lncrna、mirna、pirna、sirna、shrna、tasirna，rasirna、7sk、erna、ncrna或其他类型的rna。在非限制性示例中，捕获域能够选择性地结合到核糖核酸的所需子集，例如微生物组rna，例如16srrna。[0440]在一些实施方式中，捕获域包括“锚定物(anchor)”或“锚定序列(anchoringsequence)”，其是设计用于确保捕获域与预期生物分析物杂交的核苷酸序列。在一些实施方式中，锚定序列包括核苷酸序列，包括1‑聚体、2‑聚体、3‑聚体或更长的序列。在一些实施方式中，短序列是随机的。例如，可以设计包括多聚(t)序列的捕获域来捕获mrna。在此类实施方式中，锚定序列可包括有助于确保多聚(t)捕获域与mrna杂交的随机3‑聚体(例如，ggg)。在一些实施方式中，锚定序列可以是vn、n或nn。或者，可以使用特定的核苷酸序列来设计序列。在一些实施方式中，锚定序列位于捕获域的3′端。在一些实施方式中，锚定序列位于捕获域的5′端。[0441]在一些实施方式中，捕获探针的捕获域在生物样品与阵列接触之前被阻断，并且当生物样品中的核酸在其被捕获到阵列上之前被修饰时，使用阻断性探针。在一些实施方式中，阻断性探针用于阻断或修饰捕获域的游离3′端。在一些实施方式中，阻断性探针可与捕获探针杂交以遮蔽捕获域的游离3′端，例如发夹探针，部分双链探针或互补性序列。在一些实施方式中，捕获域的游离3′端可以通过化学修饰来阻断，例如，添加叠氮甲基作为化学可逆的加帽部分，使得捕获探针不包括游离3′端。在生物样品与阵列接触之前，阻断或修饰捕获探针，特别是在捕获域的游离3′端，防止捕获探针的修饰，例如，防止将多聚(a)尾添加到捕获探针的游离3′端。[0442]3′修饰的非限制性示例包括双脱氧c‑3′(3′‑ddc)、3′倒dt、3′c3间隔子、3′氨基和3′磷酸化。在一些实施方式中，可修饰生物样品中的核酸，使得其可被捕获域捕获。例如，衔接子序列(包括能够结合到捕获探针的捕获域的结合域)可以添加到核酸(例如片段化基因组dna)的末端。在一些实施方式中，这是通过连接衔接子序列或核酸延伸来实现的。在一些实施方式中，酶用于在核酸序列末端纳入其它核苷酸，例如多聚(a)尾。在一些实施方式中，捕获探针可以可逆地遮蔽或修饰，使得捕获探针的捕获域不包括游离3′端。在一些实施方式中，移出、修饰或使3′端不可接近，使得捕获域不易受用于修饰生物样品的核酸的过程(例如，连接或延伸)的影响。[0443]在一些实施方式中，修饰捕获探针的捕获域以移除在修饰生物样品的核酸分子期间发生的捕获探针的任何修饰。在一些实施方式中，捕获探针可以包括捕获域下游的附加序列，例如捕获域的3′，即阻断域(blockingdomain)。[0444]在一些实施方式中，捕获探针的捕获域可以是非核酸域。不仅包括基于核酸的合适捕获域的示例包括但不限于蛋白质、肽、适体、抗原、抗体和模拟本文所述的任何捕获域的功能的分子类似物。[0445](ii)裂解域[0446]每个捕获探针可任选地包括至少一个裂解域。裂解域表示用于将探针可逆地附接到阵列特征的探针部分，如本文所述。此外，捕获探针的一个或多个区段或区域可任选地通过裂解域的裂解而从阵列特征中释放。例如，空间条形码和/或通用分子标识符(umi)可以通过裂解域的裂解来释放。[0447]图7是说明可裂解捕获探针的示意图，其中裂解的捕获探针可进入非透化细胞并结合到样品内的分析物。捕获探针701包含裂解域702、细胞穿透肽703、报告分子704和二硫键(‑s‑s‑)。705表示捕获探针的所有其他部分，例如，空间条形码和捕获域。[0448]在一些实施方式中，将捕获探针连接到特征的裂解域是二硫键。可以添加还原剂来破坏二硫键，从而使捕获探针从特征中释放出来。作为另一个例子，加热也可以导致裂解域的降解和从阵列特征中释放附接的捕获探针。在一些实施方式中，激光辐射用于在特定位置加热和降解捕获探针的裂解域。在一些实施方式中，裂解域是光敏化学键(例如，当暴露于例如紫外光的光时解离的化学键)。[0449]具有光敏化学键的寡核苷酸(例如光可裂解接头)具有多种优势。它们可以被高效且快速地裂解(例如，以纳秒和毫秒为单位)。在一些情况下，可以使用光掩模使得仅阵列的特定区域暴露于可裂解刺激(例如暴露于紫外光、暴露于光、暴露于激光诱导的热)。当使用光可裂解接头时，可裂解反应由光触发，并且对接头具有高度选择性，结果是双正交的。通常，光可裂解接头的波长吸收位于光谱的近紫外范围内。在一些实施方式中，光可裂解接头的λ最大为约300nm至约400nm，或约310nm至约365nm。在一些实施方式中，光可裂解接头的λ最大为约300nm、约312nm、约325nm、约330nm、约340nm、约345nm、约355nm、约365nm或约400nm。[0450]可以用于裂解域的光敏化学键的非限制性示例包括描述于以下的那些：leriche等.bioorgmedchem.2012年1月15日；20(2)：571‑82和美国公开号2017/0275669，这两者均通过引用其全文方式纳入本文。例如，包含光敏化学键的接头包括：3‑氨基‑3‑(2‑硝基苯基)丙酸(anp)、苯甲酰酯衍生物、8‑喹啉苯磺酸酯、双香豆素、6‑溴‑7‑烷基香豆素‑4‑基甲氧基羰基、基于双烷的(bimane‑based)接头和基于双芳基腙的接头。在一些实施方式中，光敏键是可裂解接头的部分，例如以下邻硝基苄基(onb)接头：[0451][0452]其中：[0453]x选自o和nh；[0454]r1选自h和c1‑3烷基；[0455]r2选自h和c1‑3烷氧基；[0456]n是1、2或3；和[0457]a和b分别代表接头与基材的连接点，或接头与捕获探针的连接点。[0458]在一些实施方式中，至少一个间隔物包含在基材和邻硝基苄基(onb)接头之间，并且至少一个间隔物包含在邻硝基苄基(onb)接头和捕获探针之间。在这些实施方式的一些方面，间隔物包含选自以下的至少一种基团：c1‑6亚烷基、c2‑6亚烯基、c2‑6亚炔基、c＝o、o、s、nh、‑(c＝o)o‑、‑(c＝o)nh‑、‑ss‑、乙二醇、聚乙二醇、丙二醇和聚丙二醇，或它们的任何组合。在一些实施方式中，x是o。在一些实施方式中，x是nh。在一些实施方式中，r1为h。在一些实施方式中，r1为c1‑3烷基。在一些实施方式中，r1是甲基。在一些实施方式中，r2是h。在一些实施方式中，r2是c1‑3烷氧基。在一些实施方式中，r2是甲氧基。在一些实施方式中，r1为h且r2为h。在一些实施方式中，r1为h且r2为甲氧基。在一些实施方式中，r1为甲基且r2为h。在一些实施方式中，r1为甲基且r2为甲氧基。[0459]在一些实施方式中，光可裂解接头具有下式：[0460][0461]在一些实施方式中，光可裂解接头具有下式：[0462][0463]在一些实施方式中，光可裂解接头具有下式：[0464][0465]在一些实施方式中，光可裂解接头具有下式：[0466][0467]在一些实施方式中，光可裂解接头具有下式：[0468][0469]不受任何特定理论的束缚，据信邻硝基苄基(onb)接头的激发会导致γ位的norrish型夺氢，随后形成具有高度反应性并重排成亚硝基化合物的吖嗪酸，导致接头完全裂解，如下图所示：[0470][0471]在一些实施方式中，光可裂解接头是3‑氨基‑3‑(2‑硝基苯基)丙酸(anp)接头：[0472][0473]其中x、r2、n、a和b如本文对于邻硝基苄基(onb)接头所述。[0474]在一些实施方式中，光可裂解接头具有下式：[0475][0476]在一些实施方式中，光可裂解接头是苯甲酰酯接头：[0477][0478]其中a和b如本文对于邻硝基苄基(onb)接头所述。[0479]可用于裂解域的光敏化学键的其它示例包括卤化核苷，例如溴脱氧尿苷(brdu)。brdu是胸苷的类似物，可以很容易地掺入寡核苷酸中(例如，在捕获探针的裂解域中)，并且对uvb光(280‑320nm范围)敏感。在暴露于uvb光时，会发生光裂解反应(例如，在紧邻brdu掺入位点5′处的核苷处(doddridge等.chem.comm.，1998，18：1997‑1998和cook等.chemistryandbiology.1999，6：451‑459))，导致捕获探针从特征释放。[0480]裂解域的其它示例包括不稳定化学键，例如但不限于酯键(例如，可与酸、碱或羟胺裂解)、邻二醇键(例如，可通过高碘酸钠裂解)、狄尔斯‑阿尔德键(例如，可通过热裂解)、砜键(例如，可通过碱裂解)、硅基醚键(例如，可通过酸裂解)、糖苷键(例如，可通过淀粉酶裂解)、肽键(例如，可通过蛋白酶裂解)、无碱基或无嘌呤/无嘧啶(ap)位点(例如，可用碱或ap核酸内切酶裂解)，或磷酸二酯键(例如，可通过核酸酶(例如，dna酶)裂解)。[0481]在一些实施方式中，裂解域包括由一个或多个能够裂解核酸分子，例如，能够破坏两个或更多个核苷酸之间的磷酸二酯键的酶识别的序列。键可以通过其他核酸分子靶向酶，如限制性酶(如限制性内切酶)进行裂解。例如，裂解域可以包括限制性内切酶(限制性酶)识别序列。限制性内切酶在被称为限制性位点的特定识别核苷酸序列上切开双链或单链dna。在一些实施方式中，使用罕切限制性酶，例如，具有长识别位点(长度至少为8个碱基对)的酶，以减少在捕获探针中其他位置裂解的可能性。[0482]在一些实施方式中，裂解域包括多聚(u)序列，其可由尿嘧啶dna糖基化酶(udg)和dna糖基化酶‑裂解酶内切酶viii(商业上称为usertm酶)的混合物裂解。一旦释放，可释放的捕获探针可用于反应。因此，例如，可以通过从特征释放捕获探针来活化可活化的捕获探针。[0483]在一些实施方式中，当捕获探针例如经由表面探针间接地附接到基材时，裂解域包括一个或多个错配核苷酸，使得表面探针和捕获探针的互补部分不是100％互补(例如，错配碱基对的数目可以是一个、两个或三个碱基对)。例如，通过muty和t7核酸内切酶i酶识别这种错配，其导致错配位置处的核酸分子的裂解。如本文所述，“表面探针”可以是存在于基材表面上的、能够连接至试剂(例如，捕获探针)的任何部分。在一些实施方式中，表面探针是寡核苷酸。在一些实施方式中，表面探针是捕获探针的部分。[0484]在其中捕获探针间接地(例如通过表面探针)附接(例如固定)到特征上的一些实施方式中，裂解域包括切口酶识别位点或序列。切口酶是一种仅能切割dna双链体的单链的核酸内切酶。因此，裂解域可以包括靠近表面探针的5′端(和/或捕获探针的5′端)的切口酶识别位点，使得表面探针或捕获探针的裂解使表面探针和捕获探针之间的双链体失稳，从而从特征中释放捕获探针。[0485]切口酶也可用于捕获探针直接附接(例如，固定)到特征的一些实施方式中。例如，基材可与杂交到捕获探针的裂解域的核酸分子接触以提供或重组切口酶识别位点，例如裂解辅助探针。因此，与切口酶接触将导致裂解域的裂解，从而从特征中释放捕获探针。这种裂解辅助探针还可用于为其他裂解酶(例如限制性内切酶)提供或重组裂解识别位点。[0486]有些切口酶通过结合和识别特定的核苷酸识别序列，只在dna分子的特定位点引入单链切口。已经发现了许多天然切口酶，目前已经确定了至少四个切口酶的序列识别特性。切口酶在美国专利号6,867,028中描述，其通过引用整体纳入本文。一般来说，任何合适的切口酶都可用于结合到裂解域的互补切口酶识别位点。使用后，可以从分析中移除切口酶，或在释放捕获探针后使其失活，以防止捕获探针的不必要裂解。[0487]不仅包括基于核酸的合适捕获域的示例包括但不限于蛋白质、肽、适体、抗原、抗体和模拟本文所述的任何捕获域的功能的分子类似物。[0488]在一些实施方式中，捕获探针中不存在裂解域。例如在macosko等，(2015)cell161，1202‑1214中描述了具有缺乏裂解域的附接捕获探针的基材的示例，其全部内容通过引用纳入本文中。[0489]在一些实施方式中，与裂解域相对应的捕获探针区域可用于某些其它功能。例如，用于核酸延伸或扩增的其它区域可以包括在通常将定位裂解域的位置处。在这样的实施方式中，该区域可以补充功能域或者甚至作为其它功能域存在。在一些实施方式中，存在裂解域，但其用途是可选的。[0490](iii)功能域[0491]每个捕获探针可任选地包括至少一个功能域。每个功能域通常包括用于整个分析程序中的下游分析步骤的功能核苷酸序列。[0492]在一些实施方式中，捕获探针可包括用于附接到测序流动池的功能域，例如，用于测序的p5序列。在一些实施方式中，捕获探针或其衍生物可包括另一功能域，例如用于附接到用于测序的测序流动池的p7序列。可选择功能域以与各种不同测序系统中的任何一种兼容，例如454测序、离子激流质子或pgm、illuminax10等及其要求。[0493]在一些实施方式中，功能域包括引物。引物可以包括用于测序的r1引物序列，并且在一些实施方式中，包括用于测序的r2引物序列。美国专利公开号2014/0378345和2015/0376609中描述了此类捕获探针的示例及其用途，其全部内容通过引用纳入本文。[0494](iv)空间条形码[0495]如上所述，捕获探针可包括一个或多个空间条形码(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个)空间条形码。“空间条形码”是一个连续的核酸区段或两个或更多个非连续的核酸区段，用作传递或能够传递空间信息的标签或标识符。在一些实施方式中，捕获探针包括具有空间方面的空间条形码，其中条形码与阵列内的特定位置或基材上的特定位置相关联。[0496]空间条形码可以是分析物的部分，也可以独立于分析物(例如，捕获探针的部分)。空间条形码可以是附接在分析物(例如，核酸分子)上的标签，或者除了分析物的内源性特征(例如，分析物的大小或末端序列)之外的标签的组合。空间条形码可以是独特的。在空间条形码是独特的一些实施方式中，空间条形码既作为空间条形码又作为与一个特定捕获探针相关联的独特分子标识符(umi)起作用。[0497]空间条形码可以有多种不同的格式。例如，空间条形码可以包括多核苷酸空间条形码、随机核酸和/或氨基酸序列以及合成核酸和/或氨基酸序列。在一些实施方式中，空间条形码以可逆或不可逆的方式附接到分析物。在一些实施方式中，在样品测序之前、期间和/或之后将空间条形码添加到例如dna或rna样品的片段。在一些实施方式中，空间条形码使识别和/或定量个体序列读取结果。在一些实施方式中，空间条形码用作荧光条形码，其中荧光标记的寡核苷酸探针与空间条形码杂交。[0498]在一些实施方式中，空间条形码是基本上不与生物样品中的分析物核酸分子杂交的核酸序列。在一些实施方式中，空间条形码在生物样品中的核酸分子的实质部分(例如80％或更多)上对核酸序列具有小于80％的序列相同性(例如，小于70％、60％、50％或小于40％的序列相同性)。[0499]空间条形码序列可在捕获探针序列内包括约6至约20或更多核苷酸。在一些实施方式中，空间条形码序列的长度可以是约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些实施方式中，空间条形码序列的长度可以是至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些实施方式中，空间条形码序列的长度可以是至多约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更短。[0500]这些核苷酸可以是完全连续的，例如在邻近核苷酸的单个序列段中，或者它们可以被分成两个或多个单独的子序列，这些子序列由1个或多个核苷酸分开。分离的空间条形码子序列的长度约为4到16个核苷酸。在一些实施方式中，空间条形码子序列可以是约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些实施方式中，空间条形码子序列可以是至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些实施方式中，空间条形码子序列可以是至多约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更短。[0501]对于附接到共同阵列特征的多个捕获探针，多个捕获探针的一个或多个空间条形码序列可以包括对于耦合到特征的所有捕获探针相同的序列和/或在耦合到特征的所有捕获探针之间不同的序列。[0502]图8是示例性多重空间条码化特征的示意图。在图8中，特征801可耦合到空间条码化捕获探针，其中特定特征的空间条码化探针可具有相同的空间条形码，但具有设计成将特征的空间条形码与多个目标分析物相关联的不同捕获域。例如，特征可以耦合到四种不同类型的空间条码化捕获探针，每种类型的空间条码化捕获探针具有空间条形码802。与该特征相关联的一种类型捕获探针包括空间条形码802与多聚(t)捕获域803的组合，其设计用于捕获mrna目标分析物。与该特征相关联的第二类型捕获探针包括空间条形码802与用于gdna分析的随机n‑聚体捕获域804的组合。与该特征相关联的第三类型捕获探针包括空间条形码802与与分析物捕获剂捕获剂条形码结构域805上的捕获域互补的捕获域组合。与该特征相关联的第四类型捕获探针包括空间条形码802与捕获探针组合，该捕获探针可特异性结合可在crispr分析(例如crispr/cas9)中起作用的核酸分子806。虽然图8中仅示出了四种不同的捕获探针条码化构建体，但是捕获探针条码化构建体可被定制用于与核酸相关的任何给定分析物的分析，并且能够与这种构建体结合。例如，图8中所示的方案也可用于本文中所公开的其它分析物的同时分析，包括但不限于：(a)mrna，谱系追踪构建体，细胞表面或细胞内蛋白质和代谢物，以及gdna；(b)mrna，可获得的染色质(例如，atac‑seq，dna酶‑seq，和/或mna酶‑seq)细胞表面或细胞内蛋白质和代谢物，以及扰动剂(例如，crispr‑crrna/sgrna、talen、锌指核酸酶和/或如本文所述的反义寡核苷酸)；(c)mrna、细胞表面或细胞内蛋白质和/或代谢物，条码化标记剂(例如，本文所述的mhc多聚体)和免疫细胞受体(例如，t细胞受体)的v(d)j序列。在一些实施方式中，扰动剂可以是小分子、抗体、药物、适体、mirna、物理环境(例如，温度变化)，或任何其它已知扰动剂。[0503]附接到单个阵列特征的捕获探针可以包括相同(或共同)的空间条形码序列、不同的空间条形码序列或两者的组合。附接到特征的捕获探测可以包括多组捕获探针。给定组的捕获探针可以包括相同的空间条形码序列。相同的空间条形码序列可以不同于另一组捕获探针的空间条形码序列。[0504]多个捕获探针可以包括与空间阵列上的特定位置相关联的空间条形码序列(例如，核酸条形码序列)。例如，第一多个捕获探针可以基于与第一区域内的捕获探针共同的空间条形码序列与第一区域相关联，并且第二多个捕获探针可以基于与第二区域内的捕获探针共同的空间条形码序列与第二区域相关联。第二区域可以与第一区域相关联，也可以不与第一区域相关联。其它多个捕获探针可以与其他区域内的捕获探针共用的空间条形码序列相关联。在一些实施方式中，空间条形码序列可以在多个捕获探针分子之间相同。[0505]在一些实施方式中，将多个不同的空间条形码合并到单个阵列捕获探针中。例如，混合但已知的一组空间条形码序列可以通过提供对位置特性的重复或独立确认，来提供空间条形码到给定点或位置的更强的寻址(address)或属性。在一些实施方式中，多个空间条形码表示特定阵列点的位置的增加的特异性。[0506](v)独特分子标识符[0507]捕获探针可包括一个或多个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个)独特分子标识符(umi)。独特分子标识符是作为特定分析物或结合特定分析物的捕获探针(例如，通过捕获域)的标签或标识符的连续核酸区段或两个或更多个非连续核酸区段。[0508]umi可以是独特的。umi可包括一个或多个特异性多核苷酸序列，一个或多个随机核酸和/或氨基酸序列，和/或一个或多个合成核酸和/或氨基酸序列。[0509]在一些实施方式中，umi是基本上不与生物样品中的分析物核酸分子杂交的核酸序列。在一些实施方式中，umi在生物样品中的核酸分子的实质部分(例如80％或更多)上对核酸序列具有小于80％的序列相同性(例如，小于70％、60％、50％或小于40％的序列相同性)。[0510]umi可在捕获探针序列内包括约6至约20或更多核苷酸。在一些实施方式中，umi的长度可以是约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些实施方式中，umi的长度可以是至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些实施方式中，umi的长度可以是至多约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更短。[0511]这些核苷酸可以是完全连续的，即在邻近核苷酸的单个序列段中，或者它们可以被分成两个或多个单独的子序列，这些子序列由1个或多个核苷酸分开。分离的umi子序列的长度约为4到16个核苷酸。在一些实施方式中，umi子序列可以是约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些实施方式中，umi子序列可以是至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些实施方式中，umi子序列可以是至多约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更短。[0512]在一些实施方式中，umi以可逆或不可逆的方式附接到分析物。在一些实施方式中，在分析物测序之前、期间和/或之后将umi添加到例如dna或rna样品的片段。在一些实施方式中，umi使识别和/或定量个体序列读取结果(sequencing‑read)。在一些实施方式中，umi用作荧光条形码，其中荧光标记的寡核苷酸探针与umi杂交。[0513](vi)捕获探针的其他方面[0514]对于附接到阵列特征的捕获探针，个体阵列特征可以包括一个或多个捕获探针。在一些实施方式中，个体阵列特征包括数百或数千个捕获探针。在一些实施方式中，捕获探针与特定的个体特征相关联，其中个体特征包含捕获探针，该捕获探针包括对于阵列上限定的区域或位置独特的空间条形码。[0515]在一些实施方式中，特定特征可以包含包括一个以上空间条形码的捕获探针(例如，特定特征处的一个捕获探针可以包括与相同特定特征处的另一个捕获探针中包括的空间条形码不同的空间条形码，而两个捕获探针都包括第二共同空间条形码)，其中每个空间条形码对应于阵列上特定的限定区域或位置。例如，与阵列上的一个特定特征相关联的多个空间条形码序列可以通过提供位置的重复或独立确认来向给定位置提供更强的地址或属性。在一些实施方式中，多个空间条形码表示特定阵列点的位置的增加的特异性。在非限制性示例中，可以使用两个不同的空间条形码对特定阵列点进行编码，其中每个空间条形码标识阵列内的特定限定区域，并且具有两个空间条形码的阵列点标识两个限定区域交叠的子区域，例如，比如维恩图的重叠部分。[0516]在另一非限制性示例中，特定阵列点可以用三个不同的空间条码化，其中第一空间条形码标识阵列内的第一区域，第二空间条形码标识第二区域，其中第二区域是完全在第一区域内的子区域，以及第三空间条形码标识第三区域，其中第三区域是完全在第一和第二子区域内的子区域。[0517]在一些实施方式中，附接到阵列特征的捕获探针从阵列特征中释放以进行测序。或者，在一些实施方式中，捕获探针保持附接到阵列特征，并且探针被测序，同时保持附接到阵列特征(例如，通过原位测序)。捕获探针的测序的其他方面在本发明的后续部分中描述。[0518]在一些实施方式中，阵列特征可以包括附接到特征的不同类型的捕获探针。例如，阵列特征可以包括第一类捕获探针和第二类捕获探针，第一类捕获探针具有设计为结合到一类分析物的捕获域，第二类捕获探针具有设计为结合到第二类分析物的捕获域。通常，阵列特征可以包括附接到单个阵列特征的一个或多个(例如，两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个、八个或多个、十个或多个、12个或多个、15个或多个、20个或多个、30个或多个、50个或多个)不同类型的捕获探针。[0519]在一些实施方式中，捕获探针是核酸。在一些实施方式中，捕获探针通过其5′端附接到阵列特征。在一些实施方式中，捕获探针从5′端到3′端包括：一个或多个条形码(例如，空间条形码和/或umi)和一个或多个捕获域。在一些实施方式中，捕获探针从5′端到3′端包括：一个条形码(例如，空间条形码或umi)和一个捕获域。在一些实施方式中，捕获探针从5′端到3′端包括：裂解域、功能域、一个或多个条形码(例如，空间条形码和/或umi)和捕获域。在一些实施方式中，捕获探针从5′端到3′端包括：裂解域、功能域、一个或多个条形码(例如，空间条形码和/或umi)、第二功能域和捕获域。在一些实施方式中，捕获探针从5′端到3′端包括：裂解域、功能域、空间条形码、umi和捕获域。在一些实施方式中，捕获探针不包括空间条形码。在一些实施方式中，捕获探针不包括umi。在一些实施方式中，捕获探针包括用于起始测序反应的序列。[0520]在一些实施方式中，捕获探针通过其3′端固定在特征上。在一些实施方式中，捕获探针从3′端到5′端包括：一个或多个条形码(例如，空间条形码和/或umi)和一个或多个捕获域。在一些实施方式中，捕获探针从3′端到5′端包括：一个条形码(例如，空间条形码或umi)和一个捕获域。在一些实施方式中，捕获探针从3′端到5′端包括：裂解域、功能域、一个或多个条形码(例如，空间条形码和/或umi)和捕获域。在一些实施方式中，捕获探针从3′端到5′端包括：裂解域、功能域、空间条形码、umi和捕获域。[0521]在一些实施方式中，捕获探针包括原位合成的寡核苷酸。原位合成的寡核苷酸可以附连到基材上，或附连到基材上的特征上。在一些实施方式中，原位合成的寡核苷酸包括一个或多个恒定序列，其中一个或多个用作引发序列(例如，用于扩增靶核酸的引物)。原位合成的寡核苷酸可以例如包括位于3′端的恒定序列，该序列与基材附连，或与基材上的特征附连。此外或或者，原位合成的寡核苷酸可在游离5′端包括恒定序列。在一些实施方式中，一个或多个恒定序列可以是可裂解的序列。在一些实施方式中，原位合成的寡核苷酸包括条形码序列，例如可变条形码序列。条形码可以是本文所述的任何条形码。条形码的长度可以是约8至16个核苷酸(例如，8、9、10、11、12、13、14、15或16个核苷酸)。原位合成的寡核苷酸的长度可以小于100个核苷酸(例如，小于90、80、75、70、60、50、45、40、35、30、25或20个核苷酸)。在一些情况下，原位合成的寡核苷酸的长度为约20至约40个核苷酸。示例性的原位合成寡核苷酸由affymetrix生产。在一些实施方式中，原位合成的寡核苷酸附接到阵列的特征。[0522]可以将其它寡核苷酸连接到原位合成的寡核苷酸以产生捕获探针。例如，与原位合成的寡核苷酸的部分(例如，寡核苷酸中的恒定序列)互补的引物可用于杂交其它寡核苷酸并延伸(使用原位合成的寡核苷酸作为模板，例如引物延伸反应)，以形成双链寡核苷酸并进一步产生3′突出端。在一些实施方式中，3′突出端可以通过模板非依赖性连接酶(例如末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)或多聚(a)聚合酶)产生。可以使用合适的酶(例如，连接酶)和夹板寡核苷酸将包含一个或多个捕获域的附加寡核苷酸连接到3′突出端，以产生捕获探针。因此，在一些实施方式中，捕获探针是连接在一起的两个或更多个寡核苷酸序列(例如，原位合成的寡核苷酸和其它寡核苷酸)的产物。在一些实施方式中，寡核苷酸序列之一是原位合成的寡核苷酸。[0523]在一些实施方式中，可以使用夹板寡核苷酸(例如，本文所述的任何夹板寡核苷酸)来制备捕获探针。可以使用夹板寡核苷酸和本领域已知或本文所述的任何种类的连接酶(例如夹板连接酶)将两个或更多个寡核苷酸连接在一起。[0524]寡核苷酸之一可包括：例如，恒定序列(例如，与夹板寡核苷酸的部分互补的序列)、简并序列和/或捕获域(例如，如本文所述)。寡核苷酸之一还可以包括与生物样品中感兴趣的分析物连接或杂交相容的序列。感兴趣的分析物(例如，mrna)也可以作为夹板寡核苷酸使用，以将更多的寡核苷酸连接到捕获探针上。在一些实施方式中，捕获探针通过使酶在寡核苷酸序列末端添加多核苷酸来产生。捕获探针可以包括简并序列，该简并序列可以用作独特分子标识符。[0525]简并序列，它是其中核苷酸序列的某些位置包含许多可能的碱基的序列。简并序列可以是简并核苷酸序列，包括约或至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。在一些实施方式中，核苷酸序列包含核苷酸序列内的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多简并位置。在一些实施方式中，简并序列用作umi。[0526]在一些实施方式中，捕获探针包括限制性内切酶识别序列或可被特定酶活性切割的核苷酸序列。例如，可以使用尿嘧啶dna糖基化酶(udg)或尿嘧啶特异性切除试剂(user)从核苷酸序列中酶促切割尿嘧啶序列。作为另一示例，其它经修饰的碱基(例如，经甲基化修饰)可被特异性核酸内切酶识别和切割。捕获探针可经受酶切，其移出阻断域和在修饰过程中添加到捕获探针3′端的任何其它核苷酸。阻断域的移除将暴露和/或恢复捕获探针的捕获域的游离3′端。在一些实施方式中，可移除其它核苷酸以显示和/或恢复捕获探针的捕获域的3′端。[0527]在一些实施方式中，阻断域可在其合成时或在其合成之后纳入捕获探针中。捕获域的末端核苷酸是可逆终止子核苷酸(例如，3′‑o‑阻断可逆终止子和3′‑未阻断可逆终止子)，并且可以在探针合成期间或之后包含在捕获探针中。[0528](vii)延伸的捕获探针[0529]“延伸的捕获探针”是具有扩大的核酸序列的捕获探针。例如，在捕获探针包括核酸的情况下，延伸的“3′末端”表示其他核苷酸被添加到捕获探针的最末端3′核苷酸以延伸捕获探针的长度，例如，通过标准聚合反应来延伸核酸分子，包括由聚合酶(例如，dna聚合酶或逆转录酶)催化的模板聚合。[0530]在一些实施方式中，延伸捕获探针包括从捕获的(杂交的)rna产生cdna。该过程涉及合成杂交核酸的互补链，例如，基于捕获的rna模板(与捕获探针的捕获域杂交的rna)生成cdna。因此，在延伸捕获探针的初始步骤(例如cdna生成)中，捕获的(杂交的)核酸(例如rna)充当延伸的模板(例如逆转录步骤)。[0531]在一些实施方式中，捕获探针使用逆转录延伸。例如，逆转录包括使用逆转录酶从rna(例如信使rna)合成cdna(互补或拷贝dna)。在一些实施方式中，当组织仍在原位时进行逆转录，产生分析物文库，其中分析物文库包括来自邻近捕获探针的空间条形码。在一些实施方式中，捕获探针使用一种或多种dna聚合酶延伸。[0532]在一些实施方式中，捕获探针的捕获域包括用于产生与捕获探针杂交的核酸互补链的引物，例如，用于dna聚合酶和/或逆转录的引物。由延伸反应产生的核酸(例如dna和/或cdna)分子包含捕获探针的序列。捕获探针的延伸，例如dna聚合酶和/或逆转录反应，可以使用各种合适的酶和方案来进行。[0533]在一些实施方式中，产生全长dna(例如cdna)分子。在一些实施方式中，“全长”dna分子是指整个捕获的核酸分子。然而，如果核酸(例如rna)在组织样品中部分降解，则捕获的核酸分子将与组织样品中的初始rna长度不同。在一些实施方式中，延伸的探针的3′端(例如第一链cdna分子)被修饰。例如，接头或衔接子可以连接到延伸的探针的3′端。这可以通过使用单链连接酶如t4rna连接酶或circlegasetm(可从威斯康星州麦迪逊的艾匹森特生物技术公司(epicentrebiotechnologies)购得)来实现。在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸用于延伸cdna以产生全长cdna(或尽可能接近全长cdna)。在一些实施方式中，第二链合成辅助探针(能够与延伸的捕获探针的3′端杂交的部分双链dna分子)可以使用双链连接酶(例如t4dna连接酶)连接到延伸的探针的3′端，例如第一链cdna分子。适用于连接步骤的其他酶的其他酶在本领域中是已知的，并且包括例如tthdna连接酶、taqdna连接酶、热球菌属(菌株9°n)dna连接酶(9°ntmdna连接酶，新英格兰生物实验室(newenglandbiolabs))、ampligasetm(可从威斯康星州麦迪逊的艾匹森特生物技术公司(epicentrebiotechnologies)获得)和splintr(可从马萨诸塞州伊普斯维奇的新英格兰生物实验室获得)。在一些实施方式中，多核苷酸尾(例如多聚(a)尾)纳入延伸的探针分子的3′端。在一些实施方式中，使用末端转移酶活性酶纳入多核苷酸尾。[0534]在一些实施方式中，处理双链延伸的捕获探针以在扩增和/或分析(例如序列分析)之前移除任何未延伸的捕获探针。这可以通过多种方法实现，例如，使用酶降解未延伸的探针，例如核酸外切酶或纯化柱。[0535]在一些实施方式中，延伸的捕获探针被扩增以产生足以进行分析的量，例如通过dna测序。在一些实施方式中，延伸的捕获探针的第一链(例如，dna和/或cdna分子)用作扩增反应(例如，聚合酶链反应)的模板。[0536]在一些实施方式中，扩增反应使用包括亲和力基团的引物将亲和力基团纳入延伸的捕获探针(例如，rna‑cdna杂交)上。在一些实施方式中，所述引物包括亲和基团，所述延伸的捕获探针包括亲和基团。亲和基团可以对应于前面描述的任何亲和基团。[0537]在一些实施方式中，包括亲和基团的延伸的捕获探针可以耦合到亲和基团特异性的阵列特征。在一些实施方式中，基材可包括抗体或抗体片段。在一些实施方式中，阵列特征包括亲和素或链霉亲和素，并且亲和基团包括生物素。在一些实施方式中，阵列特征包括麦芽糖，亲和基团包括麦芽糖结合蛋白。在一些实施方式中，阵列特征包括麦芽糖结合蛋白，亲和基团包括麦芽糖。在一些实施方式中，只要延伸的探针的拷贝未附接到阵列特征，则扩增延伸的捕获探针可以起到从阵列特征释放扩增的探针的作用。[0538]在一些实施方式中，从阵列特征释放延伸的捕获探针或其互补物或扩增子。从阵列特征释放延伸的捕获探针或其互补物或扩增子的步骤可以通过多种方式实现。在一些实施方式中，通过核酸裂解和/或变性(例如通过加热使双链分子变性)从特征释放延伸的捕获探针或其互补物。[0539]在一些实施方式中，通过物理手段从阵列特征释放延伸的捕获探针或其互补物或扩增子。例如，诱导物理释放的方法包括变性双链核酸分子。另一种释放延伸的捕获探针的方法是使用干扰双链分子氢键的溶液。在一些实施方式中，通过施加加热的水(例如至少85℃的水或缓冲液，例如至少90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或99℃的水)来释放延伸的捕获探针。在一些实施方式中，添加包括盐、表面活性剂等可以进一步使核酸分子之间的相互作用不稳定的溶液以从阵列特征释放延伸的捕获探针。在一些实施方式中，甲酰胺溶液可用于使核酸分子之间的相互作用不稳定以从阵列特征中释放延伸的捕获探针。[0540](viii)分析物捕获剂[0541]本发明还提供用于使用分析物捕获剂对生物分析物(例如，mrna、基因组dna、可接近染色质和细胞表面或细胞内蛋白质和/或代谢物)进行空间概况分析的方法和材料。如本文所用，“分析物捕获剂”(以前有时也称为“细胞加标剂”)是指与分析物(例如，样品中的分析物)和捕获探针(例如，附接到基材的捕获探针)相互作用以识别分析物的物质。在一些实施方式中，分析物捕获剂包括分析物结合部分和捕获剂条形码结构域。[0542]图9是由分析物结合部分904和捕获剂条形码结构域908组成的示例性分析物捕获剂902的示意图。分析物结合部分904是能够结合到分析物906并与空间条码化捕获探针相互作用的分子。分析物结合部分可以高亲和力和/或高特异性结合到分析物906。分析物捕获剂可包括捕获剂条形码结构域908、核苷酸序列(例如，寡核苷酸)，其可与捕获探针的捕获域的至少部分或全部杂交。分析物结合部分904可包括多肽和/或适体(例如，结合到特定目标分析物的寡核苷酸或肽分子)。分析物结合部分904可包括抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。[0543]如本文所用，术语“分析物结合部分”是指能够结合到大分子成分(例如，分析物，例如，生物分析物)的分子或部分。在本文所述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，结合到生物分析物的分析物捕获剂的分析物结合部分可包括但不限于抗体或其表位结合片段、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子，双特异性抗体、双特异性t细胞接合物、t细胞受体接合物、b细胞受体接合物、前体、适体、单体、粘合素、darpin和蛋白质支架，或其任何组合。分析物结合部分可以高亲和力和/或高特异性结合到大分子成分(例如，分析物)。分析物结合部分可包括核苷酸序列(例如，寡核苷酸)，其可对应于分析物结合部分的至少部分或全部。分析物结合部分可包括多肽和/或适体(例如，结合到特定靶分子的多肽和/或适体，例如，分析物)。分析物结合部分可包括结合到特定分析物(例如，多肽)的抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。[0544]在一些实施方式中，分析物捕获剂的分析物结合部分包括一个或多个抗体或其抗原结合片段。包括分析物结合部分的抗体或抗原结合片段可特异性结合到目标分析物。在一些实施方式中，分析物是蛋白质(例如，生物样品(例如，细胞)表面上的蛋白质或胞内蛋白质)。在一些实施方式中，包含多个分析物结合部分的多个分析物捕获剂结合存在于生物样品中的多个分析物。在一些实施方式中，多个分析物包括单一种类的分析物(例如，单一种类的多肽)。在多个分析物包括单一种类的分析物的一些实施方式中，多个分析物捕获剂的分析物结合部分相同。在多个分析物包括单一种类的分析物的一些实施方式中，多个分析物捕获剂的分析物结合部分是不同的(例如，多个分析物捕获剂的成员可以具有两个或更多个分析物结合部分，其中两个或更多个分析物结合部分中的每一个结合单一种类的分析物(例如，在不同的结合位点))。在一些实施方式中，多个分析物包括多个不同种类的分析物(例如，多个不同种类的多肽)。[0545]分析物捕获剂可以包括分析物结合部分。分析物结合部分可以是抗体。可用作分析物捕获剂中的分析物结合部分或可用于本文公开的ihc/if应用的示例性非限制性抗体包括以下任何一种，包括它们的变体：a‑act，a‑at，acth，肌动蛋白‑肌肉特异性，肌动蛋白‑平滑肌(sma)，ae1，ae1/ae3，ae3，afp，akt磷酸盐，alk‑1，淀粉样蛋白a，雄激素受体，膜联蛋白a1，b72.3，bca‑225，bcl‑1(细胞周期蛋白d1)，bcl‑1/cd20，bcl‑2，bcl‑2/bcl‑6，bcl‑6，ber‑ep4，β‑淀粉样蛋白，β‑连环蛋白，bg8(lewisy)，bob‑1，ca19.9，ca125，caix，降钙素，钙调素结合蛋白，钙调理蛋白，钙网膜蛋白，cam5.2，cam5.2/ae1，cd1a，cd2，cd3(m)，cd3(p)，cd3/cd20，cd4，cd5，cd7，cd8，cd10，cd14，cd15，cd20，cd21，cd22，cd23，cd25，cd30，cd31，cd33，cd34，cd35，cd43，cd45(lca)，cd45ra，cd56，cd57，cd61，cd68，cd71，cd74，cd79a，cd99，cd117(c‑kit)，cd123，cd138，cd163，cdx‑2，cdx‑2/ck‑7，cea(m)，cea(p)，嗜铬粒蛋白a，胰凝乳蛋白酶，ck‑5，ck‑5/6，ck‑7，ck‑7/ttf‑1，ck‑14，ck‑17，ck‑18，ck‑19，ck‑20，ck‑hmw，ck‑lmw，cmv‑ih，coll‑iv，cox‑2，d2‑40，dba44，肌间线蛋白，dog1，eber‑ish，ebv(lmp1)，e‑钙粘素，egfr，ema，er，ercc1，因子viii(vwf)，因子xiiia，肌成束蛋白，fli‑1，fhs，半乳凝素‑3，胃泌激素，gcdfp‑15，gfap，胰高血糖素，血型糖蛋白a，磷脂酰肌醇聚糖‑3，颗粒酶b，生长激素(gh)，gst，ham56，hmbe‑1，hbp，hcag，hcg，血红蛋白a，hepbcore(hbcag)，hepbsurf，(hbsag)，heppar1，her2，疱疹i，疱疹ii，hhv‑8，hla‑dr，hmb45，hpl，hpv‑ihc，hpv(6/11)‑ish，hpv(16/18)‑ish，hpv(31/33)‑ish，hpvwss‑ish，hpv高‑ish，hpv低‑ish，hpv高与低‑ish，iga，igd，igg，igg4，igm，抑制素，胰岛素，jc病毒‑ish，κ‑ish，kerpan，ki‑67，λ‑ihc，λ‑ish，lh，脂肪酶，溶菌酶(mura)，乳腺珠蛋白，mart‑1，mbp，m‑细胞类胰蛋白酶，mel‑5，melan‑a，，melan‑a/ki‑67，间皮素，mitf，mlh‑1，moc‑31，mpo，msh‑2，msh‑6，muc1，muc2，muc4，muc5ac，mum‑1，myod1，肌细胞生成素，肌红蛋白，myoin重链，新天冬氨酸蛋白酶a，nb84a，new‑n，nf，nk1‑c3，npm，nse，oct‑2，oct‑3/4，oscar，p16，p21，p27/kip1，p53，p57，p63，p120，p504s，泛黑色素瘤，panc.poly，细小病毒b19，pax‑2，pax‑5，pax‑5/cd43，pax＝5/cd5，pax‑8，pc，pd1，穿孔素，pgp9.5，plap，pms‑2，pr，催乳激素，psa，psap，psma，pten，pth，pts，rb，rcc，s6，s100，血清素，生长激素抑制素，表面活性剂(sp‑a)，突触小泡蛋白，突触核蛋白，tau，tcl‑1，tcrβ，tdt，血栓调节蛋白，甲状腺球蛋白，tia‑1，toxo，trap，triviewtm胸，triviewtm前列腺，胰蛋白酶，ts，tsh，ttf‑1，酪氨酸酶，遍在蛋白，尿蛋白，vegf，绒毛蛋白，波形蛋白(vim)，vip，vzv，wt1(m)n‑末端，wt1(p)c‑末端，zap‑70。[0546]此外，可用作分析物捕获剂中的分析物结合部分或可用于本文公开的ihc/if应用的示例性非限制性抗体包括以下抗体中的任一种(及其变体)：细胞表面蛋白，胞内蛋白，激酶(例如，agc激酶家族(例如，akt1，akt2，pdk1，蛋白激酶c，rock1，rock2，sgk3)，camk激酶家族(例如，ampk1，ampk2，camk，chk1，chk2，zip)，ck1激酶家族，tk激酶家族(例如，abl2，axl，cd167，cd246/alk，c‑met，csk，c‑src，egfr，erbb2(her2/neu)，erbb3，erbb4，fak，fyn，lck，lyn，pkt7，syk，zap70)，ste激酶家族(例如，ask1，mapk，mek1，mek2，mek3mek4，mek5，pak1，pak2，pak4，pak6)，cmgc激酶家族(例如，cdk2，cdk4，cdk5，cdk6，cdk7，cdk9，erk1，gsk3，jnk/mapk8，jnk2/mapk9，jnk3/mapk10，p38/mapk)，和tkl激酶家族(例如，alk1，ilk1，irak1，irak2，irak3，irak4，limk1，limk2，m3k11，raf1，rip1，rip3，vegfr1，vegfr2，vegfr3)，auroraa激酶，aurorab激酶，ikk，nemo样激酶，pink，plk3，ulk2，wee1，转录因子(例如，foxp3，atf3，bach1，egr，elf3，foxa1，foxa2，fox01，gata)，生长因子受体，肿瘤遏制剂(例如，抗p53，抗blm，抗cdk2，抗chk2，抗brca‑1，抗nbs1，抗brca‑2，抗wrn，抗pten，抗wt1，抗p38)。[0547]在一些实施方式中，分析物捕获剂能够结合存在于细胞内的分析物。在一些实施方式中，分析物捕获剂能够结合细胞表面分析物，其可包括但不限于受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白通道、蛋白泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞‑细胞相互作用蛋白复合物，抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化t细胞受体、t细胞受体、b细胞受体、嵌合抗原受体、胞外基质蛋白、细胞表面蛋白的翻译后修饰(例如，磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝化、甲基化、乙酰化或脂质化)状态、间隙连接和粘附连接。在一些实施方式中，分析物捕获剂能够结合到翻译后修饰的细胞表面分析物。在此类实施方式中，分析物捕获剂可基于翻译后修饰的给定状态(例如，磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化或脂质化)对细胞表面分析物特异性，使得细胞表面分析物概况可包括一种或多种分析物的翻译后修饰信息。[0548]在一些实施方式中，分析物捕获剂包括与分析物结合部分偶联或以其他方式附接到分析物结合部分的捕获剂条形码结构域。在一些实施方式中，捕获剂条形码结构域共价连接到分析物结合部分。在一些实施方式中，捕获剂条形码结构域是核酸序列。在一些实施方式中，捕获剂条形码结构域包括分析物结合部分条形码和分析物捕获序列。[0549]如本文所用，术语“分析物结合部分条形码”是指与分析物结合部分相关联或以其他方式识别分析物结合部分的条形码。在一些实施方式中，通过识别分析物结合部分和与其相关联的分析物结合部分条形码，与分析物结合部分结合的分析物也可被识别。分析物结合部分条形码可以是给定长度的核酸序列和/或与分析物结合部分相关联的序列。分析物结合部分条形码通常可包括本文所述条形码的各种方面中的任一方面。例如，一种类型的分析物特异性的分析物捕获剂可具有耦合到其上的第一捕获剂条形码结构域(例如，其包括第一分析物结合部分条形码)，而不同分析物特异性的分析物捕获剂可具有耦合到其上的不同的捕获剂条形码结构域(例如，其包括第二条形码分析物结合部分条形码)。在一些方面中，这种捕获剂条形码结构域可包括使识别捕获剂条形码结构域耦合到的分析物结合部分的分析物结合部分条形码。捕获剂条形码结构域的选择可得到序列方面的显著多样性，同时也可容易地附接到大多数分析物结合部分(例如，抗体或适体)以及容易地检测(例如，使用测序或阵列技术)。[0550]在一些实施方式中，分析物捕获剂的捕获剂条形码结构域包括分析物捕获序列。如本文所用，术语“分析物捕获序列”是指被配置为杂交到捕获探针的捕获域、结合到捕获探针的捕获域、耦合到捕获探针的捕获域或以其他方式与捕获探针的捕获域相互作用的区域或部分。在一些实施方式中，分析物捕获序列包括与捕获探针的捕获域互补或基本互补的核酸序列，使得分析物捕获序列与捕获探针的捕获域杂交。在一些实施方式中，分析物捕获序列包含与包含多聚(t)核酸序列的捕获域杂交的多聚(a)核酸序列。在一些实施方式中，分析物捕获序列包含与包含多聚(a)核酸序列的捕获域杂交的多聚(t)核酸序列。在一些实施方式中，分析物捕获序列包含与捕获域杂交的非均聚核酸序列，该捕获域包含与分析物捕获区域的非均聚核酸序列互补(或基本互补)的非均聚核酸序列。[0551]在使用分析物捕获剂的本文所述的任何空间分析方法的一些实施方式中，捕获剂条形码结构域可以直接耦合到分析物结合部分，或者它们可以附接到珠、分子晶格，例如线性、球状、交联或其他聚合物，或与分析物结合部分附接或以其他方式相关联的其他框架，其使将多个捕获剂条形码结构域附接到单个分析物结合部分。捕获剂条形码结构域到分析物结合部分的附接(耦合)可通过各种直接或间接、共价或非共价结合或附接中的任何一种来实现。例如，在捕获剂条形码结构域耦合到包括抗体或抗原结合片段的分析物结合部分的情况下，可以使用化学偶联技术(例如，可从银诺瓦生物科学有限公司(innovabiosciences)获得的lightning抗体标记试剂盒)将这些捕获剂条形码结构域共价附接到抗体或抗原结合片段的部分。在一些实施方式中，捕获剂条形码结构域可使用非共价附接机制(例如，使用生物素化抗体和包括一个或多个生物素化接头的寡核苷酸或珠，用亲和素或链霉亲和素接头耦合到寡核苷酸)耦合到抗体或抗原结合片段。可使用抗体和寡核苷酸生物素化技术，并且其例如在fang等，nucleicacidsres.(2003)，31(2)：708‑715中描述，其全部内容通过引用纳入本文中。同样地，蛋白质和肽生物素化技术已被开发并可被使用，并且例如在美国专利号6,265,552中描述，其全部内容通过引用纳入本文。此外，点击反应化学(例如甲基四嗪‑peg5‑nhs酯反应、tco‑peg4‑nhs酯反应等)可用于将捕获剂条形码结构域耦合到分析物结合部分。分析物结合部分上的反应部分还可包括用于靶向醛类的胺、用于靶向马来酰亚胺(例如，游离巯基)的胺、用于靶向点击化学化合物(例如，炔烃)的叠氮化物、用于靶向链霉亲和素的生物素、用于靶向edc的磷酸盐，其反过来靶向活性酯(例如，nh2)。分析物结合部分上的反应部分可以是与分析物结合部分上的反应部分结合的化合物或基团。将分析物结合部分偶联到捕获剂条形码结构域的示例性策略包括使用商业试剂盒(例如，solulink、thunderlink)、铰接器区的轻微还原和马来酰亚胺标记的结合、对标记的酰胺(例如，无铜)的染色促进的点击化学反应，糖链的高碘酸盐氧化的偶联和胺的偶联。在分析物结合部分是抗体的情况下，抗体可以在寡核苷酸偶联之前或同时进行修饰。例如，抗体可用β‑1，4‑半乳糖基转移酶的化学基材相容的(chemicalsubstrate‑permissive)突变体，galt(y289l)和含叠氮化物的尿苷二磷酸‑n‑乙酰半乳糖胺类似物尿苷二磷酸‑galnaz进行糖基化。修饰后的抗体可与具有二苯并环辛炔‑peg4‑nhs基团的寡核苷酸偶联。在一些实施方式中，可以避免某些步骤(例如，cooh活化(例如，edc)和同双功能交联剂)以防止分析物结合部分与其自身偶联。在本文所述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，分析物捕获剂(例如，耦合到寡核苷酸的分析物结合部分)可通过转染(例如，使用转染胺、阳离子聚合物、磷酸钙或电穿孔)、转导(例如，使用噬菌体或重组病毒载体)，通过机械递送(例如，磁珠)，通过脂质(例如，1，2‑二油酸‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(dopc))，或通过转运蛋白递送至细胞内。分析物捕获剂可以通过外来体被递送至细胞内。例如，可产生释放包含分析物捕获剂的外来体的第一细胞。分析物捕获剂可以附接在外来体膜上。分析物捕获剂可以包含在外来体的胞浆中。释放的外来体可被收获并提供给第二细胞，从而将分析物捕获剂递送到第二细胞中。分析物捕获剂可在递送到细胞之前、期间或之后从外来体膜释放。在一些实施方式中，使细胞透化以使分析物捕获剂与胞内成分(例如但不限于细胞内蛋白质、代谢物和核膜蛋白质)耦合。在细胞内递送之后，可使用分析物捕获剂来分析如本文所述的胞内成分。[0552]在本文描述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，耦合到分析物捕捉剂的捕捉剂条形码结构域可包括使其不可由聚合酶扩增的修饰。在一些实施方式中，当结合到用于引物延伸反应的样品中的核酸或捕获探针的捕获域时，捕获剂条形码结构域可以用作模板而不是引物。当捕获剂条形码结构域还包括条形码(例如，分析物结合部分条形码)时，这样的设计可以通过增加捕获剂条形码结构域和未编码样品核酸之间的亲和力来提高分子条码化的效率，并且消除衔接子伪影的潜在形成。在一些实施方式中，捕获剂条形码结构域可包括随机n‑聚体序列，该随机n‑聚体序列被使其不可由聚合酶延伸的修饰所加帽。在某些情况下，随机n‑聚体序列的组成可以被设计成最大化与游离的、未编码的ssdna分子的结合效率。设计可包括具有较高gc含量的随机序列组合物、在特定位置具有固定g或c的部分随机序列、鸟苷的使用、锁核酸的使用或其任何组合。[0553]通过聚合酶阻断引物延伸的修饰可以是不同长度的碳间隔子基团或双脱氧核苷酸。在一些实施方式中，修饰可为具有无嘌呤或无嘧啶结构的无碱位点、碱基类似物或磷酸盐主链的类似物，例如通过酰胺键连接的n‑(2‑氨基乙基)‑甘氨酸主链、四氢呋喃或1’，2’‑二脱氧核糖。修饰还可以是尿嘧啶碱、2’ome修饰rna、c3‑18间隔子(例如，具有3‑18个连续碳原子的结构，例如c3间隔子)、乙二醇多聚体间隔子(例如，间隔子18(六乙二醇间隔子))、生物素、二脱氧核苷酸三磷酸酯、乙二醇、胺或磷酸盐。[0554]在本文描述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，耦合到分析物结合部分的捕获剂条形码结构域包括可裂解结构域。例如，在分析物捕获剂结合到分析物(例如，细胞表面分析物)之后，可以根据本文所述的方法裂解和收集捕获剂条形码结构域以用于下游分析。在一些实施方式中，捕获剂条形码结构域的可裂解结构域包括使物质从珠释放的u‑切除元件。在一些实施方式中，u‑切除元件可包括包含至少一种尿嘧啶的单链dna(ssdna)序列。该物质可以通过ssdna序列附接到珠上。该物质可通过尿嘧啶‑dna糖基化酶(例如，移除尿嘧啶)和核酸内切酶(例如，诱导ssdna断裂)的组合释放。如果核酸内切酶从裂解产生5′磷酸基团，则可在下游加工中包括其它酶处理以消除磷酸基团，例如，在连接其它测序手柄元件(例如，illumina全p5序列、部分p5序列、全r1序列和/或部分r1序列)之前。[0555]在一些实施方式中，来自生物样品的多种不同种类的分析物(例如，多肽)可随后与生物样品的一个或多个物理性质相关联。例如，多种不同种类的分析物可与分析物在生物样品中的位置相关联。此类信息(例如，当分析物结合部分识别多肽时的蛋白质组学信息)可与其它空间信息(例如，来自生物样品的遗传信息，例如dna序列信息、转录组信息(即转录物序列)或两者)联用。例如，细胞的细胞表面蛋白质可与细胞的一个或多个物理性质(例如，细胞的形状、大小、活性或类型)相关联。一个或多个物理性质可以通过对细胞成像来表征。细胞可由分析物捕获剂结合，该分析物捕获剂包含结合到细胞表面蛋白质的分析物结合部分和识别该分析物结合部分的分析物结合部分条形码，并且细胞可经空间分析(例如，本文所述的各种空间分析方法中的任何一种)。例如，结合到细胞表面蛋白质的分析物捕获剂可结合到捕获探针(例如，阵列上的捕获探针)，该捕获探针包括与存在于分析物捕获剂的捕获剂条形码结构域上的分析物捕获序列相互作用的捕获域。所有或部分捕获剂条形码结构域(包括分析物结合部分条形码)可使用聚合酶复制，使用捕获域的3′末端作为引发位点，生成延伸的捕获探针，其包括对应于捕获探针的互补序列的全部或部分(包括捕获探针上存在的空间条形码)和分析物结合部分条形码的拷贝。在一些实施方式中，具有延伸的捕获剂条形码结构域(其包括与捕获探针的空间条形码互补的序列)的分析物捕获剂被称为“空间加标的分析物捕获剂”。[0556]在一些实施方式中，可使具有空间加标的分析物捕获剂的空间阵列与样品接触，其中与空间阵列相关联的分析物捕获剂捕获目标分析物。包含延伸的捕获探针(其包括分析物结合部分条形码和捕获探针的空间条形码的互补序列)的分析物捕获剂随后可从空间阵列的捕获探针变性。这样就可以重复使用空间阵列。样品可分离成非聚集细胞(例如单细胞)并通过本文所述的单细胞/液滴方法进行分析。可以对空间加标的分析物捕获剂进行测序以获得捕获探针的空间条形码和分析物捕获剂的分析物结合部分条形码的核酸序列。因此，延伸的捕获探针的核酸序列可与分析物(例如，细胞表面蛋白质)相关联，并反过来与细胞的一个或多个物理性质(例如，形状或细胞类型)相关联。在一些实施方式中，延伸的捕获探针的核酸序列可与附近细胞的细胞内分析物相关联，其中使用本文所述的任何细胞透化或分析物迁移技术释放细胞内分析物。[0557]在本文所描述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，然后可以对从分析物捕获剂释放的捕获剂条形码结构域进行序列分析，以识别哪些分析物捕获剂与分析物结合。基于与空间阵列上的特征(例如，特定位置的特征)相关联的捕获剂条形码结构域和分析物结合部分条形码序列的存在，可以为生物样品创建分析物文件。个体细胞或细胞群的文件可与其他细胞(例如，“正常”细胞)的文件进行比较，以确定分析物的变化，从而提供诊断相关信息。在一些实施方式中，这些文件可用于诊断以细胞表面受体的变化为特征的各种疾病，例如癌症和其他疾病。[0558]图10是描绘特征固定的(feature‑immobilized)捕获探针1024和分析物捕获剂1026之间的示例性相互作用的示意图。特征固定的捕获探针1024可以包括空间条形码1008以及一个或多个功能序列1006和1010，如本文别处所述。捕获探针还可以包括能够结合到分析物捕获剂1026的捕获域1012。分析物捕获剂1026可以包括功能序列1018、捕获剂条形码结构域1016和能够结合到捕获探针1024的捕获域1012的分析物捕获序列1014。分析物捕获剂还可以包括接头1020，其使捕获剂条形码结构域1016耦合到分析物结合部分1022。[0559]在本文所描述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，所述方法用于识别免疫细胞文件。免疫细胞表达与免疫功能相关的各种适应性免疫受体，如t细胞受体(tcr)和b细胞受体(bcr)。t细胞受体和b细胞受体通过特异性识别和结合抗原并协助其破坏而在免疫应答中发挥作用。[0560]t细胞受体(tcr)是一种存在于t细胞表面的分子，通常负责将抗原片段识别为与主要组织相容性复合物(mhc)分子结合的肽。tcr通常是两条链的异二聚体，每条链都是免疫球蛋白超家族的成员，具有n末端可变(v)结构域和c末端恒定结构域。在人类，95％的t细胞中，tcr由α和β链组成，而在5％的t细胞中，tcr由γ和δ(γ/8)链组成。这一比例在个体发育过程中、疾病状态下以及不同物种中都会发生变化。当tcr与抗原肽和mhc(肽/mhc或pmhc)结合时，t淋巴细胞通过信号转导被活化。[0561]tcr的两条链中的每一条都包含基因区段的多个拷贝——可变的“v”基因区段、多样性的“d”基因区段和连接的“j”基因区段。tcrα链(tcra)由v、j区段重组产生，而β链(tcrb)由v、d、j区段重组产生。类似地，tcrγ链的产生涉及v和j基因区段的重组，而tcrδ链的产生是通过v、d和j基因区段的重组来实现的。这些特定区域的交叉点(α链或γ链的v和j，β链或δ链的v、d和j)对应于对抗原mhc识别很重要的cdr3区域。互补决定区(例如，cdr1、cdr2和cdr3)或高变区是抗原受体(例如，t细胞受体和免疫球蛋白)可变域中可与抗原互补的序列。cdr的大部分多样性存在于cdr3中，这种多样性是由t淋巴细胞发育过程中的体细胞重组事件产生的。在基因排列过程中产生的独特核苷酸序列可以称为克隆型。[0562]b细胞受体(bcr)是一种存在于b细胞表面的分子。bcr的抗原结合部分由膜结合抗体组成，与大多数抗体(例如免疫球蛋白)一样，膜结合抗体具有独特且随机确定的抗原结合位点。bcr的抗原结合部分包括一种同种型(例如igd、igm、iga、igg或ige)的膜结合免疫球蛋白分子。当b细胞被它第一次遇到的同源抗原活化时，该细胞增殖和分化产生抗体分泌型浆b细胞和记忆b细胞群体。不同的免疫球蛋白同种型在生物学特性、结构、靶特异性和分布上存在差异。存在多种分子机制来产生初始多样性，包括多个位点的基因重组。[0563]bcr由编码抗体重链和轻链的igh和igk(或igl)两个基因组成。免疫球蛋白是通过基因区段间的重组、这些区段连接处的序列多样化以及整个基因的点突变形成的。每个重链基因包含三个不同基因区段的多个拷贝——可变的“v”基因区段、多样性的“d”基因区段和连接的“j”基因区段。每个轻链基因包含蛋白质可变区的两个不同基因区段的多个拷贝‑可变的“v”基因区段和连接的“j”基因区段。[0564]重组可以产生一个v、d和j段各有一个的分子。此外，在两个连接的每个连接处可以删除几个碱基，并添加其他碱基(称为n和p核苷酸)，从而产生进一步的多样性。b细胞活化后，通过体细胞超突变发生亲和成熟过程。在这个过程中，活化的b细胞的子代细胞在整个基因中积累不同的体细胞突变，在cdr区域具有更高的突变浓度，从而产生对抗原具有更高亲和力的抗体。[0565]除了体细胞超突变外，活化的b细胞也经历了同种型转换的过程。具有相同可变区段的抗体根据恒定区段可以具有不同的形式(同种型)。而所有的原始b细胞都表达igm(或igd)，活化的b细胞大多数表达igg，但也表达igm、iga和ige。这种从igm(和/或igd)到igg、iga或ige的表达转换通过重组事件发生，该事件导致一个细胞专一产生特定的同种型。在基因排列过程中产生的独特核苷酸序列可以类似地称为克隆型。[0566]本文所描述的某些方法用于分析来自免疫细胞的tcr和bcr的各种序列，例如各种克隆型。在一些实施方式中，所述方法用于分析tcrα链、tcrβ链、tcrδ链、tcrγ链或其任何片段(例如，包括v(d)j或vj区的可变区、恒定区、跨膜区、其片段、其组合和其片段组合)的序列。在一些实施方式中，本文所述的方法可用于分析b细胞受体重链、b细胞受体轻链或其任何片段(例如，包括v(d)j或vj区的可变区、恒定区、跨膜区、其片段、其组合和其片段组合)的序列。[0567]在将要分析免疫细胞的情况下，用于附接条形码序列和/或扩增反应的各种操作中的任何一种的引物序列可包括靶向免疫细胞蛋白质(例如免疫受体)的基因或基因区域的基因特异性序列。这些基因序列包括但不限于各种t细胞受体α可变基因(trav基因)、t细胞受体α连接基因(traj基因)、t细胞受体α恒定基因(trac基因)、t细胞受体β可变基因(trbv基因)、t细胞受体β多样性基因(trbd基因)的序列，t细胞受体β连接基因(trbj基因)、t细胞受体β恒定基因(trbc基因)、t细胞受体γ可变基因(trgv基因)、t细胞受体γ连接基因(trgj基因)、t细胞受体γ恒定基因(trgc基因)、t细胞受体δ可变基因(trdv基因)，t细胞受体δ多样性基因(trdd基因)、t细胞受体δ连接基因(trdj基因)和t细胞受体δ恒定基因(trdc基因)的序列。[0568]在一些实施方式中，分析物结合部分基于i类或ii类主要组织相容性复合物(mhc)。在一些实施方式中，分析物结合部分是mhc多聚体，包括但不限于mhc右旋体、mhc四聚体和mhc五聚体(例如，参见美国专利申请公开号us2018/0180601和us2017/0343545，其全部内容通过引用纳入本文中)。包括全部或部分mhc肽的mhc(例如可溶性mhc单体分子)可用作分析物捕获剂的分析物结合部分，所述分析物捕获剂耦合到捕获剂条形码结构域，所述捕获剂条形码结构域包括识别其相关mhc的分析物结合部分条形码(因此，例如mhc的tcr结合伴侣)。在一些实施方式中，mhc用于分析t细胞的一个或多个细胞表面特征，例如tcr。在某些情况下，多个mhc以更大的复合物(mhc多聚体)结合在一起，通过多配体结合协同作用提高mhc与tcr的结合亲和力。[0569]图11a、11b和11c是图示如何在基于阵列的系统中利用链霉亲和素细胞标签来产生空间条码化的细胞或细胞内容物的示意图。例如，如图11所示，肽结合的主要组织相容性复合物(pmhc)可单独与生物素结合并结合到链霉亲和素部分，使得链霉亲和素部分包含多个pmhc部分。这些部分中的每一个可结合到tcr，使得链霉亲和素通过多个mch/tcr结合相互作用结合到靶t细胞。多个相互作用协同作用，可以大大提高结合亲和力。这种改进的亲和力可以改善t细胞的标记，也可以降低标记从t细胞表面解离的可能性。如图11b所示，捕获剂条形码结构域1101可由链霉亲和素1102修饰并与生物素化mhc1103的多个分子(例如pmhc)接触，使得生物素化mhc1103分子与链霉亲和素偶联的捕获剂条形码结构域1101耦合。结果是条码化的mhc多聚体复合物1105。如图11b所示，捕获剂条形码结构域序列1101可以将mhc识别为其相关联的标签，并且还包括可选的功能序列，例如用于与其他寡核苷酸杂交的序列。如图11c所示，一个示例寡核苷酸是捕获探针1106，其包括互补序列(例如，与ccc相对应的rgrgrg)、条形码序列和其他功能序列，例如，umi、衔接子序列(例如，包括测序引物序列(例如，r1或部分r1(“pr1”))、流动池附接序列(例如，p5或p7或其部分序列)等。在某些情况下，捕获探针1106可首先与特征(例如，凝胶珠)相关联并从特征中释放。在其它实施方式中，捕获探针1106可与mhc‑寡核苷酸复合物1105的捕获剂条形码结构域1101杂交。杂交的寡核苷酸(间隔子ccc和间隔子rgrgrg)随后可在引物延伸反应中延伸，使得生成包含对应于两个空间条形码序列(与捕获探针相关联的空间条形码，与mhc‑寡核苷酸复合物相关联的条形码)中的每一个的序列的构建物。在一些情况下，这些对应序列中的一个或两个可以是捕获探针1106或捕获剂条形码结构域1101中的原始序列的互补物。在其他实施方式中，捕获探针和捕获剂条形码结构域连接在一起。所得到的构建体可以任选地进一步加工(例如，以添加任何其它序列和/或用于清理)并进行测序。如本文别处所述，源自捕获探针1106空间条形码序列的序列可用于识别特征，并且源自捕获剂条形码结构域1101上的空间条形码序列的序列可用于识别结合在细胞表面上的特定肽mhc复合物1104(例如，当使用用于筛选免疫细胞或免疫细胞群的mhc肽库时)。[0570](c)基材[0571]对于本文中描述的基于空间阵列的分析方法，基材起到了支持捕获探针直接或间接附接到阵列特征的作用。此外，在一些实施方式中，基材(例如，相同的基材或不同的基材)可用于为生物样品，特别是，例如薄组织切片提供支持。因此，“基材(substrate)”是不溶于水性溶液的支持物，其使生物样品、分析物、特征和/或捕获探针定位在基材上。[0572]此外，如本文所用的“基材”，当前面没有修饰语“化学”时，是指具有至少一个表面的构件，该表面通常起到为本文所述的生物样品、分析物和/或任何其它化学和/或物理部分、试剂和结构提供物理支持。基材可由多种固体材料、凝胶基材料、胶体材料、半固体材料(例如，至少部分交联的材料)、完全或部分固化的材料和经历相变或过渡的材料形成以提供物理支持。可用于本文所述的方法和系统的基材的示例包括但不限于载玻片(例如由各种玻璃形成的载玻片、由各种聚合物形成的载玻片)、水凝胶、层和/或薄膜，膜(例如多孔膜)、流动池、比色皿、晶片、板或它们的组合。在一些实施方式中，基材可以任选地包括功能元件，例如凹槽、突出结构、微流体元件(例如，通道、储器、电极、阀、密封件)和各种标识，如下文将进一步详细讨论的那些。[0573](i)基材属性[0574]基材通常可以具有任何合适的形式或形态。例如，基材可以是平坦的、弯曲的，例如向生物样品(例如组织样品)和基材之间发生相互作用的区域呈凸形或凹形弯曲。在一些实施方式中，基材是平坦的，例如，平面、芯片或载玻片。基材可包含基材内的一个或多个图案化表面(例如，通道、孔、凸起、脊、凹坑等)。[0575]基材可以是任何期望的形状。例如，基材通常可以是薄的扁平形状(例如，正方形或矩形)。在一些实施方式中，基材结构具有圆角(例如，为了增加安全性或稳健性)。在一些实施方式中，基材结构具有一个或多个截止角(例如，用于滑动夹或交叉台)。在一些实施方式中，当基材结构是平坦的时，基材结构可以是具有平坦表面的任何适当类型的支持物(例如，芯片或载玻片，例如显微镜载玻片)。[0576]基材可任选地包括各种结构，例如但不限于凸起、脊和通道。基材可以被微图案化以限制横向扩散(例如，防止空间条形码的重叠)。用这种结构修饰的基材可以被修饰以使分析物、特征物(例如，珠)或探针在各个位置的结合。例如，用各种结构修饰基材的位点可以与其他位点连续或不连续。[0577]在一些实施方式中，基材的表面可以被修饰，以便形成只能具有或容纳单个特征的离散位置。在一些实施方式中，基材的表面可以被修饰，使得特征粘附到随机位点。[0578]在一些实施方式中，使用例如(但不限于)冲压、微蚀或模制技术等技术来修饰基材的表面以包含一个或多个孔。在基材包括一个或多个孔的一些实施方式中，基材可以是凹陷表面载玻片或凹穴载玻片。例如，孔可以由基材表面上的一个或多个浅凹陷形成。在一些实施方式中，在基材包括一个或多个孔的情况下，可以通过将盒(例如，包含一个或多个腔室的盒)附接到基材结构的表面来形成孔。[0579]在一些实施方式中，基材(例如，孔或特征)的结构可各自承载不同的捕获探针。可以根据结构在基材表面中或基材表面上的位置来识别附接在每个结构上的不同捕获探针。示例性基材包括阵列，其中分开的结构位于基材上，包括例如具有容纳特征的孔的阵列。[0580]在一些实施方式中，其中基材被修饰以包含一个或多个结构，包括但不限于孔、凸起、脊、特征或标识，所述结构可包括物理改变的位点。例如，用各种结构修饰的基材可包括物理性质，包括但不限于物理构型、磁力或压缩力、化学官能化位点、化学改变位点和/或静电改变位点。在一些实施方式中，其中基材被修饰以包含各种结构，包括但不限于孔、凸起、脊、特征或标识，所述结构以图案施加。或者，结构可以随机分布。[0581]基材(例如，或珠或阵列上的特征)可包括几万到几十万或数百万个个体寡核苷酸分子(例如，至少约10000、50000、100000、500000、1000000、10000000、10000000、100000000、100000000、100000000或1000000000个寡核苷酸分子)。[0582]在一些实施方式中，基材包括基材表面上的一个或多个标识，例如，以提供将空间信息与感兴趣的分析物的表征相关联的指引。例如，可以用线的网格来对基材提供标志物(例如，允许容易地估计在放大率下看到的对象的大小和/或提供用于计数对象的参考区域)。在一些实施方式中，基材上可以包括基准标志物。此类标识可使用包括但不限于印刷、喷砂和表面沉积等技术制作。[0583]在一些实施方式中，可以使用一个或多个基准标志物来进行成像，即，放置在成像系统的视野中的对象，其出现在所产生的图像中。基准标志物通常用作参考点或测量标度。基准标志物可以包括但不限于可检测的标记物，例如荧光、放射性、化学发光和比色标记物。例如，在carter等，appliedoptics46：421‑427，2007中描述了使用基准标志物来稳定化和定向生物样品，其全部内容通过引用纳入本文。在一些实施方式中，基准标志物可以是物理颗粒(例如，纳米颗粒、微球、纳米球、珠或本文所述或本领域已知的任何其他示例性物理颗粒)。[0584]在一些实施方式中，基准标志物可存在于基材上以提供生物样品的取向。在一些实施方式中，微球可耦合至基材以帮助生物样品的定向。在一些示例中，耦合至基材的微球可产生光信号(例如，荧光)。在另一示例中，微球可以特定图案或设计(例如六角形设计)附接于阵列的部分(例如角部)，以帮助生物样品在基材上的特征阵列上的定向。在一些实施方式中，量子点可耦合到基材以帮助生物样品的定向。在一些例子中，耦合到基材的量子点可以产生光信号。[0585]在一些实施方式中，基准标志物可为固定化分子，可检测信号分子可与之相互作用以产生信号。例如，标志物核酸可连接或耦合到当接受特定波长(或波长范围)的光时能够发出荧光的化学部分。这种标志物核酸分子可以在组织样品染色之前、同时或之后与阵列接触，以使组织切片可视化或成像。尽管不是必需的，但是使用可使用用于检测标记的cdna的相同条件(例如成像条件)来检测的标志物可能是有利的。[0586]在一些实施方式中，包括基准标志物以促进组织样品或其图像相对于固定在基材上的捕获探针的定向。可以使用任何数量的用于对阵列进行标识的方法，使得仅当对组织切片成像时才可检测到标志物。例如，分子，例如产生信号的荧光分子，可以直接或间接地固定在基材的表面上。可以在基材上以图案(例如，边缘、一行或多行、一条或多条线等)提供标志物。[0587]在一些实施方式中，基准标志物可以随机放置在视野中。例如，含有荧光团的寡核苷酸可在基材上的随机位置随机印刷、压印、合成或附接到基材(例如载玻片)上。组织切片可与基材接触，使得含有荧光团的寡核苷酸接触或接近来自组织切片的细胞或细胞的组分(例如，mrna或dna分子)。可以获得基材和组织切片的图像，并且可以确定荧光团在组织切片图像中的位置(例如，通过回顾覆盖有荧光团检测的组织切片的光学图像)。在一些实施方式中，基准标志物可以精确地放置在视野中(例如，在基材上的已知位置)。在这种情况下，基准标志物可以压印、附着或合成在基材上并与生物样品接触。通常，拍摄样品和基准标志物的图像，并且可以通过观看图像来确认基准标志物在基材上的位置。[0588]在一些实施方式中，基准标志物可以是附着到基材的固定化分子(例如，物理颗粒)。例如，基准标志物可以是纳米颗粒，例如纳米棒、纳米线、纳米立方体、纳米金字塔或球形纳米颗粒。在一些例子中，纳米颗粒可以由重金属(例如金)制成。在一些实施方式中，纳米颗粒可由金刚石制成。在一些实施方式中，基准标志物可以通过眼睛看到。[0589]如本文所述，本文所述的任何基准标志物(例如，微球、珠或本文所述的任何其他物理颗粒)可以以特定图案或设计(例如，六边形设计)位于阵列的部分(例如，角)，以帮助生物样品在基材上的特征阵列上的定向。在一些实施方式中，位于阵列(例如，基材上的阵列)的部分(例如，角部)的基准标志物可以被图案化或设计于至少1个、至少2个、至少3个或至少4个独特的图案。在一些示例中，位于阵列(例如，基材上的阵列)角部的基准标志物可以具有四种独特的基准标志物图案。[0590]在某些示例中，基准标志物可以环绕阵列。在一些实施方式中，基准标志物能够实现例如镜像的检测。在一些实施方式中，基准标志物可以完全包围阵列。在一些实施方式中，基准标志物可以不完全包围阵列。在一些实施方式中，基准标志物识别阵列的角。在一些实施方式中，一个或多个基准标志物标识阵列的中心。在一些实施方式中，基准标志物包括图案化点，其中一个或多个图案化点基准标志物的直径约为100微米。基准标志物的直径可以是任何有用的直径，包括但不限于50微米到500微米的直径。基准标志物可以这样布置，使得一个基准标志物的中心距阵列周围的一个或多个其他基准标志物的中心在100微米到200微米之间。在一些实施方式中，具有周围基准标志物的阵列约为8mm×8mm。在一些实施方式中，没有周围基准标志物的阵列小于8mm×50mm。[0591]在一些实施方式中，可以将阵列封闭在框架内。换句话说，阵列的周界可以有基准标志物，这样阵列就被封闭或基本封闭。在一些实施方式中，阵列的周界可以是基准标志物(例如，本文描述的任何基准标志物)。在一些实施方式中，阵列的周界可以是均匀的。例如，基准标识(fiducialmarking)可以以这样的方式连接或基本上连接阵列的连续角，使得阵列周界的非角部分在阵列的所有侧面(例如，四个侧面)上是相同的。在一些实施方式中，附接到周界的非角部分的基准标志物可以被图案化或设计成有助于生物样品在阵列上的定向。在一些实施方式中，附接到周界的非角部分的颗粒可以至少1个、至少2个、至少3个或至少4个图案来图案化或设计。在一些实施方式中，在阵列周界的非角部分上，所述图案可以具有基准标识的至少2个、至少3个或至少4个独特图案。[0592]在一些实施方式中，阵列在基材表面上的不同位置可包括至少两个基准标志物(例如，至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100或更多(例如，几百、几千或几万个基准标志物)。可以在基材上以图案(例如，边缘、一行或多行、一条或多条线等)提供基准标志物。[0593]多种不同的基材可用于上述目的。通常，基材可以是任何合适的支持材料。示例性基材包括但不限于玻璃、改性和/或功能化玻璃、水凝胶、膜、薄膜、塑料(包括例如丙烯酸、聚苯乙烯、苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、teflontm、环烯烃、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、树脂，zeonor、二氧化硅或二氧化硅基材料，包括硅和改性硅、碳、金属、无机玻璃、光纤束和聚合物，例如聚苯乙烯、环烯烃共聚物(coc)、环烯烃聚合物(cop)、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯或其组合。[0594]在上面讨论的基材材料的示例中，聚苯乙烯是适于结合带负电大分子的疏水性材料，因为它通常几乎不包含亲水性基团。对于固定在玻片上的核酸，通过增加玻璃表面的疏水性，可以增加核酸的固定。这种增强可以使相对更密集的堆叠形成(例如，提供改进的特异性和分辨率)。[0595]在另一个示例中，基材可以是流动池。流动池可以由上述任何材料形成，并且可以包括使试剂、溶剂、特征和分析物通过流动池的通道。在一些实施方式中，嵌入水凝胶的生物样品组装在流动池中(例如，流动池用于将水凝胶引入生物样品)。在一些实施方式中，嵌入水凝胶的生物样品未组装在流动池中。在一些实施方式中，然后嵌入水凝胶的生物样品可以如本文所述被制备和/或等距扩展。[0596](ii)导电基材[0597]如本文所述产生的导电基材(例如，电泳相容阵列)可用于分析物的空间检测。例如，可以应用电泳场以促进分析物向阵列上的条码化寡核苷酸(例如捕获探针)(例如，固定在纸上的捕获探针、固定在水凝胶膜中的捕获探针或固定在具有导电覆层的载玻片上的捕获探针)迁移。在一些实施方式中，可以布置电泳组件。例如，阳极和阴极可以布置成使得捕获探针阵列(例如固定在纸上的捕获探针、固定在水凝胶膜中的捕获探针，或固定在具有导电覆层的载玻片上的捕获探针)和生物样品位于阳极和阴极之间。在这样的实施方式中，使生物样品中的分析物主动迁移到导电基材上的捕获探针并被捕获。可以根据本文所述的任何方法制备(例如，透化)生物样品。在一些实施方式中，在电泳辅助捕获分析物之后，可以使用本文所述的任何方法来收集、处理和/或分析(例如，测序)条码化的寡核苷酸(例如，捕获探针)和捕获的分析物。[0598]在一些实施方式中，导电基材可包括玻璃(例如，载玻片)，其已被覆有某物质或以其它方式改性以赋予玻璃导电性质。在一些实施方式中，载玻片可以被覆有导电覆层。在一些实施方式中，导电覆层包括氧化锡(to)或氧化铟锡(ito)。在一些实施方式中，导电覆层包括透明导电氧化物(tco)。在一些实施方式中，导电覆层包括铝掺杂氧化锌(azo)。在一些实施方式中，导电覆层包括掺氟氧化锡(fto)。[0599]在一些实施方式中，可以在导电基材(例如，本文所述的任何导电基材)上产生用寡核苷酸(例如，捕获探针，例如，本文所述的多种捕获探针中的任一种)点样或印刷的阵列。例如，本文所述的阵列可与主动分析物捕获方法(例如，本文所述的任何分析物捕获方法，包括但不限于电泳捕获方法)相容。在一些实施方式中，导电基材是多孔介质。可用于本文所述的使用主动分析物捕获的方法中的多孔介质的非限制性示例包括硝化纤维素或尼龙膜。在一些实施方式中，可用于本文所述的使用主动分析物捕获的方法中的多孔介质包括纸。在一些实施方式中，寡核苷酸可以印刷在纸基材上。在一些实施方式中，印刷的寡核苷酸可以与基材相互作用(例如，与纸的纤维相互作用)。在一些实施方式中，印刷的寡核苷酸可以共价结合基材(例如，结合到纸的纤维)。在一些实施方式中，分子前体溶液中的寡核苷酸可以印刷在导电基材(例如，纸)上。在一些实施方式中，分子前体溶液可以聚合，从而在导电基材(例如，纸)上产生凝胶垫。在一些实施方式中，分子前体溶液可通过光聚合(例如，光固化)。在一些实施方式中，含有寡核苷酸(例如，条码化寡核苷酸(例如捕获探针))的凝胶珠(例如，本文所述各种凝胶珠中的任一种)可以印刷在导电基材(例如纸)上。在一些实施方式中，印刷的寡核苷酸可以共价连接到凝胶基质中。[0600](iii)覆层[0601]在一些实施方式中，基材的表面可被覆有细胞受纳覆层以使活细胞粘附。“细胞受纳覆层(cell‑permissivecoating)”是使细胞或帮助细胞在基材上维持细胞活力(例如保持活力)的覆层。例如，细胞受纳覆层可增强细胞附接、细胞生长和/或细胞分化，例如，细胞受纳覆层可向活细胞提供营养。细胞受纳覆层可以包括生物材料和/或合成材料。细胞受纳覆层的非限制性示例包括特征在于具有一个或多个细胞外基质(ecm)成分(例如蛋白聚糖和纤维蛋白，例如胶原、弹性蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白)、聚赖氨酸、聚(l)‑鸟氨酸和/或生物相容性硅酮(例如)的覆层。例如，包括一种或多种细胞外基材成分的细胞受纳覆层可包括i型胶原、ii型胶原、iv型胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和/或玻连蛋白。在一些实施方式中，细胞受纳覆层包括从engelbreth‑holm‑swarm(ehs)小鼠肉瘤(例如，)中提取的可溶性基膜制剂。在一些实施方式中，细胞受纳覆层包括胶原。细胞受纳覆层可用于在空间条码化阵列上培养贴壁细胞，或在与空间条码化阵列接触时维持组织样品或切片的细胞活力。[0602]在一些实施方式中，用表面处理剂(例如聚(l)‑赖氨酸)被覆基材。另外或可选择地，可通过硅烷化(例如采用环氧硅烷、氨基硅烷)和/或通过聚丙烯酰胺处理来处理基材。[0603]在一些实施方式中，处理基材以最小化或减少特征内或特征之间的非特异性分析物杂交。例如，处理可包括用水凝胶、膜和/或薄膜涂覆基材，其对非特异性杂交形成物理屏障。可以使用任何合适的水凝胶。例如，可以使用根据美国专利号6,391,937、9,512,422和9,889,422以及美国专利申请公开号u.s.2017/0253918和u.s.2018/0052081中所述方法制备的水凝胶基材。上述各文件的全部内容通过引用纳入本文。[0604]处理可包括添加具有反应性或能够被活化的官能团，使得其在刺激(例如，光活性官能团)的施用后变得具有反应性。处理可包括使用具有一种或多种物理性质(例如，机械、电气、磁性和/或热)的聚合物进行处理，以最小化非特异性结合(例如，在某些位置活化基材以使在这些位置进行分析物杂交)。[0605]“可条件性移出覆层”是指在应用释放剂后可从基材表面移出的覆层。在一些实施方式中，可条件性移出覆层包括如本文所述的水凝胶，例如，包括基于多肽的材料的水凝胶。具有基于多肽的材料的水凝胶的非限制性示例包括具有蜘蛛丝和人类肌肉l型钙通道的跨膜区段(例如，)的组合的基于合成肽的材料，含有重复的精氨酸‑丙氨酸‑天冬氨酸‑丙氨酸序列(radaradaradarada)(例如)、eak16(aeaeakakaeaeakak)、kld12(kldlkldlkldl)和pgmatrixtm的两亲性16残基肽。[0606]在一些实施方式中，条件可移出覆层中的水凝胶是刺激响应性水凝胶。刺激响应性水凝胶可在施加一个或多个外部触发物(例如释放剂)时经历凝胶到溶液和/或凝胶到固体的转变。参见，例如，willner，acc.chem.res.50：657‑658，2017，其全文通过引用纳入本文。刺激响应性水凝胶的非限制性示例包括热响应性水凝胶、ph响应性水凝胶、光响应性水凝胶、氧化还原响应性水凝胶、分析物响应性水凝胶或其组合。在一些实施方式中，刺激响应性水凝胶可以是多刺激响应性水凝胶。[0607]“释放剂”或“外部触发物”是当释放剂施加到可条件性移出覆层上时，使从基材移出可条件性移出覆层的试剂。外部触发物或释放剂可包括物理触发物，例如热、磁、超声、电化学和/或光刺激，以及化学触发物，例如ph、氧化还原反应、超分子复合物和/或生物催化驱动反应。参见例如echeverria等，gels(2018)，4，54；doi：10.3390/gels4020054，其全文通过引用纳入本文。“释放剂”或“外部触发物”的类型可取决于可条件性移出覆层的类型。例如，特征在于具有氧化还原响应性水凝胶的可条件性移出覆层可在施用包括还原剂(例如二硫苏糖醇(dtt))的释放剂时移出。作为另一个例子，ph响应性水凝胶可在施加改变ph的释放剂时移除。[0608](iv)凝胶基材[0609]在一些实施方式中，水凝胶可形成基材。本文中的术语“水凝胶”是指包括网络的高分子聚合物凝胶。在网络中，一些聚合物链可以选择性地交联，尽管交联并不总是发生。在一些实施方式中，基材包括水凝胶和一种或多种第二材料。在一些实施方式中，将水凝胶放置在一种或多种第二材料的顶部。例如，水凝胶可以预先形成，然后用一种或多种第二材料放置在顶部、底部或以任何其他构造放置中。在一些实施方式中，水凝胶形成发生在于基材形成期间接触一种或多种第二材料之后。水凝胶形成也可以发生在位于基材上的结构(例如，孔、脊、特征、凸起和/或标识)内。当基材包括凝胶(例如，水凝胶或凝胶基材)时，凝胶内的寡核苷酸可附接于基材。[0610]在一些实施方式中，水凝胶可包括水凝胶亚基。水凝胶亚基可包括任何方便的水凝胶亚基，例如但不限于丙烯酰胺、双丙烯酰胺、聚丙烯酰胺及其衍生物、聚乙二醇及其衍生物(例如peg‑丙烯酸酯(peg‑da)、peg‑rgd)、明胶‑甲基丙烯酰(gelma)、甲基丙烯酸化透明质酸(meha)、聚脂肪族聚氨酯，聚醚型聚氨酯、聚酯型聚氨酯、聚乙烯共聚物、聚酰胺、聚乙烯醇、聚丙二醇、聚氧丁撑、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸羟乙酯和聚甲基丙烯酸羟乙酯、胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖、琼脂糖、明胶、海藻酸盐、蛋白质聚合物、甲基纤维素等或其组合。[0611]在一些实施方式中，水凝胶包括杂化材料，例如，水凝胶材料包括合成聚合物和天然聚合物的元素。例如，在美国专利号6,391,937、9,512,422和9,889,422以及美国专利申请公开号2017/0253918、2018/0052081和2010/0055733中描述了合适水凝胶的示例，其全部内容通过引用纳入本文中。[0612]在一些实施方式中，将交联剂和/或引发剂添加到水凝胶亚基。交联剂的示例包括但不限于双丙烯酰胺和双吖丙啶。引发剂的示例包括但不限于偶氮二异丁腈(aibn)、核黄素和l‑精氨酸。包含交联剂和/或引发剂可导致在后期聚合步骤中相互作用的生物大分子之间共价键合增加。[0613]在一些实施方式中，水凝胶可具有胶体结构(例如琼脂糖)或聚合物网状结构(例如明胶)。在一些实施方式中，水凝胶是均聚水凝胶。在一些实施方式中，水凝胶是共聚水凝胶。在一些实施方式中，水凝胶是多聚物互穿聚合物水凝胶。[0614]在一些实施方式中，一些水凝胶亚基共价或物理交联聚合(例如经历“形成”)，以形成水凝胶网络。例如，水凝胶亚基可以通过任何方法聚合，包括但不限于，热交联、化学交联、物理交联、离子交联、光交联、自由基引发交联、加成反应、缩合反应、水溶性交联反应、辐照交联(例如，x射线、电子束)或其组合。光刻聚合等技术也可用于形成水凝胶。[0615]在一些实施方式中，可以将含有寡核苷酸(例如，条码化的寡核苷酸，例如捕获探针)的凝胶珠沉积在基材(例如，载玻片)上。在一些实施方式中，凝胶垫可以沉积在基材(例如，载玻片)上。在一些实施方式中，凝胶垫或凝胶珠以阵列形式沉积在基材上。在凝胶垫或凝胶珠以阵列形式沉积在基材上的一些实施方式中，可将水凝胶分子前体溶液施加在阵列(例如，载玻片上的凝胶垫或凝胶珠的阵列)的顶部。在一些实施方式中，可以使水凝胶分子前体溶液聚合，使得沉积的凝胶垫或凝胶珠固定在聚合的水凝胶内。可以使用任何合适的聚合方法或(例如，本文描述的各种方法中的任何一种)。在一些实施方式中，包括凝胶垫或凝胶珠的聚合水凝胶可以从基材(例如，载玻片)移除(例如，剥离)，使得凝胶珠或凝胶垫固定在水凝胶中。在一些实施方式中，包括凝胶垫或凝胶珠的聚合水凝胶是导电基材(如本文所述)，其可根据本文所述的多种分析物捕获方法(例如，用于捕获的分析物的电泳迁移)中的任一种使用。[0616]阵列可以通过在基材表面上沉积特征(例如，液滴、珠)以产生空间条码化阵列来制备。用于沉积(例如，液滴操作)特征的方法是本领域已知的(参见，美国专利申请公开号2008/0132429，rubina，a.y.等，biotechniques.2003年5月；34(5)：1008‑14，1016‑20，1022和vasiliskov等.biotechniques.1999年9月；27(3)：592‑4，596‑8，600各处，其各自通过引用其全文的方式纳入本文)。可以在基材上的特定位置印刷或沉积特征(例如，喷墨印刷)。在一些实施方式中，每个特征可具有用作空间条形码的独特寡核苷酸。在一些实施方式中，每个特征可以具有用于多重化(例如，捕获多种分析物或多种类型的分析物，例如蛋白质和核酸)的捕获探针。在一些实施方式中，可以使用电场在特定位置印刷或沉积特征。特征可以包含可光交联的聚合物前体和寡核苷酸。在一些实施方式中，可光交联的聚合物前体可以沉积到基材(例如，孔)上的图案化特征中。[0617]“可光交联的聚合物前体”是指在曝光时交联和/或聚合的化合物。在一些实施方式中，还可包括一种或多种光引发剂以诱导和/或促进聚合和/或交联。参见，例如，choi等.biotechniques.2019年1月；66(1)：40‑53，其通过引用其全文的方式纳入本文。[0618]可光交联聚合物前体的非限制性示例包括聚(乙二醇)二丙烯酸酯(pegda)、明胶‑甲基丙烯酰(gelma)和甲基丙烯酸化透明质酸(meha)。在一些实施方式中，可光交联的聚合物前体包括聚(乙二醇)二丙烯酸酯(pegda)、明胶‑甲基丙烯酰(gelma)、甲基丙烯酸化透明质酸(meha)或其组合。在一些实施方式中，可光交联的聚合物前体(例如，pazam)可以共价连接(例如，交联)至基材。在一些实施方式中，可光交联的聚合物前体不与基材表面共价连接。例如，可以使用不含硅烷的丙烯酰胺(参见美国专利申请公开号2011/0059865，通过引用其全文方式纳入本文)。特征中的可光交联聚合物前体(例如、液滴或珠)可以通过任何已知的方法聚合。寡核苷酸可以在交联凝胶基质中聚合(例如，共聚或同时聚合)。在一些实施方式中，可以将包含沉积在基材表面上的可光交联聚合物前体的特征暴露于紫外光。紫外光可诱导可光交联聚合物前体的聚合并导致特征变成基材表面(例如，阵列)上的凝胶基质(例如，凝胶垫)。[0619]可选择水凝胶亚基的聚合方法以形成具有不同性质(例如，水凝胶的孔体积、溶胀性质、生物降解性、导电性、透明度和/或透化性)的水凝胶。例如，水凝胶可包括足够体积的孔，以使大分子(例如，核酸、蛋白质、染色质、代谢物、grna、抗体、碳水合合物、肽、代谢物和/或小分子)通过至/自样品(例如，组织切片)。众所周知，孔体积通常随着水凝胶亚基浓度的增加而减小，并且通常随着水凝胶亚基与交联剂的比例的增加而增大。因此，可制备包含一定浓度的使此类生物大分子通过的水凝胶亚基的水凝胶组合物。[0620]在一些实施方式中，基材上的水凝胶形成发生在特征(例如，珠)附接到基材之前、同时或之后。例如，当捕获探针附接(例如，直接或间接)至基材时，可在已包含捕获探针的基材上进行水凝胶形成。[0621](d)阵列[0622]在本文描述的许多方法中，特征(如下面进一步描述的)被集体地定位在基材上。“阵列”是不规则或形成规则图案的多个特征的特定排列。阵列中的各个特征基于其相对空间位置而彼此不同。一般而言，阵列中的多个特征中的至少两个包括不同的捕获探针(例如，本文描述的捕获探针的任何示例)。[0623]阵列可用于同时测量大量分析物。在一些实施方式中，至少部分地使用寡核苷酸来创建阵列。例如，单一种类的寡核苷酸(例如，捕获探针)的一个或多个拷贝可对应于或直接或间接地附接到阵列中的给定特征。在一些实施方式中，阵列中的给定特征包括两种或更多种寡核苷酸(例如，捕获探针)。在一些实施方式中，直接或间接连接到阵列上给定特征的两种或更多种寡核苷酸(例如，捕获探针)包括共同(例如，相同)空间条形码。[0624](i)用于分析物捕获的阵列[0625]在一些实施方式中，阵列可包括直接或间接附接至基材的捕获探针。捕获探针可包括捕获域(例如，核苷酸序列)，其可以特异性地结合(例如，杂交)到样品内的目标分析物(例如，mrna、dna或蛋白质)。在一些实施方式中，捕获探针与靶标的结合(例如杂交)可通过检测已纳入靶标中的视觉信号(例如荧光团、重金属(例如银离子)或化学发光标记)来检测和定量。在一些实施方式中，视觉信号的强度与生物样品中每个分析物的相对丰度相关。由于阵列可以包含数千或数百万个捕获探针(或更多)，因此阵列可以并行询问许多分析物。[0626]在一些实施方式中，基材包括一个或多个捕获探针，其设计用于捕获来自一个或多个生物体的分析物。在非限制性示例中，基材可包含设计用于捕获来自一个生物体(例如，人类)的mrna的一个或多个捕获探针和设计用于捕获来自第二生物体(例如，细菌)的dna的一个或多个捕获探针。[0627]捕获探针可以使用多种技术附接到基材或特征。在一些实施方式中，捕获探针直接附接到固定在阵列上的特征。在一些实施方式中，捕获探针通过化学固定固定到基材上。例如，在基材上的官能团和捕获探针上的相应功能元件之间可以发生化学固定。捕获探针中的示例性对应功能元件可以是捕获探针的固有化学基团，例如羟基，或者可以将功能元件引入到捕获探针上。基材上官能团的示例为胺基。在一些实施方式中，要固定的捕获探针包括官能胺基或经化学修饰以包括官能胺基。用于这种化学改性的手段和方法在本领域是众所周知的。[0628]在一些实施方式中，捕获探针是核酸。在一些实施方式中，捕获探针通过其5′端固定在基材或特征上。在一些实施方式中，捕获探针通过其5′端固定在基材或特征上，并且从5′端到3′端包括：一个或多个条形码(例如，空间条形码和/或umi)和一个或多个捕获域。在一些实施方式中，捕获探针通过其5′端固定在基材或特征上，并且从5′端到3′端包括：一个条形码(例如，空间条形码或umi)和一个捕获域。在一些实施方式中，捕获探针通过其5′端固定在基材或特征上，并且从5′端到3′端包括：裂解域、功能域、一个或多个条形码(例如，空间条形码和/或umi)和捕获域。[0629]在一些实施方式中，捕获探针通过其5′端固定在基材或特征上，并且从5′端到3′端包括：裂解域、功能域、一个或多个条形码(例如，空间条形码和/或umi)、第二功能域和捕获域。在一些实施方式中，捕获探针通过其5′端固定在基材或特征上，并且从5′端到3′端包括：裂解域、功能域、空间条形码、umi和捕获域。在一些实施方式中，捕获探针通过其5′端固定在基材或特征上，并且不包括空间条形码。在一些实施方式中，捕获探针通过其5′端固定在基材或特征上，并且不包括umi。在一些实施方式中，捕获探针包括用于起始测序反应的序列。[0630]在一些实施方式中，捕获探针通过其3′端固定在基材或特征上。在一些实施方式中，捕获探针通过其3′端固定在基材或特征上，并且从3′端到5′端包括：一个或多个条形码(例如，空间条形码和/或umi)和一个或多个捕获域。在一些实施方式中，捕获探针通过其3′端固定在基材或特征上，并且从3′端到5′端包括：一个条形码(例如，空间条形码或umi)和一个捕获域。在一些实施方式中，捕获探针通过其3′端固定在基材或特征上，并且从3′端到5′端包括：裂解域、功能域、一个或多个条形码(例如，空间条形码和/或umi)和捕获域。在一些实施方式中，捕获探针通过其3′端固定在基材或特征上，并且从3′端到5′端包括：裂解域、功能域、空间条形码、umi和捕获域。[0631]待固定的捕获探针内的官能团的定位可用于控制和塑造捕获探针的结合行为和/或取向，例如，官能团可放置在捕获探针的5′或3′端部或捕获探针的序列内。在一些实施方式中，捕获探针还可包括基材。待固定的捕获探针的典型基材包括能够结合到所述捕获探针(例如，结合到胺官能化核酸)的部分。此类基材的示例为羧基、醛基或环氧基基材。[0632]在一些实施方式中，可将捕获探针固定在其上的基材可被化学活化，例如通过活化基材上可用的官能团。术语“活化(的)基材”涉及其中通过化学修饰程序建立或实现相互作用或反应性化学官能团的材料。例如，包括羧基的基材可在使用前活化。此外，某些基材含有能与捕获探针中已有的特定部分反应的官能团。[0633]在一些实施方式中，共价键用于将捕获探针直接耦合到基材。在一些实施方式中，捕获探针通过将捕获探针的“第一”核苷酸与基材分离的接头(例如，化学接头)间接耦合到基材。在一些实施方式中，捕获探针不直接结合到基材，而是间接地相互作用，例如通过结合到本身直接或间接结合到基材的分子。在一些实施方式中，捕获探针间接地附接到基材(例如，经由包括聚合物的溶液附接至基材)。[0634]在捕获探针间接固定在阵列特征上的一些实施方式中，例如通过与能够结合捕获探针的表面探针杂交，捕获探针还可以包括能够与表面探针的5′端杂交的上游序列(与杂交到核酸，例如，组织样品的rna的序列的5′方向上)。单独地，捕获探针的捕获域可被视为捕获域寡核苷酸，其可在捕获探针间接固定在阵列上的实施方式中用于捕获探针的合成。[0635]在一些实施方式中，基材由惰性材料或基质(例如，载玻片)组成，所述惰性材料或基质已通过例如用包含能够固定捕获探针的反应基团的材料处理基材而官能化。例如，参见wo2017/019456，其全部内容通过引用纳入本文。非限制性示例包括惰性基材上支持的聚丙烯酰胺水凝胶(例如，载玻片；参见wo2005/065814和美国专利申请号2008/0280773，其全部内容通过引用纳入本文)。[0636]在一些实施方式中，使用共价方法将官能化生物分子(例如，捕获探针)固定在官能化基材上。共价附接的方法包括，例如胺和活化的羧酸酯(例如，n‑羟基琥珀酰亚胺酯)的缩合；胺和醛在还原胺化条件下的缩合；以及环加成反应，例如diels‑alder[4 2]反应、1，3‑偶极环加成反应，和[2 2]环加成反应。共价附接的方法还包括，例如点击化学反应，包括[3 2]环加成反应(例如，huisgen1，3‑偶极环加成反应和铜(i)催化的叠氮炔环加成反应(cuaac))；巯基‑烯反应；diels‑alder反应和逆电子需求diels‑alder反应；[4 1]异腈和四嗪的环加成；小碳环的亲核开环(例如，氨基寡核苷酸的环氧化物开环)。共价附接的方法还包括例如马来酰亚胺和硫醇；以及对硝基苯酯‑官能化寡核苷酸和聚赖氨酸‑官能化基材。共价附接的方法还包括，例如，二硫键反应；自由基反应(参见，例如，美国专利号5919626，其全部内容通过引用纳入本文)；和酰肼‑官能化基材(例如，其中酰肼官能团直接或间接附接到基材)和醛‑官能化寡核苷酸(参见例如yershov等，(1996)proc.natl.acad.sci.usa93，4913‑4918，其全部内容通过引用纳入本文)。[0637]在一些实施方式中，使用光化学共价方法将官能化的生物分子(例如，捕获探针)固定在官能化的基材上。光化学共价连接的方法包括，例如，安曲酮‑偶联寡核苷酸的固定(参见，例如，koch等，(2000)bioconjugatechem.11，474‑483，其全部内容通过引用纳入本文)。[0638]在一些实施方式中，使用非共价方法将官能化生物分子(例如，捕获探针)固定在官能化基材上。用于非共价附接的方法包括例如生物素‑官能化的寡核苷酸和链霉亲和素‑处理的基材(参见例如等，(1993)analyticalbiochemistry209，278‑283和gilles等，(1999)naturebiotechnology17，365‑370，其全部内容通过引用纳入本文)。[0639]在一些实施方式中，寡核苷酸(例如，捕获探针)可根据以下所述的方法附接到基材或特征：美国专利号6737236、7259258、7375234、7427678、5610287、5807522、5837860和5472881；美国专利申请公开号2008/0280773和2011/0059865；shalon等，(1996)genomeresearch，639‑645；rogers等，(1999)analyticalbiochemistry266，23‑30；stimpson等，(1995)proc.natl.acad.sci.usa92，6379‑6383；beattie等，(1995)clin.chem.45，700‑706；lamture等，(1994)nucleicacidsresearch22，2121‑2125；beier等，(1999)nucleicacidsresearch27，1970‑1977；joos等，(1997)analyticalbiochemistry247，96‑101；nikiforov等，(1995)analyticalbiochemistry227，201‑209；timofeev等，(1996)nucleicacidsresearch24，3142‑3148；chrisey等，(1996)nucleicacidsresearch24，3031‑3039；guo等，(1994)nucleicacidsresearch22，5456‑5465；running和urdea(1990)biotechniques8，276‑279；fahy等，(1993)nucleicacidsresearch21，1819‑1826；zhang等，(1991)19，3929‑3933；和rogers等，(1997)genetherapy4，1387‑1392。上述各文件的全部内容通过引用纳入本文。[0640](ii)以阵列形式生成捕获探针[0641]阵列可以通过多种方法制备。在一些实施方式中，通过在阵列上合成(例如，原位合成)寡核苷酸或通过喷墨印刷或平版印刷来制备阵列。例如，高密度dna寡核苷酸的光定向合成可以通过光刻或固相dna合成来实现。为了实现光刻合成，可以将用光化学保护基团修饰的合成接头附接到基材上，并且可以使用光刻掩模(应用于基材的特定区域)和光来修饰光化学保护基团，从而产生具有局部光脱保护作用的阵列。这些方法中的许多在本领域中是已知的，并且在例如miller等的“微阵列的基本概念和临床微生物学中的潜在应用(basicconceptsofmicroarraysandpotentialapplicationsinclinicalmicrobiology)”，clinicalmicrobiologyreviews22.4(2009)：611‑633；us201314111482a；us9593365b2；us2019203275；和wo2018091676中描述，其全部通过引用纳入本文。[0642](1)点样或印刷[0643]在一些实施方式中，寡核苷酸(例如，捕获探针)可以被“点样”或“印刷”到基材上以形成阵列。寡核苷酸可以通过非接触或接触印刷来施加。非接触式打印机可以使用与计算机打印机相同的方法(例如，气泡喷射或喷墨)将探针溶液的小液滴喷射到基材上。这种专用的喷墨式打印机可以将纳升到皮升体积的寡核苷酸溶液滴(而不是墨水)喷射到基材上。在接触印刷中，每个印刷针直接将寡核苷酸溶液施涂在表面的特定位置上。寡核苷酸可通过dna磷酸主链的负电荷与基材表面的带正电覆层的静电相互作用或通过dna中的胸腺嘧啶碱与处理过的基材表面上的胺基之间的紫外光交联共价键附接到基材表面。在一些实施方式中，所述基材是载玻片。在一些实施方式中，寡核苷酸(例如，捕获探针)通过共价键附接到化学基材，例如环氧硅烷、氨基硅烷、赖氨酸、聚丙烯酰胺等。[0644](2)原位合成[0645]捕获探针阵列可以通过原位合成来制备。在一些实施方式中，可以使用光刻法制备捕获探针阵列。光刻法通常依赖于在基材上的紫外光掩蔽和光定向的组合化学合成来直接在阵列表面选择性地合成探针，每个点一次一个核苷酸，同时用于多个点。在一些实施方式中，基材包含共价接头分子，其在游离端上具有可被光移除的保护基团。紫外光通过光刻掩模被引导以去保护和活化带有羟基的选定位点，其起始与附接到活化的位点的进入的受保护核苷酸的耦合。掩模的设计方式是可以选择暴露位点，从而指定每个核苷酸可以附接的阵列上的坐标。这个过程可以重复，一个新的掩膜被应用于活化不同的位点集和耦合不同的碱基，使在每个位点构建不同的寡核苷酸。这个过程可以用来合成成千上万种不同的寡核苷酸。在一些实施方式中，可以使用无掩模阵列合成器技术。可编程微镜能够创建数字掩模，所述数字掩模能反射所需的紫外光图案，以对特征进行去保护。[0646]在一些实施方式中，喷墨点蚀工艺还可用于原位寡核苷酸合成。不同的核苷酸前体加催化剂可以印在基材上，然后结合耦合和去保护步骤。该方法依赖于在阵列表面以重复轮次的逐个碱基印刷方式印刷皮升体积的核苷酸，其延长阵列上寡核苷酸探针的长度。[0647](3)电场[0648]阵列也可以通过电场主动杂交来制备，以控制核酸的转运。当正电流施加到阵列上的一个或多个测试位点时，带负电荷的核酸可以被转运到特定的位点或特征。阵列的表面可包含结合分子，例如链霉亲和素，其使在电子寻址的生物素化探针到达其靶向的位置时形成键(例如链霉亲和素‑生物素键)。然后从活化的特征移除正电流，新的测试位点可以通过正电流的靶向应用被活化。重复此过程，直到阵列上的所有位点都被覆盖。[0649](4)连接[0650]在一些实施方式中，可通过连接多个寡核苷酸来产生包含条码化的探针的阵列。在一些示例中，所述多个寡核苷酸包含条形码的部分，并且在连接所述多个寡核苷酸时生成完整的条形码。例如，包含条形码的第一部分的第一寡核苷酸可附接到基材(例如，使用本文所述的将寡核苷酸附接到基材的任何方法)，然后，包含条形码的第二部分的第二寡核苷酸可以连接到第一寡核苷酸上以生成完整的条形码。条形码的第一、第二和任何其它部分的不同组合可用于增加条形码的多样性。在第二寡核苷酸在连接之前也附接于基材的示例中，第一和/或第二寡核苷酸可经由包含裂解位点的表面接头附接于基材。连接后，可通过在裂解位点裂解将连接的寡核苷酸线性化。[0651]为了增加条形码的多样性，包含两个或更多个不同条形码序列的多个第二寡核苷酸可以连接到包含相同条形码序列的多个第一寡核苷酸上，从而产生两个或更多个不同种类的条形码。为了实现选择性连接，附接到包含条形码的第一部分的基材的第一寡核苷酸最初可以用保护基团(例如，光可裂解保护基团)保护，并且在第一寡核苷酸和第二寡核苷酸之间连接之前可以移除保护基团。在阵列上的条码化的探针通过连接两个或更多个寡核苷酸产生的情况下，寡核苷酸的浓度梯度可应用于基材，使得寡核苷酸的不同组合根据其在基材上的位置纳入条码化的探针中。[0652]探针可以通过夹板寡核苷酸将其它寡核苷酸直接连接到现有的寡核苷酸上来产生。在一些实施方式中，现有阵列上的寡核苷酸可包括可与夹板寡核苷酸杂交的识别序列(recognitionsequence)。识别序列可以位于现有阵列上寡核苷酸的游离5′端或游离3′端。对本发明方法有用的识别序列可以不包含限制性酶识别位点或二级结构(例如发夹)，并且可以包括高含量的鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸。[0653](5)聚合酶[0654]阵列上的条形码探针也可以通过将单个核苷酸添加到阵列上现有的寡核苷酸来生成，例如，使用以模板独立方式起作用的聚合酶。单个核苷酸可以以浓度梯度添加到现有的寡核苷酸中，从而产生具有不同长度的探针，这取决于探针在阵列上的位置。[0655](6)现有捕获探针的修饰[0656]也可以通过修饰现有的阵列来制备阵列，例如，通过修饰已附接到阵列的寡核苷酸。例如，可以在已包含寡核苷酸的阵列上生成捕获探针，所述寡核苷酸在3′端附接到阵列(或阵列上的特征)并且具有游离的5′端。在一些情况下，阵列是任何可商购的阵列(例如，如本文所述的任何可商购的阵列)。可以使用本文所述的任何原位合成方法来原位合成寡核苷酸。寡核苷酸可以包含条形码和一个或多个恒定序列。在一些情况下，恒定序列是可切割的序列。连接到基材(例如，阵列)的寡核苷酸的长度可以小于100个核苷酸(例如，小于90、80、75、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸)。为了使用寡核苷酸产生探针，与寡核苷酸的部分(例如寡核苷酸共有的恒定序列)互补的引物可以与寡核苷酸杂交并延伸该寡核苷酸(使用寡核苷酸作为模板)以形成双链体并产生3′突出端。所述3′突出端可以通过模板非依赖性连接酶(例如末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)或多聚(a)聚合酶)产生。3′突出端允许其它核苷酸或寡核苷酸添加到双链体中，例如，通过酶。例如，可以通过向3′突出端的末端添加其它寡核苷酸(例如，通过夹板寡核苷酸介导的连接)来产生捕获探针，其中其它寡核苷酸可以包括一个或多个捕获域的序列或序列的部分，或其互补物。[0657]其它寡核苷酸(例如，捕获域的序列或序列的部分)可以包括简并序列(例如，如本文所述的任何简并序列)。其它寡核苷酸(例如，捕获域的序列或序列的部分)可以包括与生物样品中感兴趣的分析物杂交或连接相容的序列。感兴趣的分析物也可以用作夹板寡核苷酸以将其它寡核苷酸连接到探针上。当使用夹板寡核苷酸帮助连接其它寡核苷酸时，其它寡核苷酸可包括与夹板寡核苷酸的序列互补的序列。寡核苷酸的连接可涉及使用酶，例如但不限于连接酶。合适连接酶的非限制性示例包括tthdna连接酶、taqdna连接酶、高温球菌属的种(thermococcussp.)(菌株9on)dna连接酶(9ontmdna连接酶，新英格兰生物实验室公司(newenglandbiolabs))，ampligasetm(获自生物技术中心(epicentrebiotechnologies)，威斯康星州麦迪逊)，和splintr(获自新英格兰生物实验室公司，马萨诸塞州伊普斯维奇)。如上所述生成的阵列可用于生物样品的空间分析。例如，一个或多个捕获域可用于与mrna分子的多聚(a)尾杂交。可以使用逆转录酶进行逆转录，以生成与捕获的mrna互补的cdna。然后可以确定捕获的mrna的序列和位置(例如，通过对包含条形码以及互补cdna的捕获探针进行测序)。[0658]可通过如本文所述的各种方法来生成用于空间分析的阵列。在一些实施方式中，阵列具有多个包含空间条形码的捕获探针。可以确定这些空间条形码及其与阵列上位置的关系。在某些情况下，这样的信息很容易获得，因为寡核苷酸是以预先确定的图案在阵列上被点样、印刷或合成的。在一些情况下，可以通过本文描述的方法(例如，通过原位测序、通过与空间条形码相关联的各种标签等)对空间条形码进行解码。在一些实施方式中，可以使用阵列作为模板来生成子阵列。因此，可以将空间条形码转移到具有已知图案的子阵列。[0659](iii)特征[0660]“特征”是一个实体，作为样品分析中使用的各种分子实体的支持或存储库。在一些实施方式中，阵列中的一些或全部特征被功能化以用于分析物捕获。在一些实施方式中，功能化特征包括一个或多个捕获探针。特征的示例包括但不限于珠、任何二维或三维几何形状的点(例如，喷墨点、掩模点、网格上的正方形)、孔和水凝胶垫。在一些实施方式中，特征直接或间接地附接或固定到基材。在一些实施方式中，所述特征不直接或间接地附接或固定到基材，而是例如布置在封闭或部分封闭的三维空间(例如，孔或凹坑)内。[0661]除上述特征外，还可以使用多种其他特征来形成本文所述的阵列。例如，在一些实施方式中，由喷墨印刷、丝网印刷或静电沉积在基材上的聚合物和/或生物聚合物形成的特征可用于形成阵列。例如，在pct专利申请公开号wo2014/085725中描述了生物聚合物的喷墨印刷。例如，在degans等，advmater.16(3)：203‑213(2004)中描述了聚合物的喷墨印刷。聚合物和生物聚合物的静电沉积方法被描述于，例如，hoyer等，anal.chem.68(21)：3840‑3844(1996)。上述各参考文献的全部内容通过引用纳入本文。[0662]作为另一示例，在一些实施方式中，特征由金属微颗粒或纳米颗粒形成。例如，lee等，beilsteinj.nanotechnol.8：1049‑1055(2017)中描述了沉积此类颗粒以形成阵列的合适方法，其全部内容通过引用纳入本文。[0663]作为另一示例，在一些实施方式中，特征由组装在基材上的磁性颗粒形成。ye等，scientificreports6：23145(2016)中描述了此类组装阵列的方法和颗粒的示例，其全部内容通过引用纳入本文。[0664]作为另一示例，在一些实施方式中，特征对应于其中已纳入一个或多个光学标记物和/或已通过例如永久性光漂白的过程改变的基材区域。以这种方式实施特征的合适基材包括例如多种聚合物。例如，在moshrefzadeh等，appl.phys.lett.62：16(1993)中描述了形成这种特征的方法，其全部内容通过引用纳入本文。[0665]作为又一示例，在一些实施方式中，特征可对应于组装(例如，经由自组装)以形成阵列的胶体颗粒。合适的胶体颗粒例如在sharma，resonance23(3)：263‑275(2018)中描述，其全部内容通过引用纳入本文。[0666]作为另一示例，在一些实施方式中，可以通过单体溶液在基材上的点阵列光聚合来形成特征。特别地，双光子和三光子聚合可用于制造相对较小(例如，亚微米)尺寸的特征。nguyen等，materialstoday20(6)：314‑322(2017)中描述了以这种方式在基材上制备特征的合适方法，其全部内容通过引用纳入本文。[0667]在一些实施方式中，特征直接或间接地附接或固定到液体可透化的基材。在一些实施方式中，特征直接或间接地附接或固定到生物相容性基材。在一些实施方式中，特征直接或间接地附接或固定到基材，该基材是水凝胶。[0668]图12描述了阵列中条码化特征的示例性排列。从左到右，图12示出了(l)包括六个空间条码化阵列的载玻片，(c)六个空间条码化阵列中的一个的放大示意图，显示了与生物样品有关的条码化特征的网格，以及(r)阵列的一个部分的放大示意图，显示阵列中多个特征的特定标识(标记为id578、id579、id560等)。[0669](1)珠[0670]“珠”可以是颗粒。珠可以是多孔的、无孔的、固体的、半固体的和/或其组合。在一些实施方式中，珠可溶解、可破裂和/或可降解，而在某些实施方式中，珠不可降解。半固体珠可以是脂质体珠。固体珠可包括金属，包括但不限于氧化铁、金和银。在一些实施方式中，珠可以是二氧化硅珠。在一些实施方式中，珠可以是刚性的。在一些实施方式中，珠可以是柔性的和/或可压缩的。[0671]珠可以是大分子。珠可以由结合在一起的核酸分子形成。珠可以通过分子(例如大分子)的共价或非共价组装形成，例如单体或聚合物。聚合物或单体可以是天然的或合成的。聚合物或单体可以是或包括例如，核酸分子(例如dna或rna)。[0672]珠可以是刚性的，或可以是柔性的和/或可压缩的。珠可以包括包括一种或多种聚合物的覆层。这种覆层可以被破坏或溶解。在一些实施方式中，珠包括直接或间接(例如，通过接头)附接到珠的光谱或光学标记物(例如，染料)。例如，珠可制备为有色制剂(例如，在可见光谱内表现出不同颜色的珠)，其可在施加所需刺激(例如，热和/或化学反应)时改变颜色(例如，比色珠)以形成不同颜色的珠(例如，不透明和/或透明珠)。[0673]珠可包括天然和/或合成材料。例如，珠可包括天然聚合物、合成聚合物或天然聚合物和合成聚合物两者。天然聚合物的示例包括但不限于蛋白质、例如脱氧核糖核酸的糖、橡胶、纤维素、淀粉(例如直链淀粉、支链淀粉)、酶、多糖、丝、聚羟基烷酸酯、壳聚糖、葡聚糖、胶原、卡拉胶、依巴瓜胶、阿拉伯胶、琼脂、明胶、虫胶、梧桐胶、黄原胶、玉米糖胶、瓜尔胶、卡拉亚胶、琼脂糖、海藻酸、海藻酸钠或其天然聚合物。合成聚合物的示例包括但不限于丙烯酸、树脂、尼龙、硅酮、氨纶、粘胶人造丝、聚羧酸、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙二醇、聚氨酯、聚乳酸、二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚三氟氯乙烯、聚环氧乙烷、聚对苯二甲酸乙二酯、聚乙烯、聚异丁烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲醛、聚丙烯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚偏二氟乙烯、聚氟乙烯和/或其组合(例如共聚合物)。珠也可以由聚合物以外的材料形成，包括例如脂类、胶束、陶瓷、玻璃陶瓷、材料复合物、金属和/或其他无机材料。[0674]在一些实施方式中，珠是可降解珠。可降解珠可包括具有不稳定键的一种或多种物质(例如，二硫键接头、引物、其他寡核苷酸等)，使得当珠/物质暴露于适当的刺激物时，不稳定键被破坏并且珠降解。不稳定键可以是化学键(例如，共价键、离子键)或者可以是另一种类型的物理相互作用(例如，范德华相互作用、偶极‑偶极相互作用等)。在一些实施方式中，用于生成珠的交联剂可包括不稳定键。当暴露在适当的条件下时，不稳定的键会断裂，珠会降解。例如，当将包含半胱胺交联剂的聚丙烯酰胺凝胶珠暴露于还原剂时，胱胺的二硫键可被破坏且珠降解。[0675]降解可指结合或夹带物质(例如，二硫键接头、引物、其他寡核苷酸等)与珠的解离，无论是否在结构上降解物理珠本身。例如，由于化学环境的变化，夹带的物质可以通过渗透压差从珠中释放出来。举例来说，由于渗透压差引起的珠孔体积的改变通常可以在珠本身没有结构降解的情况下发生。在一些实施方式中，由于珠的透化溶胀导致的孔体积增大可使珠内夹带的物质释放。在一些实施方式中，由于孔体积收缩，珠的透化收缩可导致珠更好地保留夹带的物质。[0676]可使用任何可降解珠的合适试剂。在一些实施方式中，温度或ph值的变化可用于降解珠内的热敏或ph敏感键。在一些实施方式中，化学降解剂可用于通过氧化、还原或其他化学变化降解珠内的化学键。例如，化学降解剂可以是还原剂，例如dtt，其中dtt可以降解交联剂和凝胶前体之间形成的二硫键，从而降解珠。在一些实施方式中，可添加还原剂以降解珠，其可导致珠释放其内容物。还原剂的示例可包括但不限于二硫苏糖醇(dtt)、β‑巯基乙醇、(2s)‑2‑氨基‑1，4‑二巯基丁烷(二硫丁胺或dtba)、三(2‑羧乙基)膦(tcep)或其组合。[0677]任何一种化学试剂都可以用来引发珠的降解。化学试剂的示例包括但不限于ph介导的珠内组分完整性的改变、通过交联键的裂解降解珠的组分以及珠的组分的解聚。[0678]在一些实施方式中，珠可由包括可降解化学交联剂(例如n，n’‑双‑(丙烯酰)胱胺(bac)或胱胺)的材料形成。这种可降解交联剂的降解可以通过任何各种机制来实现。在一些示例中，珠可与可引起氧化、还原或其它化学变化的化学降解剂接触。例如，化学降解剂可以是还原剂，例如二硫苏糖醇(dtt)。还原剂的其他示例可包括β‑巯基乙醇、(2s)‑2‑氨基‑1，4‑二巯基丁烷(二硫丁胺或dtba)、三(2‑羧乙基)膦(tcep)或其组合。[0679]在一些实施方式中，暴露于水性溶液(例如水)可触发水解降解，从而引发珠的降解。在应用热刺激时，也可以诱导珠释放其内容物。温度的变化会引起珠的各种变化。例如，热会使固体珠液化。热的变化会导致珠熔化，使珠的部分降解。在一些实施方式中，热可增加珠组分的内部压力，使得珠破裂或爆炸。热也可以作用于热敏聚合物作为材料来构建珠。[0680]在使用可降解珠的情况下，避免在给定时间之前将所述珠暴露于引起所述降解的一个或多个刺激物是有益的，以便例如避免珠过早降解和由此降解引起的问题，包括例如不良流动特性和聚集。举例来说，在珠包括可还原交联基团(例如二硫化物基团)的情况下，将期望避免将所述珠与还原剂(例如dtt或其它二硫化物裂解试剂)接触。在这些实施方式中，在一些实施方式中，本文所述的珠的处理将不含还原剂，例如dtt。由于还原剂通常在商业酶制剂中提供，因此在处理本文所述的珠时希望提供不含还原剂(或不含dtt)的酶制剂。此类酶的示例包括例如聚合酶制剂、逆转录酶制剂、连接酶制剂以及可用于处理本文所述珠的许多其它酶制剂。术语“无还原剂”或“无dtt”制剂是指具有小于此类用于降解珠的材料的较低范围的约1/10、约1/50或约1/100的制剂。例如，对于dtt，无还原剂制剂可具有小于约0.01毫摩尔(mm)、0.005mm、0.001mmdtt、0.0005mmdtt或小于约0.0001mmdtt。在一些实施方式中，dtt的量可以是不可检测的。[0681]与不降解的珠相比，当对珠施加适当的刺激时，可降解珠可用于更快速地从珠释放附接的捕获探针(例如，核酸分子、空间条形码序列和/或引物)。例如，对于结合到多孔珠的内表面的物质或在包封的物质的情况下，在珠降解时，该物质可对溶液中的其他物质具有更大的移动性和可及性。在一些实施方式中，物质还可经由可降解接头(例如，二硫键接头)附接到可降解珠。所述可降解接头可对与所述可降解珠相同的刺激作出响应，或者所述两种可降解物质可对不同的刺激作出响应。例如，可以通过二硫键将具有一个或多个空间条形码的捕获探针附接到包括胱胺的聚丙烯酰胺珠。当空间条码化珠暴露于还原剂时，珠降解并且在捕获探针和珠之间的二硫键和珠内胱胺的二硫键断裂时释放具有一个或多个空间条形码序列的捕获探针。[0682]向珠中添加多种类型的不稳定键可以产生能够响应各种刺激的珠。每种类型的不稳定键可对相关刺激(例如，化学刺激、光、温度、ph、酶等)敏感，使得通过每种不稳定键附接到珠上的试剂的释放可通过施加适当的刺激来控制。可耦合至前体或珠的不稳定键的一些非限制性示例包括酯键(例如，可与酸、碱或羟胺裂解)、邻二醇键(例如，可通过高碘酸钠裂解)、diels‑alder键(例如，可通过热裂解)、砜键(例如，可通过碱裂解)、硅基醚键(例如，可通过酸裂解)、糖苷键(例如，可通过淀粉酶裂解)、肽键(例如，可通过蛋白酶裂解)或磷酸二酯键(例如，可通过核酸酶裂解(例如，dna酶))。键可以通过其他核酸分子靶向酶，如限制性酶(如限制性内切酶)进行裂解。这种功能性可用于控制从珠中释放试剂。在一些实施方式中，包括不稳定键的另一试剂可在凝胶珠形成后经由例如上述珠的活化官能团连接到珠。在一些实施方式中，包括不稳定键的凝胶珠是可逆的。在一些实施方式中，使用具有可逆不稳定键的凝胶珠来捕获生物样品的一个或多个感兴趣区域。例如，但不限于，包括不耐热键的珠可由光源(例如，激光)加热，所述光源使凝胶珠中的变化有助于捕获与凝胶珠接触的生物样品。具有一个或多个可释放、可裂解或可逆地附接到本文所述珠的空间条形码的捕获探针包括通过捕获探针和珠之间的连接的裂解而释放或可释放的捕获探针，或通过底层珠本身的降解而释放的捕获探针，使具有一个或多个空间条形码的捕获探针待被其他试剂触及或变得可被其他试剂触及，或两者。[0683]珠可以有不同的物理性质。珠的物理性质可以用来表征珠。珠的物理性质的非限制性例子包括尺寸、形状、圆度、密度、对称性和硬度。例如，珠可以有不同的尺寸。可以通过使用微流体通道网络来获得不同直径的珠，该网络被设置为提供特定体积的珠(例如，基于通道尺寸、流速等)。在一些实施方式中，珠具有不同的硬度值，其可通过改变用于生成珠的聚合物浓度来获得。在一些实施方式中，可以使用捕获探针的物理性质使附接到珠的空间条形码在光学上可检测。例如，核酸折纸，例如脱氧核糖核酸(dna)折纸，可用于产生光学可检测的空间条形码。为此，可以折叠一个核酸分子或多个核酸分子以形成二维和/或三维几何形状。不同的几何形状可以通过光学检测。[0684]在一些实施方式中，具有一种以上不同物理性质的特殊类型的纳米颗粒可用于使珠在物理上可区分。例如，具有亲水和疏水表面的janus颗粒可用于提供独特的物理性质。[0685]珠通常可以是任何合适的形状。珠形状的示例包括但不限于球形、非球形、椭圆形、长方形、无定形、圆形、圆柱形、立方形、六边形及其变体。在一些实施方式中，非球形(例如，六边形、立方形、异形珠可以比球形珠组装得更紧密(例如，更紧密)。在一些实施方式中，珠可以自组装成单层。截面(例如，第一截面)可对应于珠的直径或最大截面尺寸。在一些实施方式中，珠可以是近似球形的。在这些实施方式中，第一截面可对应于珠的直径。在一些实施方式中，珠可以是近似圆柱形的。在这样的实施方式中，第一截面可对应于沿近似圆柱形珠的直径、长度或宽度。[0686]珠可以是均匀尺寸或不均匀尺寸。“多分散性”一般是指分子或颗粒大小的不均匀性。珠的多分散性指数(pdi)可使用方程式pdi＝mw/mn计算，其中mw是重均摩尔质量，mn是数均摩尔质量。在某些实施方式中，可将珠提供为具有相对单分散尺寸分布的多个珠或珠群。当需要提供相对一致的试剂量时，保持相对一致的珠特征(例如尺寸)有助于整体一致性。[0687]在一些实施方式中，本文提供的珠可具有尺寸分布，其截面尺寸的变化系数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或更低。在一些实施方式中，本文提供的多个珠具有小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或更低的多分散性指数。[0688]在一些实施方式中，珠的直径或最大尺寸可不大于100μm(例如，不大于95μm、90μm、85μm、80μm、75μm、70μm、65μm、60μm、55μm、50μm、45μm、40μm、35μm、30μm、25μm、20μm、15μm、14μm、13μm、12μm、11μm、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm，或1μm)。[0689]在一些实施方式中，多个珠的平均直径不大于100μm。在一些实施方式中，多个珠的平均直径或最大尺寸不大于95μm、90μm、85μm、80μm、75μm、70μm、65μm、60μm、55μm、50μm、45μm、40μm、35μm、30μm、25μm、20μm、15μm、14μm、13μm，12μm、11μm、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm或1μm。[0690]在一些实施方式中，珠的体积可为至少约1μm3，例如至少1μm3、2μm3、3μm3、4μm3、5μm3、6μm3、7μm3、8μm3、9μm3、10μm3、12μm3、14μm3、16μm3、18μm3、20μm3、25μm3、30μm3、35μm3、40μm3、45μm3、50μm3、55μm3、60μm3、65μm3、70μm3、75μm3、80μm3、85μm3、90μm3、95μm3、100μm3、125μm3、150μm3、175μm3、200μm3、250μm3、300μm3、350μm3、400μm3、450μm3、μm3、500μm3、550μm3、600μm3、650μm3、700μm3、750μm3、800μm3、850μm3、900μm3、950μm3、1000μm3、1200μm3、1400μm3、1600μm3、1800μm3、2000μm3、2200μm3、2400μm3、2600μm3、2800μm3、3000μm3或更大。[0691]在一些实施方式中，珠可具有约1μm3与100μm3之间的体积，例如约1μm3与10μm3之间、约10μm3与50μm3之间或约50μm3与100μm3之间的体积。在一些实施方式中，珠可包括约100μm3与1000μm3之间的体积，例如约100μm3与500μm3之间或约500μm3与1000μm3之间的体积。在一些实施方式中，珠可包括约1000μm3与3000μm3之间的体积，例如约1000μm3与2000μm3之间或约2000μm3与3000μm3之间的体积。在一些实施方式中，珠可包括约1μm3与3000μm3之间的体积，例如约1μm3与2000μm3之间、约1μm3与1000μm3之间、约1μm3与500μm3之间或约1μm3与250μm3之间的体积。[0692]珠可以包括一个或多个相同或不同的截面。在一些实施方式中，珠可具有不同于第二截面的第一截面。该珠可具有至少约为0.0001微米、0.001微米、0.01微米、0.1微米或1微米的第一截面。在一些实施方式中，珠可包括至少约1微米(μm)、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、100μm、120μm、140μm、160μm、180μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1毫米(mm)或更大的截面(例如，第一截面)。在一些实施方式中，珠可包括约1μm与500μm之间的截面(例如，第一截面)，例如约1μm与100μm之间、约100μm与200μm之间、约200μm与300μm之间、约300μm与400μm之间或约400μm与500μm之间。例如，珠可包括约1μm与100μm之间的截面(例如，第一截面)。在一些实施方式中，珠可具有至少约1μm的第二截面。例如，珠可包括至少约1微米(μm)、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、100μm、120μm、140μm、160μm、180μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1毫米(mm)或更大的第二截面。在一些实施方式中，珠可包括约1μm与500μm之间的第二截面，例如约1μm与100μm之间、约100μm与200μm之间、约200μm与300μm之间、约300μm与400μm之间或约400μm与500μm之间。例如，珠可包括约1μm与100μm之间的第二截面。[0693]在一些实施方式中，珠可以是纳米级的(例如，珠可以具有约100纳米(nm)到约900纳米(nm)的直径或最大截面尺寸)(例如，850纳米或更小、800纳米或更小、750纳米或更小、700纳米或更小、650纳米或更小、600纳米或更小、550纳米或更小、500纳米或更小、450纳米或更小、400纳米或更小，350纳米或更小、300纳米或更小、250纳米或更小、200纳米或更小、150纳米或更小)。多个珠可具有约100纳米(nm)到约900纳米(nm)的平均直径或平均最大截面尺寸(例如，850纳米或更小、800纳米或更小、750纳米或更小、700纳米或更小、650纳米或更小、600纳米或更小、550纳米或更小、500纳米或更小、450纳米或更小、400纳米或更小、350纳米或更小，300纳米或更小、250纳米或更小、200纳米或更小、150纳米或更小)。在一些实施方式中，珠的直径或体积约为单个细胞(例如，被评估的单个细胞)的直径。[0694]在一些实施方式中，珠能够识别来自单个细胞的多种分析物(例如，核酸、蛋白质、染色质、代谢物、药物、grna和脂质)。在一些实施方式中，珠能够识别来自单个细胞的单个分析物(例如，mrna)。[0695]珠的孔体积可以调节。例如，可以选择孔体积以保留变性核酸。可选择孔体积以维持对例如氢氧化钠(naoh)的外源性化学品和/或例如抑制剂的内源性化学品的扩散透化性。珠可由生物相容性和/或生物化学相容性材料和/或维持或增强细胞活力的材料形成。珠可由可热解聚、化学解聚、酶解聚和/或光学解聚的材料形成。[0696]在一些实施方式中，珠可非共价地加载一种或多种试剂。可通过(例如)使珠经受足以使珠溶胀的条件、使试剂扩散到珠内部的足够时间以及使珠经受足以使珠去溶胀的条件来非共价地加载珠。可通过例如将珠置于热力学有利溶剂中、使珠经受较高或较低温度、使珠经受较高或较低离子浓度和/或使珠经受电场来实现珠的溶胀。[0697]珠的溶胀可以通过各种溶胀方法来实现。在一些实施方式中，溶胀是可逆的(例如，通过使珠经受促进去溶胀的条件)。在一些实施方式中，例如通过在热力学不利的溶剂中转移珠、使珠经受更低或更高的温度、使珠经受更低或更高的离子浓度和/或添加或移除电场来实现珠的去溶胀。珠的去溶胀可以通过各种去溶胀方法来实现。在一些实施方式中，去溶胀是可逆的(例如，通过使珠经受促进溶胀的条件)。在一些实施方式中，珠的去膨胀可包括转移珠以使珠中的孔收缩。收缩会阻碍珠内的试剂扩散出珠内部。所产生的阻碍可能是由于试剂和珠内部之间的空间相互作用造成的。这种转移可以通过微流体来完成。例如，可以通过将珠从一个同流溶剂流移动到不同的同流溶剂流来实现转移。可通过改变珠的聚合物组成来调节珠的可溶胀性和/或孔体积。[0698]珠可以包括对温度有响应的聚合物，以便当珠被加热或冷却时，珠的特性或尺寸可以改变。例如，聚合物可包括聚(n‑异丙基丙烯酰胺)。凝胶珠可包括聚(n‑异丙基丙烯酰胺)，并且当加热时，凝胶珠可在一个或多个尺寸上减小(例如，截面直径、多个截面直径)。足以改变凝胶珠的一个或多个特性的温度可为例如至少约0摄氏度(℃)、1摄氏度、2摄氏度、3摄氏度、4摄氏度、5摄氏度、10摄氏度或更高。例如，温度可为约4℃。在一些实施方式中，足以改变凝胶珠的一个或多个特性的温度可为(例如)至少约25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃或更高。例如，温度可为约37℃。[0699]用于附接捕获探针的珠的官能化可以通过多种不同的方法来实现，包括但不限于在聚合物内活化化学基团，在聚合物结构中引入活性或可活化的官能团，或在珠生产的预聚物或单体阶段的附接。珠可被官能化以结合到目标分析物，例如核酸、蛋白质、碳水合合物、脂质、代谢物、肽或其它分析物。[0700]在一些实施方式中，珠可包含分子前体(例如，单体或聚合物)，其可通过分子前体的聚合形成聚合物网络。在一些实施方式中，前体可以是能够经由例如化学交联经历进一步聚合的已聚合物质。在一些实施方式中，前体可包括丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺单体、低聚物或聚合物中的一种或多种。在一些实施方式中，珠可包括预聚物，其为能够进一步聚合的低聚物。例如，可以使用预聚物制备聚氨酯珠。在一些实施方式中，珠可包含可进一步聚合在一起(例如，形成共聚物)的单个聚合物。在一些实施方式中，可以通过不同前体的聚合来生成珠，使得它们包括混合的聚合物、共聚物和/或嵌段共聚物。在一些实施方式中，珠可包括聚合物前体(例如，单体、低聚物和线性聚合物)、核酸分子(例如，寡核苷酸)、引物和其他实体之间的共价键或离子键。在一些实施方式中，共价键可以是碳碳键或硫醚键。[0701]聚合物的交联可以是永久性的，也可以是可逆的，这取决于所使用的特定交联剂。可逆交联可使聚合物在适当条件下线性化或解离。在一些实施方式中，可逆交联还可允许结合到珠表面的材料的可逆附接。在一些实施方式中，交联剂可形成二硫键。在一些实施方式中，形成二硫键的化学交联剂可以是胱胺或改性胱胺。[0702]例如，在聚合物前体材料包括线性聚合物材料(例如线性聚丙烯酰胺、peg或其他线性聚合物材料)的情况下，活化剂可包括交联剂或活化形成的液滴内的交联剂的化学品。同样，对于包括可聚合单体的聚合物前体，活化剂可包括聚合引发剂。例如，在某些实施方式中，其中聚合物前体包括丙烯酰胺单体与n，n’‑双‑(丙烯酰)胱胺(bac)共聚单体的混合物，可提供例如四乙基甲二胺(temed)的试剂，其可引发丙烯酰胺和bac共聚成交联的聚合物网络，或其他足以使前体聚合或凝胶化的条件。足以使前体聚合或凝胶化的条件可包括暴露于加热、冷却、电磁辐射和/或光下。[0703]在聚合或凝胶化之后，可以形成聚合物或凝胶。聚合物或凝胶对于化学或生化试剂可以是可扩散透化的。聚合物或凝胶可对大分子组分不可扩散透化。所述聚合物或凝胶可包括二硫化物交联聚丙烯酰胺、琼脂糖、海藻酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇(peg)‑二丙烯酸酯、peg丙烯酸酯、peg巯基、peg叠氮化物、peg炔烃、其他丙烯酸酯、壳聚糖、透明质酸、胶原、纤维蛋白、明胶或弹性蛋白中的一种或多种。聚合物或凝胶可以包括任何其他聚合物或凝胶。[0704]在一些实施方式中，可在分子前体单元(例如，单体、低聚物或线性聚合物)或纳入珠中的前体与核酸分子(例如，寡核苷酸、捕获探针)之间形成二硫键。例如，胱胺(包括改性胱胺)是包括二硫键的有机试剂，其可用作珠的个体单体或聚合前体之间的交联剂。聚丙烯酰胺可在胱胺或包括胱胺的物质(例如，改性胱胺)存在下聚合以产生包括二硫键的聚丙烯酰胺凝胶珠(例如，包括化学可还原交联剂的化学可降解珠)。二硫键可使珠在暴露于还原剂时降解(或溶解)。[0705]在一些实施方式中，线性多糖聚合物壳聚糖可通过亲水链与戊二醛交联以形成珠。壳聚糖聚合物的交联可以通过热、压力、ph值变化和/或辐射引发的化学反应来实现。[0706]在一些实施方式中，珠可包括丙烯酸亚磷酰胺部分，其在某些方面可用于将一个或多个捕获探针附接到珠。在一些实施方式中，丙烯酸亚磷酰胺(acrydite)部分可指由丙烯酸亚磷酰胺与一种或多种物质(例如，二硫键接头、引物、其他寡核苷酸等)的反应生成的丙烯酸亚磷酰胺类似物，例如但不限于在聚合反应期间丙烯酸亚磷酰胺与其他单体和交联剂的反应。丙烯酸亚磷酰胺部分可以被修饰以形成与待附接物质(例如捕获探针)的化学键。丙烯酸亚磷酰胺部分可以用能够形成二硫键的巯基修饰，或者可以用已经包括二硫键的基团修饰。巯基或二硫化物(通过二硫化物交换)可用作将要附接的物质的锚定点，或可使用丙烯酸亚磷酰胺部分的另一部分来附接。在一些实施方式中，附接可以是可逆的，使得当二硫键断裂时(例如，在存在还原剂的情况下)，附接的物质从珠中释放。在一些实施方式中，丙烯酸亚磷酰胺部分可包括可用于物质附接的反应性羟基。[0707]在一些实施方式中，聚合以形成珠的前体(例如，单体或交联剂)可包括丙烯酸亚磷酰胺部分，使得当产生珠时，珠还包括丙烯酸亚磷酰胺部分。丙烯酸亚磷酰胺部分可附接于核酸分子(例如，寡核苷酸)，其可包括引发序列(例如，用于扩增靶核酸的引物、随机引物、信使rna的引物序列)和/或一个或多个捕获探针。一个或多个捕获探针可以包括对于耦合到给定珠的所有捕获探针相同的序列和/或对于耦合到给定珠的所有捕获探针不同的序列。捕获探针可纳入珠中。在一些实施方式中，捕获探针可纳入或附接到珠上，使得捕获探针保持游离的3′端。在一些实施方式中，捕获探针可纳入或附接到珠上，使得捕获探针保持游离的5′端。在一些实施方式中，可以对珠进行官能化，使得每个珠包含多个不同的捕获探针。例如，珠可以包括多个捕获探针，例如捕获探针1、捕获探针2和捕获探针3，并且捕获探针1、捕获探针2和捕获探针3中的每一个都包含不同的捕获域(例如，捕获探针1的捕获域包括聚(dt)捕获域，捕获探针2的捕获域包括基因特异性捕获域，捕获探针3的捕获域包括crispr特异性捕获域)。通过使珠官能化以使每个珠包含多个不同捕获域，可提高用于分析物检测的复用能力的水平。[0708]在一些实施方式中，聚合以形成珠的前体(例如，单体或交联剂)可包括具有反应性或能够被活化的官能团，使得当其变得具有反应性时，其可与其它前体聚合以产生包括所述活化或可活化官能团的珠。然后可以使用官能团将其它物质(例如，二硫键接头、引物、其他寡核苷酸等)附接到珠上。例如，包括羧酸(cooh)基团的一些前体可与其它前体共聚合以形成也包括cooh官能团的珠。在一些实施方式中，丙烯酸(包括游离cooh基团的物质)、丙烯酰胺和双(丙烯酰)胱胺可共聚合在一起以产生包括游离cooh基团的珠。珠的cooh基团可被活化(例如，经由1‑乙基‑3‑(3‑二甲氨基丙基)碳二亚胺(edc)和n‑羟基琥珀酰亚胺(nhs)或4‑(4，6‑二甲氧基‑1，3，5‑三嗪‑2‑基)‑4‑甲基吗啉氯化物(dmtmm))以使其具有反应性(例如，与胺官能团反应，其中edc/nhs或dmtmm用于活化)。活化的cooh基团随后可与适当的物质(例如，包括胺官能团的物质，其中羧酸基团被活化以可与胺官能团反应)反应，其作为待连接到珠的部分上的官能团。[0709]通过将一些二硫键还原为游离巯基，在其聚合物网络中包括二硫键的珠可以用其它物质(例如，二硫键接头、引物、其他寡核苷酸等)官能化。二硫键可通过例如还原剂(例如dtt、tcep等)的作用来还原以生成游离巯基，而不使珠溶解。然后，珠的游离巯基可与物质或包括另一二硫键的物质的游离巯基反应(例如，通过巯基二硫键交换)，使得物质可连接到珠(例如，通过生成的二硫键)。在一些实施方式中，珠的游离巯基可与任何其它合适基团反应。例如，珠的游离巯基可与包括丙烯酸亚磷酰胺部分的物质反应。珠的游离巯基可以通过michael加成化学与丙烯酸亚磷酰胺反应，使得包括丙烯酸亚磷酰胺的物质与珠相连。在一些实施方式中，可通过包含巯基封端剂(例如n‑乙基马来酰胺或碘乙酸盐)来防止非受控反应。[0710]可以控制珠中二硫键的活化，使得只有少量二硫键被活化。例如，可以通过控制用于生成游离巯基的还原剂的浓度和/或用于在珠聚合中形成二硫键的试剂的浓度来施加控制。在一些实施方式中，低浓度的还原剂(例如，还原剂分子∶凝胶珠比率)小于或等于约1∶10000000000，小于或等于约1∶10000000000，小于或等于约1∶1000000000，小于或等于约1∶100000000，小于或等于约1∶10000000，小于或等于约等于1∶1000000，小于或等于约1∶100000，或小于或等于约1∶10000)可用于还原。控制还原为游离巯基的二硫键的数量有助于确保官能化过程中珠结构的完整性。在一些实施方式中，光学活性剂(例如荧光染料)可经由珠的游离巯基耦合到珠并用于定量珠中存在的游离巯基的数量和/或跟踪珠。[0711]在一些实施方式中，在珠形成后向珠添加部分可能是有利的。例如，在珠形成后添加捕获探针可避免在聚合期间可能发生的链转移终止期间物质(例如，二硫键接头、引物、其他寡核苷酸等)的损失。在一些实施方式中，较小的前体(例如，不包括侧链基团和联接部分的单体或交联剂)可用于聚合，并且可由于粘性效应而最小程度地阻止链末端的生长。在一些实施方式中，珠合成后的官能化可最小化物质(例如，寡核苷酸)对于待加载的潜在破坏剂(例如，自由基)和/或化学环境的暴露。在一些实施方式中，所生成的水凝胶可具有使温度驱动的珠溶胀和崩塌的上临界溶液温度(ucst)。这种功能性可帮助寡核苷酸(例如，引物)在随后用寡核苷酸对珠进行官能化期间渗入珠。生产后官能化也可用于控制珠中物质的加载率，例如，使得加载率的可变性最小化。还可以在批次处理过程中进行物质加载，使得多个珠可以在单个批次处理中用物质官能化。[0712]试剂可在珠生成期间(例如，在前体聚合期间)包封在珠中。这些试剂可以或不能参与聚合。此类试剂可进入聚合反应混合物中，使得生成的珠在珠形成时包含试剂。在一些实施方式中，可在形成后将此类试剂添加到珠中。此类试剂可包括例如捕获探针(例如，寡核苷酸)、用于核酸扩增反应的试剂(例如，引物、聚合酶、dntp、辅因子(例如，离子辅因子)、缓冲剂)，包括本文所述的试剂、用于酶促反应的试剂(例如，酶、辅因子、基材、缓冲剂)，用于聚合、连接或消化等核酸修饰反应的试剂和/或用于一个或多个测序平台的模板制备(例如，标签化)的试剂(例如，用于的)。此类试剂可包括本文所述的一种或多种酶，包括但不限于聚合酶、逆转录酶、限制性内切酶(例如，核酸内切酶)、转座酶、连接酶、蛋白酶k、dna酶等。此类试剂还可或可选地包括一种或多种试剂，例如裂解剂、抑制剂、灭活剂，螯合剂，刺激剂。此类试剂的捕获可通过前体聚合期间产生的聚合物网络密度、珠内离子电荷的控制(例如，通过与聚合物质相连的离子物质)或其他物质的释放来控制。当珠降解和/或通过施加能够从珠中释放试剂的刺激时，可从珠中释放包封的试剂。在一些实施方式中，珠或珠的排列可以在如本文所述的透化试剂中孵育。[0713]在一些实施方式中，珠还可包括(例如，包封或在其上附接)包括空间条形码的多个捕获探针，并且空间条形码的光学特性可用于珠的光学检测。例如，空间条形码的光吸收率可以用来区分珠。在一些实施方式中，可检测标签可以直接或间接地附接到空间条形码上并提供对珠的光学检测。在一些实施方式中，一个或多个珠的组中的每个珠具有独特可检测标签，并且独特可检测标签的检测确定与珠相关联的空间条形码序列的位置。[0714]引起珠光学检测的光学特性可归因于珠表面的光学特性(例如，附接在珠上的可检测标记物)或珠的大片区域(bulkregion)的光学特性(例如，在珠形成过程中掺入的可检测标记物或珠本身的光学特性)。在一些实施方式中，可检测标记物可与珠或耦合到珠的一个或多个部分相关联。[0715]在一些实施方式中，珠包括多个可检测标记物。例如，荧光染料可附接于珠的表面和/或可纳入珠中。不同荧光染料的不同强度可用于增加可用于区分珠的光学组合的数量。例如，如果n是荧光染料的数量(例如，2到10种荧光染料，例如4种荧光染料)，m是染料的可能强度(例如，2到50种强度，例如20种强度)，那么mn是可能的不同光学组合。在一个示例中，可使用具有20种可能强度的4种荧光染料来产生160000种不同的光学组合。[0716]珠或生物内容物(例如细胞或细胞核)的一个或多个光学性质可用于将个体珠或生物内容物与其他珠或生物内容物区分开来。在一些实施方式中，通过包括具有光学特性以将珠彼此区分的可检测标签，使得珠可进行光学检测。[0717]在一些实施方式中，珠的光学性质可用于珠的光学检测。例如，但不限于，光学性质可以包括吸光度、双折射、颜色、荧光、光度、光敏性、反射率、折射率、散射或透射率。例如，珠可以基于聚合度、链长或单体化学具有不同的双折射值。[0718]在一些实施方式中，纳米珠(例如量子点或janus珠)可以用作光学标记物或其组件。例如，量子点可以附接在珠的空间条形码上。[0719]珠的光学标记物可以提供增强的光谱分辨率，以区分(例如，识别)具有独特空间条形码的珠(例如，包括独特空间条形码序列的珠)。即，珠以光学标记物和珠上的条形码(例如，空间条形码)彼此相关的方式制造。在一些方面，可以将珠加载到流动池中，使得珠以紧密堆积的方式排列(例如，单细胞分辨率)。可以进行成像，并且可以确定条形码的空间位置(例如，基于来自查找表(lut)的信息)。用于空间分析的光学标记物允许珠条形码(例如，空间条形码)识别的快速解卷积。[0720]在一些示例中，查找表(lut)可用于将珠的属性(例如，光学标记物，例如颜色和/或强度)与条形码序列相关联。该特性可以源自颗粒(例如，珠)或与珠相关联的光学标记物。可以对珠进行成像以获得珠的光学信息，包括例如珠的特性(例如，颜色和/或强度)或与珠相关联的光学标记物，以及生物样品的光学信息。例如，图像可以包括可见光谱、不可见光谱或两者中的光学信息。在一些实施方式中，可以跨越各种光学频率获得多个图像。[0721]在一些实施方式中，第一珠包括第一光学标记物和空间条形码，每个空间条形码具有第一空间条形码序列。第二珠包括第二光学标记物和空间条形码，每个空间条形码具有第二空间条形码序列。第一光学标记物和第二光学标记物可以不同(例如，由两种不同的荧光染料或两种不同强度的相同荧光染料提供)。第一和第二空间条形码序列可以是不同的核酸序列。在一些实施方式中，可以对珠成像以识别第一和第二光学标记物，然后可以使用第一和第二光学标记物将第一和第二光学标记物分别与第一和第二空间条形码序列相关联。在一些实施方式中，包含空间条形码的核酸还可具有分析物(例如，mrna)的捕获域。在一些实施方式中，核酸(例如，包含空间条形码的核酸)可具有独特的分子标识符、裂解域、功能域或其组合。[0722]在一些实施方式中，光学标记物具有特征电磁谱。如本文所用，“电磁谱”是指电磁辐射的频率范围。在一些实施方式中，光学标记物具有特征吸收谱。如本文所用，“吸收谱”是指被吸收的电磁辐射的频率范围。“电磁谱”或“吸收谱”会导致不同的特征谱。在一些实施方式中，峰值辐射或峰值吸收发生在380‑450nm(紫色)、450‑485nm(蓝色)、485‑500nm(青色)、500‑565nm(绿色)、565‑590nm(黄色)、590‑625nm(橙色)或625‑740nm(红色)。在一些实施方式中，峰值辐射或峰值吸收出现在400nm、460nm或520nm附近。[0723]珠上包含的光学标记物可以识别珠上的相关空间条形码。由于光学标记物的多样性相对有限，因此限制用于解卷积的空间阵列的大小可能是有利的。例如，基材可以被分成两个或更多个分区(例如，箱)。在一些实施方式中，基材可被分成三个或更多个分区。在一些实施方式中，基材可被分成四个或更多个分区(例如，箱)。在一些实施方式中，一组珠被沉积到分区。在各组珠内，一个或多个珠(例如，等于或多于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000或5000个珠)可以具有独特的光学标记物。[0724]在一些情况下，同一分区内的珠在基材上可能具有不同的坐标。这些坐标可以例如通过各种成像技术确定，例如在适当条件下通过显微镜观察。在一些实施方式中，同一分区内的珠可以共享相同的空间条形码。在一些实施方式中，珠(例如，具有条形码(例如，空间条形码或umi)的捕获探针的珠)对于不同的分区箱(partitionbin)而言彼此不同。在一些实施方式中，具有带有条形码(例如，空间条形码或umi)的捕获探针的珠可具有不同的条形码。例如，在某些情况下，在其珠与捕获探针相关联的各组珠中，个体珠上的捕获探针可以具有独特条形码。在一些情况中，在全部的珠中(例如，在两组或更多组珠中)，个体珠可具有含独特条形码的捕获探针。[0725]在一些方面，本公开提供了一种基材。基材可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或超过1000个分区(例如，箱或预定区域)。分区可以具有相同的形状或不同的形状。在一些实施方式中，基材仅具有一个分区(例如，箱或预定区域)。[0726]在一些实施方式中，第一分区(例如，第一预定区域，或基材上的唯一箱)可具有第一组珠。在一些实施方式中，来自第一组珠的至少一个珠包含光学标记物和含有条形码和捕获域的捕获探针(例如，寡核苷酸捕获探针)。在第一组珠中，至少一个珠可以具有独特的光学标记物。在一些实施方式中，第一组珠中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％的珠具有独特的光学标记物。在一些实施方式中，第一组珠中的每个珠具有独特的光学标记物。[0727]在一些实施方式中，基材可具有第二分区(例如，第二预定区域或第二箱)。第二分区可以具有第二组珠。在一些实施方式中，来自第二组珠的至少一个珠包含光学标记物和含有条形码和捕获域的捕获探针(例如，寡核苷酸捕获探针)。在第二组珠中，至少一个珠可以具有独特的光学标记物。在一些实施方式中，第二组珠中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％的珠具有独特的光学标记物。在一些实施方式中，第二组珠中的每个珠具有独特的光学标记物。[0728]在一些实施方式中，基材可具有第三分区、第四分区、第五分区、第六分区、第七分区、第八分区、第九分区或第十分区等。在一些实施方式中，基材可有多个分区。在一些情况下，这些分区中的每一个都具有类似于本文所述的第一或第二分区的特性。例如，来自每组珠的至少一个珠包含光学标记物和含有条形码和捕获域的捕获探针(例如，寡核苷酸捕获探针)。这些珠中的至少一个可以在每组珠中具有独特的光学标记物。在一些实施方式中，各组珠中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％的珠具有独特的光学标记物。在一些实施方式中，各组珠中的每个珠具有独特的光学标记物。[0729]在一些实施方式中，珠沉积在基材上。在一些实施方式中，珠可以直接沉积在生物样品之上或之中。因此，在一些情况下，生物样品可以在珠沉积到基材上之前固定或附着在基材上。[0730]在一些实施方式中，珠仅沉积到感兴趣的区域(例如，基材上的特定位置、特定细胞类型和特定组织结构)。因此，沉积的珠不一定覆盖整个生物样品。在一些实施方式中，可以遮蔽或修饰基材的一个或多个区域(例如加帽的捕获域)，使得遮蔽的区域不与生物样品的相应区域相互作用。[0731]在一些实施方式中，两组或更多组的珠(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10组)沉积在两个或更多个分区(例如、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个分区)。这些分区不需要彼此相邻。只要记录基材上分区的位置，就可以由光学标记物确定珠的身份。[0732]在一些实施方式中，一组珠可具有等于或多于1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，500，600，700，800，900，1000，2000，3000，4000或5000个珠。在一些实施方式中，一组25的珠可具有少于5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，500，600，700，800，900，1000，2000，3000，4000或5000个珠。[0733]生成珠时可以包括光学标记物。例如，光学标记物可以包括在凝胶珠的聚合物结构中，或者在珠生产的预聚合物或单体阶段附接。在一些实施方式中，珠包括附接到一个或多个光学标记物的部分(例如，在珠的表面和/或珠内)。在一些实施方式中，光学标记物可以用一种或多种试剂加载到珠中。例如，试剂和光学标记物可以通过试剂的扩散(例如，包括光学标记物的试剂溶液)被加载到珠中。在一些实施方式中，在制备空间条形码时可以包括光学标记物。例如，可以通过合成包括条形码序列的分子(例如，使用分离池(splitpool)或组合方法)来制备空间条形码。光学标记物可以在将空间条形码附接到珠之前附接到空间条形码。在一些实施方式中，在将空间条形码附接到珠之后可以包括光学标记物。例如，光学标记物可以附接到耦合到珠的空间条形码上。在一些实施方式中，空间条形码或其序列可以可释放地或可裂解地附接到珠。光学标记物可以可释放或不可释放形式附接到珠上。在一些实施方式中，第一珠(例如，包括多个空间条形码的珠)可耦合到包括一个或多个光学标记物的第二珠。例如，第一珠可经由化学键与第二珠共价耦合。在一些实施方式中，第一珠可与第二珠非共价结合。[0734]第一和/或第二珠可以包括多个空间条形码。耦合到给定珠的多个空间条形码可以包括相同的条形码序列。在第一和第二珠都包括空间条形码的情况下，第一和第二珠可以包括包括相同条形码序列或不同条形码序列的空间条形码。[0735]含有捕获的分析物的珠阵列可以批量处理，也可以分为液滴乳液，以制备测序文库。在一些实施方式中，下一代测序读取被聚集并与珠阵列上空间条形码的空间位置相关。例如，该信息可计算地叠加在组织切片的高分辨率图像上以识别检测到分析物的位置。[0736]在一些实施方式中，可进行解交联以说明可能与某些条码化/文库制备生物化学(例如，蛋白酶的存在)不相容的解交联化学。例如，两步过程是可能的。在第一步中，可以以液滴的形式提供珠，使得在进行常规的去交联化学后dna结合到珠上。在第二步中，将乳液破碎并收集珠，然后在洗涤后重新包封以进行进一步加工。[0737]在一些实施方式中，可使用光化学方法将珠固定或附接至基材。例如，珠可使用全氟苯基叠氮化物硅烷(pfpa硅烷)官能化，与基材接触，然后暴露于辐照(参见，例如，liu等，(2006)journaloftheamericanchemicalsociety128，14067‑14072)。例如，安曲酮官能化基材的固定(参见，例如，koch等，(2000)bioconjugatechem.11，474‑483，其全部内容通过引用纳入本文)。[0738]这些阵列也可以通过珠自组装来制备。每个珠上都覆盖着数十万个特定的寡核苷酸拷贝。在一些实施方式中，每个珠可以覆盖有约1,000至约1,000,000个寡核苷酸。在一些实施方式中，每个珠可被约1000000至约10000000个寡核苷酸覆盖。在一些实施方式中，每个珠可覆盖约2000000至约3000000、约3000000至约4000000、约4000000至约5000000、约5000000至约6000000、约6000000至约7000000、约7000000至约8000000、约8000000至约9000000或约9000000至约10000000个寡核苷酸。在一些实施方式中，每个珠可被约10,000,000至约100,000,000个寡核苷酸覆盖。在一些实施方式中，每个珠可被约100,000,000至约1,000,000,000个寡核苷酸覆盖。在一些实施方式中，每个珠可被约1,000,000,000至约10,000,000,000个寡核苷酸覆盖。在阵列生产过程中，珠可以不规则地分布在蚀刻基材上。在此过程中，珠可自组装成阵列(例如，在光纤束基材或二氧化硅载玻片基材上)。在一些实施方式中，珠不规则地到达其在阵列上的最终位置。因此，可能需要映射珠位置或者可能需要基于预定图案合成寡核苷酸。[0739]珠可以用粘合剂或其组合以共价或非共价方式固定或附接至基材。附接的珠可以例如以单层、双层、三层或簇的形式分层。如本文所定义，“单层”通常是指固定或附接于基材的一系列探针、珠、点、点、特征、微位置或岛的阵列，使得珠排列成一层单珠。在一些实施方式中，珠被紧密地包装。[0740]如本文所定义，短语“基本单层”或“基本形成单层”通常指(形成)固定或附接至基材的成阵列系列的探针、珠、微球、点、点、特征、微位置或岛，使得约50％至约99％(例如，约50％至约98％)的珠排列成一层单珠。这种排列可以使用多种方法来确定，包括显微成像。[0741]在一些实施方式中，单层珠位于基材上的预定区域中。例如，预定区域可以用物理屏障、光掩模、基材中的凹口或基材中的孔来划分。[0742]如本文所用，术语“反应性元件”通常指可与另一分子或分子部分反应以形成共价键的分子或分子部分。反应性元件包括例如胺、醛、炔烃、叠氮化物、硫醇、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、酰肼、羧酸、烷氧基胺、巯基、马来酰亚胺、迈克尔受体、羟基和活性酯。一些反应性元件，例如羧酸，可以用一种或多种活化剂(例如酰化剂、异脲形成剂)处理以增加反应性元件对亲核攻击的敏感性。活化剂的非限制性示例包括n‑羟基琥珀酰亚胺、n‑羟基磺基琥珀酰亚胺、1‑乙基‑3‑(3‑二甲氨基丙基)碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、六氟磷酸1‑羟基苯并三唑、(苯并三唑‑1‑基氧基)三吡咯烷基鏻、六氟磷酸(苯并三唑‑1‑基)‑n，n，n’，n’‑四甲基脲、4‑(n，n‑二甲氨基)吡啶和羰基二咪唑。[0743]在一些实施方式中，反应性元件直接结合到珠。例如，水凝胶珠可以用丙烯酸单体处理以形成丙烯酸官能化水凝胶珠。在某些情况下，反应性元件通过一个或多个接头间接地结合到珠。如本文所用，“接头”通常指用于偶联两个或更多化学部分的多功能(例如，双功能、三功能)试剂。接头可以是能够经历诱导离解的可裂解接头。例如，可通过溶剂(例如，水解和溶剂解)、辐照(例如，光解)、酶(例如，酶解)或用特定ph(例如，ph4、5、6、7或8)的溶液处理来诱导离解。[0744]在一些实施方式中，反应性元件直接结合到基材。例如，载玻片可涂有(3‑氨基丙基)三乙氧基硅烷。在一些实施方式中，反应性元件经由一个或多个接头间接地结合到基材。[0745]凝胶/水凝胶珠[0746]在一些实施方式中，珠可以是凝胶珠。“凝胶”是一种对液体和气体具有透化性的半刚性材料。示例性凝胶包括但不限于具有胶体结构的凝胶，例如琼脂糖；聚合物网状结构，例如明胶；水凝胶；以及交联聚合物结构，例如聚丙烯酰胺、sfa(例如，参见美国专利申请公开号2011/0059865，通过引用将其全部纳入本文)和pazam(例如，参见美国专利申请公开号2014/0079923，通过引用将其全部纳入本文)。[0747]根据预期用途的不同，凝胶可以配制成各种形状和尺寸。在一些实施方式中，制备凝胶并将其配制成凝胶珠(例如，凝胶珠，其包括附接于凝胶珠或与凝胶珠相关联的捕获探针)。凝胶珠可以是水凝胶珠。水凝胶珠可由分子前体形成，例如聚合物或单体物质。[0748]在一些情况下，珠包含聚合物或水凝胶。聚合物或水凝胶可以确定水凝胶珠的一种或多种特性，例如水凝胶珠的体积、流动性、孔隙率、刚性、组织或一种或多种其它特征。在一些实施方式中，水凝胶珠可包括聚合物基质(例如，通过聚合或交联形成的基质)。聚合物基质可包括一种或多种聚合物(例如，具有不同官能团或重复单元的聚合物)。交联可以通过共价、离子和/或诱导相互作用和/或物理缠结实现。[0749]聚合物或水凝胶可以，例如，在交联水凝胶珠内的一种或多种可交联分子时形成。例如，水凝胶可在水凝胶珠内的一种或多种分子交联时形成。水凝胶可在水凝胶珠内聚合多个单体时形成。水凝胶可在水凝胶珠内聚合多个聚合物时形成。聚合物或水凝胶前体可以提供给水凝胶珠并且在不施加刺激的情况下可能不形成聚合物或水凝胶(例如，如本文所述)。在一些情况下，水凝胶珠可被封装在聚合物或水凝胶内。水凝胶珠的形成可以在由一种或多种其它条件引起的细胞的一种或多种其它变化之后发生。[0750]本文所述的方法可施用于单个水凝胶珠或多个水凝胶珠。处理多个水凝胶珠的方法可包括在容器内提供多个水凝胶珠并使多个水凝胶珠经受足以改变水凝胶珠的一个或多个特性的条件。例如，多个水凝胶珠可以经受包括化学物质的第一条件或第一组条件，从而多个水凝胶珠中的水凝胶珠的截面可以从第一截面变为第二截面，其中第二截面小于第一截面。化学物质可以包括例如有机溶剂，例如乙醇、甲醇或丙酮。然后可以使多个水凝胶珠经受包含化学物质的第二条件或第二组条件，并且可以在每个水凝胶珠内形成交联。化学物质可以包括例如交联剂。可以在水性流体中提供多个处理过的水凝胶珠。在一些情况下，使多个水凝胶珠的第二截面基本上保持在水性流体中。多个处理过的水凝胶珠可被分配在多个分区内。分区可以是，例如，包含在油包水乳液中的水性液滴。分区可以是例如多个孔。多个固定的水凝胶珠可以与一种或多种试剂被共同分区(co‑partition)。在一些情况下，多个固定的水凝胶珠可以与一个或多个珠共同分区，其中每个珠包含与其附接的多个核酸条形码分子。附连于给定珠的核酸条形码分子可包含共有条形码序列，且附连于每个不同珠的核酸条形码分子可包含含有不同共有条形码序列的序列。然后可以将核酸条形码分子或其部分用于与和多个水凝胶珠中的水凝胶珠相关联的目标分子的反应。[0751]核/壳珠[0752]在一些实施方式中，珠是核/壳珠(core/shellbead)，其包含内核(例如，纳米球或微米球)和外壳(例如，包被纳米球或微米球的水凝胶)。在一些实施方式中，内核可以是固体纳米颗粒或固体微米颗粒。在一些实施方式中，内核可以是二氧化硅内核(例如，二氧化硅纳米颗粒或二氧化硅微米颗粒)。在一些实施方式中，核/壳珠的内核可具有约1微米的平均直径。在一些实施方式中，内核可具有约2微米的平均直径。在一些实施方式中，内核可具有约3微米的平均直径。在一些实施方式中，内核可具有约4微米的平均直径。在一些实施方式中，内核可具有约5微米的平均直径。在一些实施方式中，内核可具有约6微米的平均直径。在一些实施方式中，内核可具有约7微米的平均直径。在一些实施方式中，内核可具有约8微米的平均直径。在一些实施方式中，内核可具有约9微米的平均直径。在一些实施方式中，内核可具有约10微米的平均直径。在一些实施方式中，内核可具有约100纳米至约10微米的平均直径。[0753]在一些实施方式中，核/壳珠可通过从外壳移除溶剂、盐或水(例如，脱水的、干的、干燥的、变干的)以形成收缩的核/壳珠，来减小其外壳体积。在另一个示例中，如上所述，核/壳珠可以通过调节温度或ph来减小其外壳体积。在一些实施方式中，核/壳珠可以扩展其外壳体积，例如通过添加溶剂、盐或水(例如，再水合)以形成扩展的核/壳珠。在一些实施方式中，外壳(例如包覆内核)可具有约1微米的平均厚度。在一些实施方式中，外壳可具有约2微米的平均厚度。在一些实施方式中，外壳可具有约3微米的平均厚度。在一些实施方式中，外壳可具有约4微米的平均厚度。在一些实施方式中，外壳可具有约5微米的平均厚度。[0754]在一些实施方式中，核/壳珠可具有约1微米至约10微米的平均直径。在一些实施方式中，核/壳珠可具有约1微米的平均直径。在一些实施方式中，核/壳珠可具有约2微米的平均直径。在一些实施方式中，核/壳珠可具有约3微米的平均直径。在一些实施方式中，核/壳珠可具有约4微米的平均直径。在一些实施方式中，核/壳珠可具有约5微米的平均直径。在一些实施方式中，核/壳珠可具有约6微米的平均直径。在一些实施方式中，核/壳珠可具有约7微米的平均直径。在一些实施方式中，核/壳珠可具有约8微米的平均直径。在一些实施方式中，核/壳珠可具有约9微米的平均直径。在一些实施方式中，核/壳珠可具有约10微米的平均直径。[0755](2)将特征共价键合到基材的方法[0756]本文提供用于将特征(例如，光学标记珠、水凝胶珠、微球珠)共价键合到基材的方法。[0757]在一些实施方式中，通过第一反应性元件和第二反应性元件之间的共价键将特征(例如珠)耦合到基材。在一些实施方式中，共价结合的珠基本上在基材上形成单层特征(例如，水凝胶珠、微球珠)。[0758]在一些实施方式中，所述特征(例如珠)用第一反应性元件官能化，所述第一反应性元件直接结合到所述特征。在一些实施方式中，所述特征用第一反应性元件官能化，所述第一反应性元件通过接头间接结合到所述珠。在一些实施方式中，接头是二苯甲酮。在一些实施方式中，接头是氨基甲基丙烯酰胺。例如，接头可以是3‑氨基丙基甲基丙烯酰胺。在一些实施方式中，接头是peg接头。在一些实施方式中，接头是可裂解接头。[0759]在一些实施方式中，用直接结合到基材的第二反应性元件使基材官能化。在一些实施方式中，所述基材用第二反应性元件官能化，所述第二反应性元件通过接头间接结合到所述珠。在一些实施方式中，接头是二苯甲酮。例如，接头可以是二苯甲酮。在一些实施方式中，接头是氨基甲基丙烯酰胺。例如，接头可以是3‑氨基丙基甲基丙烯酰胺。在一些实施方式中，接头是peg接头。在一些实施方式中，接头是可裂解接头。[0760]在一些实施方式中，所述基材是载玻片。在一些实施方式中，基材是预官能化的载玻片。[0761]在一些实施方式中，约99％的共价结合珠在基材上形成单层珠。在一些实施方式中，约50％至约98％在基材上形成单层珠。例如，约50％至约95％、约50％至约90％、约50％至约85％、约50％至约80％、约50％至约75％、约50％至约70％、约50％至约65％、约50％至约60％或约50％至约55％的共价结合珠在基材上形成单层珠。在一些实施方式中，约55％至约98％、约60％至约98％、约65％至约98％、约70％至约98％、约75％至约98％、约80％至约98％、约85％至约98％、约90％至约95％或约95％至约98％的共价结合珠在基材上形成单层珠。在一些实施方式中，约55％至约95％、约60％至约90％、约65％至约95％、约70％至约95％、约75％至约90％、约75％至约95％、约80％至约90％、约80％至约95％、约85％至约90％、或约85％至约95％共价结合的珠在基材上形成单层珠。[0762]在一些实施方式中，第一反应性元件和第二反应性元件中的至少一个选自以下组：[0763][0764]其中，[0765]r1选自h，c1‑c6烷基，或‑so3；[0766]r2是c1‑c6烷基；和[0767]x是卤素部分。[0768]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括[0769]其中表示第一反应性元件或第二反应性元件与珠(例如，水凝胶珠或微球珠)或基材附接的点。[0770]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个选自以下组：[0771][0772]其中，[0773]r1选自h，c1‑c6烷基，或‑so3；[0774]r2是c1‑c6烷基；和[0775]x是卤素部分。[0776]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括其中r1选自h、c1‑c6烷基或‑so3。在一些实施方式中，r1是h。在一些实施方式中，r1是c1‑c6烷基。在一些实施方式中，r1是‑so3。[0777]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括其中r2是c1‑c6烷基。在一些实施方式中，r2是甲基。[0778]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括在一些实施方式中，可与活化剂反应形成活性酯。在一些实施方式中，活性酯为在一些实施方式中，活化剂是酰化剂(例如，n‑羟基琥珀酰亚胺和n‑羟基磺基琥珀酰亚胺)。在一些实施方式中，活化剂是o‑酰基脲形成剂(例如，1‑乙基‑3‑(3‑二甲氨基丙基)碳二亚胺(edc)、二环己基碳二亚胺和二异丙基碳二亚胺)。在一些实施方式中，活化剂是至少一种酰化剂和至少一种o‑异脲形成剂(例如，n‑羟基琥珀酰亚胺(nhs)、1‑乙基‑3‑(3‑二甲氨基丙基)碳二亚胺(edc)、n‑羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基nhs)及其组合)的组合。[0779]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括[0780]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括其中x是卤素部分。例如，x是氯、溴或碘。[0781]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括[0782]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括[0783]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括[0784]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个选自以下组：[0785][0786]其中，[0787]r3是h或c1‑c6烷基；并且[0788]r4是h或三甲基甲硅烷基。[0789]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括其中r4是h或三甲基甲硅烷基。在一些实施方式中，r4是h。[0790]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个选自以下组：[0791][0792]其中r3是h或c1‑c6烷基。在一些实施方式中，r3是h。在一些实施方式中，r3是c1‑c6烷基。[0793]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括其中r3是h或c1‑c6烷基。在一些实施方式中，r3是h。在一些实施方式中，r3是c1‑c6烷基。[0794]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括[0795]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的至少一个包括[0796]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的一个选自以下组：[0797][0798]其中，[0799]r1选自h，c1‑c6烷基，或‑so3；[0800]r2是c1‑c6烷基；[0801]x是卤素部分；[0802]并且第一反应性元件或第二反应性元件中的另一个选自以下组：[0803][0804]其中，[0805]r3是h或c1‑c6烷基；并且[0806]r4是h或三甲基甲硅烷基。[0807]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的一个选自以下组：其中r3是h或c1‑c6烷基；[0808]并且第一反应性元件或第二反应性元件中的另一个是其中r4是h或三甲基甲硅烷基。在一些实施方式中，r3是h。在一些实施方式中，r3是c1‑c6烷基。在一些实施方式中，r4是h。在一些实施方式中，r4是三甲基甲硅烷基。[0809]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的一个选自以下组：[0810][0811]其中，[0812]r1选自h，c1‑c6烷基，或‑so3；[0813]r2是c1‑c6烷基；[0814]x是卤素部分；[0815]并且第一反应性元件或第二反应性元件中的另一个选自以下组：[0816][0817]其中r3是h或c1‑c6烷基。在一些实施方式中，r1是h。在一些实施方式中，r1是c1‑c6烷基。在一些实施方式中，r1是‑so3。在一些实施方式中，r2是甲基。在一些实施方式中，x是碘。在一些实施方式中，r3是h。在一些实施方式中，r3是c1‑c6烷基。[0818]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的一个选自以下组：[0819][0820]其中，[0821]r1选自h，c1‑c6烷基，或‑so3；[0822]r2是c1‑c6烷基；[0823]并且第一反应性元件或第二反应性元件中的另一个包括其中r3是h或c1‑c6烷基。在一些实施方式中，r1是h。在一些实施方式中，r1是c1‑c6烷基。在一些实施方式中，r1是‑so3。在一些实施方式中，r2是甲基。在一些实施方式中，r3是h。在一些实施方式中，r3是c1‑c6烷基。[0824]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的一个选自以下组：[0825][0826]其中x是卤素部分；[0827]并且第一反应性元件或第二反应性元件中的另一个包括在一些实施方式中，x是溴。在一些实施方式中，x是碘。[0828]在一些实施方式中，第一反应性元件或第二反应性元件中的一个选自以下组：[0829]并且第一反应性元件或第二反应性元件中的另一个包括[0830]术语“卤素”是指氟(f)，氯(c1)，溴(br)或碘(i)。[0831]术语“烷基”是指可以是直链或支链的烃链，其包含所示数目的碳原子。例如，c1‑10表示该基团中可以具有1至10个(含)碳原子。非限制性示例包括甲基、乙基、异‑丙基、叔‑丁基、正‑己基。[0832]术语“卤代烷基”是指其中一个或多个氢原子被独立选择的卤素取代的烷基。[0833]术语“烷氧基”是指‑o‑烷基(例如，‑och3)。[0834]术语“亚烷基”是指二价烷基(例如，‑ch2‑)。[0835]术语“烯基”是指可以是具有一个或多个碳‑碳双键的直链或支链的烃链。烯基部分包含指定数目的碳原子。例如，c2‑6表示该基团中可以具有2至6个(含)碳原子。[0836]术语“炔基”是指可以是具有一个或多个碳‑碳三键的直链或支链的烃链。炔基部分包含指定数目的碳原子。例如，c2‑6表示该基团中可以具有2至6个(含)碳原子。[0837]术语“芳基”是指6‑20个碳的单环、双环、三环或多环基团，其中系统中的至少一个环是芳族的(例如6‑碳单环，10‑碳双环或14‑碳三环芳族环系统)；以及其中每个环的0、1、2、3或4个原子可以被取代基取代。芳基的实例还包括苯基、萘基、四氢萘基等。[0838](3)将特征非共价键合到基材的方法[0839]本文提供用于将特征(例如，光学标记珠、水凝胶珠、或微球珠)非共价键合到基材的方法。[0840]在一些实施方式中，特征(例如珠)经由第一亲合基团和第二亲合基团之间的非共价键耦合到基材。在一些实施方式中，非共价结合的特征(例如珠)基本上在基材上形成珠的单层(例如，水凝胶珠、微球珠)。[0841]在一些实施方式中，所述特征用第一亲和基团官能化，所述第一亲和基团直接结合到所述特征。在一些实施方式中，所述特征用第一亲和基团官能化，所述第一亲和基团通过接头间接结合到所述珠。在一些实施方式中，接头是二苯甲酮。在一些实施方式中，接头是氨基甲基丙烯酰胺。例如，接头可以是3‑氨基丙基甲基丙烯酰胺。在一些实施方式中，接头是peg接头。在一些实施方式中，接头是可裂解接头。[0842]在一些实施方式中，用直接结合到基材的第二亲和基团使基材官能化。在一些实施方式中，所述基材用第二亲核基团官能化，所述第二亲和基团通过接头间接结合到所述珠。在一些实施方式中，接头是二苯甲酮。在一些实施方式中，接头是氨基甲基丙烯酰胺。例如，接头可以是3‑氨基丙基甲基丙烯酰胺。在一些实施方式中，接头是peg接头。在一些实施方式中，接头是可裂解接头。[0843]在一些实施方式中，第一亲和基团或第二亲和基团是生物素，并且第一亲和基团或第二亲和基团中的另一个是链霉亲和素。[0844]在一些实施方式中，约99％的非共价结合珠在基材上形成珠单层。在一些实施方式中，约50％至约98％在基材上形成单层珠。例如，约50％至约95％、约50％至约90％、约50％至约85％、约50％至约80％、约50％至约75％、约50％至约70％、约50％至约65％、约50％至约60％或约50％至约55％的非共价结合珠在基材上形成单层珠。在一些实施方式中，约55％至约98％、约60％至约98％、约65％至约98％、约70％至约98％、约75％至约98％、约80％至约98％、约85％至约98％、约90％至约95％或约95％至约98％的非共价结合珠在基材上形成单层珠。在一些实施方式中，约55％至约95％、约60％至约90％、约65％至约95％、约70％至约95％、约75％至约90％、约75％至约95％、约80％至约90％、约80％至约95％、约85％至约90％、或约85％至约95％的非共价结合的珠在基材上形成单层珠。[0845]在一些实施方式中，珠的单层在基材上的预定区域中形成。在一些实施方式中，预定区域用物理屏障划分。例如，基材中的凹坑或孔。在一些实施方式中，使用光掩模对预定区域进行分区。例如，基材用光活化的溶液被覆，干燥，然后在光掩模下辐照。在一些实施方式中，光活化的溶液是经紫外光活化的。[0846]如本文所用，“粘合剂”通常指用于将物体或材料粘在一起的物质。粘合剂包括，例如，胶水、糊料、液体胶带、环氧树脂、生物粘合剂、凝胶和粘液。在一些实施方式中，粘合剂是液体胶带。在一些实施方式中，粘合剂是胶水。[0847]在一些实施方式中，使用粘合剂(例如，液体胶带、胶水、糊料)将珠粘附到基材上。在一些实施方式中，粘附的珠基本上在基材(例如，载玻片)上形成单层珠。在一些实施方式中，珠是水凝胶珠。在一些实施方式中，珠是微球珠。在一些实施方式中，用粘合剂涂覆珠，然后珠与基材接触。在一些实施方式中，用粘合剂涂覆基材，然后使基材与珠接触。在一些实施方式中，用粘合剂涂覆基材和用粘合剂涂覆珠，然后珠和基材彼此接触。[0848]在一些实施方式中，约99％的粘附珠在基材上形成单层珠。在一些实施方式中，约50％至约98％在基材上形成单层珠。例如，约50％至约95％、约50％至约90％、约50％至约85％、约50％至约80％、约50％至约75％、约50％至约70％、约50％至约65％、约50％至约60％或约50％至约55％的粘附的珠在基材上形成单层珠。在一些实施方式中，约55％至约98％、约60％至约98％、约65％至约98％、约70％至约98％、约75％至约98％、约80％至约98％、约85％至约98％、约90％至约95％或约95％至约98％的粘附的珠在基材上形成单层珠。在一些实施方式中，约55％至约95％、约60％至约90％、约65％至约95％、约70％至约95％、约75％至约90％、约75％至约95％、约80％至约90％、约80％至约95％、约85％至约90％、或约85％至约95％的粘附的珠在基材上形成单层珠。[0849]在一些实施方式中，可以将珠沉积到生物样品上，使得沉积的珠在生物样品上形成单层珠(例如，在生物样品上或下)。在一些实施方式中，沉积在基材上的珠可自组装成单层珠，其饱和所研究生物样品的预期表面积。在这种方法中，可以设计、配制和制备珠阵列，以评估来自任何大小或尺寸的生物样品的多种分析物。在一些实施方式中，应用于生物样品的珠(例如凝胶珠)的浓度或密度使得整个区域或生物样品中的一个或多个感兴趣区域被单层珠饱和。在一些实施方式中，通过在生物样品上浇注、移液、喷涂等方式使珠与生物样品接触。可以使用任何合适的珠沉积形式。[0850]在一些实施方式中，生物样品可限定于阵列的特定区或区域。例如，可以将生物样品固定在载玻片上，并且将腔室、垫圈或笼定位在生物样品上，以充当容纳区域或框架，在其中沉积珠。显而易见，饱和区域或生物样品所需的珠的密度或浓度可由本领域普通技术人员容易地确定(例如，通过生物样品上珠的显微可视化)。在一些实施方式中，珠阵列包含微流体通道以将试剂引导到阵列的点或珠。[0851](4)特征几何属性[0852]阵列上的特征可以有多种大小。在一些实施方式中，阵列的特征可以具有500μm到100μm之间的平均直径或最大尺寸。例如，500nm至2μm、1μm至3μm、1μm至5μm、1μm至10μm、1μm至20μm、1μm至30μm、1μm至40μm、1μm至50μm、1μm至60μm、1μm至70μm、1μm至80μm、1μm至90μm、90μm至100μm、80μm至100μm、70μm至100μm、60μm至100μm50μm至100μm、40μm至100μm、30μm至100μm、20μm至100μm、10μm至100μm、约40μm至约70μm或约50μm至约60μm。在一些实施方式中，特征具有30μm至100μm、40μm至90μm、50μm至80μm、60μm至70μm之间或所公开的子范围内的任何范围的平均直径或最大尺寸。在一些实施方式中，特征的平均直径或最大尺寸不大于95μm、90μm、85μm、80μm、75μm、70μm、65μm、60μm、55μm、50μm、45μm、40μm、35μm、30μm、25μm、20μm、15μm、14μm、13μm，12μm、11μm、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm或1μm。在一些实施方式中，特征的平均直径或最大尺寸约为65μm。在一些实施方式中，特征的平均直径或最大距离约为55μm。[0853]在一些实施方式中，阵列的多个特征的大小和/或形状大致相同。在一些实施方式中，阵列的多个特征的大小和/或形状不均匀。例如，在一些实施方式中，阵列中的特征可以具有平均截面尺寸，并且特征之间的截面尺寸的分布可以具有分布的平均截面尺寸的0％或更多(例如，5％或更多、10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、70％或更多、或100％或更多)的全宽和半最大值。[0854]在某些实施方式中，阵列中的特征可以具有约1μm到约10μm之间的平均截面尺寸。该平均特征截面尺寸的范围对应于单个哺乳动物细胞的近似直径。因此，这些特征的阵列可用于检测处于或低于哺乳动物单细胞分辨能力的分析物。[0855]在一些实施方式中，多个特征具有约0.1μm到约100μm的平均直径或平均最大尺寸(例如，约0.1μm到约5μm，约1μm到约10μm，约1μm到约20μm，约1μm到约30μm，约1μm到约40μm，约1μm到约50μm，约1μm到约60μm，约1μm至约70μm，约1μm至约80μm，约1μm至约90μm，约90μm至约100μm，约80μm至约100μm，约70μm至约100μm，约60μm至约100μm，约50μm至约100μm，约40μm至约100μm，约30μm至约100μm，约20μm至约100μm，或约10μm至约100μm)。在一些实施方式中，多个特征具有30μm至100μm、40μm至90μm、50μm至80μm、60μm至70μm之间的平均直径或平均最大尺寸，或公开的子范围内的任何范围。在一些实施方式中，多个特征的平均直径或平均最大尺寸不大于95μm、90μm、85μm、80μm、75μm、70μm、65μm、60μm、55μm、50μm、45μm、40μm、35μm、30μm、25μm、20μm、15μm、14μm、13μm，12μm、11μm、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm或1μm。在一些实施方式中，多个特征具有约65μm、约60μm、约55μm、约50μm、约45μm、约40μm、约35μm、约30μm、约25μm、约20μm、约15μm、约10μm、约5μm、约4μm、约3μm、约2μm或约1μm的均平均直径或均最大尺寸。[0856](iv)阵列几何属性[0857]在一些实施方式中，阵列包括多个特征。例如，阵列包含4000到50,000个特征，或4000到40,000个特征的任何范围内的特征。例如，阵列包括4000到35,000个特征、4000到30,000个特征、4000到25,000个特征、4000到20,000个特征、4,000到15,000个特征、4,000到10,000个特征、4,000到6000个特征或4400到6000个特征。在一些实施方式中，阵列包括4100到5900个特征、4200到5800个特征、4300到5700个特征、4400到5600个特征、4500到5500个特征、4600到5400个特征、4700到5300个特征、4800到5200个特征、4900到5100个特征，或者所公开的子范围内的任何范围。例如，阵列可包括约4,000个特征，约4,200个特征，约4,400个特征，约4,800个特征，约5,000个特征，约5,200个特征，约5,400个特征，约5,600个特征，或约6,000个特征，约10,000个特征，约20,000个特征，约30,000个特征，约40,000个特征，或约50,000个特征。在一些实施方式中，阵列包括至少4000个特征。在一些实施方式中，阵列包括大约5000个特征。[0858]在一些实施方式中，阵列内的特征彼此具有不规则的排列或关系，使得在特征之间的几何间距关系中没有明显的可辨别的图案或规则性。例如，阵列中的特征可以彼此随机定位。或者，阵列内的特征可以不规则地定位，但是可以确定地选择间隔，以确保所得到的特征排列是不规则的。[0859]在一些实施方式中，阵列内的特征相对于彼此规则地定位以形成图案。阵列中可以实现多种不同的特性模式。这种模式的示例包括但不限于特征的正方形阵列、特征的矩形阵列、特征的六边形阵列(包括六边形密排阵列)、特征的径向阵列、特征的螺旋阵列、特征的三角形阵列，以及更一般地，其中阵列中邻近特征在通过线性和/或角度坐标尺寸的规则增量彼此达到的任何阵列。[0860]在一些实施方式中，阵列内的特征以相对于彼此的一定规则度定位，使得特征阵列既不是完全规则的，也不是完全不规则的(即，阵列是″部分规则的″)。例如，在一些实施方式中，阵列中的邻近特征可以由一个或多个线性和/或角度坐标尺寸中的位移分离，该位移为阵列中邻近特征之间的平均位移或标称位移的10％或更多(例如，20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、100％或更多、110％或更多、120％或更多、130％或更多，140％或更多、150％或更多、160％或更多、170％或更多、180％或更多、190％或更多、200％或更多)。在某些实施方式中，阵列中邻近特征之间的位移分布(线性和/或角度)具有阵列中邻近特征之间的平均位移或标称位移的0％和200％之间(例如，0％和100％之间、0％和75％之间、0％和50％之间、0％和25％之间、0％和15％之间、0％和10％之间)的半最大值处的全宽。[0861]在一些实施方式中，特征阵列可以具有可变几何形状。例如，可以根据第一几何图案排列阵列中的特征的第一子集，并且可以根据与第一图案不同的第二几何图案排列阵列中的特征的第二子集。例如，上述任何图案都可以对应于第一和/或第二几何图案。[0862]通常，可以通过调整阵列中相邻特征之间的间距来制备不同特征密度的阵列。在一些实施方式中，阵列中相邻特征之间的几何中心到中心(例如，节距)间距是100nm至10μm、500nm至2μm、1μm至5μm，和20μm至200μm。例如，中心到中心间距可以是100nm至10μm，500nm至2μm，1μm至5μm，20μm至40μm，20μm至60μm，20μm至80μm，80μm至100μm，100μm至120μm，120μm至140μm，140μm至160μm，160μm至180μm，180μm至200μm，60μm至100μm，或40μm至100μm，50μm至150μm，80μm至120μm，或90μm至110μm。在一些实施方式中，邻近阵列特征之间的节距在30μm和100μm、40μm和90μm、50μm和80μm、60μm和70μm、80μm和120μm之间，或在所公开的子范围内的任何范围。在一些实施方式中，阵列的相邻阵列特征之间的节距是约65μm，约60μm，约55μm，约50μm，约45μm，约40μm，约35μm，约30μm，约25μm，约20μm，约15μm，约10μm，约5μm，约4μm，约3μm，约2μm，或约1μm。在一些实施方式中，阵列的相邻阵列特征之间的节距小于100μm。[0863]特征阵列可以具有任何适当的分辨率。在一些实施方式中，特征阵列可具有空间恒定(例如，在误差范围内)分辨率。一般而言，具有空间一致分辨率的阵列是其中阵列中相邻特征之间的节距恒定(例如，在误差范围内)的阵列。这种阵列可用于各种应用。在一些实施方式中，特征阵列可以具有空间上变化的分辨率。通常，具有空间变化分辨率的阵列是阵列中邻近特征之间的中心到中心间距(例如节距)(沿线性、角度，或线性和角度坐标尺寸)变化的阵列。这种阵列可用于各种应用。例如，在一些实施方式中，取决于要调查样品的空间分辨率，样品可以选择性地与阵列中大约对应于测量的期望空间分辨率的部分相关联。[0864]在一些实施方式中，通过功能方面来描述特征阵列的分辨率可能是有用的，例如，每个特征可以进行的读取次数(可以是测序饱和度的代表)、每个特征可以检测到的转录物的数量，或者每个特征可以检测到的基因数量。例如，在一些实施方式中，每个特征可以进行的读取次数是50,000至1,000,000。例如，每个特征可以进行的读取次数可以是50,000至100,000，50,000至150,000，50,000至200,000，50,000至250,000，50,000至300,000，50,000至350,000，50,000至400,000，50,000至500,000，50,000至550,000，50,000至600,000，50,000至650,000，50,000至700,000，50,000至750,000，50,000至800,000，50,000至850,000，50,000至900,000，50,000至950,000，50,000至1,000,000，100,000至500,000，150,000至500,000，200,000至500,000，250,000至500,000，300,000至500,000，350,000至500,000，400,000至500,000，450,000至500,000，150,000至250,000，或300,000至400,000。在一些实施方式中，每个特征可以进行的读取次数为约70,000。在一些实施方式中，每个特征可以进行的读取次数为约170,000。在一些实施方式中，每个特征可以进行的读取次数为约330,000。在一些实施方式中，每个特征可以进行的读取次数为约500,000。在一些实施方式中，每个特征可以进行的读取次数为约800,000。[0865]在一些实施方式中，每个特征可以检测的转录物数量是20,000至200,000。例如，在一些实施方式中，每个特征可以检测的转录物数量可以是20,000至30,000，20,000至40,000，20,000至50,000，30,000至60,000，40,000至60,000，50,000至60,000，20,000至100,000，30,000至100,000，40,000至200,000，50,000至200,000，或30,000至200,000。在一些实施方式中，每个特征可以检测的转录物数量是约40,000。在一些实施方式中，每个特征可以检测的转录物数量是约60,000。在一些实施方式中，每个特征可以检测的转录物数量是约80,000。在一些实施方式中，每个特征可以检测的转录物数量是约100,000。[0866]在一些实施方式中，每个特征可以检测的基因数量是1,000至5,000。例如，每个特征可以检测的基因数量可以是1,000至1,500，1,000至2,000，1,000至2,500，1,000至3,000，1,000至3,500，1,000至4,000，1,000至4,500，1,500至5,000，2,000至5,000，2,500至5,000，3,000至5,000，3,500至5,000，4,000至5,000，4,500至5,000，1,500至2,500，2,500至3,500，或3,500至4,000。在一些实施方式中，每个特征可以检测的基因数量是约2,000。在一些实施方式中，每个特征可以检测的基因数量是约3,000。在一些实施方式中，每个特征可以检测的基因数量是约4,000。[0867]在一些实施方式中，通过功能方面来描述特征阵列的分辨率可能是有用的，例如每个特征的umi计数的数量。例如，在一些实施方式中，每个特征可以进行的umi计数的数量是1,000至50,000。在一些实施方式中，可以将umi计数的数量平均以获得每个特征的平均umi。在一些实施方式中，可以将umi计数的数量平均以获得每个特征的中值umi计数。例如，每个特征的中值umi计数可以是1,000至50,000，1,000至40,000，1,000至30,000，1,000至20,000，1,000至10,000，1,000至5,000。在一些实施方式中，每个特征的中值umi计数为约5,000。在一些实施方式中，每个特征的中值umi计数为约10,000。[0868]这些组成可用于确定阵列的测序饱和度。测序饱和度可以度量文库复杂性和测序深度。例如，不同的细胞类型将具有不同数量的rna，因此不同数量的转录物会影响文库的复杂性。此外，测序深度与测序读数的数量有关。在一些实施方式中，测序饱和度的倒数是检测新转录物所需的附加读数的数量。测量阵列测序饱和度的一种方法是确定检测新umi的读取次数。例如，如果每2次读取特征就检测到一个新的umi，则测序饱和度将为50％。再举一个示例，如果每10次读取一个特征就检测到一个新的umi，那么测序饱和度将是90％。[0869]空间上不同分辨率的阵列可以以多种方式实现。例如，在一些实施方式中，阵列中相邻特征之间的节距沿着一个或多个线性和/或角坐标方向连续变化。因此，对于矩形阵列，特征的连续行之间、特征的连续列之间或特征的连续行和连续列之间的间距可以连续变化。[0870]在某些实施方式中，空间上变化的分辨率的阵列可以包括具有特征总体的离散域。在每个域内，相邻特征可以具有规则节距。因此，例如，阵列可以包括第一域，其中邻近特征沿线性和/或角度坐标维度彼此间隔第一组均匀坐标位移，以及第二域，其中邻近特征沿线性和/或角度坐标维度彼此间隔第二组均匀坐标位移。第一和第二组位移在至少一个坐标位移中不同，使得两个域中的邻近特征间隔不同，因此第一域中的阵列的分辨率不同于第二域中的阵列的分辨率。[0871]在一些实施方式中，阵列特征的节距可以足够小，使得阵列特征沿着一个或多个阵列维度有效地连续或几乎连续地定位，并且阵列特征之间沿着这些维度很少或没有位移。例如，在其中特征对应于基材的区域(即，寡核苷酸直接结合到基材)的特征阵列中，邻近寡核苷酸之间的位移可以非常小‑有效地，单个寡核苷酸的分子宽度。在这些实施方式中，每个寡核苷酸可以包括不同的空间条形码，使得可以在样品分析期间确定阵列中每个寡核苷酸的空间位置。这种类型的阵列可以具有非常高的空间分辨率，但可能仅包括对应于样品中每个不同空间位置的单个寡核苷酸。[0872]通常，阵列的大小(对应于沿一个坐标方向包围阵列中所有特征的最小边界的最大维度)可以根据需要进行选择，这是基于例如每个特征内样品大小、特征直径和捕获探针的密度等标准。例如，在一些实施方式中，阵列可以是矩形或正方形阵列，其沿每个坐标方向的最大阵列维度为10mm或更小(例如，9mm或更小、8mm或更小、7mm或更小、6mm或更小、5mm或更小、4mm或更小、3mm或更小)。因此，例如，特征的正方形阵列可以具有8mm×8mm、7mm×7mm、5mm×5mm或小于5mm×5mm的维度。[0873](v)珠阵列[0874]如本文所使用的，术语“珠阵列”是指包括多个珠作为阵列中的特征的阵列。在一些实施方式中，两个或多个珠分散在基材上以创建阵列，其中每个珠是阵列上的特征。在一些实施方式中，珠附接到基材。例如，所述珠可以任选地附接到例如显微镜载玻片之类的基材上并且靠近生物样品(例如，包括细胞的组织切片)。珠也可悬浮在溶液中并沉积在表面(例如，膜、组织切片或基材(例如，显微镜载玻片))上。可任选地将珠分散到基材上的孔中，例如，使得每个孔仅容纳单个珠。[0875]基材上或基材内珠阵列的示例包括位于孔中的珠，例如beadchip阵列(可从加利福尼亚州圣迭戈的亿明达公司(illuminainc.)获得)、454lifesciences(瑞士巴塞尔罗氏公司的子公司)测序平台中使用的阵列，以及用于离子激流测序平台的阵列(加利福尼亚州卡尔斯巴德生命科技公司的子公司)。例如，美国专利号6,266,459、6,355,431、6,770,441、6,859,570、6,210,891、6,258,568和6,274,320；美国专利申请公开号2009/0026082；2009/0127589；2010/0137143；2019/0177777；和2010/0282617；以及pct专利申请公开号wo00/063437和wo2016/162309中描述了珠阵列的示例，其全部内容通过引用纳入本文。[0876]在一些实施方式中，珠阵列包括多个珠。例如，珠阵列可以包括至少10000个珠(例如，至少100000个珠、至少1000000个珠、至少5000000个珠、至少10000000个珠)。在一些实施方式中，所述多个珠包括单一类型的珠(例如，在体积、形状和其他物理性质上基本均匀，例如半透明)。在一些实施方式中，所述多个珠包括两种或更多种类型的不同珠。[0877]可以通过将珠(例如，条码化的珠)以规则的图案或不规则的排列附接到基材来生成珠阵列。在一些实施方式中，条形码序列在将它们附接到基材之前是已知的。在一些实施方式中，条形码序列在将它们附接到基材之前是未知的。可以通过例如选择性地活化基材上的区域来将珠附接到基材上的选择性区域以使珠的附接。活化基材上的选择性区域可包括活化或降解选择性区域处的覆层(例如，如本文所述的可有条件移除的覆层)，其中覆层已施加在基材上，使得与所选区域之外的区域相比，选择区域更容易附接珠。使珠附接更容易的区域可以配置为仅适合一个珠或多个珠(例如，受限于孔尺寸或表面图案，例如制造技术)。结合到选定区域的珠可以在基材上形成二维阵列。基材可以均一或不均一地被覆有覆层。珠可以是本文所述的任何合适的珠，包括附接到一个或多个空间条形码的珠。珠可以根据适合于将珠连接到本文所述的基材的任何方法附接到所选区域，例如通过共价键、非共价键或化学接头。[0878]可以使用任何多种合适的图案化技术将珠附接到基材表面。在一些实施方式中，以非限制性方式，例如喷墨印刷、光学和光电细胞捕获、基于激光的图案化、声学图案化、介电泳或磁性技术的物理技术可用于图案化基材。或者，可以使用化学和/或物理化学技术，例如，以非限制性方式，表面化学方法、微接触印刷、微孔和过滤、duv图案化或与微接触印刷相结合的微流体装置中的图案化(参见，例如，martinez‑rivas，a.，用于生物医学应用的细胞微图案化和操作方法(methodsofmicropatterningandmanipulationofcellsforbiomedicalapplications)，micromachines(巴塞尔)8，(2017)，其通过引用方式纳入本文)。[0879]覆层可以是光反应性的，并且选择性地活化或降解覆层包括将覆层的选定区域暴露于光或辐射。选择性可以通过应用光掩模来实现。与未暴露于光的区域(例如，通过光掩模保护免受光的区域)相比，暴露于光的覆层区域可以变得更易于珠附接(例如，更多的粘合剂)。当施加到基材上时，珠因此优先附接到基材上更宽松的区域，并且可以任选地从基材上移除未附接的珠。可以调整光源和/或光掩模以允许基材上的更多位点变得更容易附接珠，从而允许在这些位点附接其它珠。或者，可以应用不同的光源或不同的光掩模。因此，光图案化过程允许珠附接在基材上的预定位置，从而产生珠阵列。[0880]珠可以迭代地附接，例如，可以一次附接一个珠子集，并且可以重复该过程以附接一个或多个其它珠子集。在一些实施方式中，活化点(例如，基材上的点)的尺寸小于珠的尺寸。例如，可以将珠附接到活化的基材(例如，点)，从而仅单个珠附接到活化的基材。在一些实施方式中，可以洗涤基材以移除未结合的珠。在一些实施方式中，基材可在第二位置被活化并且第二珠可附接到活化的基材表面。该过程可以反复进行以将珠附接到整个基材或其部分。或者，可以一步将珠全部附接到基材上。此外，将珠附接到基材的方法是本领域已知的。可以使用任何合适的方法，包括但不限于特定化学键、非特定化学键、接头、物理捕获珠(例如聚合物、水凝胶)或本文所述的任何方法。[0881]用于生成珠阵列的示例性工作流程可以包括：选择性地使被覆的基材上的第一组的一个或多个选定区域变得与选定区域之外的区域相比更容易附接珠，将多个珠施用于阵列，和允许珠附接到第一组的选定区域，任选地移除未附接的珠，使第二组的一个或多个选定区域与第二组的选定区域之外的区域相比更容易附接珠，施用多个珠，和允许珠附接到第二组选定区域，和任选地移除未附接的珠。该迭代过程可以进行任意次数以生成图案化的珠阵列。[0882]另一个示例性过程包括活化被覆的基材上的第一区域并将活化的第一区域暴露于多个条码化的珠，从而第一组的一个或多个珠结合到第一区域；和，活化被覆的基材上的第二区域并将活化的第二区域暴露于多个条码化的珠，从而第二组的一个或多个珠结合到第二区域，其中第一组的一个或多个珠包含基材表面的第一区域所独特的相同的第一寡核苷酸序列，并且第二组的一个或多个珠包含基材表面的第二区域所独特的相同的第二寡核苷酸序列，并且其中第一和第二寡核苷酸序列不同。可活化被覆基材上的其它区域并将其暴露于其它条码化的珠。每组条码化的珠可以包括不同于所有其它条码化的珠组并且对于活化区域的位置而言独特的寡核苷酸序列。此外，第一组的一个或多个珠和第二组的一个或多个珠可以不同。换言之，第一组的一个或多个珠和第二组的一个或多个珠可以具有不同的表面化学性质、不同的组成(例如，固体珠、凝胶珠、二氧化硅珠)(例如，纳米颗粒与微粒)，和/或物理体积。在一些实施方式中，第三组的一个或多个珠、第四组的一个或多个珠、第五组的一个或多个珠或更多可以具有不同的表面化学、不同的组成(例如，固体珠、凝胶珠、二氧化硅珠)(例如，纳米颗粒对微粒)和/或物理体积，可以附接到基材表面。该方法可以包括移除不与第一、第二和/或任何其它区域结合的珠。在一些实施方式中，移除珠包括将珠从基材表面上洗掉。可以在每轮或几轮区域(例如，基材表面上的第一、第二或附加区域)活化并将珠结合到活化区域之后进行移除。在一些情况下，每个珠都在单个位置结合到基材上。结合到第一、第二和其它区域的珠可以在基材上形成珠的二维阵列。[0883]光反应性覆层可包含多个光反应性分子，当暴露于特定波长或波长范围的光时，所述光反应性分子可发生化学反应(例如，水解、氧化、光解)。光反应性分子在暴露于光时会变得具有反应性，并且可以与其它分子发生反应并与其它分子形成化学键。[0884]覆层可包含聚合物，并且活化基材上的选定区域包括在相应区域处改性聚合物。改性聚合物包括例如通过将聚合物暴露于辐射或光来光化学改性聚合物。或者或另外，改性聚合物可包括通过使聚合物与一种或多种化学试剂接触来化学改性聚合物。在一些情况下，覆层是水凝胶。在一些情况下，覆层包含光反应性聚合物。示例性的光反应性聚合物包括基于聚(乙二醇)(peg)的聚合物、基于聚(l‑赖氨酸)(pll)的聚合物、包含peg和pll的官能化或未官能化单元的共聚物(例如，聚‑l‑赖氨酸‑接枝‑聚乙二醇(pll‑g‑peg))和甲基丙烯酸化明胶(gelma)聚合物。[0885]通过将珠选择性地交联到已施加到基材上的覆层，珠也可以附接到基材上的选择性区域。例如，可以将多个珠施加到具有可光交联覆层的基材上，并且在将珠的子集交联到覆层上时，可以移除未交联的珠，只留下交联的珠在基材上。该过程可以重复多次。覆层可包括可光交联的聚合物。示例性的可光交联聚合物描述于，例如，shirai，polymerjournal46：859‑865(2014)，ravve，《可光交联的聚合物》(photocrosslinkablepolymers)，合成聚合物的光相关反应(light‑associatedreactionsofsyntheticpolymers).施普林格出版社(springer)，纽约州纽约(2006)，和ferreira等.《用于生物医药应用的可光交联的聚合物》(photocrosslinkablepolymersforbiomedicalapplications)，生物医药工程——前端与挑战(biomedicalengineering‑frontiersandchallenges)，rezafazel教授(编)，isbn：978‑953‑307‑309‑5(2011)，其各自通过引用其全文的方式纳入本文。[0886]用于活化、降解或交联如本文所述的覆层的合适光源包括但不限于紫外(uv)光(例如，250‑350nm或350‑460nm的紫外光)和可见光(例如，广谱可见光)。数字微镜器件(dmd)也可用于提供光源。[0887]根据本文所述方法的第一对相邻选定区域之间的距离可以与第二对相邻选定区域相同或不同。[0888]可通过首先在基材上制备多个条码化的探针、在基材上沉积多个珠并使用基材上的探针作为模板生成附接到珠的探针来生成条码化的珠或包含多个条码化的探针的珠。[0889]大规模商业制造方法允许将数百万个寡核苷酸附接到阵列上。商用阵列包括来自rochenimblegen公司(威斯康星州)和affymetrix公司(赛默飞(thermofisherscientific))的阵列。[0890]在一些实施方式中，可根据wo2012/140224、wo2014/060483、wo2016/162309、wo2017/019456、wo2018/091676和wo2012/140224以及美国专利申请号2018/0245142中所述的方法来制备阵列。上述各文件的全部内容通过引用纳入本文。[0891]在一些实施方式中，当珠包埋在水凝胶层中时形成珠阵列，其中水凝胶聚合并固定相对珠位置。珠阵列可以预先平衡并与反应缓冲液和酶结合(例如，逆转录混合物)。在一些实施方式中，珠阵列可以在使用前长期(例如，数天)储存(例如，冷冻)。[0892](vi)柔性阵列[0893]“柔性阵列”包括附接到或嵌入到放置在生物样品上或靠近生物样品的柔性基材(例如，膜、水凝胶或胶带)中的多个空间条码化特征。在一些实施方式中，柔性阵列包括嵌入水凝胶内的多个空间条码化特征。[0894]柔性的阵列可以是高度模块化的。在一些实施方式中，空间条码化的特征(例如珠)可以加载到基材(例如载玻片)上以产生高密度自组装阵列。在一些实施方式中，特征(例如，珠)可以用流动池加载到基材上。在一些实施方式中，特征(例如，珠)被嵌入水凝胶(例如，放置在自组装特征顶部的水凝胶垫或层)中。在一些实施方式中，水凝胶可以聚合，从而固定水凝胶中的特征。在一些实施方式中，包含特征的水凝胶可从基材移除并用作柔性阵列。在一些实施方式中，柔性阵列可以通过光学测序或本文所述的任何其它方法去卷积(deconvolved)。在一些实施方式中，特征(例如，珠)的直径可以是约1μm至约25μm。在一些实施方式中，柔性阵列中约25μm直径的特征可以提供约1000dpi和约1兆像素的分辨率。在一些实施方式中，特征(例如，珠)的直径可为约13.2μm。在一些实施方式中，柔性阵列中约13.2μm的珠可提供约1920x1080的分辨率。[0895]根据本文所述的任何方法产生的柔性阵列(例如，嵌入水凝胶中的珠)可以包含不耐热聚合物。在一些实施方式中，具有不耐热珠的柔性阵列可以与生物样品接触。在一些实施方式中，可以识别生物样品中的感兴趣区域，从而可以使用红外激光来选择感兴趣区域。在一些实施方式中，红外激光可导致柔性阵列(例如，不耐热珠)变形并变得具有粘性。在一些实施方式中，柔性阵列的粘合剂部分可以粘附(例如，结合)至直接位于上方或下方的感兴趣区域(例如，细胞)。识别感兴趣区域、将红外激光施用于感兴趣区域并粘附下面的生物样品(例如，细胞)到柔性阵列的过程可以迭代重复。在一些实施方式中，柔性阵列可以被移除，从而也可以用柔性阵列仅移除来自一个或多个感兴趣区域的粘附的生物样品(例如，细胞)。在一些实施方式中，可根据本文所述的任何方法进一步处理(例如，扩增、定量和/或测序)柔性阵列和粘附的生物样品。[0896]柔性的阵列可以用反应缓冲液和功能浓度的酶(例如，逆转录混合物)进行预平衡。在一些实施方式中，柔性阵列可以储存较长时间(例如，数天)或冷冻直至准备使用。在一些实施方式中，生物样品(例如，组织切片)的透化可在与柔性阵列接触之前通过添加酶/洗涤剂来进行。在一些实施方式中，柔性阵列可以直接放置在样品上，或者放置成与样品间接接触(例如，在生物样品和柔性珠阵列之间具有中间层或物质)。在一些实施方式中，柔性阵列可以机械地施加(例如，向下按压或压缩在两个表面之间)在生物样品上以增强分析物捕获。在一些实施方式中，可将柔性阵列施用于生物样品的一侧。例如，可以在任何方向上切割(例如，切片)生物样品并且可以将柔性阵列施用于暴露的分析物。在一些实施方式中，柔性阵列可以是可溶解的(例如，通过热、化学或酶促破坏)。在一些实施方式中，一旦将柔性阵列施用于样品，分析物的逆转录和靶向捕获可以在微球体，或第一体积的珠和第二体积的珠，或本文所述的任何珠上进行。在一些实施方式中，一旦将柔性阵列施用于生物样品并允许捕获分析物，就可以从生物样品移除(例如剥离)柔性阵列，以供根据本文所述任何方法的进一步处理(例如，扩增、定量和/或测序)。[0897]柔性阵列还可以与本文所述的任何方法(例如，主动捕获方法，例如电泳)一起使用。例如，柔性阵列可以与导电基材(例如，氧化铟锡被覆的载玻片)上的生物样品接触，从而可以向导电基材施加电场，以促进分析物通过、穿过、内部或在柔性阵列方向上的迁移。另外和可选地，柔性阵列可以与电泳组件(例如，电泳室)中的生物样品接触，从而可以施加电场，以使分析物在柔性阵列的方向上或穿过、穿过或在柔性阵列内部迁移。[0898]在一些实施方式中，可在基材保持器(例如，任何阵列对准装置)的帮助下产生柔性阵列。例如，空间条码化珠阵列可以放置在基材支架的一个位置保持器(placeholder)中并且第二基材(例如，载玻片)可以放置在基材支架的第二位置保持器中。在一些实施方式中，阵列任选地被光学解码(opticallydecoded)并且凝胶预聚物溶液被引入空间条码化珠阵列和第二基材之间。在一些实施方式中，基材保持器被关闭，从而第二基材在空间条码化珠阵列的顶部(例如，在其上方，与其平行)。凝胶预聚物溶液可以通过本文所述的任何方法聚合并导致在水凝胶中交联的空间条码化特征，从而产生柔性阵列。在一些实施方式中，基材保持器可以是开放的，并且可以从基材保持器上移除具有水凝胶和空间条码化的交联特征的第二基材(柔性阵列可以任选地从第二基材移除)以用于通过本文所述的任何方法进行空间分析。[0899](vii)收缩水凝胶特征/阵列[0900]如本文所用，水凝胶的“收缩”或“减小尺寸”是指导致水凝胶物理收缩和/或水凝胶尺寸体积减小的任何过程。例如，凝胶支架可能会在溶剂移除后收缩或“内爆”(参见，例如long和williams.science.2018；362(6420)：1244‑1245，和oran等.science2018；362(6420)：1281‑1285；其各自通过引用其全文方式纳入本文)。作为另一个示例，收缩或减小水凝胶体积的过程可以是从水凝胶中移除水的过程(即，脱水过程)。有许多本领域技术人员已知的用于收缩或减小水凝胶体积的方法。收缩或减小水凝胶体积的方法的非限制性示例包括将水凝胶暴露于以下一种或多种：脱水溶剂、盐、加热、真空、冻干、干燥、过滤、风干或其组合。[0901]在一些实施方式中，水凝胶珠在附接到或嵌入水凝胶之前可以减小体积(例如，收缩的水凝胶珠)。在一些实施方式中，水凝胶珠在附接到或嵌入水凝胶之后可以减小体积(例如，收缩的水凝胶珠)。在一些实施方式中，一个或多个水凝胶珠可附接到或嵌入水凝胶中。在一些实施方式中，一个或多个水凝胶珠在附接到或嵌入水凝胶之前可减小体积(例如，一个或多个收缩的水凝胶珠)。在一些实施方式中，一个或多个水凝胶珠在附接到或嵌入水凝胶之后可减小体积(例如，一个或多个收缩的水凝胶珠)。在一些实施方式中，附接到或嵌入水凝胶中的一个或多个水凝胶珠的体积可以减小。例如，一个或多个水凝胶珠和水凝胶珠附接或嵌入的水凝胶的体积同时减少(例如，收缩的含水凝胶珠的水凝胶)。在一些实施方式中，附接到或嵌入水凝胶中的一个或多个水凝胶珠的体积可以等距减小。[0902]在一些实施方式中，附接到或嵌入水凝胶中的一个或多个水凝胶珠的体积可减少约3倍至约4倍。例如，可以通过移除或交换溶剂、盐或水(例如，脱水)来减小附接到或嵌入水凝胶中的一个或多个水凝胶珠的体积。在另一示例中，可通过控制温度或ph来减小附接于或嵌入水凝胶中的一个或多个水凝胶珠的体积。参见例如ahmed，e.m.j.ofadvancedresearch.2015年3月；6(2)：105‑121，其全部通过引用其全文的方式纳入本文。在一些实施方式中，可通过移除水来减小附接到或嵌入水凝胶中的一个或多个水凝胶珠的体积。[0903]在一些实施方式中，减少附接于或嵌入水凝胶中的一个或多个水凝胶珠的体积可增加样品的后续分析的空间分辨率。空间概况分析中增加的分辨率可以通过比较使用附接或嵌入水凝胶的一个或多个收缩水凝胶珠的样品的空间分析与附接或嵌入水凝胶的一个或多个非收缩水凝胶珠的样品的空间分析来确定。[0904]在一些实施方式中，水凝胶珠的体积没有减少。在一些实施方式中，水凝胶珠的体积可以减小(例如，收缩的水凝胶珠)。在一些实施方式中，收缩的水凝胶凝胶珠是稳定的。例如，可以通过从水凝胶珠中移除溶剂、盐或水(例如，脱水、干燥、干燥化、变干)以形成收缩的水凝胶珠来减小水凝胶珠的体积。在另一个示例中，水凝胶珠的体积可以通过控制温度或ph值来减少。参见例如ahmed，e.m.j.ofadvancedresearch.2015年3月；6(2)：105‑121，其全部通过引用其全文的方式纳入本文。可用于形成收缩水凝胶珠或收缩水凝胶珠阵列的溶剂的非限制性示例包括酮，例如甲乙酮(mek)、异丙醇(ipa)、丙酮、1‑丁醇、甲醇(meoh)、二甲亚砜(dmso)、甘油、丙二醇、乙二醇、乙醇、(k)1，4‑二噁烷、碳酸丙烯酯、糠醇、n，n‑二甲基甲酰胺(dmf)、乙腈、醛，例如甲醛或戊二醛，或其任何组合。[0905]在一些实施方式中，水凝胶珠或水凝胶珠阵列通过交联剂收缩或稳定。例如，交联剂可包括辛二酸二琥珀酰亚胺酯(dss)、二甲基琥珀酸酯(dms)、福尔马林和二甲基己二酰亚胺(dma)、二硫代‑双(‑琥珀酰亚胺丙酸酯)(dsp)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(dst)和乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(egs)。[0906]在一些实施方式中，水凝胶珠或水凝胶珠阵列用盐处理以形成收缩的水凝胶珠或收缩的水凝胶珠阵列。可用于形成收缩水凝胶珠或收缩水凝胶珠阵列的盐的非限制性示例是无机盐，包括铝盐、铵盐、钡盐、铍盐、钙盐、铯盐、锂盐、镁盐、钾盐、铷盐、钠盐和锶盐。无机盐的其他非限制性实例包括氯化钠、氯化钾、氯化锂、氯化铯、氟化钠、溴化钠、碘化钠、亚硝酸钠、硫酸钾、硝酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、硫酸钠、硝酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸钙、氯氧化铜、氯化钙、碳酸钙、碳酸氢钙、硫酸镁、硝酸镁、氯化镁、碳酸镁、碳酸氢镁、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸三钠、磷酸三钾、磷酸钙、硫酸铜(ii)、硫化钠、硫化钾、硫化钙、高锰酸钾、氯化铁(ii)、氯化铁(iii)、硫酸(2 )铁、硫酸铁(iii)、硝酸铁(ii)、硝酸铁(iii)、氯化锰(ii)、氯化锰(iii)、硫酸锰(ii)、硝酸锰(ii)、氯化锌、硝酸锌、硫酸锌、正钼酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镍(ii)、硝酸镍(ii)、偏钒酸钠、仲钒酸钠、重铬酸钾、重铬酸铵、安托霉素、亚硝酸铵、氟化钾、钠氟化物、氟化铵、氟化钙、铬明矾、钾明矾、碘化钾、次氯酸钠、硫酸锡(ii)、硝酸锡(ii)、亚硒酸金、铬酸二甲酯、高氯酸钾、高氯酸钙、硫酸铝、硫酸氢铅(ii)、磷酸钡、正磷酸氢钡、磷酸二氢钡、重铬酸银、溴酸钾、溴酸钠、碘酸钠、硅酸钠、磷酸二铵、磷酸铵、磷酸二氢铵、正磷酸铬、氯化铜(ii)、氯化铜(i)、四偏磷酸钠、七氟铌酸钾、磷酸锌、亚硫酸钠、硝酸铜(i)、硝酸铜(ii)、硅酸钾、碱式碳酸铜(ii)、丙烯酸碳酸铜(ii)盐和磺丙基丙烯酸盐。[0907]在一些实施方式中，水的移除包括酸。酸的非限制性示例包括：hcl、hi、hbr、hclo4、hclo3、hno3、h2so4、磷酸、亚磷酸、乙酸、草酸、抗坏血酸、碳酸、亚硫酸、酒石酸、柠檬酸、丙二酸、邻苯二甲酸、巴比妥酸、肉桂酸、戊二酸、己酸、苹果酸、叶酸、丙酸、硬脂酸、三氟乙酸、乙酰水杨酸、谷氨酸、壬二酸、二苯甲酸、富马酸、葡糖酸、乳酸、油酸、丙炔酸、蔷薇酸、单宁酸、尿酸、没食子酸，及其两种或更多种的组合。在一些实施方式中，水凝胶暴露于不同的ph环境。例如，水凝胶可以暴露于酸性ph值或碱性ph值。在一些实施方式中，水凝胶暴露于小于约6.5的ph，例如约6、约5.5、约5、约4.5、约4、约3.5、约3、约2.5、约2、约1.5或约1的ph。在一些实施方式中，水凝胶暴露于大于约7.5的ph，例如约8、约8.5、约9、约9.5、约10、约10.5、约11、约11.5、约12、约12.5、约13、约13.5或约14的ph。[0908]在一些实施方式中，水的移除包括脱水过程，例如加热、真空、冻干、干燥、过滤和风干。在一些实施方式中，水凝胶珠或水凝胶珠阵列经历ph变化以形成收缩水凝胶珠或收缩水凝胶珠阵列(例如，从约ph7变化至约phs，从约ph7变化至约ph5.5，约ph7至约ph6、约ph7至约ph6.5、约ph6.5至约ph5、约ph6至约ph5、约ph6至约ph5.5或包含在这些范围内的任何ph变化)。[0909]在一些实施方式中，水凝胶珠或水凝胶珠阵列经历温度变化(例如，从约37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃到约50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃或更高，或包含在这些范围内的任何温度变化)以形成收缩的水凝胶珠或收缩的水凝胶珠阵列。[0910]在一些实施方式中，水凝胶珠的线性尺寸的尺寸可减小约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或其中任何间隔。在一些实施方式中，水凝胶珠的体积可减小约1倍、约5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍、约50倍、约55倍、约60倍、约65倍、约70倍、约75倍、约80倍或其中任何间隔。在一些实施方式中，水凝胶珠的尺寸可以减小，使得水凝胶珠的平均直径为约1μm至约15μm。[0911]在一些实施方式中，多个水凝胶珠的线性尺寸的尺寸可减小约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或其中任何间隔。在一些实施方式中，多个水凝胶珠的尺寸可以减小，使得水凝胶珠的平均直径为约1μm至约15μm。在一些实施方式中，多个水凝胶珠的体积可减小约1倍、约5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍、约50倍、约55倍、约60倍、约65倍、约70倍、约75倍、约80倍或其中任何间隔。[0912]在一些实施方式中，多个水凝胶珠的体积可以减小，使得水凝胶珠的平均直径为约1μm至约15μm。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约15μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约14μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约13μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约12μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约11μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约10μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约9μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约8μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约7μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约6μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约5μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约4μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约3μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约2μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约1μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约14‑15μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约13‑15μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约12‑15μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约11‑15μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约10‑15μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约9‑15μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约8‑15μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约7‑15μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约6‑15μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约1‑10μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约1‑5μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约1‑3μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约13‑14μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约12‑14μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约11‑14μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约10‑14μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约9‑14μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约8‑14μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约7‑14μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约6‑14μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约5‑14μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约12‑13μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约11‑13μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约10‑13μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约9‑13μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约8‑13μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约7‑13μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约6‑13μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约5‑13μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约11‑12μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约10‑12μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约9‑12μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约8‑12μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约7‑12μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约6‑12μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约5‑12μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约10‑11μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约9‑11μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约8‑11μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约7‑11μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约6‑11μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约5‑11μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约9‑10μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约8‑10μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约7‑10μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约6‑10μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约5‑10μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约8‑9μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约7‑9μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约6‑9μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约5‑9μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约7‑8μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约6‑8μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约5‑8μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约6‑7μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约5‑7μm的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约5‑6μm的平均直径。[0913]在一些实施方式中，一个或多个水凝胶珠的体积可同时减小。在一些实施方式中，一个或多个水凝胶珠的体积可不同时减小。在一些实施方式中，一个或多个水凝胶珠可以在减小一个或多个水凝胶珠的体积之前组装成阵列。在一些实施方式中，一个或多个水凝胶珠可以在减小一个或多个水凝胶珠的体积之后组装成阵列。在一些实施方式中，一个或多个收缩的水凝胶珠可以可逆地附接到基材上。在一些实施方式中，一个或多个收缩的水凝胶珠可以不可逆地附接到基材上。在一些实施方式中，可以再扩展一个或多个收缩的水凝胶珠。在一些实施方式中，可以等距地再扩展一个或多个收缩的水凝胶珠。在一些实施方式中，一个或多个收缩的水凝胶珠可以主要在z维度上再扩展。在一些实施方式中，(例如，可逆地或不可逆地)附接到基材的一个或多个收缩的水凝胶珠可以主要在z维度上再扩展。在一些实施方式中，(例如，可逆地或不可逆地)附接到基材的一个或多个收缩的水凝胶珠可以主要在z维度上等距地再扩展。[0914]在一些实施方式中，减小水凝胶珠(例如，收缩的水凝胶珠)的体积可以增加样品的后续分析的空间分辨率。通过比较使用收缩的水凝胶珠和非收缩的水凝胶珠对样品进行的空间分析，可以确定空间分析中增加的分辨率。例如，在一些实施方式中，样品的后续分析可以包括本文公开的任何基于阵列的空间分析方法。[0915]在一些实施方式中，可以改变水凝胶珠的一种或多种物理参数或尺寸和/或一种或多种其它特性。例如，水凝胶珠的截面可以从第一截面变为第二截面。第一截面可以小于或大于第二截面。或者或另外，可以改变水凝胶珠的一个或多个其它特性。例如，水凝胶珠或其一种或多种组分的流动性、密度、刚度、孔隙率、折射率、极性和/或其它特性可以改变。在一个非限制性示例中，水凝胶珠包括水凝胶。在另一个示例中，水凝胶珠水凝胶可在珠内形成交联。相同或不同的条件可用于同时或不同时间改变或影响水凝胶珠的不同特性。在一些情况下，第一条件或条件组可用于改变水凝胶珠的第一特性或特性组(例如截面)，并且第二条件或条件组可用于改变水凝胶珠的第二特性或特性组。可以在与第二条件或条件组相同或不同的时间应用第一条件或条件组。例如，可以在第一条件或条件组下改变第一特性或特性组，之后可以在第二条件或条件组下改变第二特性或特性组。[0916]水凝胶珠的特性或特性组可以通过一个或多个条件改变。适合改变水凝胶珠的特性或特性组的条件可以是例如温度、ph、离子或盐浓度、压力、化学物质、它们的任意组合或其它条件。例如，水凝胶珠可暴露于能导致水凝胶珠的一种或多种特性发生变化的化学物质。在某些情况下，可以利用刺激来改变水凝胶珠的一种或多种特性。例如，在施加刺激时，水凝胶珠的一种或多种特性可以改变。刺激可以是例如热刺激、光刺激、化学刺激或其它刺激。足以改变水凝胶珠的一种或多种特性的温度可以是例如至少约0摄氏度(℃)、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、10℃或更高。例如，温度可以是约4℃。在其它情况下，足以改变水凝胶珠的一种或多种特性的温度可以是例如至少约25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃或更高。例如，温度可以是约37℃。足以改变水凝胶珠的一种或多种特性的ph值可以是例如约5至8，例如约6至7。[0917]在一些情况下，化学物质或化学刺激可用于改变水凝胶珠的一种或多种特性。例如，化学物质或化学刺激可用于改变水凝胶珠的尺寸(例如，截面、直径或体积)。在一些情况下，化学物质或化学刺激可用于将水凝胶珠的尺寸(例如，截面直径)从第一尺寸改变为第二尺寸(例如，第二截面直径)，其中第二尺寸与第一尺寸相比有所减小。化学物质可包括有机溶剂，例如醇、酮或醛。例如，化学物质可以包括丙酮、甲醇、乙醇、甲醛或戊二醛。化学物质可包括交联剂。例如，交联剂可包括辛二酸二琥珀酰亚胺酯(dss)、二甲基琥珀酸酯(dms)、福尔马林和二甲基己二酰亚胺(dma)、二硫代‑双(‑琥珀酰亚胺丙酸酯)(dsp)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(dst)和乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(egs)，及其任何组合。在一些情况下，交联剂可以是光可裂解交联剂。在一些情况下，化学刺激可用于改变水凝胶珠的一种或多种特性(例如，水凝胶珠的尺寸)，其中化学刺激包括一种或多种化学物质。例如，化学刺激可以包括第一化学物质和第二化学物质，其中第一化学物质是有机溶剂并且第二化学物质是交联剂。在某些情况下，化学刺激可以包括作为能够固定或保存水凝胶珠的固定剂的化学物质。例如，有机溶剂例如醇(例如乙醇或甲醇)、酮(例如丙酮)或醛(例如甲醛或戊二醛)或其任何组合可作为固定剂。或者或另外，交联剂可作为固定剂。在一些情况下，固定剂可包含辛二酸二琥珀酰亚胺酯(dss)、二甲基琥珀酸酯(dms)、福尔马林和二甲基己二酰亚胺(dma)、二硫代双(‑琥珀酰亚胺丙酸酯)(dsp)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(dst)和/或乙烯乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)(egs)及其任何组合。在某些情况下，可以将第一化学物质和/或固定剂提供给水凝胶珠或使其与水凝胶珠接触以引起水凝胶珠的第一特性或特性组的变化，并且可将第二化学物质和/或固定剂提供给水凝胶珠或使其与水凝胶珠接触以引起水凝胶珠的第二特性或特性组的变化。例如，可以将第一化学物质和/或固定剂提供给水凝胶珠或使其与水凝胶珠接触以引起水凝胶珠的尺寸变化(例如，截面直径的减小)，并且可以将第二化学物质和/或固定剂提供给水凝胶珠或使其与水凝胶珠接触以因其水凝胶珠的第二特性或特性组的变化(例如，在水凝胶珠内部和/或周围形成交联)。第一和第二化学物质和/或固定剂可在相同或不同时间提供给水凝胶珠或使之与水凝胶珠接触。[0918]在一些实施方式中，固定可影响水凝胶珠的一个或多个参数或特性。例如，固定可能导致水凝胶珠的收缩或体积减少。固定可以包括水凝胶珠的脱水。向水凝胶珠提供固定剂可导致水凝胶珠的尺寸发生变化。例如，向水凝胶珠提供固定剂可能导致水凝胶珠的体积或直径发生变化。向水凝胶珠提供固定剂可导致水凝胶珠的截面(例如，截面直径)的变化。例如，固定前水凝胶珠的第一截面可以不同于(例如，更大于)固定后水凝胶珠的第二截面。在一个示例中，近似球形的水凝胶珠在固定之前可以包括第一截面(例如，截面直径)，其在固定之后尺寸减小到第二截面。向水凝胶珠提供固定剂可导致与第一截面相比减小至少约5％的第二截面。在一些情况下，第二截面可相对于第一截面减小至少6％、8％、10％、15％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。例如，第二截面可相对于第一截面减小至少约10％、15％、25％或50％。固定也可能影响水凝胶珠的其它特性。例如，固定可导致水凝胶珠的膜或壁的孔隙率发生变化，水凝胶珠的组分重组，水凝胶珠流动性或刚性的变化，或其它变化。在一个示例中，向水凝胶珠提供有机溶剂形式的第一固定剂以改变第一特性(例如，水凝胶珠体积)并且向水凝胶珠提供交联剂形式的第二固定剂以改变第二个特性(例如，水凝胶珠的流动性或刚性)。第一固定剂可以在第二固定剂之前提供给水凝胶珠。[0919]在一些情况下，近似球形的水凝胶珠可在固定(例如，通过有机溶剂固定)之前包括第一直径，其在固定之后，当维持在非水性环境中时，与第二直径相比体积减小。在固定和体积减小至所述第二直径之后，当维持在水性环境中时，水凝胶珠的体积可增加至具有与第一直径基本相似的直径。在一些情况下，近似球形的水凝胶珠在固定(例如，通过有机溶剂固定)之前可以包括与固定之后的第二直径相比体积减小的第一直径。在固定和体积减小至所述第二直径之后，水凝胶珠可以通过第二固定剂交联，其中第二直径在第二固定剂交联后于水性环境中基本维持。[0920]水凝胶珠的特性或特性组的变化可以是可逆的或不可逆的。在某些情况下，水凝胶珠的特性或特性组的变化可能是不可逆的，从而使该变化无法轻易撤消。例如，水凝胶珠的体积、形态或其它特征可能以无法轻易逆转的方式改变。在一个示例中，从水凝胶珠的第一截面到水凝胶珠的第二截面的变化是不可逆的。在某些情况下，在应用适当的条件和/或经过一段时间后，不可逆的变化可能至少部分被逆转。在其它情况下，水凝胶珠的特性或特性组的变化可能是可逆的。例如，在经受第一条件或条件组时，水凝胶珠的体积可以减小，并且在经受第二条件或条件组时，水凝胶珠的体积可以增加到约原始体积。因此，从水凝胶珠的第一截面到第二截面的变化可以是可逆的。可逆变化(例如，可逆体积减小)可用于例如将给定体积的水凝胶珠提供至给定位置，例如分区。在一些情况下，水凝胶珠的特性或特性组的变化可能只是部分可逆的。例如，可以减少水凝胶珠的体积(例如，通过脱水)，并且水凝胶珠体积的减少可能伴随着水凝胶珠内组分的重组。在水凝胶珠的体积逆转时(例如，通过再水合)，一种或多种组分的排列可能不会恢复到体积减小之前水凝胶珠的原始排列。水凝胶珠的特征或特征组(例如水凝胶珠的截面)的变化，在施加刺激时是可逆的。刺激可以是例如热刺激、光刺激或化学刺激。在一些情况下，刺激可以包括ph的变化和/或还原剂例如二硫苏糖醇的应用。刺激的施加可以完全或部分逆转从例如第一截面到第二截面的变化。[0921]在一些实施方式中，多个水凝胶珠可以是通过从多个第一水凝胶珠移除水而产生的收缩的水凝胶珠。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的平均直径不大于约15微米。例如，多个收缩的水凝胶珠的平均直径不大于约15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1微米。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的每个成员具有不大于约15微米的直径。例如，多个收缩的水凝胶珠的每个成员的直径可以不大于约15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1微米。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的平均直径不大于10微米。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的每个成员具有不大于10微米的直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的平均直径不大于5微米。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的每个成员具有不大于5微米的直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的平均直径不大于1微米。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的每个成员具有不大于1微米的直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的平均直径不大于细胞(例如，哺乳动物细胞、植物细胞或真菌细胞)的直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的每个成员的直径不大于细胞(例如，哺乳动物细胞、植物细胞或真菌细胞)的直径。[0922]在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有小于约25％的多分散指数。例如，多个收缩的水凝胶珠可具有小于约25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的多分散指数。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有小于15％的多分散指数。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约8至约13微米的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠具有约10至约12微米的平均直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的平均直径约为细胞(例如，哺乳动物细胞、植物细胞或真菌细胞)的直径。在一些实施方式中，多个收缩的水凝胶珠的平均直径小于细胞(例如，哺乳动物细胞、植物细胞或真菌细胞)的直径。在一些实施方式中，多个收缩的凝胶珠上的多个捕获探针以单细胞分辨率结合细胞分析物。在一些实施方式中，多个收缩的凝胶珠上的多个捕获探针以高于单细胞分辨率(例如，以比细胞直径更高的密度的分辨率)结合细胞分析物。[0923]在一些实施方式中，具有布置在基材上的多个水凝胶珠的珠阵列通过较大凝胶珠的自组装或图案化产生，之后较大凝胶珠的阵列收缩(例如，通过本文所提供的多种方法中的任一种)。在一些实施方式中，较大的凝胶珠对于单细胞分辨率而言不够小，而收缩的凝胶珠对于单细胞分辨率而言足够小。在一些实施方式中，具有布置在基材上的多个水凝胶珠的珠阵列通过使先前通过收缩较大凝胶珠(例如，通过本文提供的多种方法中的任一种)产生的收缩的凝胶珠自组装或图案化而产生。珠可以通过多种方法中的任何一种进行空间上的限制，包括但不限于可逆或不可逆交联。[0924]在一些实施方式中，珠阵列包括具有高纵横比的空间限制的凝胶珠(例如，柱状阵列)。例如，可以通过本文所述的多种方法中的任一种来产生具有布置在基材上的多个水凝胶珠的珠阵列(例如，通过收缩凝胶珠的自组装或图案化或通过较大凝胶的自组装或图案化珠然后收缩)，然后扩展(或重新扩展)高密度珠阵列。扩展时，空间限制会引导珠主要在z维度(远离基材)扩展，从而形成柱状阵列。在一些实施方式中，柱状阵列的凝胶珠具有高纵横比。在一些实施方式中，扩展的多个空间受限的收缩水凝胶珠的纵横比为至少2。在其它实施方式中，扩展的多个空间受限的收缩水凝胶珠的纵横比为至少3。在一些实施方式中，多个空间限制的收缩的水凝胶珠的纵横比为至少4、5、6、7、8或更大。[0925]在一些实施方式中，从水凝胶移除水的方法对于每个水凝胶(例如，第一水凝胶、第二水凝胶或第三水凝胶)是相同的。在一些实施方式中，从一种水凝胶(例如，第一水凝胶)移除水的方法不同于用于至少一种其它水凝胶(例如，第二水凝胶、第三水凝胶或第四水凝胶)移除水的方法。例如，从一种水凝胶移除水的方法可以不同于用于其它水凝胶(例如，第二水凝胶、第三水凝胶或第四水凝胶)的移除水的方法。在一些实施方式中，用于移除水的方法对于每个水凝胶(例如，第一水凝胶、第二水凝胶、第三水凝胶和第四水凝胶)而言是不同的。[0926]在一些实施方式中，收缩的水凝胶在线性维度上(例如，沿一个轴)比收缩前的水凝胶小至少约2倍。例如，在线性维度上比收缩前的水凝胶小至少约2.5、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10或更多倍。[0927]在一些实施方式中，水凝胶的尺寸沿多于一个轴减小，例如沿2或3个轴。在一些实施方式中，各轴以90度与其它轴相交。在一些实施方式中，水凝胶沿第一轴的尺寸比收缩前的水凝胶小约2至约10倍或更多倍，例如比收缩前的水凝胶小约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10倍或更多倍。在一些实施方式中，水凝胶沿第二轴的尺寸比收缩前的水凝胶小约2至约10倍或更多倍，例如比收缩前的水凝胶小约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10倍或更多倍。在一些实施方式中，水凝胶沿第三轴的尺寸比收缩前的水凝胶小约2至约10倍或更多倍，例如比收缩前的水凝胶小约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10倍或更多倍。在一些实施方式中，水凝胶体积的减小是等距的。[0928]在一些实施方式中，每个水凝胶(例如，第一水凝胶、第二水凝胶、第三水凝胶或第四水凝胶)的体积是相同的。在一些实施方式中，至少一种水凝胶的体积不同。例如，在一些实施方式中，一种水凝胶的体积不同于其它水凝胶(例如，第二水凝胶、第三水凝胶或第四水凝胶)。在一些实施方式中，每个水凝胶在体积上与每个其它水凝胶不同。[0929]在一些实施方式中，多个特征的成员与水凝胶(例如，第一水凝胶、第二水凝胶、第三水凝胶或第四水凝胶)交联。[0930]在一个实施方式中，可以将阵列的特征复制到水凝胶中，并且通过移除水来减小水凝胶的体积。这些步骤可以进行多次。例如，制备高密度空间条码化柔性阵列的方法可以包括：将多个空间条码化特征从阵列复制到第一水凝胶中，其中第一水凝胶与阵列接触；通过移除水来减小包括复制的特征的第一水凝胶的体积，形成包括复制的特征的第一收缩水凝胶；将第一收缩的水凝胶中的特征复制到第二水凝胶中，其中第二水凝胶与第一水凝胶接触；和，通过移除水来减小包含复制的特征的第二水凝胶的体积，形成包含复制的特征的第二收缩水凝胶，从而生成高密度空间条码化阵列。将空间条码化特征从阵列复制到第一水凝胶、从第一水凝胶移除水以形成第一收缩水凝胶以及将空间条码化特征从第一收缩水凝胶复制到一个或多个后续水凝胶的过程可以进行多次(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10次)。结果产生包括空间条码化特征的高密度柔性阵列。[0931]在一些实施方式中，从阵列复制多个特征的成员包括通过pcr复制。在一些实施方式中，水凝胶(例如，第一水凝胶、第二水凝胶、第三水凝胶和/或第四水凝胶)包含如本文所述的pcr试剂。在一些实施方式中，使用复制镀覆技术复制多个特征的成员(参见，例如mitra和church，nucleicacidsres.1999年12月15日；27(24)：e34，其通过引用其全文方式纳入本文)。在一些实施方式中，在将多个特征从阵列复制到第一水凝胶中之后，阵列的特征在第一水凝胶中被扩增(例如，克隆扩增)。在一些实施方式中，多个特征的成员被复制到第一水凝胶中，从而使第一水凝胶的多个特征的图案与该阵列的多个特征的图案相同或基本相似(例如，至少80％)。[0932]在一些实施方式中，阵列的一个或多个多个特征被分区。例如，每个分区可以包括与其它分区的多个特征不同的多个特征。例如，多个特征的成员以相似的方式被划分至阵列的多个特征的分区。在一些实施方式中，阵列的特征被复制到第一水凝胶中，使得收缩前的第一水凝胶特征的体积或直径类似于阵列特征的体积或直径。[0933]在一些实施方式中，包括复制的特征的水凝胶的体积减小，从而增加复制的特征的密度。在一些实施方式中，水凝胶内的复制的特征的密度随着每个后续水凝胶复制和收缩而进一步增加。例如，第二收缩的水凝胶的复制的特征的密度高于第一收缩的水凝胶的复制的特征的密度。类似地，第三收缩的水凝胶的复制的特征的密度高于第二收缩的水凝胶的复制的特征的密度。类似地，第四收缩的水凝胶的复制的特征的密度高于第三收缩的水凝胶的复制的特征的密度。在一些实施方式中，当水凝胶的体积减小时，水凝胶中的多个特征的成员的分区的体积减小。[0934]在本文所述方法的一些实施方式中，阵列包含收缩的凝胶特征(例如珠)。在一些实施方式中，本文所述的方法产生收缩的凝胶珠阵列。在一些实施方式中，阵列的收缩凝胶珠是收缩的水凝胶珠。[0935]“收缩的阵列”包括附接到或嵌入在体积已经减小(例如，直径或体积减小)的基材中的多个空间条码化特征。生物样品可以与收缩的阵列接触并进一步与能够使收缩的阵列再水合的溶液接触。在一些实施方式中，分析物转移和捕获由分子扩散驱动。通过向样品提供透化溶液或组织染色剂使收缩的阵列再水合的过程可以促进生物样品中存在的分析物(例如，转录物)朝向空间条码化特征，由此提高分析物的捕获效率。参见例如，j.vlassakis，a.e.herr.“聚合物水合状态对凝胶内免疫测定的作用(effectofpolymerhydrationstateonin‑gelimmunoassays).”anal.chem.2015，87(21)：11030‑8，通过引用其全文方式纳入本文。[0936]可以使用包含来自现有阵列的空间条形码的特征(例如，珠)生成收缩的阵列。例如，通过本文任何方法描述和制备的阵列(例如，水凝胶珠阵列)可以与能够使特征(例如，珠)脱水(例如，移除水)的试剂接触以产生收缩的阵列(例如，收缩的阵列)。使特征(例如，珠)脱水的方法是本领域已知的。可以使用任何合适的脱水方法(例如，移除水)。例如，以非限制性的方式，特征(例如珠)可以通过酮脱水，例如甲乙酮(mek)、异丙醇(ipa)、丙酮、1‑丁醇、甲醇(meoh)、二甲亚砜(dmso)、甘油、丙二醇、乙二醇、乙醇、(k)1，4‑二噁烷、碳酸亚丙酯、糠醇、n，n‑二甲基甲酰胺(dmf)、乙腈、醛，例如甲醛或戊二醛，或它们的任何组合。其它脱水剂包括各种盐，包括无机盐(参见，例如ahmed，e.m.，水凝胶：制备、表征和应用：综述(hydrogel：preparation，characterization，andapplications：areview)，journalofadvancedresearch，6(2)105‑121(2015)，其通过引用其全文方式纳入本文)。[0937]在一些实施方式中，脱水特征(例如，珠)可以产生收缩的阵列(例如，收缩珠阵列或收缩水凝胶阵列)，其中脱水特征(例如，珠)的平均直径可以小于脱水前的特征的平均直径。在一些实施方式中，脱水特征(例如，珠)的平均直径可以比脱水前特征的平均直径小至少两倍。在一些实施方式中，脱水特征(例如，珠)的平均直径可以比脱水前特征的平均直径小至少三倍。在一些实施方式中，脱水特征(例如，珠)的平均直径可以比脱水前特征(例如，珠)的平均直径小至少四倍或更多。[0938]在产生收缩阵列之后，生物样品(例如，组织样品)可以与收缩阵列(例如，收缩珠阵列)接触。可以通过任何合适的方法(例如，通过移液)向生物样品和收缩的阵列提供再水合溶液。再水合溶液可以包含再水合(例如，水或缓冲液)收缩阵列的特征(例如，珠)的试剂。在一些实施方式中，再水合溶液可施用于整个生物样品。在一些实施方式中，可以选择性地施加再水合溶液(例如，施加到感兴趣的区域)。在一些实施方式中，从再水合溶液吸收水可以增加收缩阵列中至少一个特征(例如，珠)的直径。在一些实施方式中，再水合溶液可以将至少一个特征(例如，珠)的直径增加至少两倍。在一些实施方式中，再水合溶液可以将至少一个特征(例如，珠)的直径增加至少三倍。在一些实施方式中，再水合溶液可以将至少一个特征(例如，珠)的直径增加至少四倍。在一些实施方式中，再水合溶液可以将至少一个特征(例如，珠)的直径增加至少五倍或更多。[0939]在一些实施方式中，再水合溶液可包含透化试剂。可以使用本领域已知的或本文中以其它方式描述的透化试剂和技术来透化生物样品。来自不同来源(例如，脑、肝、卵巢、肾、乳房、结肠等)的生物样品可能需要不同的透化处理。例如，透化生物样品(例如，使用蛋白酶)可以促进分析物迁移到基材表面(例如，空间条码化特征)。在一些实施方式中，透化试剂可以是去污剂(例如皂苷、tritonx‑100tm、tween‑20tm)。在一些实施方式中，有机溶剂(例如，甲醇、丙酮)可透化生物样品的细胞。在一些实施方式中，酶(例如，胰蛋白酶)可以透化生物样品。在另一个实施方式中，酶(例如，胶原酶)可以透化生物样品。[0940]在一些实施方式中，该溶液可以使生物样品透化并使收缩阵列(例如，收缩水凝胶)的特征(例如，珠)再水合。在一些实施方式中，再水合溶液可以染色生物样品并且再水合收缩阵列的特征(例如，珠)。[0941]在一些实施方式中，再水合溶液(例如，透化或染色溶液)可以扩散通过生物样品。在一些实施方式中，再水合溶液可以减少分析物从基材扩散开。在一些实施方式中，当扩散通过生物样品时，再水合溶液可以将分析物迁移到基材表面并提高分析物捕获的效率。[0942](viii)微毛细管阵列[0943]“微毛细管阵列”是由微毛细管划分的一系列阵列特征。“微毛细管通道”是由微毛细管建立的个体分区。例如，微毛细管通道可以与其它微毛细管通道流体隔离，从而使阵列中一个微毛细管通道中的流体或其它内容物与阵列中相邻微毛细管通道中的流体或其它内容物分离。微毛细管通道的密度和顺序可以是任何合适的离散位点的密度或顺序。[0944]在一些实施方式中，处理微毛细管阵列以产生有助于加载的条件。一个例子是使用电晕棒(bd‑20ac，电子技术产品公司(electrotechnicproducts))以产生亲水表面。在一些实施方式中，特征(例如，附有捕获探针的珠)被加载到微毛细管阵列上，从而使特征在阵列内的准确位置是已知的。例如，可以将包含空间条形码的捕获探针置于微毛细管通道中，以便空间条形码能够识别出条码化核酸分子的来源位置。[0945]在一些实施方式中，当使用随机分布来分布特征时，可以进行经验测试以生成有助于每个微毛细管的单个特征的加载/分布条件。在一些实施方式中，可能需要实现每个微毛细管通道仅促进单个特征(例如，珠)的分布条件。在一些实施方式中，可能需要通过使特征流过微毛细管通道来实现促进每个微毛细管通道多于一个特征(例如，珠)的分布条件。[0946]在一些实施方式中，将微毛细管阵列放置在与样品接触的位置(例如，在顶部或下方)，使得包含特征的微毛细管(例如，可以包括捕获探针的珠)与生物样品接触。在一些实施方式中，将生物样品放置在微毛细管阵列的暴露侧上并且施加机械加压，将生物样品移动到微毛细管通道中以创建包含生物样品的流体隔离反应室。[0947]在一些实施方式中，通过将微毛细管阵列接触生物样品来划分生物样品，从而创建包括珠和生物样品的部分的微毛细管通道。在一些实施方式中，包含在微毛细管通道中的生物样品的部分是一个或多个细胞。在一些实施方式中，在一个或多个细胞被添加至微毛细管阵列之后，通过流动将特征引入微毛细管阵列。[0948]在一些实施方式中，将试剂添加到微毛细管阵列。试剂可以包括用于进行核酸扩增的酶试剂或试剂混合物。在一些实施方式中，试剂包括逆转录酶、连接酶、一种或多种核苷酸或其任何组合。在将试剂添加到微毛细管通道之后，例如通过使用硅油、矿物油、无孔材料或盖体，可以密封一个或多个微毛细管通道。[0949]在一些实施方式中，在孵育一定时间和一定温度或温度范围后(例如，在杂交或扩增反应后)，从每个微毛细管通道移出试剂溶液。试剂溶液可以单独处理用于测序，也可以混合用于测序分析。[0950](ix)水凝胶/孔阵列[0951]在一些实施方式中是使用孔(例如，纳米孔或微孔阵列)产生图案化水凝胶阵列的方法。在一些实施方式中，孔是三维结构。在一些实施方式中，孔的俯视图是任何合适的二维形状，当沿着z轴延伸时，其产生能够包含一个或多个特征(例如，珠)和/或试剂的三维结构。可以形成阵列的孔的非限制性示例包括三棱柱、正方形或矩形棱柱、五棱柱、六棱柱、七棱柱、八角棱柱、n边棱柱或圆柱阵列(例如，“微毛细管阵列”)。在一些实施方式中，孔阵列的孔与相邻孔共享至少一个孔壁(或孔壁的部分，如果是微毛细管阵列)。在一些实施方式中，一个孔不与阵列的另一个孔共享任何壁或壁的部分。在一些实施方式中，孔阵列附接到基材，从而使孔阵列的孔彼此流体隔离。在一些实施方式中，孔阵列的一端是开放的(例如，暴露的)，其中开放端可用于将特征或试剂分配到孔中。[0952]在一些实施方式中，该方法包括向孔阵列提供收缩的(例如，脱水的)水凝胶特征(例如，珠)。水凝胶特征可以通过本文所述的多种方法中的任一种脱水(例如，移除水)。可以提供本文他处描述的特征，从而使特征的数量小于阵列的孔的数量，可以提供特征，从而使特征的数量等于阵列的孔的数量，或者可以提供特征，其数量超过阵列的孔的数量。在一些实施方式中，孔阵列被操纵，从而使一个或多个收缩的水凝胶特征从阵列的顶面向下移动到孔中。例如，可以将孔阵列放置在振动器上一段时间，以使特征分布到孔中。可导致收缩的水凝胶特征进入孔的操作的其它非限制性示例是：物理摇动、倾斜或滚动孔阵列，或其组合；使用鼓风将特征吹入孔中，使用磁体拉下包含磁性颗粒的水凝胶特征，使用微流体系统将特征分布到孔中，使用打印机将特征沉积到孔中，或任何其它方法将特征分布到孔中。在一些实施方式中，一旦孔包含特征，则该孔就不能接受或保留另一特征。在其它实施方式中，孔可以包含多于一个特征。[0953]在一些实施方式中，该方法包括使收缩的水凝胶特征再水合(例如，加水)，其中收缩的水凝胶特征位于孔中。使收缩的水凝胶特征再水合可以通过本文所述的任何方法来实现。使孔中收缩的水凝胶特征再水合会导致收缩的水凝胶特征扩展。在一些实施方式中，收缩的水凝胶特征扩展以填充孔。在一些实施方式中，收缩的水凝胶特征在z方向上扩展，从而使该特征从孔的未封闭(即开口)端扩展出来。再水合特征的暴露区域可以产生图案化的水凝胶阵列(例如，孔阵列)。孔内包含的再水合特征可以是稳定的。在一些实施方式中，再水合特征(例如，再水合的收缩的水凝胶特征)固定在孔内，从而常规的阵列使用不会将再水合特征与孔分离。根据本文所述的方法，图案化的水凝胶阵列可用于分析物捕获。[0954](x)珠拴系[0955]“珠拴系(beadtethering)”可以指珠的排列，其中该排列可以或可以不形成阵列。拴系的珠可以与样品接触并根据本文所述的方法进行处理。此外，将生物样品与单个珠或以各种排列拴系在一起的珠接触可以允许更精确的分析物空间检测，例如感兴趣的区域。将珠拴系在一起的方法是本领域已知的。将珠拴系在一起的一些合适的非限制性方法可以是例如化学接头、邻近连接或本文所述的任何其它方法。在一些实施方式中，珠可以独立于基材而被拴系在一起。在一些实施方式中，珠可以以各种排列拴系在现有基材上。在一些实施方式中，基材(例如，水凝胶)可以围绕现有的拴系的珠形成。在一些实施方式中，珠或珠排列可以接触生物样品的部分。在一些实施方式中，珠或珠排列可以接触感兴趣的区域。在一些实施方式中，珠或珠排列可以接触整个生物样品。在一些实施方式中，珠或珠排列与生物样品上的随机位置接触。在一些实施方式中，按生物样品上的特定图案接触珠。[0956]珠可以以各种排列方式拴系在一起。在一些实施方式中，单个(例如，一个)珠可以与生物样品接触。在一些实施方式中，两个或更多个珠可以以各种排列被拴系(例如，彼此连接)。例如，以非限制性的方式，珠可以被拴系在一起以形成簇、行或布置在网格(例如，网)上。在一些实施方式中，至少三个珠可以二维(2d)阵列(例如，簇)拴系在一起。在一些实施方式中，至少两个珠可以一维(1d)阵列(例如，一行)拴系在一起。在这样的实施例中，珠以珠可以彼此直接接触的方式排列。在一些实施方式中，至少两个珠可以串状排列(stringarrangement)栓系在一起。在这样的实施例中，珠以珠可以彼此间接接触的方式排列(例如珠通过接头连接)。在一些实施方式中，至少两个珠可以网状排列(mesharrangement)(例如，网)栓系在一起。在一些实施方式中，以2d阵列、1d阵列栓系在一起的珠，串状排列上的珠，和网状排列上的珠可以在生物样品上以彼此的任何组合使用。[0957]在一些实施方式中，至少约2至约10个珠可以以各种排列栓系在一起。在一些实施方式中，至少约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个或更多个珠可以拴系在一起。在一些实施方式中，约10到约100个珠可以以各种排列被拴系在一起。在一些实施方式中，约10个、约20个、约30个、约40个、约50个、约60个、约70个、约80个、约90个或更多个珠可以以各种排列系在一起。在一些实施方式中，约100到约1,000个珠可以以各种排列被拴系在一起。在一些实施方式中，约100个、约200个、约300个、约400个、约500个、约600个、约700个、约800个，或约900个或更多个珠可以以各种排列系在一起。在一些实施方式中，约1000到约10000个珠可以以各种排列被拴系在一起。在一些实施方式中，约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000或更多个珠可被拴系在一起。[0958]在一些实施方式中，拴系的珠可具有包含空间条形码、功能域、独特分子标识符、裂解域和捕获域或其组合的捕获探针。在一些实施方式中，每个珠可以与独特的空间条形码相关联。在一些实施方式中，空间条形码在珠或珠排列接触生物样品之前是已知的。在一些实施方式中，空间条形码在珠或珠排列接触生物样品之前是未知的。阵列中每个珠(例如，空间条形码)的身份(identity)可以例如通过直接光学测序进行去卷积，如本文所讨论的。[0959](xi)在液体中打印阵列[0960]在一些实施方式中，阵列可以在液体中打印。归因于打印溶液的扩散，传统打印阵列的分辨率可能会受到限制。在高粘性液体中打印阵列可以通过防止打印溶液的扩散来提高分辨率。因此，本文公开了用于将具有条形码(例如，空间条形码)的捕获探针(例如核酸捕获探针)附接和/或引入基材(例如载玻片)的各种方法和材料，其中附接(例如，打印)在液体中进行。[0961]在一些方面，捕获探针打印在基材(例如，载玻片或珠)上。在一些方面，基材是载玻片。在一些方面，基材是96孔微量滴定板。在一些方面，本文提供的方法还可以施用于通常用于核酸分析的其它基材，包括但不限于珠、颗粒、膜、过滤器、试纸条、载玻片、板和微芯片。在一些方面，此类基材可由多种已知与核酸分析相容的材料组成，包括但不限于琼脂糖、苯乙烯、尼龙、玻璃和硅。[0962](1)第一溶液[0963]在一些实施方式中，本文提供了使用一种或多种液体溶液(例如，包括不同捕获探针的两种或更多种溶液)在基材上打印阵列的方法。在一些方面，使用一种或多种溶液在基材上打印阵列的方法可以提高打印阵列的分辨率。在一些方面，本文提供的方法包括将第一溶液(例如，大量溶液(bulksolution))分配到基材上。在一些方面，第一溶液(例如，大量溶液)相对于第二溶液(例如，包括待附接至基材的捕获探针的第二溶液)具有较低的雷诺数(reynoldsnumber)。雷诺数表示流体的密度和速度与其在给定长度的通道中的粘度之间的反比关系。粘性更大，密度更小，和/或移动速度更慢的流体将具有更低的雷诺数，并且更容易在没有湍流的情况下转向、停止、启动或反转。在一些实施方式中，第一溶液和第二溶液是不混溶的。[0964]在一些方面，第一(例如，大量)溶液是疏水的。在一些方面，在将第一(例如，大量)溶液分配到载玻片上之后，第一(例如，大量)溶液在载玻片上的离散空间区域中保留在载玻片上。在一些方面，第一(例如，大量)溶液由不使一个或多个探针变性和/或不抑制探针与基材结合的溶液制成。在一些实施方式中，大量溶液可包括水溶液、高粘度溶液或低核酸扩散性溶液。在一些方面，第一(例如，大量)溶液是凝胶。在一些方面，第一(例如，大量)溶液是水凝胶。在一些方面，第一(例如，大量)溶液包括天然聚合物，包括例如甘油、胶原蛋白、明胶、糖如淀粉、藻酸盐和琼脂糖，或其任何组合。在一些方面，第一(例如，大量)溶液包括合成聚合物。在一些方面，合成聚合物通过本领域已知的任何方法制备，包括例如化学聚合方法。在一些方面，凝胶或聚合物是疏水的。在一些方面，凝胶或聚合物是亲水的。在一些方面，凝胶或聚合物是水性的。在一些方面，凝胶或聚合物在室温下收缩。在一些方面，凝胶或聚合物在加热时收缩。在一些方面，聚合物是加热时收缩的膜。[0965]在一些方面，第一(例如，大量)溶液包括甘油。在一些方面，甘油以5‑100％的浓度存在于第一(例如，大量)溶液中。在一些方面，甘油以5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的浓度存在于溶液中。[0966]在一些方面，第一(例如，大量)溶液包括糖。在一些方面，糖是单糖、二糖、多糖或其组合。在一些方面，糖是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉纤维素或其组合。在某些方面，糖来源于复杂的化合物，例如糖蜜或来自糖精制的其它副产品。在一些方面，糖以5‑100％的浓度存在于第一(例如，大量)溶液中。在一些方面，糖以5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的浓度存在于溶液中。[0967]在一些方面，第一(例如，大量)溶液的粘度比第二溶液的粘度大约0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1.0倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍或10倍。[0968](2)第二溶液[0969]在一些实施方式中，使用两种或更多种溶液，包括使用第二溶液，在基材上打印阵列。在一些实施方式中，第二溶液可包括一个或多个捕获探针。在一些实施方式中，第二溶液以液滴的形式分配。一些实施方式包括多个第二溶液，其中所述多个中的每个成员包括一个或多个捕获探针，所述捕获探针包含该特定液滴独有的空间条形码。在一些实施方式中，第二溶液被分配到覆盖或部分覆盖有第一(例如，大量)溶液的基材上。在一些实施方式中，第一(例如，大量)溶液减少或防止一个或多个捕获探针从第二溶液扩散。在一些方面，当被打印到被覆或部分被覆有第一(例如，大量)溶液的基材上时，一个或多个捕获探针整体留存在第二溶液中。[0970]在一些方面，第二溶液包括一个或多个捕获探针(例如，本文公开的任何捕获探针)。在一些方面中，第二溶液包括一个空间条码化的捕获探针。在一些方面，第二溶液包括至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1,000、至少1,500、至少2,000、至少3,000、至少4,000或至少5,000个空间条码化捕获探针。在一些方面，第二溶液包括促进一个或多个捕获探针与基材结合的化合物。在一些方面，第二溶液不抑制一个或多个捕获探针结合基材和/或不使一个或多个捕获探针变性。在一些方面，第二溶液的粘性小于第一(例如，大量)溶液。在一些方面，第二溶液和第一(例如，大量)溶液完全或基本上不混溶(例如，它们不混合)。在一些方面，第二溶液是水性溶液。在一些方面，第二溶液是亲水溶液。[0971](3)分配[0972]在一些实施方式中，点印(spotprinting)特征的高密度图案可以包括在大量溶液的存在下以液滴的形式将寡核苷酸和/或特征分配到基材的表面上。在一些实施方式中，第二溶液液滴(例如，寡核苷酸和/或特征液滴)和第一(例如，大量)溶液基本上不彼此混合。在一些方面，包括在存在(例如，通过)第一(例如，大量)溶液的情况下将包括一个或多个空间条码化捕获探针的第二溶液分配到基材上的本文公开的打印方法导致第二溶液的点的大小(例如，在基材平面上的第二溶液的切面点大小)与第一(例如，大量)溶液不存在的情况下分配相同第二溶液至基材上所将获得的点的大小相比较小。在一些方面，第二溶液的点的大小(例如，在基材平面上的第二溶液的切面点大小)在于第一(例如，大量)溶液存在下将第二溶液打印到基材上之后不增加。在一些方面，在第一(例如，大量)溶液的存在下，在将第二溶液打印到基材上之后，第二溶液的点的面积不改变。在一些方面，在第一(例如，大量)溶液存在下，将第二溶液打印到基材上导致基材表面上的所需图案。例如，可以在第一溶液的存在下将多组第二溶液打印到基材上，从而使打印多组第二溶液的位置在基材上产生所需的图案。在一些实施方式中，打印到基材上的多组第二溶液的两个或更多个成员包括捕获探针的不同群，所述捕获探针附连至基材，从而产生捕获探针的阵列。[0973](4)密度[0974]在一些实施方式中，基材上的寡核苷酸和/或特征液滴的截面积小于通过在所述大量溶液不存在的情况下分配所述寡核苷酸和/或特征至基材表面上所将产生的寡核苷酸和/或特征液滴的对应截面积。在一些实施方式中，基材上的寡核苷酸和/或特征液滴的截面积比通过在所述大量溶液不存在的情况下分配所述寡核苷酸和/或特征液滴至基材表面上所将产生的寡核苷酸和/或特征液滴的对应截面积小约两倍。[0975]在一些方面，通过在第一溶液存在的情况下将第二溶液分配到基材表面上而产生的第二溶液在基材上的截面积小于在第一溶液不存在的情况下通过将第二溶液分配到基材表面上而产生的第二溶液的对应截面积。在一些方面，通过在第一溶液的存在下将第二溶液分配到基材的表面上而产生的基材上的第二溶液的截面积为比在第一溶液不存在的情况下将第二溶液分配至基材表面上所将产生的第二溶液的对应截面积小约2倍，约3倍，约4倍，或约5倍，约10倍，约20倍，约30倍，约40倍，约50倍，约60倍，约70倍，约80倍，约90倍，或约100倍。[0976](5)固化[0977]在将第二溶液(包括捕获探针)分配至基材上之后，可以使用任何合适的技术或条件来固化第一溶液、第二溶液和/或第二溶液形成的点。如本文所用，术语“固化”和相关术语可以指用能将溶液从液态转变为固态(例如，转化为基质)的试剂和/或条件处理溶液(例如，第一溶液、第二溶液或两者)，其中所述溶液在固化过程之后保持三维形状。固化技术和/或条件的合适示例包括紫外光(uv)辐射、红外线(ir)辐射、热辐射、微波辐射、可见光辐射、窄波长辐射、激光、自然光、湿度或其组合。固化源的合适示例包括例如紫外光、加热装置、辐射装置、微波装置、等离子体装置或它们的组合。[0978]在一些实施方式中，第一溶液和/或第二溶液被化学固化。在一些实施方式中，寡核苷酸和/或特征液滴被化学固化。在一些实施方式中，大量溶液被化学固化。在一些方面，在将第二溶液(包括捕获探针)分配到基材上之后由第二溶液形成的点被化学固化。在一些实施方式中，寡核苷酸和/或特征和大量溶液被附连至基材(例如，通过固化)，从而产生特征和大量溶液‑基质。在一些方面，基质(例如，第一和第二溶液基质)被化学固化。可以通过本领域已知的任何方式实现溶液的化学固化。例如，溶液可以包括一个或多个水凝胶亚单元，其可以经化学聚合(例如，交联)以形成三维(3d)水凝胶网络。在大量溶液的存在下，以液滴的形式分配到基材表面上的特征可以被聚合。在一些实施方式中，特征与大量溶液共聚以在水凝胶柔性阵列中产生凝胶特征，而在其它实施方式中，凝胶垫或特征被聚合并且大量溶液被移除，留下点或珠阵列。水凝胶亚基的非限制性实例包括丙烯酰胺、双丙烯酰胺、聚丙烯酰胺及其衍生物、聚(乙二醇)及其衍生物(例如peg‑丙烯酸酯(peg‑da)、peg‑rgd)、明胶‑甲基丙烯酰(gelma)、甲基丙烯酸化透明质酸(meha)、聚脂族聚氨酯、聚醚聚氨酯、聚酯聚氨酯、聚乙烯共聚物、聚酰胺、聚乙烯醇、聚丙二醇、聚四亚甲基氧、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚(丙烯酸羟乙酯)和聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖、琼脂糖、明胶、藻酸盐、蛋白质聚合物、甲基纤维素等，或它们的组合。有用于形成和/或交联水凝胶的其它材料和技术在本文中更详细地描述。[0979]在一些方面，第一溶液和/或第二溶液被光反应固化。在一些实施方式中，寡核苷酸和/或特征液滴被光反应固化。在一些实施方式中，大量溶液被光反应固化。在一些方面，在将包含捕获探针的第二溶液分配到基材上之后由第二溶液形成的点被光反应固化。在一些方面，基质(例如，第一和第二溶液基质)被光反应固化。光反应固化可以通过本领域已知的任何方式完成。[0980]在一些方面，本文公开的方法包括固化第一(例如，大量)和/或第二溶液。在一些方面，本文公开的方法包括在将第二溶液(例如，包括捕获探针的第二溶液)分配到基材上之后固化由第二溶液形成的点。在一些方面，本文公开的方法包括在将第一溶液和第二溶液分配到载玻片上之后固化它们。在一些实施方式中，固化第一和第二溶液产生第一和第二溶液基质。在一些方面，本文公开的方法包括固化第二溶液，然后从基材移除未固化的第一溶液。在一些方面，本文公开的方法包括固化基材上的第一和第二溶液，从而产生基质(例如，第一和第二溶液‑基质)。[0981](6)扩展基质[0982]在一些实施方式中，在第一(例如，大量)溶液存在的情况下将第二溶液液滴(例如，寡核苷酸和/或特征液体)分配至基材表面上之前，第一(例如，大量)溶液被固化以形成大量溶液‑基质，然后使该大量溶液基质沿一个或多个轴(例如，基质或基材表面的一个或多个轴)可逆地扩展。在一些实施方式中，可以在扩展的第一(例如，大量)溶液基质存在的情况下分配第二溶液液滴。[0983]在一些实施方式中，将多个第二溶液液滴(例如，包括具有不同空间条形码的不同捕获探针)分配到被覆有第一(例如，大量)溶液的基材上，其中第一溶液最初沿一个或多个轴拉伸。在一些实施方式中，拉伸的第一溶液被固化。在一些实施方式中，拉伸的第一溶液被部分固化。在一些实施方式中，拉伸的第一溶液未固化并且分配在其自身被拉伸的表面上。在一些方面，第二溶液液滴的体积(例如，截面积)在被分配到最初被拉伸的第一溶液中之后减小。在一些方面，本文公开了制备阵列的方法，包括(i)提供凝胶或聚合物(例如，固化或部分固化的溶液)到基材上，(2)拉伸凝胶或聚合物，(3)在凝胶或聚合物拉伸时将第二溶液的液滴分配到基材上，和(4)允许凝胶或聚合物松弛，从而减小基材上第二溶液液滴的总面积(例如，截面积)。在一些方面，拉伸步骤包括沿着与基材表面共面的一个或多个轴可逆地扩展凝胶或聚合物。[0984](7)移除溶液[0985]在一些实施方式中，可在寡核苷酸和/或特征液滴附接至基材之后从基材移除第一(例如，大量)溶液。在一些方面，在将包含一个或多个捕获探针的第二溶液(例如，包含不同捕获探针的多个第二溶液)分配到基材上之后，移除第一(例如，大量)溶液。移除第一(例如，大量)溶液的方法是本领域已知的。在一些方面，第一(例如，大量)溶液的移除导致第一溶液的完全移除，仅留下包含一个或多个捕获探针的第二溶液(例如，包含不同捕获探针的多组第二溶液)在基质上。在一些方面，移除第一(例如，大量)溶液不会改变与基材接触的第二溶液(例如，包括不同捕获探针的多组第二溶液)的表面积。在一些方面，移除第一(例如，大量)溶液不会改变与基材接触的第二溶液(例如，包括不同捕获探针的多组第二溶液)的液滴的形状。在一些方面，在移除第一(例如，大量)溶液之前，包含一个或多个探针(例如，包含不同捕获探针的多组第二溶液)的第二溶液通过本文公开的方法固化，但第一(例如，大量)溶液不被固化。例如，第一和第二溶液可以经历试剂和/或条件作用，在所述试剂和/或条件下，第二溶液(例如，包括不同捕获探针的多组第二溶液)被固化，而第一(例如，大量)溶液不被固化。在一些实施方式中，第二溶液(例如，包含不同捕获探针的多组第二溶液)包括一种或多种可以聚合(例如，交联)以形成三维(3d)水凝胶网络的水凝胶亚单元，而第一(例如，大量)溶液不包括这样的一个或多个水凝胶亚单元。在使第一和第二溶液经历固化条件时，仅第二溶液将被固化，从而允许移除第一溶液。[0986]在一些实施方式中，在寡核苷酸和/或特征附接到基材之后，不从基材移除第一(例如，大量)溶液。[0987](8)收缩液滴/特征阵列[0988]在一些实施方式中，包含第二溶液(例如，寡核苷酸和/或特征液滴)的扩展的第一(例如，大量)溶液‑基质可以沿着(例如，基质的或基材表面的)一个或多个轴收缩，从而使第二溶液液滴(例如寡核苷酸和/或特征液滴)的截面积小于在包含第二溶液液滴(例如寡核苷酸和/或特征液滴)的第一(例如，大量)溶液‑基质不沿所述一个或多个轴收缩的情况下所将产生的第二溶液液滴(例如，寡核苷酸和/或特征液滴)的对应截面积。在一些实施方式中，使基质(例如，第一和第二溶液基质)收缩能产生收缩的基质(例如，收缩的第一和第二基质)，其中，与非收缩基质中的第二溶液液滴的体积相比，该基质的第二溶液液滴(例如，多个第二溶液液滴)的体积减小。在一些方面，使两种或更多第二溶液(例如，第二溶液的液滴)收缩能导致两种或更多第二溶液的更高密度。在一些实施方式中，第二溶液液滴(例如，寡核苷酸和/或特征液滴)和第一(例如，大量)溶液‑基质可以通过本文公开的任何方法收缩。在一些实施方式中，收缩可以包括移除水。在一些方面，阵列的分辨率在液滴收缩后增加。在一些方面，使第二溶液液滴收缩导致液滴的截面积减小(例如，其上打印或分配第二溶液液滴的基材平面中的截面积)。在一些方面中，在使液滴收缩后，基材上的探针浓度会增加，从而提高灵敏度。[0989]使空间阵列与生物样品接触，其中生物样品可以是本文所述的任何样品(例如，ffpe组织切片)。一旦将空间阵列被置于生物样品上，就会发生细胞和/或核透化反应，从而生物分析物(例如，dna、rna、蛋白质、代谢物、小分子、脂质等)被释放并捕获到空间阵列上，保留其空间信息。移出空间阵列，并确定其中的分子信息(例如，通过进行用于下一代测序的文库构建)。测序之后可以是表达值(例如，分析物的基因表达)与特征的相关性。[0990]在一些方面，第二溶液液滴的截面积在收缩时相较于打印或分配到基材上的第二溶液液滴的截面积减少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。在一些方面，第二溶液液滴的截面积相较于打印或分配到基材上的第二溶液液滴的截面积减小约1.0倍、约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍或约5倍。[0991]在一些方面，本文公开了制备阵列的方法，其包括：将多个第二溶液液滴(例如，包括具有不同空间条形码的不同捕获探针)分配到被覆有第一(例如，大量)溶液的基材上，固化第一溶液和第二溶液，以产生基质(例如，第一和第二溶液基质)，其中基质中的多个第二溶液液滴的体积和形状与多个第二溶液液滴分配时基本相同，和，使基质收缩，由此减少多个第二溶液液滴的总体积(例如，截面积)。在一些方面，可以使用本文所述的各种收缩剂或条件中的任一种来实现收缩。在一些方面，收缩可通过使基质脱水来完成。[0992]在一些方面，在分配第二溶液之后，第二溶液的面积沿着与基材表面共面的一个或多个轴收缩，从而使基材(例如，载玻片)上的第二溶液的截面积小于在包含第二溶液的第一溶液基质不沿基材表面的一个或多个轴收缩的情况下所将产生的第二溶液的对应截面积。[0993]关于取向，基材上任意两个正交方向的收缩率不必相等。然而，在一些方面，第二溶液液滴的收缩在收缩上是基本均一的。在一些方面，第二溶液液滴在每个方向上以基本相同的量收缩，而不管基材平面上的位置如何。[0994]在一些方面，在用一个或多个捕获探针制备基材(例如，包括捕获探针的空间阵列)之后，本文公开了用于对生物样品中的分析物(例如，多种分析物)进行空间概况分析的方法，其包括(a)产生空间阵列，其包括结合到基材的多个捕获探针；其中(i)基材的至少部分被覆有第一溶液；和(ii)在第一溶液的存在下，将液滴形式的多组第二溶液分配到基材的表面上，其中第一溶液和多组第二溶液基本上不彼此混合，其中多组第二溶液的至少两个成员包括具有不同空间条形码的一个或多个不同捕获探针，并且其中多组第二溶液的至少两个成员的一个或多个捕获探针中的至少一个结合至基材；(b)使生物样品与空间阵列接触，从而使生物样品中存在的分析物被一个或多个捕获探针捕获；和(c)确定生物样品中捕获的分析物的空间概况。[0995](xii)阵列/特征保留[0996]在一些实施方式中，可以在具有特征或特征排列的分析完成后保存生物样品，以用于分析物的附加多轮空间检测。在一些实施方式中，生物样品、特征、阵列或其任何组合可在空间概况分析之后保存。在一些实施方式中，可以保护生物样品、特征、阵列或其组合免于脱水(例如，干燥、变干)。在一些实施方式中，可以保护生物样品、特征、阵列或其组合免于蒸发。保存和/或保护生物样品、特征或阵列的方法是本领域已知的。例如，以非限制性的方式，生物样品、特征、阵列或其组合可以被可逆密封剂覆盖。可以使用任何合适的可逆密封剂。可逆密封的方法是本领域已知的(参见例如wo2019/104337，其通过引用方式纳入本文)。以非限制性方式，合适的可逆密封剂可包括无孔材料、膜、盖或油(例如，硅油、矿物油)。在进一步的非限制性示例中，生物样品、特征、阵列或它们的组合可以保存在环境室中(例如，气密密封的)并且在之后移出用于之后附加轮次的空间分析。[0997](e)分析物捕获[0998]在本节中，描述了捕获分析物的方法和系统的一般方面。单独的方法步骤和系统特征可以组合存在于许多不同的实施方式中；本文中描述的特定组合不以任何方式限制步骤或特征的其它组合。[0999](i)捕获条件[1000]通常，当生物样品与包含捕获探针的基材(例如，具有嵌入、点样、印刷在基材上的捕获探针的基材或具有包含捕获探针的特征(例如，珠、孔)的基材)接触时，可捕获分析物。[1001]如本文所用，使生物样品“接触”包含特征的基材指任何接触(例如，直接或间接)，使得捕获探针可以与来自生物样品的分析物相互作用(例如，捕获)。例如，基材可以靠近或邻近生物样品而无直接物理接触，但能够从生物样品中捕获分析物。在一些实施方式中，生物样品与基材直接物理接触。在一些实施方式中，生物样品与基材间接物理接触。例如，液体层可以存在于生物样品和基材之间。在一些实施方式中，分析物扩散通过液体层。在一些实施方式中，捕获探针扩散通过液体层。在一些实施方式中，试剂可以通过生物样品和基材之间的液体层递送。在一些实施方式中，间接物理接触可以包括位于生物样品和包含捕获探针的第一基材之间的第二基材(例如，水凝胶、薄膜、多孔膜)。在一些实施方式中，试剂可通过第二基材递送至生物样品。[1002]在一些实施方式中，细胞固定剂可用于使生物样品与基材接触(例如，通过在分析物捕获之前将非聚集或解聚的样品固定在空间条码化阵列上)。如本文所用，“细胞固定剂”可指附接于基材的试剂(例如，抗体)，其可结合细胞表面标志物。细胞表面标志物的非限制性示例包括：cd45、cd3、cd4、cd8、cd56、cd19、cd20、cd11c、cd14、cd33、cd66b、cd34、cd41、cd61、cd235a、cd146和上皮细胞粘附分子(epcam)。细胞固定剂可包括能够结合(例如，固定)细胞或组织(在基材上时)的任何探针或组分。附接在基材表面的细胞固定剂可用于结合具有细胞表面标志物的细胞。细胞表面标志物可以是遍在的细胞表面标志物，其中细胞固定剂的目的是捕获样品中高百分比的细胞。细胞表面标志物可以是特异性的或更罕见表达的细胞表面标志物，其中细胞固定剂的目的是捕获表达靶细胞表面标志物的特定细胞群。因此，细胞固定剂可用于从不具有相同细胞表面标志物的细胞群中选择性地捕获表达靶细胞表面标志物的细胞。[1003]基材(或基材上的特征)上的捕获探针可通过捕获域与释放的分析物相互作用，如他处所述，以捕获分析物。在一些实施方式中，进行某些步骤以增强与阵列的捕获探针的分析物的转移或捕获。此类修改的实例包括但不限于调整用于使基材与生物样品接触的条件(例如，时间、温度、取向、ph水平、生物样品的预处理等)、使用力来传输分析物(例如，电泳、离心、机械等)，进行扩增反应以增加生物分析物的量(例如，pcr扩增、原位扩增、克隆扩增)，和/或使用标记的探针检测扩增子和条形码。[1004]在一些实施方式中，使阵列适应于促进生物分析物迁移。使阵列适应于促进生物分析物迁移的非限制性示例包括：具有包含纳米孔、纳米孔和/或微流体通道的基材的阵列；具有多孔膜的阵列；和具有由水凝胶制成的基材的阵列。在一些情况下，阵列基材是液体可透化的。在一些情况下，阵列是(例如，通过制造)包括纳米孔或图案的盖玻片或载玻片。在基材包括纳米洞、纳米孔和/或微流体通道的一些情况下，这些结构可以促进生物样品暴露于试剂(例如，用于透化、生物分析物捕获和/或核酸延伸反应的试剂)，从而与缺乏此类特性的基材相比，提高了分析物捕获效率。[1005]在一些实施方式中，通过用透化试剂处理生物样品来促进分析物捕获。如果生物样品透化不够，则在基材上捕获的分析物的量可能过低，无法进行充分的分析。相反，如果生物样品透化性太强，则分析物可从其在生物样品中的来源扩散出去，从而失去生物样品中分析物的相对空间关系。因此，在充分透化生物样品以获得良好信号强度同时仍保持生物样品中分析物分布的空间分辨率之间的平衡是理想的。用于制备生物样品以促进分析物捕获的方法是本领域已知的，并且可根据生物样品和生物样品如何制备(例如，新鲜冷冻、ffpe等)来改良。[1006](ii)基材保持器(substrateholder)[1007]本文描述了其中具有位于基材上的捕获探针的阵列和位于不同基材上的生物样品接触的方法，从而使阵列与生物样品接触(例如，将基材夹在一起)。在一些实施方式中，阵列和生物样品可以接触(例如，夹在中间)，而无需基材保持器的帮助。在一些实施方式中，阵列和生物样品基材可以放置在设计用于对准生物样品和阵列的基材保持器(例如，阵列对准装置)中。例如，基材保持器可以具有用于两个基材的位置保持器(placeholder)。在一些实施方式中，包括捕获探针的阵列可以定位在基材保持器的一侧上(例如，在第一基材位置保持器中)。在一些实施方式中，生物样品可以放置在第二位置保持器中的基材保持器的相邻侧上。在一些实施方式中，铰接器可以位于两个基材位置保持器之间，其允许基材保持器闭合，例如，在两个基材位置保持器之间形成夹层。在一些实施方式中，当基材保持器关闭时，生物样品和具有捕获探针的阵列在足以允许生物样品中存在的分析物与阵列的捕获探针相互作用的条件下彼此接触。例如，干燥的透化试剂可以放置在生物样品上且再水合。透化溶液可以流经基材保持器以透化生物样品并允许生物样品中的分析物与捕获探针相互作用。此外，基材或透化溶液的温度可用于启动或控制透化速率。例如，可以将包括阵列的基材、包括生物样品的基材或这两种基材保持在低温下以减慢扩散和透化效率。一旦被夹在中间，在一些实施方式中，可以加热基材以起始透化和/或增加扩散效率。从透化组织释放的转录物可扩散到阵列并被捕获探针捕获。可以打开夹层，在阵列上进行cdna合成。[1008]本文所述的多种组合中的任一种，其中包括具有捕获探针的阵列和在两个不同基材上的生物样品的夹心体可以放置在设计用于对齐生物样品和阵列的基材保持器中。例如，基材保持器可以具有用于两个基材的位置保持器(placeholder)。在一些实施方式中，包括捕获探针的阵列可以定位在基材保持器的一侧上(例如，在第一基材位置保持器中)。在一些实施方式中，生物样品可以放置在第二位置保持器中的基材保持器的相邻侧上。在一些实施方式中，铰接器可以位于两个基材位置保持器之间，其允许基材保持器闭合，例如，在两个基材位置保持器之间形成夹层。在一些实施方式中，当基材保持器关闭时，可使生物样品和具有捕获探针的阵列在足以允许生物样品中存在的分析物与阵列的捕获探针相互作用的条件下彼此接触，用于通过本文所述的任何方法进行空间分析。例如，干燥的透化试剂可以放置在生物样品上并再水合。此外，透化溶液可以流经基材保持器以透化生物样品并允许生物样品中的分析物与捕获探针相互作用。[1009]在一些实施方式中，本文所述的柔性阵列可放置在基材保持器中，并与生物样品夹在中间。在一些实施方式中，柔性阵列可包括空间条码化交联特征。在一些实施方式中，柔性阵列可以在被放置到基材保持器中之前预浸在透化试剂中。在一些实施方式中，柔性阵列可以在被放置到基材保持器中之后浸渍透化试剂。在一些实施方式中，包括一个位置保持器中的生物样品和柔性阵列的基材保持器可以闭合(例如，形成夹心体)，从而透化试剂允许生物样品中存在的分析物与柔性阵列的捕获探针(例如，空间条码化特征上的捕获探针)相互作用。[1010]在一些实施方式中，可使基材保持器升温或降温以调节透化和/或扩散效率。[1011](iii)被动捕获方法[1012]在一些实施方式中，分析物可从样品迁移到基材。促进迁移的方法可以是被动的(例如，扩散)和/或主动的(例如，核酸的电泳迁移)。被动迁移的非限制性示例可包括由脱水物体的再水合产生的简单扩散和渗透压。[1013]通过扩散进行的被动迁移利用浓度梯度。扩散是未经约束的物体向平衡方向运动。因此，当存在物体浓度高的区域和物体浓度低的区域时，物体(例如，捕获探针、分析物等)移动到较低浓度的区域。在一些实施方式中，未经约束的分析物沿着浓度梯度向下移动。[1014]在一些实施方式中，可将不同试剂添加到生物样品中，使得生物样品被再水化，同时改进分析物的捕获。在一些实施方式中，生物样品可以与如本文所述的收缩的阵列接触。在一些实施方式中，生物样品和/或收缩的阵列可以用透化试剂再水合。在一些实施方式中，生物样品和/或收缩的阵列可以用染色溶液(例如，苏木精和曙红染色剂)再水合。[1015](iv)防扩散介质/盖体[1016]为了通过鼓励分析物向空间条码化的捕获探针扩散来提高效率，可以使用抗扩散介质。通常，生物分析物的分子扩散发生在所有方向，包括朝向捕获探针(即朝向空间条码化阵列)和远离捕获探针(即进入大量溶液)。朝向空间条码化阵列的扩散增加能减少远离空间条码化阵列的分析物扩散并增加了捕获探针的捕获效率。[1017]在一些实施方式中，将生物样品放置在空间条码化基材的顶部，并且将抗扩散介质放置在生物样品的顶部。例如，可以将抗扩散介质放置在与生物样品接触的阵列上。在一些实施方式中，防扩散介质和空间条码化阵列是相同的组件。例如，抗扩散介质可以在防扩散介质(例如，盖玻片、载玻片、水凝胶或膜)之内或之上包含空间条码化捕获探针。在一些实施方式中，样品被放置在基材上，并且防扩散介质被放置在生物样品的顶部。此外，空间条码化捕获探针阵列可以放置在靠近防扩散介质的位置。例如，防扩散介质可以夹在空间条码化阵列和基材上的样品之间。在一些实施方式中，防扩散介质被布置或点在样品上。在其它实施方式中，防扩散介质放置在靠近样品的位置。[1018]一般而言，抗扩散介质可以是任何已知的限制生物分析物扩散率的材料。例如，防扩散介质可以是固态盖体(例如，盖玻片或载玻片)。在一些实施方式中，抗扩散介质可由玻璃、硅、纸、水凝胶、聚合物整材或其他材料制成。在一些实施方式中，玻璃侧可以是丙烯酸化的载玻片。在一些实施方式中，防扩散介质是多孔膜。在一些实施方式中，材料可以是天然多孔的。在一些实施方式中，该材料可具有蚀刻到固体材料中的孔或洞。在一些实施方式中，可以控制孔体积以最小化目标分析物的损失。在一些实施方式中，可以控制膜化学以最小化目标分析物的损失。在一些实施方式中，防扩散介质(例如，水凝胶)共价连接到基材(例如，载玻片)。在一些实施方式中，防扩散介质可以是任何已知的限制多聚(a)转录物扩散的材料。在一些实施方式中，防扩散介质可以是任何已知的限制蛋白质扩散的材料。在一些实施方式中，防扩散介质可以是任何已知的限制大分子成分的扩散率的材料。[1019]在一些实施方式中，抗扩散介质包括一种或多种抗扩散介质。例如，可以在将介质与生物样品接触之前以多种方式组合一种或多种防扩散介质，包括但不限于被覆、分层或点样。作为另一个示例，可以将水凝胶放置在生物样品上，然后将盖体(例如，载玻片)放置在水凝胶的顶部。[1020]在一些实施方式中，施加力(例如，流体动压、超声振动、溶质对比度、微波辐射、血管循环或其他电、机械、磁力、离心力和/或热力)以控制扩散并增强分析物捕获。在一些实施方式中，利用一种或多种力和一种或多种防扩散介质来控制扩散和增强捕获。例如，可以同时使用离心力和载玻片。力和防扩散介质的多种组合中的任何一种都可用于控制或减轻扩散并增强分析物捕获。[1021]在一些实施方式中，抗扩散介质与空间条码化阵列和样品一起浸没在大量溶液(bulksolution)中。在一些实施方式中，大量溶液包括透化试剂。在一些实施方式中，抗扩散介质包括至少一种透化试剂。在一些实施方式中，在抗扩散介质与样品接触之前，将抗扩散介质(即水凝胶)浸泡在透化试剂中。在一些实施方式中，抗扩散介质可包括含有透化缓冲液或试剂的孔(例如，微孔、纳米孔或皮孔)。在一些实施方式中，抗扩散介质可包括透化试剂。在一些实施方式中，当抗扩散介质应用于生物样品时，抗扩散介质可包含干燥试剂或单体以递送透化试剂。在一些实施方式中，在将所述组件浸入大量溶液中之前，将所述抗扩散介质添加到所述空间条码化阵列和样品组件中。在一些实施方式中，在样品暴露于透化试剂之后，将抗扩散介质添加到空间条码化阵列和样品组件中。在一些实施方式中，透化试剂流过抗扩散介质上的微流体室或通道。在一些实施方式中，流控制样品对透化试剂的可及性。在一些实施方式中，目标分析物扩散出样品并朝向大量溶液，并且包埋到空间条码化的捕获探针包埋的抗扩散介质中。在一些实施方式中，游离溶液被夹在生物样品和防扩散介质之间。[1022]图13是抗扩散介质的示例性使用的图示。防扩散介质1302可以与样品1303接触。在图13中，载玻片1304被填充有空间条码化的捕获探针1306，并且样品1303，1305与阵列1304，1306接触。可将防扩散介质1302施用于样品1303，其中样品1303夹在防扩散介质1302和捕获探针被覆的载玻片1304之间。当将透化溶液1301施加到样品时，使用抗扩散介质/盖1302通过减少分析物向外扩散到介质中来引导分析物1305向捕获探针1306的迁移。或者，盖可以包含透化试剂。[1023](v)主动捕获方法[1024]在本文所述的一些方法中，生物样品(例如，细胞或组织切片中)中的分析物可以被(例如，被动地或主动地)运输到捕获探针(例如，固定到基材(例如，基材或珠)的捕获探针)。[1025]例如，可以使用电场(例如，使用电泳)、压力、流体流动、重力、温度和/或磁场将分析物输送到捕获探针(例如，固定的捕获探针)。例如，可以使用压力梯度、化学浓度梯度、温度梯度和/或ph梯度来使分析物通过例如凝胶(例如水凝胶)、流体或透化的细胞运输至捕获探针(例如固定的捕获探针)。例如，分析物可以通过凝胶(例如，水凝胶)、流体或透化的细胞运输到捕获探针(例如，固定的捕获探针)。[1026]在一些实例中，电泳场可施加于分析物以促进分析物向捕获探针迁移。在一些示例中，使含有分析物的样品接触具有固定在基材上的捕获探针的基材(例如载玻片、盖玻片或珠)，并且施加电流以促进带电分析物朝向基材上的捕获探针的定向迁移。电泳组件(例如，电泳室)可用于施加电流，其中生物样品与阴极和捕获探针(例如，固定在基材上的捕获探针)接触，并且其中捕获探针与生物样品和阳极接触。[1027]在一些实施方式中，利用主动捕获方法的方法可以采用导电基材(例如，本文所述的任何导电基材)。在一些实施方式中，导电基材包括纸、水凝胶膜或具有导电覆层的载玻片。在一些实施方式中，导电基材(例如，本文所述的任何导电基材)包括一个或多个捕获探针。[1028]在一些实施方式中，可以进行分析物的电泳转移，同时保留分析物在生物样品中的相对空间位置，同时使分析物远离其在生物样品中的位置的被动扩散最小化。在一些实施方式中，被捕获探针(例如，基材上的捕获探针)捕获的分析物保留了该分析物存在于其来源的生物样品中的空间位置(例如，相较于分析物不主动迁移至捕获探针的情况，当分析物通过电泳转移主动迁移到捕获探针时，被基材上的捕获探针捕获的分析物的空间位置，可以更准确或更能代表分析物在该生物样品中的空间位置)。在一些实施方式中，电泳传输和结合过程由达姆科勒数(number，da)描述，它是反应和质量传输速率的比率。结合的分析物的分数和生物样品的形状将取决于da中的参数。参数包括电迁移速度ue(取决于电泳迁移率μe和电场强度e)，捕获探针(例如，条码化的寡核苷酸)的密度p0，探针和分析物的结合速率(例如，条码化寡核苷酸)kon，和捕获区域的厚度l。[1029][1030]快速迁移(例如，电迁移)可以减少测定时间并且可以最小化分析物的分子扩散。[1031]在一些实施方式中，在保持样品中分析物的相对空间排列的同时，可以进行分析物的电泳转移。因此，被捕获探针(例如，基材上的捕获探针)捕获的分析物保留了细胞或其来源的生物样品的空间信息。对分析物施加电泳场也可导致温度升高(例如，热量)。在一些实施方式中，升高的温度(例如，热量)可以促进分析物向捕获探针迁移。[1032]在一些示例中，空间可寻址的微电极阵列用于通过捕获探针来空间限制地捕获至少一种感兴趣的带电分析物。例如，空间可寻址的微电极阵列可以允许电场的离散(例如，局部)施加而不是均一电场的施加。空间可寻址的微电极阵列可以独立寻址。在一些实施方式中，可以将电场施加到生物样品中的一个或多个感兴趣区域。电极可以彼此相邻或彼此远离。微电极阵列可以被设置为包括具有小面积的高密度离散位点，用于施加电场以促进感兴趣的带电分析物的迁移。例如，可以使用空间可寻址的微电极阵列在感兴趣的区域上进行电泳捕获。[1033]可以使用微电极阵列上的高密度离散位点。表面可以包括任何合适密度(例如，适合于在给定的时间内处理导电基材上的样品的密度)的离散位点。在一个实施方式中，该表面具有大于或等于约500个位点/1mm2的离散位点密度。在一些实施方式中，表面具有每1mm2约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约40000、约60000、约80000个，约100000个，或约500000个位点的离散位点密度。在一些实施方式中，表面具有每1mm2至少约200、至少约300、至少约400、至少约500、至少约600、至少约700、至少约800、至少约900、至少约1000、至少约2000、至少约3000、至少约4000、至少约5000、至少约6000、至少约7000、至少约8000、至少约9000、至少约10000、至少约20000、至少约40000、至少约60000、至少约80000、至少约100000、或至少约500000个位点的离散位点密度。[1034]图14a和图14b说明了被设置为将核酸分析物(例如，mrna转录物)导向空间条码化捕获探针阵列的电泳转移系统的示意图。在该电泳系统的示例性设置中，样品1402夹在阴极之间1401和空间条码化捕获探针阵列1404，1405之间，且空间条码化捕获探针阵列1404，1405夹在样品1402和阳极1403之间，从而使样品1402，1406与空间条码化捕获探针1407接触。当电场被施加到电泳转移系统时，带负电荷的核酸分析物1406将朝向带正电荷的阳极1403，并且进入含有空间条码化捕获探针1407的空间条码化阵列1404，1405。空间条码化捕获探针1407与核酸分析物相互作用(例如，mrna转录物与形成dna/rna杂交体的空间条码化核酸捕获探针杂交)1406，使分析物捕获更有效。电泳系统设置可能会因目标分析物而异。例如，取决于蛋白质以及其它因素(例如，等电点、溶解度等)，蛋白质可以是正的、负的、中性的或极性的。技术从业者具有布置电泳转移系统以促进特定目标分析物的捕获的知识和经验。[1035]图15是示出利用电泳转移系统的示例性工作流方案的示意图。在该示例中，分图a描绘了与样品接触的柔性空间条码化特征阵列。样品可以是柔性阵列，其中阵列固定在水凝胶、膜或其它柔性基材上。分图b描绘了阵列与样品的接触以及阵列‑样品组件的成像。样品/阵列组件的图像可用于验证样品放置、选择感兴趣区域、或如本文所述对阵列上的样品成像的任何其他原因。分图c描述了使用电泳转移系统施加电场以帮助高效捕获目标分析物。此处，带负电的mrna目标分析物向带正电的阳极迁移。分图d描述了逆转录试剂的应用和捕获的目标分析物的第一链edna合成。分图e描述了阵列移出和文库构建准备(组图f)和下一代测序(组图g)。[1036](vi)靶向分析[1037]在一些方面，阵列(例如，载玻片)包括能与样品中的一个或多个特定生物靶标结合的多个捕获探针。捕获探针可以直接或间接附接到基材上。捕获探针可以是或包括例如dna或rna。在一些方面，取决于阵列的化学基质，阵列上的捕获探针可以通过它们的5′或3′末端固定，例如附接或结合到阵列。在一些方面，探针通过3′连接来附接，从而留下游离的5′端。在一些方面，探针通过5′连接来附接，从而留下游离的3′端。在一些方面，探针被间接固定。例如，可以将探针附接到珠上，该珠可以沉积在基材上。本节中公开的捕获探针可以包括本公开通篇提供的捕获探针的各种组分中的任一种(例如，空间条形码、umi、功能域、裂解域等)。[1038]在一些方面，一个或多个捕获探针与对特定物种或生物体(例如，宿主或病原体)具有特异性的分析物相互作用。在一些方面，探针或多个探针可用于检测病毒、细菌或植物蛋白质或核酸。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针可用于检测生物样品中病原体(例如，细菌或病毒)的存在。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针可用于检测与病原体相关的特定核酸的表达(例如，人类样品中16s核糖体rna或人类免疫缺陷病毒(hiv)rna的存在)。[1039]在一些方面，捕获探针中的捕获域可与一种或多种特定分析物(例如，总分析物池中的分析物或分析物的子集)相互作用。待检测的特定分析物可以是多种生物分子中的任一种，包括但不限于蛋白质、核酸、脂质、碳水合合物、离子、小分子、亚细胞靶标或含有上述任一种的多组分复合物。在一些实施方式中，分析物可定位于亚细胞位置，包括例如细胞器，例如线粒体、高尔基体、内质网、叶绿体、内吞囊泡、排出囊泡、液泡、溶酶体等。在一些实施方式中，分析物可以是肽或蛋白质，包括但不限于抗体和酶。[1040]在一些方面，来自生物样品的分析物与一个或多个捕获探针(例如，直接或间接固定在基材上的一个或多个捕获探针)相互作用，并且捕获探针与生物样品中的特定分析物相互作用。在一些方面，允许捕获探针与特定分析物相互作用(例如，杂交至特定分析物)，例如，在合适的条件下，其中寡核苷酸捕获探针可以与目标核酸杂交。在一些方面，不与捕获探针杂交的分析物(例如，不与捕获探针的捕获域相互作用的分析物)被移除。在一些实施方式中，不与捕获探针相互作用的分析物的移除可以通过例如洗涤样品以移除此类分析物来实现。[1041]在一些方面，捕获探针或多个捕获探针包括与生物样品中存在的一种或多种分析物相互作用的捕获域。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针包括检测特定分析物或感兴趣分析物的存在或水平量(例如，表达水平)的捕获域。捕获探针的捕获域(直接或间接固定在基材上)能够选择性地结合到所需的核酸亚型或子集。在一些方面，例如，捕获域结合基因组中的核酸子集或转录组中的核酸子集。在一些方面，分析物可包括一种或多种核酸。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针可用于检测特定转录物(例如特定mrna)的表达。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针可以对核酸或蛋白质的个体变化具有特异性(例如结合至核酸或蛋白质的个体变化)(例如，突变或单核苷酸多态性(snp))。[1042]在一些方面，生物样品包括分析物是或包含核酸。核酸可以是rna或dna。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针能够检测特定核酸分析物组的dna拷贝数。例如，本文提供的捕获探针或多个捕获探针可用于检测彼此具有同源性的核酸的dna拷贝数。[1043]在一些方面，捕获探针或多个捕获探针包括能检测一种或多种rna转录物(例如，特定rna转录物)的存在或水平量(例如，表达水平)的捕获域。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针包括能检测一种或多种非编码rna(例如，微rna、转移rna(trna)、核糖体rna、小干扰rna(sirna)和核仁小rna(snorna))的存在或量(例如，表达水平)的捕获域。在一些方面，所述探针或多个探针包括能检测一种或多种蛋白质(例如，感兴趣的核酸表达的蛋白质)的存在或水平量(例如，表达水平)的捕获域。[1044]在一些方面，捕获探针或多个捕获探针可以对特定蛋白质具有特异性。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针可用于检测特定感兴趣蛋白质的存在。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针可用于检测特定蛋白质的翻译。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针可以与酶的活性区、免疫球蛋白的结合域、蛋白质的确定域、完整蛋白质、合成肽、具有引入突变的肽、适体或其任何组合特异性地相互作用。在一些方面，分析物可包括一种或多种蛋白质。在一些方面，分析物可包括一种或多种核酸和一种或多种蛋白质。[1045]在一些方面，捕获探针或多个捕获探针可用于检测特定蛋白质的特定翻译后修饰。在此类实施方式中，分析物捕获剂可对具有翻译后修饰的给定状态(例如，磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化或脂质化)的细胞表面分析物具有特异性，使得细胞表面分析物概况可包括一种或多种分析物的翻译后修饰信息。[1046]在一些方面，捕获探针或多个捕获探针可以对一组特定的核酸(例如，与一个或多个特定细胞途径相关的核酸)具有特异性。在一些方面，该组核酸是dna。在一些方面，该组核酸是rna。在一些方面，该组核酸具有相似和/或同源序列。在一些方面，该组核酸编码在类似细胞途径中起作用的分析物。在一些方面，该组核酸编码在某种病理状态(例如，癌症、阿尔茨海默病或帕金森病)中表达的分析物。在一些方面，该组核酸编码在某种病理状态下过表达的分析物。在一些方面，该组核酸编码在某种病理状态下表达不足的分析物。[1047]在一些方面，捕获探针或多个捕获探针可以对特定核酸、或特定蛋白质组的检测或表达(例如，在类似的细胞途径中)具有特异性。在一些方面，该组蛋白质具有相似的功能域。在一些方面，该组蛋白质在相似的细胞途径中起作用。在一些方面，该组蛋白质在某种病理状态(例如，癌症、阿尔茨海默病或帕金森病)中表达。在一些方面，该组蛋白质在某种病理状态下过度表达。在一些方面，该组蛋白质在某种病理状态下表达不足。[1048]在一些实施方式中，捕获探针包括能够结合多于一种分析物的捕获域。在一些实施方式中，捕获域可结合一种或多种分析物，所述分析物与目标分析物约80％相同、约85％相同、约90％相同、约95％相同、约96％相同、约97％相同、约98％相同，约99％相同，100％相同。在一些方面，捕获探针可结合彼此约80％相同、约85％相同、约90％相同、约95％相同、约96％相同、约97％相同、约98％相同或约99％相同的分析物。在一些实施方式中，捕获域可以结合一种或多种分析物的保守区，其中保守区与目标分析物约80％相同、约85％相同、约90％相同、约95％相同、约96％相同、约97％相同、约98％相同、约99％相同，100％相同。[1049]在一些方面，捕获探针或多个捕获探针与序列不相似和/或不共享保守结构域的两种或更多种分析物(例如，核酸或蛋白质)相互作用。在一些实施方式中，捕获探针包括两个或更多个捕获域，每个捕获域与不同的分析物相互作用。在这样的实施方式中，两个或更多个捕获域的成员在捕获探针中可以彼此相邻和/或两个或更多个捕获域的成员在捕获探针中可以通过一个或多个域(例如，核酸域)彼此分开。例如，在一些方面，检测到的分析物组包括靶核酸或蛋白质的突变变化。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针能检测在致病状态期间单独突变的核酸或蛋白质组(例如，非同源核酸或蛋白质)。在一些方面，致病状态是癌症。[1050]在一些方面，捕获探针或多个捕获探针包括可用于检测通常使用诊断组检测的分析物的捕获域。在一些方面，捕获探针或多个捕获探针用于检测一种或多种分析物的变化。在一些方面，分析物变化包括分析物表达增加、分析物表达减少、核酸序列突变，或其任何组合中的一种或多种。在一些方面，分析物的变化与对象的致病状态相关和/或导致其表现。在一些方面，将检测到的变化与一个或多个参考分析物进行比较。[1051](vii)多肽捕获[1052]本文提供了用于鉴定生物样品中多肽位置的方法和材料。在一些实施方式中，分析物(例如，多肽分析物)可直接捕获在基材上。例如，多肽分析物可以被官能化基材上的胺基团捕获。在其它示例中，分析物(例如，多肽分析物)可通过直接附接至基材的分析物结合部分被捕获。在一些实施方式中，基材可填入直接附连到基材的分析物关注部分(analytemindingmoiety)以及直接附连到基材的空间条码化捕获探针。在其它实施方式中，分析物(例如，多肽分析物)可通过间接附连至基材的分析物结合部分被捕获。在一个示例中，基材可填入与分析物捕获剂结合的捕获探针，其中分析物捕获剂的分析物捕获域能与捕获探针的捕获域结合，并且分析物结合部分能与多肽分析物结合。[1053]在一些实施方式中，分析物(例如，多肽分析物)可被直接捕获或固定在基材上。直接固定可以通过将多肽分析物通过c‑末端氨基酸残基的羧酸与功能化的基材表面之间的酰胺键共价偶联至基材来实现。例如，基材(例如，玻璃盖玻片或载玻片)可以通过氨基‑硅烷化用氨基丙基三乙氧基硅烷进行官能化。基材表面通过与聚乙二醇(peg)‑nhs溶液过夜孵育而进一步钝化，且功能化的载玻片可以储存在真空干燥器中直至使用。叔丁氧羰基保护基团可以通过在使用前将基材与90％tfa(v/v于水中)孵育5小时来移除，从而暴露出用于肽固定的游离胺基团。所得的功能化基材对埃德曼降解(edmandegradation)和洗涤步骤的多次循环是稳定的。[1054]在一些实施方式中，用于捕获生物样品中的多肽的方法包括提供基材，其中分析物结合部分直接固定在基材上。在一些实施方式中，直接固定是通过基材的化学修饰和/或分析物结合部分的化学修饰来实现的。例如，可以用表面上的游离胺制备基材。当暴露于在c端残基上具有游离羧酸的分析物结合部分时，游离胺可与羧酸形成酰胺键，从而将分析物结合部分共价偶联至基材。基材和/或分析物结合部分可以以促进分析物结合部分与基材共价键合的任何方式进行修饰。可用于将分析物结合部分与基材共价结合的化学修饰的非限制性示例包括在本文中。[1055]在一些实施方式中，用于捕获分析物多肽的方法包括提供基材(例如，阵列)，其中分析物结合部分间接连接至基材。例如，分析物结合部分可以通过寡核苷酸(例如，捕获剂条码域或与捕获探针杂交的捕获剂条码域)或能够同时结合基材和分析物结合域的其它结构域间接附接至基材。捕获剂条码域在本文别处描述。捕获剂条码域可被修饰以包括裂解域，其可使用本文所述的任何化学物附接至基材。在一些实施方式中，捕获剂条码域可包括如本文所述的分析物捕获序列，其中分析物捕获序列可以与捕获探针的捕获域杂交。在一些实施方式中，可以通过使分析物捕获剂的分析物捕获序列与捕获探针的捕获域杂交来修饰包含捕获探针的基材(例如阵列)以捕获多肽分析物。[1056]在一些实施方式中，用于捕获分析物多肽的方法包括提供基材(例如，阵列)和向生物样品提供分析物捕获剂。例如，在干燥和固定切片组织样品后，组织样品可以被置于基材(例如空间阵列)上、再水合、封闭和透化(例如，3xssc、2％bsa、0.1％tritonx、1u/μlrna酶抑制剂，在4℃保持10分钟)，然后用荧光一抗(1∶100)和分析物捕获剂池(于3xssc、2％bsa、0.1％tritonx、1u/μlrna酶抑制剂中，4℃保持30分钟)染色。可以洗涤生物样品，盖上盖玻片(在甘油 1u/μlrna酶抑制剂中)，对检测到的分析物进行成像(例如，使用共聚焦显微镜或其它能够进行荧光检测的设备)，然后再次洗涤。可以使结合了分析物的分析物捕获剂从生物样品中释放(例如，生物样品可以用蛋白酶，例如蛋白酶k处理)并迁移到空间阵列。结合了分析物的分析物捕获剂的分析物捕获序列可被捕获探针捕获域捕获，并且捕获剂条码域可被延伸以产生空间加标的分析物捕获剂。空间加标的分析物捕获剂可以根据本文所述的空间工作流程进行处理。[1057]在一些实施方式中，用于捕获分析物多肽的方法包括在将分析物捕获剂引入生物样品之前向分析物捕获剂提供封闭探针(blockingprobe)。在一些实施方式中，封闭探针可以替代地或另外地提供在本文提供的任何再水合或封闭缓冲液中。在一些实施方式中，可以在结合到捕获探针捕获域之前使用与分析物捕获序列互补的封闭探针序列封闭分析物捕获剂分析物捕获序列。在将分析物捕获剂与生物样品和/或基材接触之前，封闭捕获剂条码域，特别是捕获剂条码域的游离3′端(例如，分析物捕获序列)，可以防止捕获剂条码域的分析物捕获序列，例如，防止多聚(a)尾与捕获探针捕获域的结合。在一些实施方式中，封闭分析物捕获剂分析物捕获域减少了非特异性背景染色。在一些实施方式中，封闭探针是可逆的，从而使封闭探针可以在分析物捕获剂与生物样品接触期间或之后从分析物捕获序列中移除。在一些实施方式中，封闭探针可以用rna酶处理(例如，rna酶h处理)来移除。[1058]在一些实施方式中，用于捕获生物样品中的多肽的方法包括主动转移(例如，电泳)。例如，将生物样品置于导电基材上并与包含一个或多个分析物结合部分的空间阵列接触。如本文所述，可以将电场施加到导电基材以促进多肽向分析物结合部分迁移。[1059]在一些实施方式中，用于鉴定生物样品中多肽的空间位置的方法包括确定捕获的多肽的序列。在一些实施方式中，捕获的多肽的序列通过用可检测标记物(例如，荧光团的放射性标记物)检测标记的氨基酸残基来确定。可用于标记捕获的多肽的可检测标记物的非限制性示例包括荧光团和放射性标记物。在一些实施方式中，多肽仅在特定氨基酸残基处被标记(例如，并非所有氨基酸残基都被标记)。在一些实施方式中，在生物样品与基材接触之前标记多肽。在一些实施方式中，采用标准偶联方案(参见hernandez等，newj.chem.41：462‑469(2017))，用荧光团对捕获的多肽进行标记。例如，视情况而定，多肽可以通过与atto647n‑nhs、atto647n碘乙酰胺、tmr‑nhs或jf549‑nhs反应进行标记，以标记赖氨酸(通过nhs)或半胱氨酸(通过碘乙酰胺)。此外，丝氨酸或苏氨酸磷酸化位点可以通过β消除来选择性地标记，然后通过硫醇进行偶联物添加以取代硫醇连接的荧光团，代替磷酸盐(参见stevens等，rapidcommun.massspecrtom.，15：2157‑2162(2005))。掺入多肽中的荧光团的数量是可以光谱分辨的任何数量。在一些情况下，使用四个或更多个荧光团。[1060]在一些实施方式中，被捕获的多肽被放射性标记。在一些实施方式中，特定氨基酸可以用同位素标记。用于标记氨基酸的同位素的非限制性示例包括3h、14c、15n、32p和125i。在一些实施方式中，在掺入多肽之前将同位素掺入所选氨基酸。在一些实施方式中，放射性标记的氨基酸可在多肽形成后掺入多肽中。[1061]在一些实施方式中，所捕获的多肽的序列使用埃德曼降解(并且在一些实施方式中，埃德曼降解的连续轮次)确定。在这种情况下，多肽被捕获，多肽序列可以通过在重复几轮埃德曼降解后对基材进行成像来解析。例如，在每次埃德曼反应后对基材进行成像，以捕获由于移除了反应副产物氨基酸而产生的可检测标记物。通过埃德曼降解获得的信息可用于鉴定多肽。在一些实施方式中，使用光学或荧光显微术使生物样品可视化或成像。[1062](viii)捕获后捕获分析物的富集[1063]在一些方面，目标分析物的空间分析包括捕获后的一个或多个富集步骤以针对目标分析物富集捕获的分析物。例如，可以选择或设计捕获域以选择性捕获比实施人员所希望分析的更多的分析物。在一些实施方式中，包括形成全部或部分捕获域的随机序列(例如，随机六聚体或类似序列)的捕获探针可用于以无偏的(unbiased)方式从生物样品捕获核酸。例如，具有包括随机序列的捕获域的捕获探针可用于从生物样品中一般地捕获dna、rna或两者。或者，捕获探针可以包括通常捕获mrna的捕获域。如本领域公知的，这可以基于与mrna的多聚‑a尾杂交。在一些实施方式中，捕获域包括与mrna的多聚‑a尾相互作用(例如杂交)的序列。这种序列的非限制性示例包括多聚‑tdna序列和多聚‑urna序列。在一些实施方式中，随机序列可以与多聚‑t(或多聚‑t类似物等)序列结合使用。因此，在捕获域包括聚‑t(或“聚‑t‑样”)寡核苷酸的情况下，它还可以包括随机寡核苷酸序列。[1064]在一些方面，在捕获比实施人员希望分析的更多的分析物之后，本文公开的方法包括富集特定捕获的分析物。在一些方面，方法包括富集分析物，所述分析物包括感兴趣的突变(例如，snp)、感兴趣的核酸和/或感兴趣的蛋白质。[1065]在一些实施方式中，本文提供的空间分析方法包括在分析物捕获之后选择性地富集一种或多种感兴趣的分析物(例如，目标分析物)。例如，可以通过将一种或多种寡核苷酸添加到捕获的分析物库中来富集一种或多种感兴趣的分析物。在一些实施方式中，可以通过将一种或多种寡核苷酸添加到阵列上捕获的分析物库来富集一种或多种感兴趣的分析物。在一些实施方式中，可以通过将一种或多种寡核苷酸添加到捕获的分析物的库中来富集一种或多种感兴趣的分析物，其中捕获的分析物的库已经从阵列释放(例如，移出)。在一些实施方式中，当捕获的分析物已从阵列释放时，一个或多个核苷酸可以与tso的部分和r1序列或其部分互补。在一些实施方式中，其它寡核苷酸包括用于引发聚合酶反应的序列。例如，与一种或多种感兴趣的分析物具有序列互补性的一种或多种引物序列可用于扩增一种或多种感兴趣的分析物，从而选择性地富集这些分析物。在一些实施方式中，一个或多个引物序列可以与捕获探针上的其它结构域互补(例如，r1序列或其部分，如上)，而不与分析物互补。在一些实施方式中，扩增式富集(例如，pcr)通过使用与感兴趣的一种或多种分析物互补的第一引物(或tso和捕获探针中的另一个结构域)或其互补物，和与捕获探针的某一区域互补的第二引物或其互补物，而发生。在一些实施方式中，捕获探针的该区域或其互补物远离捕获域的空间条形码，从而使扩增式富集扩增被捕获的一种或多种分析物及其相关的空间条形码，从而允许空间分析富集的一种或多种分析物。[1066]在一些实施方式中，两种或更多种捕获探针捕获两种或更多种不同的分析物，这些分析物从捕获的分析物库中富集(例如，同时或顺序地)。在一些实施方式中，pcr扩增式富集包括多轮扩增。例如，pcr扩增式富集可以包括巢式pcr反应，使用不同的引物，这些引物对一个或多个感兴趣的分析物具有特异性。在一些实施方式中，可以使用非pcr式扩增方法进行扩增式富集。非pcr扩增方法的非限制性示例是滚环扩增。其它非pcr扩增方法是本领域已知的。[1067]在一些实施方式中，与捕获的一个或多个感兴趣的分析物或其互补序列具有序列互补性的寡核苷酸可用于从捕获的分析物库中富集捕获的一个或多个感兴趣的分析物。在一些实施方式中，与捕获的一个或多个感兴趣的分析物(或捕获探针的另一个结构域)或其互补物具有序列互补性的寡核苷酸可以包括可用于富集过程的一个或多个功能部分。例如，具有与一种或多种感兴趣的分析物或其互补物互补的序列的生物素化寡核苷酸可以与感兴趣的分析物结合并且可以使用本领域已知的多种方法中的任一种(例如，链酶亲和素珠)利用生物素化‑链霉亲和素亲和力进行选择。在一些实施方式中，具有与一种或多种感兴趣的分析物或其互补物互补的序列的寡核苷酸包括可用于富集过程的磁性部分(例如，磁珠)。[1068]另外或可替代地，可以使用多种方法中的任一种来向下选择(例如，移除)一种或多种分析物(例如，线粒体dna或rna)。在一些实施方式中，对不感兴趣的分析物的这种向下选择可以导致对感兴趣的其它类型的分析物的改进的捕获。例如，可以将探针给予选择性地与核糖体rna(rrna)杂交的样品，从而减少样品中rrna的集和浓度。在一些实施方式中，由于样品中存在的非特异性rna的减少，这种向下选择可能会导致对其它类型的rna的改进的捕获。另外或或者，双链特异性核酸酶(dsn)处理可去除rrna(参见，例如，archer等，在cdna阶段从rna‑seq文库选择性和灵活去除有问题的序列(selectiveandflexibledepletionofproblematicsequenceswfromrna‑seqlibrariesatthecdnastage)，bmcgenomics，15401，(2014)，其全部内容通过引用纳入本文)。在一些实施方式中，羟基磷灰石层析可用于移除丰富的物质(例如，rrna)。[1069](ix)rna模板化连接[1070]在本文提供的方法的一些实施方式中，rna模板化连接用于询问生物样品(例如ffpe组织切片)中的空间基因表达。rna模板连接能够灵敏地测量感兴趣的特定核酸分析物，否则这些分析物可能会用全转录组学方法进行分析。它具有与常见组织化学染色相容的优点，适用于分析已有十年历史的材料(例如ffpe样品)和极小的显微解剖组织碎片。[1071]在一些方面，rna模板化连接的步骤包括：(1)探针(例如dna探针)对与组织切片内的rna(例如福尔马林固定rna)的杂交；(2)相邻退火探针对的原位连接；(3)rna酶h处理，其(i)从组织中释放rna模板化连接产物(例如，释放到溶液中)用于下游分析，和(ii)破坏不需要的dna模板化连接产物；和任选地，(4)rna模板化的连接产物的扩增(例如，通过多重pcr)。[1072]在一些方面，本文公开了直接检测rna靶‑dna探针双链体而不首先通过逆转录将rna转化为cdna的方法。在一些方面，rna模板化的连接可以包括dna连接酶。在一些方面，rna模板化的连接可包括rna连接酶。在一些方面，rna模板化的连接可以包括t4rna连接酶。[1073]在一些方面，rna模板化连接用于检测rna、确定rna序列同一性和/或表达监测和转录物分析。在一些方面，rna模板化连接允许检测核酸中的特定变化(例如，突变或单核苷酸多态性(snp))、特定核酸的检测或表达、或特定核酸组的检测或表达(例如，在类似的细胞途径中或在特定病理中表达)。在一些实施方式中，包括rna模板化连接的方法用于分析核酸，例如，通过基因分型、dna拷贝数或rna转录物的定量、样品内特定转录物的定位等。在一些方面，本文提供的包括rna模板化的连接的系统和方法能鉴定单核苷酸多态性(snp)。在一些方面，此类系统和方法能识别突变。[1074]在一些方面，本文公开了检测rna表达的方法，包括使第一探针、第二探针和连接酶(例如，t4rna连接酶)接触。在一些实施方式中，第一探针和第二探针被设计为能与靶序列杂交，从而使第一探针的5′末端和第二探针的3′末端相邻并且可以连接，其中至少第一探针的5′‑末端核苷酸和至少第二探针的3′‑末端核苷酸是脱氧核糖核苷酸(dna)，并且其中靶序列包括(例如，包含)核糖核苷酸(rna)。杂交后，如果目标样品中存在靶序列，则连接酶(例如，t4rna连接酶)将第一探针和第二探针连接起来，但如果目标序列不存在于目标样品中，则连接酶(例如，t4rna连接酶)不连接第一探针和第二探针。生物样品中靶序列的存在与否可以通过确定第一和第二探针是否在连接酶存在下连接来确定。可以使用多种方法中的任一种来确定第一和第二探针是否在连接酶存在下连接，包括但不限于对连接产物测序、将连接产物与检测探针杂交(所述检测探针仅在第一和第二探针在连接酶存在下连接时杂交)、限制酶分析和本领域已知的其它方法。[1075]在一些方面，使用包括rna模板化的连接的方法分析两种或更多种rna分析物。在一些方面，当分析两种或更多种分析物时，使用对每种rna分析物具有特异性(例如，特异性杂交)的第一和第二探针。[1076]在一些方面，在本文提供的rna模板化的连接方法中使用三种或更多种探针。在一些实施方式中，三种或更多种探针被设计为能与靶序列杂交，从而使三种或更多种探针彼此相邻杂交，从而可以连接相邻探针的5′和3′末端。在一些实施方式中，生物样品中靶序列的存在与否可以通过确定三种或更多种探针是否在连接酶存在下连接来确定。[1077]在一些方面，第一探针是dna探针。在一些方面，第一探针是嵌合dna/rna探针。在一些方面，第二探针是dna探针。在一些方面，第二探针是嵌合dna/rna探针。[1078]在某些方面，rna模板化的连接方法利用t4rna连接酶2有效地接合在固定rna目标序列上原位杂交的相邻嵌合rna‑dna探针对。随后用rna酶h处理释放rna模板化的连接产物(例如，进入溶液)用于下游分析。[1079](x)感兴趣的区域[1080]生物样品可能会具有显示可能指示疾病的存在或疾病表型的发展的形态特征的区域。例如，肿瘤活检样品内特定部位的形态学特征可以指示对象癌症的侵袭性、治疗抗性、转移潜力、迁移、阶段、诊断和/或预后。肿瘤活检样品中特定部位形态学特征的变化通常与特定部位细胞中分析物水平或表达的变化相关，这反过来又可用于提供有关对象中侵袭性、癌症的治疗抗性、转移潜能、迁移、分期、诊断和/或预后的信息。被选择用于特定分析的生物样品内的区(region)或区域(area)(例如，生物样品中具有感兴趣的形态特征的区域)通常被描述为“感兴趣的区域”。[1081]生物样品中的感兴趣区域可用于分析生物样品中的特定感兴趣区域，从而将实验和数据收集集中到生物样品的特定区域(而不是整个生物样品)。这导致生物样品分析的时间效率提高。[1082]可以使用各种不同的技术在生物样品中识别感兴趣的区域，例如扩展显微镜、亮场显微镜、暗场显微镜、相衬显微镜、电子显微镜、荧光显微镜、反射显微镜、干涉显微镜、共焦显微镜、以及视觉识别(例如，通过眼睛)及其组合。例如，可以对生物样品进行染色和成像以识别感兴趣的区域。在一些示例中，感兴趣区域可以对应于细胞结构的特定结构。在一些实施方式中，可以在可视化之前对生物样品进行染色以提供生物样品的不同区域之间的对比度。可以根据生物样品的类型和要染色的细胞区域来选择染色剂的类型。在一些实施方式中，可以使用多于一种染色剂来显现生物样品的不同方面，例如样品的不同区域、特定细胞结构(例如细胞器)或不同细胞类型。在其它实施方式中，可以在不染色生物样品的情况下使生物样品可视化或成像。[1083]在一些实施方式中，在生物样品与空间阵列接触之前对生物样品进行染色和成像以选择用于空间分析的样品。在一些实施方式中，染色包括应用如本文所述的基准标志物，包括荧光、放射性、化学发光或比色可检测标志物。在一些实施方式中，生物样品的染色和成像允许用户识别用户希望评估的特定样品(或感兴趣区域)。[1084]在一些示例中，阵列(例如，本文所述的任何示例性阵列)可仅与生物样品的部分(例如，细胞、组织区段或感兴趣区域)接触。在一些示例中，生物样品仅与阵列的部分接触(例如，本文所述的任何示例性阵列)。在一些实施方式中，可以选择性地裂解和分析与生物样品的感兴趣区域(例如，感兴趣区域的近端)对应的阵列上的捕获探针。例如，阵列上的捕获探针可以在对应于生物样品的感兴趣区域的区域之外被去活化或消除。在一些实施方式中，可以通过使用光选择性地裂解包括光可裂解键和在对应于生物样品的感兴趣区域的区域中的阵列上的捕获探针。反射镜、反射镜阵列、透镜、移动台和/或光掩模可用于将光引导至阵列的区域，其对应于生物样品中一个或多个感兴趣区域之外的区域。一些实施方式包括利用光使捕获探针(例如包含如本文所述的光可裂解键的捕获探针)失活或消除。在一些实施方式中，可以使用激光，例如扫描激光，来停用或消除捕获探针。在一些实施方式中，多个捕获探针中被消除的成员可以被洗掉。在一些实施方式中，感兴趣的区域可以用不同的重金属标记，并且在质谱鉴定之前，激光可以顺序地烧蚀这些感兴趣的区域。例如，激光可以通过紫外光破坏dna、加热、诱导防止捕获探针移动到下一步的化学反应、诱导光可裂解键的光裂解或其组合来使捕获探针失活或消除。在一些实例中，阵列的部分可失活以使其不与生物样品中的分析物相互作用(例如，光学失活、化学失活、热失活或阵列中捕获探针的阻断(例如，使用阻断性探针))。在一些示例中，可以从生物样品移出感兴趣区域，然后可以将感兴趣区域接触到阵列(例如，本文所述的任何阵列)。可以使用显微手术、激光捕获显微切割、分块、切片机、切割、胰蛋白酶消化、标记和/或荧光辅助细胞分选等从生物样品中移出感兴趣区域。[1085]在一些示例中，感兴趣区域可以被透化或裂解，而感兴趣区域之外的区域不被透化或裂解(例如，kashyap等.scirep.2016；6：29579，通过引用其全文方式纳入本文)。例如，在一些实施方式中，感兴趣的区域可以与包含透化或裂解试剂的水凝胶接触。在一些实施方式中，感兴趣区域之外的区域不与包含透化或裂解试剂的水凝胶接触。[1086](f)分区[1087]如上所述，在一些实施方式中，可任选地将样品分离成单细胞、细胞群或比原始未破碎样品小的其他片段/碎片。可以分析样品的这些较小部分中的每一个以获得样品的空间分辨分析物信息。[1088]对于已被分离成更小片段的样品‑特别是对于已被分解、解离或以其他方式分离成个体细胞的样品‑分析片段的一种方法涉及将片段分隔进入个体分区(例如液滴)，然后分析分区的内容物。通常，每个分区都保持其自身内容物与其他分区的内容物的分离。例如，分区可以是乳液中的液滴。[1089]分区可以在流体流中流动。所述分区可包括例如具有围绕内部流体中心或核心的外部屏障的微泡。在某些情况下，分区可包括多孔基材，其能够在其基材内夹带和/或保持材料。所述分区可以是第二相内第一相的液滴，其中所述第一相和第二相是不混溶的。例如，分区可以是非水性连续相(例如油相)内的水性流体液滴。在另一实例中，该分区可为水相中非水性流体的液滴。在一些示例中，分区可以在油包水乳液或水包油乳液中提供。各种不同的容器在例如美国专利申请公开号2014/0155295中描述，其全部内容通过引用纳入本文。例如，在美国专利申请公开号2010/0105112中描述了用于在非水或油连续相中产生稳定液滴的乳液系统，其全部内容通过引用纳入本文。[1090]对于乳液中的液滴，可通过例如将水性流体中的颗粒流动流引入非水性流体的流动流，使得液滴在两个流的接合部产生来实现将个体颗粒分配到离散分区。可对流体特性(例如，流体流速、流体粘度等)、颗粒特性(例如，体积分数、颗粒体积、颗粒浓度等)、微流体结构(例如，通道几何形状等)和其它参数进行调整以控制所得分区的占用率(例如，每个分区的分析物数量、每个分区的珠数量等)。例如，可以通过以分析物的特定浓度和/或流速提供水性流来控制分区占用率。[1091]为了生成单个分析物分区，可以选择不混溶流体的相对流速，使得平均而言，分区每个分区可以包含少于一个分析物，以确保被占用的分区主要是单独占用的。在某些情况下，多个分区中的分区最多可包含一个分析物。在一些实施方式中，可以选择或调整各种参数(例如，流体性质、颗粒性质、微流体结构等)，使得大多数分区被占用，例如，仅有小百分比的未占用分区。可以控制流和信道架构以确保给定数量的单占用分区、小于某一水平的未占用分区和/或小于某一水平的多占用分区。[1092]本文所述的通道段可以耦合到各种不同的流体源或接收部件中的任何一个，包括储层、管道、歧管或其他系统的流体部件。如将理解的，微流体通道结构可以具有各种几何形状。例如，微流体通道结构可以具有一个或多个通道连接。作为另一实例，微流体通道结构可具有2、3、4或5个通道段，每个通道段携带在通道接合部相遇的颗粒。流体可以通过一个或多个流体流动单元被引导沿着一个或多个通道或储层流动。流体流动单元可包括压缩机(例如，提供正压力)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。流体也可以通过施加的压差、离心力、电动泵、真空、毛细管和/或重力流来控制。[1093]除了细胞和/或分析物之外，分区可以包括其它成分，特别是一个或多个珠。分区可以包括单个凝胶珠、单个细胞珠或单个细胞珠和单个凝胶珠两者。可以将各种不同的珠纳入分区中。在一些实施方式中，例如，可以将非条码化珠纳入分区中。例如，在纳入分区中的生物颗粒(例如，细胞)携带一个或多个条形码(例如，空间条形码、umi及其组合)的情况下，珠可以是非条码化珠。[1094]在一些实施方式中，携带条形码的珠可以纳入分区中。一般来说，个体珠可以耦合到任意数量的个体核酸分子，例如，从一个到几十个到几十万个甚至数百万个个体核酸分子。个体核酸分子的相应条形码可以包括共同序列段或相对共同序列段以及耦合到同一珠的不同个体核酸分子之间的可变或独特序列段。例如，核酸分子(例如，寡核苷酸)可以通过可释放的键(例如，二硫键)与珠偶联，其中核酸分子可以是或包括条形码。例如，条形码可以在液滴生成之前、之后或同时注入液滴。将条形码传递到特定分区使稍后将个体生物颗粒的特性归因于特定分区。条形码可以例如在核酸分子(例如寡核苷酸)上通过任何合适的机制传递到分区。条码化核酸分子可以通过微胶囊传递到分区。在一些情况中，微胶囊可包括珠。同一珠可与一个或多个其它核酸分子耦合(例如，通过可释放连接)。[1095]所述核酸分子可包括可用于后续加工的功能域。例如，功能域可包括测序仪特异性流动池附接序列(例如，用于测序系统的p5序列)和测序引物序列(例如，用于测序系统的r1引物)中的一个或多个。核酸分子可包括用于对样品(例如dna、rna、蛋白质等)进行条码化的条形码序列。在某些情况下，条形码序列可以是珠特异性的，使得条形码序列对于耦合到同一珠的所有核酸分子是共同的。可选地或另外，条形码序列可以是分区特异性的，使得条形码序列对于耦合到被划分到相同分区中的一个或多个珠的所有核酸分子是共同的。核酸分子可包括特定引发序列，例如mrna特定引发序列(例如，多聚(t)序列)、靶向的引发序列和/或随机引发序列。核酸分子可包括锚定序列以确保特定引发序列在序列末端(例如，mrna的)杂交。例如，锚定序列可包括核苷酸的随机短序列，例如1‑聚体、2‑聚体、3‑聚体或更长的序列，其可确保多聚(t)片段更有可能在mrna的多聚(a)尾的序列末端杂交。[1096]核酸分子可包括独特分子识别序列(例如，独特分子标识符(umi))。在一些实施方式中，独特分子识别序列可包括约5至约8个核苷酸。或者，独特分子识别序列可包括少于约5个或多于约8个核苷酸。独特分子识别序列可以是在耦合到单个珠的个体核酸分子之间变化的独特序列。在一些实施方式中，独特分子识别序列可以是随机序列(例如，随机n‑聚体序列)。例如，umi可以提供捕获的起始mrna分子的独特标识符，以便能够对原始表达rna的数量进行定量。[1097]分区还可以包括一种或多种试剂。例如条形码之类的独特标识符可在液滴生成之前、之后或与液滴生成同时注入到液滴中，例如经由微胶囊(例如，珠)。微流体通道网络(例如，在芯片上)可用于生成分区。替代机制也可用于个体生物颗粒的划分，包括多孔膜，通过多孔膜，细胞的水性混合物被挤压成非水流体。[1098]在一些实施方式中，条形码核酸分子最初可与微胶囊结合，然后从微胶囊释放。条形码核酸分子的释放可以是被动的(例如，通过扩散出微胶囊)。另外或可选择地，可在施加使条码化核酸分子离解或从微胶囊释放的刺激物时从微胶囊释放。这种刺激可以破坏微胶囊，这种相互作用使条码化核酸分子与微胶囊或在微胶囊内耦合，或两者结合。这种刺激可以包括，例如，热刺激、光刺激、化学刺激(例如，ph值的改变或还原剂的使用)、机械刺激、辐射刺激、生物刺激(例如，酶)或其任何组合。[1099]在一些实施方式中，一个或多个条形码(例如，空间条形码、umi或其组合)可作为分析物的部分引入到分区中。如前所述，条形码可直接结合到分析物，或可形成捕获探针或分析物捕获剂的部分，所述捕获探针或分析物捕获剂与分析物杂交、偶联或以其他方式关联，使得当分析物被引入分区时，条形码也被引入。如上所述，图16示出了用于将个体分析物(例如，细胞)划分进入离散分区的微流体通道结构的示例。[1100]图16示出了用于将个体分析物(例如，细胞)划分进入离散分区的微流体通道结构的示例。通道结构可以包括在通道接合点1605处连通的通道段1601、1602、1603和1604。在操作中，包括悬浮的生物颗粒(或细胞)1607的第一水性流体1606可以沿着通道段1601输送到接合部1605中，而与水性流体1606不混溶的第二流体1608被输送到来自每个通道段的1602和1603的接合部1605来建立流入通道段1604并流离接合部1605的第一水性流体1606的离散液滴1609，1610。通道段1604可以流体耦合到出口储器，其中可以存储和/或收获离散的液滴。产生的离散液滴可包括个体生物颗粒1607(例如液滴1609)。产生的离散液滴可包括超过一个的个体生物颗粒1607。产生的离散液滴可不包括生物颗粒1607(例如，液滴1610)。每个离散分区可保持其自身内容物(例如，个体生物颗粒1607)与其他分区的内容物的分离。[1101]图17a示出了微流体通道结构1700的另一个示例，该微流体通道结构1700用于将珠递送到液滴。通道结构包括通道段1701，1702，1703，1704和1705，其在通道接合部1706处连通。在操作期间，通道段1701可以将包括多个珠1708的水性流体1707沿着通道段1701输送到接合部1706中。多个珠1708可以来自珠的悬浮液。例如，通道段1701可以连接到包括珠1708的水性悬浮液的储器。通道段1702可以将包括多个颗粒1709(例如，细胞)的水性流体1707沿着通道段1702输送到接合部1706中。在一些实施方式中，第一通道段1701或第二通道段1702中或两段中的水性流体1707可包括一种或多种试剂，如下所述。[1102]与水性流体1707(例如，油)不混溶的第二流体1710可以从通道段1703和1704中的每一个被递送到接合部1706。当来自通道段1701和1702中的每一个的水性流体1707和来自通道段1703和1704中的每一个的第二流体1710在通道接合部1706处相遇时，水性流体1707可以在第二流体1710中被分配为离散的液滴1711并沿着通道段1705流离接合部1706。通道段1705可以将离散的液滴输送到与通道段1705流体耦合的出口储器，在那里可以收集液滴。[1103]作为替代方案，通道段1701和1702可以在接合点1706的上游的另一个接合点处相遇。在这样的接合部，珠和生物颗粒可形成混合物，该混合物沿着另一个通道被引导到接合部1706以产生液滴1711。该混合物可以以交替的方式提供珠和生物颗粒，从而使例如液滴包括单个珠和单个生物颗粒。[1104]第二流体1710可包括油，例如氟化油，其包括用于稳定所得液滴的含氟表面活性剂，例如，用于抑制所得液滴1711的随后聚结。[1105]本文描述的分区可以包括小体积，例如，小于约10微升(μl)、5μl、1μl、900皮升(pl)、800pl、700pl、600pl、500pl、400pl、300pl、200pl、100pl、50pl、20pl、10pl、1pl、500纳升(nl)、100nl、50nl或更小。[1106]在前面的讨论中，在不同流体流的接合点处形成了带有珠的液滴。在一些实施方式中，液滴可以通过基于重力的划分方法形成。[1107]图17b示出了具有用于受控划分的几何特征的微流体通道结构1750的另一示例的截面图。通道结构1750可以包括在通道接合部1758(或交叉点)处与储器1754连通的通道段1752。在一些情况下，通道结构1750及其组件中的一个或多个可对应于通道结构1700及其组件中的一个或多个。[1108]包含多个颗粒1756的水性流体1760可沿通道段1752输送至接合点1758以与储器1754中与水性流体1760不混溶的第二流体1762(例如，油等)相遇，从而产生流入储器1754的水性流体1760的液滴1764。在水性流体1760和第二流体1762相遇的接合部1758处，可以基于某些因素，例如接合部1758处的流体动力，两种流体1760，1762的相对流速，流体性质，以及通道结构1750的某些几何参数(例如，δh等)形成液滴。通过在接合部1758处从通道段1752连续注入水性流体1760，可以在储器1754中收集多个液滴。[1109]生成的离散液滴可包括多个颗粒1756中的一个或多个颗粒。如本文他处所述，颗粒可以是任何颗粒，例如珠、细胞珠、凝胶珠、生物颗粒、生物颗粒的大分子成分或其它颗粒。或者，产生的离散液滴可不包括任何颗粒。[1110]在一些实例中，水性流体1760可具有颗粒1756的基本均匀浓度或频率。如本文他处所述，颗粒1756(例如，珠)可以从单独的通道(图17中未示出)引入通道段1752中。颗粒1756在通道段1752中的频率可通过控制其中颗粒1756被引入到通道区段1752的频率和/或在通道段1752和单独通道中流体的相对流速来控制。在一些情况下，颗粒1756可以从多个不同的通道被引入到通道段1752中，并且频率被相应地控制。在某些情况下，可以通过分开的通道引入不同的颗粒。例如，第一单独通道可引入珠，而第二单独通道可将生物颗粒引入通道段1752中。引入珠的第一单独通道可以在引入生物颗粒的第二单独通道的上游或下游。[1111]在一些实例中，第二流体1762可不经受和/或不导向任何流入或流出储器1754的流。例如，第二流体1762可以在储器1754中基本静止。在一些情况下，第二流体1762可以在储器1754内流动，但不能流入或流出储器1754，例如通过向储器1754施加压力和/或受到在接合部1758处进入的水性流体1760的影响。或者，第二流体1762可经历和/或被引导流入或流出储器1754。例如，储器1754可以是引导第二流体1762从上游至下游、输送产生的液滴的通道。[1112]在接合点1758处或附近的通道结构1750可具有某些几何特征，其至少部分地确定由通道结构1750形成的液滴的体积和/或形状。通道段1752可具有第一截面高度h1，并且储器1754可具有第二截面高度h2。第一截面高度h1和第二截面高度h2可以不同，从而在接合部1758处，有δh的高度差。第二截面高度h2可以大于第一截面高度h1。在一些情况下，储器此后可逐渐增加截面高度，例如，它离接合部1758越来越远。在一些情况下，储器的截面高度可根据接合部1758处或附近的扩展角β而增加。高度差δh和/或扩张角β可使舌片(在接合点1758处离开通道段1752和在液滴形成之前进入储器1754的水性流体1760的部分)深度增加，并有助于中间形成液滴的曲率减小。例如，液滴体积可能随着高度差的增加和/或扩展角的增加而减少。[1113]高度差δh可至少约为1μm。或者，高度差可为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500μm或更多。或者，高度差可为至多约500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1μm或更小。在一些情况下，扩展角β可以是约0.5°至约4°、约0.1°至约10°或约0°至约90°的范围。例如，扩展角可至少约为0.01°、0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°或更大。在一些情况下，扩展角可以是至多约89°、88°、87°、86°、85°、84°、83°、82°、81°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°、1°、0.1°、0.01°或更小。[1114]在一些实例中，进入接合点1758的水性流体1760的流速可在约0.04微升(μl)/分钟(min)与约40μl/分钟之间。在一些实例中，进入接合点1758的水性流体1760的流速可在约0.01微升(μl)/分钟(min)与约100μl/分钟之间。或者，进入接合部1758的水性流体1760的流速可小于约0.01μl/min。或者，进入接合点1758的水性流体1760的流速可大于约40μl/min，例如45μl/min、50μl/min、55μl/min、60μl/min、65μl/min、70μl/min、75μl/min、80μl/min、85μl/min、90μl/min，95μl/min、100μl/min、110μl/min、120μl/min、130μl/min、140μl/min、150μl/min或更高。在较低流速下，例如约小于或等于10微升/分钟的流速，液滴半径可能不取决于进入接合部1758的水性流体1760的流速。第二流体1762在储器1754中可以是静止的或基本上静止的。或者，第二流体1762可以流动，例如以上述针对水性流体1760描述的流速。[1115]虽然图17b说明高度差δh在接合部1758处陡增(例如，阶梯增加)，高度差可逐步增加(例如，从约0μm到最大高度差)。或者，高度差可以从最大高度差逐步减小(例如，锥形)。如本文所用，高度差的逐步增加或减少可以指高度差的连续增量增加或减少，其中高度曲线的任何一个差分段与该高度曲线的紧邻的差分段之间的角度大于90°。例如，在接合部1758，通道的底壁和储器的底壁可以以大于90°的角度相交。或者或者另外，所述通道的顶壁(例如，顶板)和所述储器的顶壁(例如，顶板)可以大于90°的角度相交。逐步增加或减少可以是线性的或非线性的(例如，指数的、正弦的等)。替代地或另外地，高度差可以线性或非线性可变地增加和/或减少。虽然图17b显示扩展的储器截面高度为线性(例如，恒定扩展角β)，但截面高度可以非线性扩展。例如，储器可以至少部分地由具有可变扩展角的圆顶状(例如，半球形)形状限定。截面高度可以以任何形状扩展。[1116]图17c描述了一个工作流，其中细胞与带有条形码的珠1770一起被划分进入液滴。参见图17a。液滴形成一个隔离的反应室，在其中细胞可被裂解1771，然后细胞内的目标分析物可根据先前描述的方法被捕获1772和扩增的1773、1774。在序列文库制备清理1775之后，根据本文所述的方法对材料进行测序和/或定量1776。[1117]应当注意的是，虽然图17c中的示例工作流包括专门用于mrna分析的步骤，但是可以对多种其他分析物(包括先前描述的任何分析物)实施类似工作流。[1118]举例来说，在如图17c所示分析样品rna的上下文中，释放的核酸分子之一(例如，来自珠)的多聚(t)片段可与mrna分子的多聚(a)尾杂交。逆转录可产生mrna的cdna转录物，该转录物包括核酸分子的每个序列区段。如果核酸分子包含一个锚定序列，它将更有可能与mrna的多聚(a)尾的序列末端杂交并起始逆转录。[1119]在任何给定的分区内，个体mrna分子的所有cdna转录物都可以包含一个共同的条形码序列区段。然而，由给定分区内的不同mrna分子产生的转录物可以在独特分子识别序列区段(例如，umi区段)处变化。有益的是，即使在随后对给定分区的内容物进行任何扩增之后，不同umi的数目也可以指示源自给定分区的mrna的量。如上所述，转录物可被扩增、净化和测序以鉴定mrna的cdna转录物的序列，以及对条形码区段和umi区段进行测序。在描述多聚(t)引物序列的同时，其它靶向或随机引发序列也可用于起始逆转录反应。同样地，尽管描述为将条码化寡核苷酸释放到分区中，但在某些情况下，结合到珠的核酸分子可用于杂交并捕获珠固相上的mrna，例如，以促进rna与其他细胞内容物的分离。[1120]在一些实施方式中，分区包括前体，所述前体包括具有反应性或能够被活化以使其变得具有反应性的官能团的前体可与其它前体聚合以生成包括所述活化或可活化官能团的凝胶珠。然后可以使用官能团将其它物质(例如，二硫键接头、引物、其他寡核苷酸等)附接到凝胶珠上。例如，特征为羧酸(cooh)基团的一些前体可与其它前体共聚合以形成也包括cooh官能团的珠。在一些情况中，丙烯酸(包括游离cooh基团的物质)、丙烯酰胺和双(丙烯酰)胱胺可共聚合在一起以产生包括游离cooh基团的珠。珠的cooh基团可被活化(例如，经由1‑乙基‑3‑(3‑二甲氨基丙基)碳二亚胺(edc)和n‑羟基琥珀酰亚胺(nhs)或4‑(4，6‑二甲氧基‑1，3，5‑三嗪‑2‑基)‑4‑甲基吗啉氯化物(dmtmm))以使其具有反应性(例如，与胺官能团反应，其中edc/nhs或dmtmm用于活化)。活化的cooh基团随后可与连接到珠的部分的适当的物质(例如，包括胺官能团的物质，其中羧酸基团被活化以可与胺官能团反应)反应。[1121]在一些实施方式中，珠可由包括可降解化学交联剂(例如bac或胱胺)的材料形成。这种可降解交联剂的降解可以通过各种机制来实现。在一些实例中，珠可与可引起氧化、还原或其它化学变化的化学降解剂接触。例如，化学降解剂可以是还原剂，例如二硫苏糖醇(dtt)。还原剂的其他实例可包括β‑巯基乙醇、(2s)‑2‑氨基‑1，4‑二巯基丁烷(二硫丁胺或dtba)、三(2‑羧乙基)膦(tcep)或其组合。还原剂可降解形成珠的凝胶前体之间形成的二硫键，从而降解珠。[1122]可降解珠可包括具有不稳定键的一种或多种物质，使得当珠/物质暴露于适当的刺激物时，键被破坏从而珠在分区内降解。不稳定键可以是化学键(例如，共价键、离子键)或者可以是另一种类型的物理相互作用(例如，范德华相互作用、偶极‑偶极相互作用等)。在一些实施方式中，用于生成珠的交联剂可包括不稳定键。当暴露在适当的条件下时，不稳定的键会断裂，珠会降解。例如，特征为胱胺并通过二硫键连接到条形码序列的聚丙烯酰胺珠可与油包水乳液液滴内的还原剂结合。在液滴内，还原剂可以破坏各种二硫键，导致珠降解，条形码序列释放到液滴的水性内部环境中。在另一实例中，在碱性溶液中加热具有珠结合条形码序列的液滴也可导致珠降解并将所附接的条形码序列释放到液滴的水性内部环境中。游离物质(例如，寡核苷酸、核酸分子)可以与分区中包含的其他试剂相互作用。[1123]与不降解的珠相比，当对珠施加适当的刺激时，可降解珠可用于更快速地从珠释放附接的物质(例如，核酸分子、条形码序列、引物等)。例如，对于结合到多孔珠的内表面的物质或在包封的物质的情况下，在珠降解时，该物质可对溶液中的其他物质具有更大的移动性和可及性。在一些实施方式中，物质还可经由可降解接头(例如，二硫键接头)附接到可降解珠。所述可降解接头可对与所述可降解珠相同的刺激作出响应，或者所述两种可降解物质可对不同的刺激作出响应。例如，条形码序列可以通过二硫键附接到包含胱胺的聚丙烯酰胺珠。当条码化珠暴露于还原剂时，珠降解并且在条形码序列和珠之间的二硫键和珠中胱胺的二硫键断裂时释放空间条形码序列。[1124]任何适当数量的物质(例如，引物，条码化寡核苷酸)可与珠粒相关联，使得在从珠释放时，物质(例如，引物，例如，条码化寡核苷酸)以预定浓度存在于分区中。可选择该预定浓度以促进某些反应以在分区内产生测序文库(例如扩增)。在某些情况下，引物的预定浓度可通过产生带有核酸分子(例如寡核苷酸)的珠的过程来限制。[1125]如将从上述描述中了解到的，虽然被称为珠的降解，但在许多实施方式中，降解可指结合或夹带物质与珠的解离，具有或不具有物理珠本身的结构降解。例如，由于化学环境的变化，夹带的物质可以通过渗透压差从珠中释放出来。举例来说，由于渗透压差引起的珠孔体积的改变通常可以在珠本身没有结构降解的情况下发生。在一些情况中，由于珠的透化溶胀导致的孔体积增大可使珠内夹带的物质释放。在一些实施方式中，由于孔体积收缩，珠的透化收缩可导致珠更好地保留夹带的物质。[1126]许多化学触发物可用于触发分区内珠的降解。这些化学变化的实例可包括但不限于ph介导的珠内组分完整性的改变、通过交联键的裂解降解珠的组分以及珠的组分的解聚。[1127]在某些实施方式中，溶液ph值的变化(例如ph值的增加)可触发珠的降解。在其他实施方式中，暴露于水溶液(例如水)可触发水解降解，从而引发珠的降解。在某些情况下，任何刺激组合都可能引发珠降解。例如，ph值的变化可以使化学试剂(例如dtt)成为有效的还原剂。[1128]在应用热刺激时，也可以诱导珠释放其内容物。温度的变化会引起珠的各种变化。例如，热会使固体珠液化。热的变化会导致珠熔化，使珠的部分降解。在其他情况中，热可增加珠组分的内部压力，使得珠破裂或爆炸。热也可以作用于热敏聚合物作为材料来构建珠。[1129]除了珠和分析物之外，形成的分区可以包括各种不同的试剂和物质。例如，当裂解试剂存在于分区内时，裂解试剂可促进分区内分析物的释放。裂解剂的实例包括生物活性试剂，例如用于裂解不同细胞类型的裂解酶，例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物等，例如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌素、唇膏酶、基他酶、溶细胞酶和多种其它市售的裂解酶，例如来自西格玛奥德里奇公司(密苏里州圣路易斯)，以及其他市售的裂解酶。其他裂解剂可另外或可选地共划分以使分析物释放到分区中。例如，在某些情况下，基于表面活性剂的裂解溶液可用于裂解细胞，尽管这些溶液对于表面活性剂可干扰稳定乳液的基于乳液的系统可能不太理想。在一些实施方式中，裂解溶液可包括非离子表面活性剂，例如tritonx‑100和tween20。在一些实施方式中，裂解溶液可包括离子表面活性剂，例如肌氨酰和十二烷基硫酸钠(sds)。电穿孔、热的、声学的或机械的细胞分裂也可用于某些实施方式中，例如，基于非乳液的分配，例如可作为液滴划分的补充或代替液滴划分的分析物的封装，在细胞破裂后，囊膜的任何孔体积足够小以保留给定大小的核酸片段。[1130]可与分区中的分析物共划分的其它物质的实例包括但不限于dna酶和rna酶失活剂或抑制剂(例如蛋白酶k)、螯合剂(例如edta)以及用于去除或以其它方式降低不同细胞裂解物组分对核酸后续加工的负活性或影响的其它试剂。其他试剂也可以被共划分，包括用于片段化dna的核酸内切酶、dna聚合酶和用于扩增核酸片段和将条形码分子标签附接到扩增的片段的dntp。[1131]其他试剂还可包括逆转录酶，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和寡核苷酸，以及可用于模板转换的转换寡核苷酸(在本文中也称为“转换寡核苷酸”或“模板转换寡核苷酸”)。在一些实施方式中，模板转换可用于增加edna的长度。模板转换可用于将预先定义的核酸序列附加到cdna。在模板转换的实例中，cdna可由模板(例如，细胞mrna)的逆转录产生，其中具有末端转移酶活性的逆转录酶可以非模板依赖的方式向cdna添加其它的核苷酸(例如，多聚(c))。转换寡核苷酸可以包括与其它核苷酸互补的序列，例如多聚(g)。cdna上的其它核苷酸(例如，多聚(c))可与转换寡核苷酸上的其它核苷酸(例如，多聚(g))杂交，由此转换寡核苷酸可被逆转录酶用作模板以进一步延伸cdna。[1132]模板转换寡核苷酸可以包括杂交区和模板区。杂交区可以包括能够与靶标杂交的任何序列。在一些情况中，杂交区包括一系列g碱基以与cdna分子3′端的突出端c碱基互补。连续g碱基可包括1个g碱基、2个g碱基、3个g碱基、4个g碱基、5个g碱基或超过5个g碱基。模板序列可以包括待纳入cdna的任何序列。在一些情况中，模板区包括至少1个(例如，至少2个、3个、4个、5个或更多)标签序列和/或功能序列。转换寡核苷酸可包括脱氧核糖核酸；核糖核酸；桥接核酸，修饰的核酸，包括2‑氨基嘌呤，2，6‑二氨基嘌呤(2‑氨基‑da)，逆序dt，5‑甲基dc，2′‑脱氧肌苷，超级t(5‑羟基丁炔基‑2′‑脱氧尿苷)，超级g(8‑氮杂‑7‑脱氮鸟苷)，锁核酸(lna)，未锁核酸(una，例如una‑a，una‑u，una‑c，una‑g)，iso‑dg，iso‑dc，2′氟碱基(例如氟c，氟u，氟a和氟g)，以及上述物质的组合。[1133]在一些实施方式中，与分析物划分的珠可包括结合到珠的不同类型的寡核苷酸，其中不同类型的寡核苷酸结合到不同类型的分析物。例如，珠可以包括一个或多个第一寡核苷酸(例如，可以是捕获探针)和一个或多个第二寡核苷酸(例如，可以是捕获探针)，第一寡核苷酸可以结合或杂交到第一类型的分析物，例如mrna，第二寡核苷酸可以结合或杂交到第二类型的分析物，例如gdna。分区还可以包括有助于从共划分的细胞释放核酸的裂解剂，并且还可以包括可以降解珠和/或破坏寡核苷酸和珠之间的共价键的剂(例如还原剂)，从而将寡核苷酸释放到分区中。释放的条码化寡核苷酸(也可以条码化)可以与从细胞释放的mrna以及从细胞释放的gdna杂交。[1134]由此由杂交形成的条码化构建体可包括第一类构建体，其包括对应于来自珠的原始条形码序列的序列和对应于来自细胞的转录物的序列，以及第二类构建体，其包括对应于来自珠的原始条形码序列的序列和对应于来自细胞的基因组dna的序列。然后可以从分区中释放/移出条码化构建体，并且在一些实施方式中，进一步加工以添加任何其他序列。然后可以对得到的构建体进行测序，对测序数据进行加工，并将结果用于在空间上表征来自细胞的mrna和gdna。[1135]在另一实例中，分区包括珠，其包括具有第一条形码序列的第一类寡核苷酸(例如，第一捕获探针)、可与mrna转录物的多聚(a)尾杂交的多聚(t)引发序列以及可独特地识别给定转录物的umi条形码序列。该珠还包括具有第二条形码序列的第二类寡核苷酸(例如，第二捕获探针)、能够与结合到划分细胞表面的抗体的第三条码化寡核苷酸(例如，分析物捕获剂)特异性杂交的靶向引发序列。第三条码化寡核苷酸包括独特地识别抗体的umi条形码序列(因此，它所结合的特定细胞表面特征)。[1136]在该示例中，第一和第二条码化寡核苷酸包括相同的空间条形码序列(例如，第一和第二条形码序列相同)，这使条码化核酸与分区的下游关联。然而，在一些实施方式中，第一和第二条码化序列不同。[1137]分区还可以包括有助于从细胞释放核酸的裂解剂，并且还可以包括可以降解珠和/或破坏条码化寡核苷酸和珠之间的共价键的剂(例如还原剂)，从而将它们释放到分区中。第一类释放的条码化寡核苷酸可与从细胞释放的mrna杂交，第二类释放的条码化寡核苷酸可与第三类条码化寡核苷酸杂交，形成条码化构建体。[1138]第一类条码化构建体包括与来自珠的第一条形码序列相对应的空间条形码序列和与来自第一类寡核苷酸的umi条形码序列相对应的序列，其识别细胞转录物。第二类条码化构建体包括与来自第二类寡核苷酸的第二条形码序列相对应的空间条形码序列和与第三类寡核苷酸(例如，分析物捕获剂)相对应的umi条形码序列，并用于识别细胞表面特征。然后可以从分区中释放/移出条码化构建体，并且在一些实施方式中，进一步加工以添加任何其他序列。然后对得到的构建体进行测序，对测序数据进行处理，结果用于表征细胞的mrna和细胞表面特征。[1139]前面的讨论涉及两个带有寡核苷酸的珠的具体例子，用于分析一个分区内的两种不同分析物。更一般地，被划分的珠可以具有先前描述的任何结构，并且可以包括所描述的用于分析分区内两个或更多个(例如，三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、八个或更多个、十个或更多个、12个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个，40个或更多个，50个或更多个)的不同类型的分析物的寡核苷酸的任何组合。用于同时分析分区内分析物的不同组合的具有不同类型寡核苷酸(例如，捕获探针)组合的珠的实例包括但不限于：(a)基因组dna和细胞表面特征(例如，使用本文所述的分析物捕获剂)；(b)mrna和谱系追踪构建体；(c)mrna和细胞甲基化状态；(d)mrna和可及染色质(例如，atac‑seq、dna酶‑seq和/或微球菌酶‑seq)；(e)mrna和细胞表面或细胞内蛋白质和/或代谢物；(f)条码化分析物捕获剂(例如，本文所述的mhc多聚体)和免疫细胞受体(例如，t细胞受体)的v(d)j序列；和(g)mrna和扰动剂(例如，crispr‑crrna/sgrna、talen、锌指核酸酶和/或本文所述的反义寡核苷酸)。在一些实施方式中，扰动剂可以是小分子、抗体、药物、适体、mirna、物理环境(例如，温度变化)，或任何其它已知扰动剂。[1140]另外，在一些实施方式中，如本文所述在分区或液滴内引入和加工的未聚集细胞或解聚细胞可从分区移出，与空间阵列接触，并根据本文所述方法进行空间条码化。例如，如本文所述，未聚集细胞样品的单细胞可被划分进入分区或液滴。分区或液滴可以包括使细胞透化、用细胞条形码条码化靶向的细胞分析物，以及扩增条码化的分析物的试剂。分区或液滴可以与本文所述的任何空间阵列接触。在一些实施方式中，分区可以被溶解，从而使分区的内容物被置于与空间阵列的捕获探针接触。空间阵列的捕获探针然后可以捕获来自破裂的分区或液滴中的目标分析物，并通过本文所述的空间工作流程进行处理。[1141](g)捕获的分析物的分析[1142](i)从阵列移出样品[1143]在一些实施方式中，在将生物样品与包括捕获探针的基材接触之后，可任选地进行移出步骤以从基材移出全部或部分生物样品。在一些实施方式中，移出步骤包括生物样品细胞的酶促和/或化学降解。例如，移出步骤可包括用酶(例如，蛋白酶，例如，蛋白酶k)处理生物样品以从基材去除生物样品的至少部分。在一些实施方式中，移出步骤可包括组织的消融(例如，激光消融)。[1144]在一些实施方式中，本文提供了用于从生物样品(例如，存在于生物样品中)空间检测分析物(例如，检测分析物的位置，例如，生物分析物)的方法，该方法包括：(a)任选地对基材上的生物样品进行染色和/或成像；(b)透化基材上的生物样品(例如，提供一种包含透化试剂的溶液)；(c)将生物样品与包含多个捕获探针的阵列接触，其中多个中的捕获探针捕获生物分析物；和(d)分析捕获的生物分析物，从而在空间上检测所述生物分析物；其中所述生物样品全部或部分地从所述基材移出。[1145]在一些实施方式中，不从基材移出生物样品。例如，在从基材释放捕获探针(例如，结合到分析物的捕获探针)之前，不从基材移出生物样品。在一些实施方式中，这种释放包括从基材上裂解捕获探针(例如，通过裂解域)。在一些实施方式中，这种释放不包括从基材释放捕获探针(例如，可以制备与分析物结合的捕获探针的拷贝，且该拷贝可从基材释放，例如，通过变性)。在一些实施方式中，生物样品从基材释放后，在分析结合到捕获探针的分析物之前，不从基材移出生物样品。在一些实施方式中，在从基材移出捕获探针期间和/或在从基材释放后分析结合到捕获探针的分析物期间，生物样品保持在基材上。在一些实施方式中，可以在不使生物样品经受细胞(例如透化的细胞)的酶促和/或化学降解或组织的消融(例如激光消融)的情况下进行对结合到来自基材的捕获探针的分析物的分析。[1146]在一些实施方式中，至少部分生物样品不从基材被移出。例如，在从基材释放捕获探针(例如，与分析物结合的捕获探针)和/或分析从基材释放的与捕获探针结合的分析物之前，生物样品的部分可以保留在基材上。在一些实施方式中，在分析结合到来自基材的捕获探针的分析物之前，生物样品的至少部分不经受细胞(例如透化的细胞)的酶促和/或化学降解或组织的消融(例如激光消融)。[1147]在一些实施方式中，本文提供了用于从生物样品(例如，存在于生物样品中)空间检测分析物(例如，检测分析物的位置，例如，生物分析物)的方法，其包括：(a)任选地对基材上的生物样品进行染色和/或成像；(b)透化基材上的生物样品(例如，提供一种包含透化试剂的溶液)；(c)将生物样品与包含多个捕获探针的阵列接触，其中多个中的捕获探针捕获生物分析物；和(d)分析捕获的生物分析物，从而在空间上检测所述生物分析物；其中所述生物样品未从基材移出。[1148]在一些实施方式中，本文提供用于从生物样品空间检测感兴趣的生物分析物的方法，其包括：(a)在基材上对生物样品进行染色和成像；(b)向基材上的生物样品提供包含透化试剂的溶液；(c)使生物样品接触基材上的阵列，其中所述阵列包括一个或多个捕获探针，从而使所述一个或多个捕获探针捕获感兴趣的生物分析物；和(d)分析所捕获的生物分析物，从而在空间上检测感兴趣的生物分析物；其中所述生物样品未从基材上移出。[1149]在一些实施方式中，该方法还包括选择生物样品中的感兴趣区域以进行空间转录组分析。在一些实施方式中，一个或多个捕获探针中的一个或多个包括捕获域。在一些实施方式中，一个或多个捕获探针复数中的一个或多个包含独特分子标识符(umi)。在一些实施方式中，一个或多个捕获探针中的一个或多个包括裂解域。在一些实施方式中，裂解域包含由尿嘧啶dna糖基酶、无嘌呤/无嘧啶(ap)核酸内切酶(ape1)、u尿嘧啶特异性切除试剂(user)和/或核酸内切酶viii识别和裂解的序列。在一些实施方式中，一个或多个捕获探针不包含裂解域并且不从阵列被裂解。[1150](ii)延伸的捕获探针[1151]在一些实施方式中，捕获探针可以被延伸(“延伸的捕获探针”，例如，如本文所述(例如，部分ii(b)(vii)))。例如，延伸捕获探针可以包括从捕获的(杂交的)rna生成cdna。该过程涉及合成杂交核酸的互补链，例如，基于捕获的rna模板(与捕获探针的捕获域杂交的rna)生成cdna。因此，在延伸捕获探针的初始步骤(例如cdna生成)中，捕获的(杂交的)核酸(例如rna)充当延伸的模板(例如逆转录步骤)。[1152]在一些实施方式中，捕获探针使用逆转录延伸。例如，逆转录包括使用逆转录酶从rna(例如信使rna)合成cdna(互补或拷贝dna)。在一些实施方式中，当组织仍在原位时进行逆转录，产生分析物文库，其中分析物文库包括来自邻近捕获探针的空间条形码。在一些实施方式中，捕获探针使用一种或多种dna聚合酶延伸。[1153]在一些实施方式中，捕获探针的捕获域包括用于产生与捕获探针杂交的核酸互补链的引物，例如，用于dna聚合酶和/或逆转录的引物。由延伸反应产生的核酸(例如dna和/或cdna)分子包含捕获探针的序列。捕获探针的延伸，例如dna聚合酶和/或逆转录反应，可以使用各种合适的酶和方案来进行。[1154]在一些实施方式中，产生全长dna(例如cdna)分子。在一些实施方式中，“全长”dna分子是指整个捕获的核酸分子。然而，如果核酸(例如rna)在组织样品中部分降解，则捕获的核酸分子将与组织样品中的初始rna长度不同。在一些实施方式中，延伸的探针的3′端(例如第一链cdna分子)被修饰。例如，接头或衔接子可以连接到延伸的探针的3′端。这可以通过使用单链连接酶如t4rna连接酶或circlegasetm(可从威斯康星州麦迪逊的艾匹森特生物技术公司(epicentrebiotechnologies)购得)来实现。在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸用于延伸cdna以产生全长cdna(或尽可能接近全长cdna)。在一些实施方式中，第二链合成辅助探针(能够与延伸的捕获探针的3′端杂交的部分双链dna分子)可以使用双链连接酶(例如t4dna连接酶)连接到延伸的探针的3′端，例如第一链cdna分子。适用于连接步骤的其他酶的其他酶在本领域中是已知的，并且包括例如tthdna连接酶、taqdna连接酶、热球菌属(菌株9°n)dna连接酶(9°ntmdna连接酶，新英格兰生物实验室(newenglandbiolabs))、ampligasetm(可从威斯康星州麦迪逊的艾匹森特生物技术公司(epicentrebiotechnologies)获得)和splintr(可从马萨诸塞州伊普斯维奇的新英格兰生物实验室获得)。在一些实施方式中，多核苷酸尾(例如多聚(a)尾)纳入延伸的探针分子的3′端。在一些实施方式中，使用末端转移酶活性酶纳入多核苷酸尾。[1155]在一些实施方式中，处理双链延伸的捕获探针以在扩增和/或分析(例如序列分析)之前去除任何未延伸的捕获探针。这可以通过多种方法实现，例如，使用酶降解未延伸的探针，例如核酸外切酶或纯化柱。[1156]在一些实施方式中，延伸的捕获探针被扩增以产生足以进行分析的量，例如通过dna测序。在一些实施方式中，延伸的捕获探针的第一链(例如，dna和/或cdna分子)用作扩增反应(例如，聚合酶链反应)的模板。[1157]在一些实施方式中，扩增反应使用包括亲和力基团的引物将亲和力基团纳入延伸的捕获探针(例如，rna‑cdna杂交)上。在一些实施方式中，所述引物包括亲和基团，所述延伸的捕获探针包括亲和基团。亲和基团可以对应于前面描述的任何亲和基团。[1158]在一些实施方式中，包括亲和基团的延伸的捕获探针可以耦合到亲和基团特异性的基材。在一些实施方式中，基材可包括抗体或抗体片段。在一些实施方式中，基材包括亲和素或链霉亲和素，并且亲和基团包括生物素。在一些实施方式中，基材包括麦芽糖，亲和基团包括麦芽糖结合蛋白。在一些实施方式中，基材包括麦芽糖结合蛋白，亲和基团包括麦芽糖。在一些实施方式中，只要延伸的探针的拷贝未固定到基材，则扩增延伸的捕获探针可以起到从基材表面释放延伸的探针的作用。[1159]在一些实施方式中，释放延伸的捕获探针或其互补物或扩增子。从基材表面释放延伸的捕获探针或其互补物或扩增子的步骤可以通过多种方式实现。在一些实施方式中，通过核酸裂解和/或变性(例如通过加热使双链分子变性)从阵列释放延伸的捕获探针或其互补物。[1160]在一些实施方式中，通过物理方式从基材的表面(例如阵列)释放延伸的捕获探针或其互补物或扩增子。例如，当延伸捕获探针被间接固定在阵列基材上时，例如通过与表面探针杂交，能足以破坏延伸捕获探针和表面探针之间的相互作用。破坏核酸分子之间相互作用的方法包括本领域已知的使双链核酸分子变性。释放dna分子(即剥离延伸探针阵列)的直接方法是使用干扰双链分子氢键的溶液。在一些实施方式中，通过施加加热的溶液(例如至少85℃的水或缓冲液，例如至少90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或99℃的水)来释放延伸的捕获探针。在一些实施方式中，添加包括盐、表面活性剂等可以进一步使核酸分子之间的相互作用不稳定的溶液以从基材释放延伸的捕获探针。[1161]在一些实施方式中，延伸的捕获探针包括裂解域，延伸的捕获探针通过裂解从基材表面释放。例如，延伸的捕获探针的裂解域可以通过本文所述的任何方法裂解。在一些实施方式中，在扩增延伸的捕获探针的步骤之前，例如通过裂解延伸的捕获探针中的裂解域，从基材表面释放延伸的捕获探针。[1162](iii)裂解域[1163]捕获探针可以任选地包括“裂解域”，其中捕获探针的一个或多个区段或区域(例如，空间条形码和/或umi)可以可释放地、可裂解地或可逆地附接到特征或其它基材，使得空间条形码和/或umi可以通过裂解捕获探针和特征之间的联接来释放或可释放，或者通过降解底层(underlying)基材或化学基材来释放，从而使裂解的捕获探针的空间条形码和/或umi被其他试剂触及或可触及，或者两者。裂解域的非限制性方面在本文中描述(例如，在部分ii(b)(ii)中)。[1164]在一些实施方式中，捕获探针(例如通过二硫键)连接到特征。在一些实施方式中，捕获探针通过丙烯基团(例如，间隔物c3)连接至特征。可以添加还原剂来破坏各个二硫键，从而释放包含空间条形码序列的捕获探针。在另一个示例中，加热也可能导致附接的捕获探针的降解和释放。在一些实施方式中，加热通过激光(例如，激光烧蚀)进行，从而特定位置处的特征可被降解。除了可热裂解键、二硫键、光敏键和紫外光敏感键之外，可耦合到捕获探针(即，空间条形码)的不稳定键的其他非限制性实例包括酯键(例如，可与酸、碱或羟胺裂解)、邻二醇键(例如，可通过高碘酸钠裂解)、diels‑alder键(例如，可通过热裂解)、砜键(例如，可通过碱裂解)、硅基醚键(例如，可通过酸裂解)、糖苷键(例如，可通过淀粉酶裂解)、肽键(例如，可通过蛋白酶裂解)或磷酸二酯键(例如，可通过核酸酶裂解(例如，dna酶))。[1165]在一些实施方式中，裂解域包括多聚(u)序列，其可由尿嘧啶dna糖基化酶(udg)和dna糖基化酶‑裂解酶内切酶viii(商业上称为usertm酶)的混合物裂解。在一些实施方式中，裂解域可以是单个u。在一些实施方式中，裂解域可以是可以用无碱基位点特异性核酸内切酶(例如，核酸内切酶iv或核酸内切酶viii)裂解的无碱基位点。[1166]在一些实施方式中，捕获探针的裂解域是捕获探针内的核苷酸序列，其例如通过光或热等物理方式、化学或酶促被特异地裂解。裂解域在捕获探针内的位置将取决于捕获探针是否固定在基材上，使得其具有能够作为延伸引物的游离3′端(例如，通过其5′或3′端)。例如，如果捕获探针被其5′端固定，则裂解域将位于空间条形码和/或umi的5′处，并且所述结构域的裂解导致捕获探针的部分(包括空间条形码和/或umi)和空间条形码3′的序列，和任选地部分裂解域，从特征释放。或者，如果捕获探针被其3′端固定，则裂解域将位于捕获域(和空间条形码)3′处，并且所述域的裂解导致捕获探针的部分(包括空间条形码和空间条形码3′的序列)从特征释放。在一些实施方式中，裂解导致裂解结构域的部分移出。在一些实施方式中，裂解导致裂解结构域的完全移出，特别是当捕获探针通过其3′端固定时，因为裂解结构域的部分的存在可能会干扰捕获域和目标核酸的杂交和/或其随后的延伸。[1167](iv)测序[1168]在来自样品的分析物已根据上述与基于一般空间细胞的分析方法相关的任何方法与捕获探针、分析物捕获剂或其他条码化寡核苷酸序列杂交或以其他方式结合之后，杂交/结合产生的条码化构建体通过测序进行分析以鉴定分析物。[1169]在一些实施方式中，如上文所述，通过与与细胞表面杂交、结合或关联或引入细胞的捕获探针或分析物捕获剂杂交直接对样品进行条码化，可对完整样品进行测序。或者，如上文所述，如果条码化样品已被分离成片段、细胞群或个体细胞，则可对个体片段、细胞群或细胞进行测序。如上所述，对于已通过珠划分进行条码化的分析物，可通过打破分区从分区中提取个体分析物(例如，细胞或细胞裂解后的细胞内容物)，然后通过测序来分析以识别分析物。[1170]多种不同的测序方法可用于分析条码化的分析物构建体。一般来说，测序的多核苷酸可以是例如，核酸分子，例如脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)，包括其变体或衍生物(例如，单链dna或dna/rna杂合体，以及具有核苷酸类似物的核酸分子)。[1171]多核苷酸的测序可以通过各种商业系统进行。更一般地，可以使用核酸扩增、聚合酶链反应(pcr)(例如，数字pcr和液滴数字pcr(ddpcr)、定量pcr、实时pcr、多重pcr、基于pcr的单重方法、乳液pcr)和/或等温扩增来进行测序。[1172]对遗传物质进行测序的方法的其他示例包括但不限于dna杂交方法(例如，southern印迹法)、限制性酶消化方法、sanger测序方法、下一代测序方法(例如，单分子实时测序、纳米孔测序和polony测序)，连接法和微阵列法。可使用的测序方法的其他示例包括靶向测序、单分子实时测序、外显子测序、基于电子显微镜的测序、面板测序、晶体管介导测序、直接测序、随机鸟枪测序、sanger双脱氧终止测序、全基因组测序，杂交测序、焦磷酸测序、毛细管电泳、凝胶电泳、双链体测序、循环测序、单碱基延伸测序、固相测序、高通量测序、大规模平行标记测序、低温共扩增pcr(cold‑pcr)、可逆染料终止子测序、双端测序、近期测序、核酸外切酶测序、连接测序、短读测序、单分子测序、合成测序、实时测序、反向终止子测序、纳米孔测序、454测序、solexa基因组分析仪测序、solidtm测序、ms‑pet测序及其任何组合。[1173]核酸分子(包括条码化核酸分子或其衍生物)的序列分析可以是直接的或间接的。因此，序列分析基材(可被视为经受序列分析步骤或过程的分子)可为条码化的核酸分子或其可为从其衍生的分子(例如，其互补物)。因此，例如，在测序反应的序列分析步骤中，测序模板可以是条码化的核酸分子，也可以是从其衍生的分子。例如，第一和/或第二链dna分子可以直接进行序列分析(例如测序)，即可以直接参与序列分析反应或过程(例如测序反应或测序过程，或者是被测序或以其他方式识别的分子)。或者，可在序列分析(例如，通过另一技术进行测序或鉴定)之前对条码化核酸分子进行第二链合成或扩增的步骤。因此，序列分析底物(例如模板)可以是扩增子或条码化核酸分子的第二链。[1174]在一些实施方式中，双链分子的两条链可经序列分析(例如，测序)。在一些实施方式中，可以分析(例如测序)单链分子(例如条码化核酸分子)。为了进行单分子测序，可以在3′末端修饰核酸链。[1175]大规模平行焦磷酸测序技术可用于对核酸进行测序。在焦磷酸测序中，核酸在油溶液中的水滴内扩增(乳液pcr)，每个液滴包含单一的核酸模板，其附接在单一的涂有引物的珠上，然后形成克隆群体。测序系统包含许多皮升体积孔，每个孔包含一个珠和测序酶。焦磷酸测序使用荧光素酶产生光来检测添加到新生核酸中的个体核苷酸，并且组合数据用于产生序列读取。[1176]作为焦磷酸测序的另一个示例应用，释放的ppi可通过atp磺酰化酶立即转化为三磷酸腺苷(atp)来检测，并且产生的atp水平可通过荧光素酶产生的光子来检测，如ronaghi等anal.biochem.242(1)，84‑9(1996)；ronaghi，genomeres.11(1)，3‑11(2001)；ronaghi等，science281(5375)，363(1998)；以及美国专利号6,210,891，6,258,568和6,274,320所述，其全部内容通过引用纳入本文。[1177]在一些实施方式中，大规模平行测序技术可基于可逆染料终止剂。例如，首先将dna分子附接到例如玻璃或硅基材上的引物上，并进行扩增以形成局部克隆群体(桥式扩增)。添加四种类型的ddntp，并冲走未结合的核苷酸。与焦磷酸测序不同，由于阻断基团(例如，ddntp的糖部分上存在3′阻断基团)，dna一次仅延伸一个核苷酸。检测器获取荧光标记的核苷酸的图像，然后染料连同末端3′阻断基团从dna中化学去除，作为后续循环的前体。可以重复此过程，直到获得所需的序列数据。[1178]在一些实施方式中，通过检测在dna聚合期间释放的氢离子来进行测序。含有待测序的模板dna链的微孔可以充满单一类型的核苷酸。如果引入的核苷酸与前导模板核苷酸互补，则它被纳入生长的互补链。这会导致氢离子释放，从而触发超敏离子传感器，这表明发生了反应。若模板系列中存在均聚重复系列，单次循环中会纳入多个核苷酸。这导致对应数量的氢离子释放，和成比例的更高电子信号。[1179]在一些实施方式中，可以原位进行测序。原位测序方法特别有用，例如，当样品表面上的分析物(例如，细胞表面分析物)或样品内的分析物(例如，细胞内分析物)已被条码化后，生物样品保持完整。原位测序通常涉及以连续的、模板依赖的方式将标记的核苷酸(例如，荧光标记的单核苷酸或二核苷酸)纳入或将标记的引物(例如，标记的随机六聚体)杂交到核酸模板上，使得可以确定纳入的核苷酸或标记的引物延伸产物的核苷酸序列的相同性(即，核苷酸序列)，从而测定相应模板核酸的核苷酸序列。例如，在mitra等，(2003)anal.biochem.320，55‑65，和lee等，(2014)science，343(6177)，1360‑1363中描述了原位测序的各个方面，通过引用将其全部内容纳入本文。[1180]此外，pct专利申请公开号wo2014/163886、wo2018/045181、wo2018/045186和美国专利号10138509和10179932中描述了用于进行原位测序的方法和系统的示例，其全部内容通过引用纳入本文中。用于原位测序的示例技术包括但不限于starmap(例如在wang等，(2018)science，361(6499)5691中描述)、merfish(例如在moffitt，(2016)methodsinenzymology，572，1‑49中描述)和fisseq(例如在美国专利申请公开号2019/0032121中描述)。上述各参考文献的全部内容通过引用纳入本文。[1181]对于已通过划分进行条码化的分析物，条码化核酸分子或其衍生物(例如，已添加一个或多个功能序列的条码化核酸分子，或已从中移出一个或多个特征的条码化核酸分子)可汇集并一起加工以用于后续分析，例如在高分辨率测序仪上测序。可以使用条形码序列实现汇集处理。例如，给定分区的条码化核酸分子可以具有相同的条形码，这与其他空间分区的条形码不同。或者，可以分开处理不同分区的条码化核酸分子以进行后续分析(例如，测序)。[1182]在一些实施方式中，在捕获探针不包含空间条形码的情况下，可以在捕获探针从生物样品捕获分析物之后和分析分析物之前添加空间条形码。当在捕获分析物之后添加空间条形码时，可在扩增分析物之后添加条形码(例如，rna的逆转录和聚合酶扩增)。在一些实施方式中，分析物分析使用一个或多个捕获的分析物的直接测序，例如杂交的rna的直接测序。在一些实施方式中，在杂交的rna的逆转录之后进行直接测序。在一些实施方式中，在杂交的rna的逆转录的扩增之后进行直接测序。[1183]在一些实施方式中，通过合成测序(sbs)进行捕获的rna的直接测序。在一些实施方式中，测序引物与捕获探针的一个或多个域(例如，功能域)中的序列互补。在此类实施方式中，通过合成进行测序可包括逆转录和/或扩增以产生模板序列(例如，功能域)，其中引物序列可与模板序列结合。[1184]sbs可涉及将适当的引物(有时称为测序引物)与待测序的核酸模板杂交、延伸引物以及检测用于延伸引物的核苷酸。优选地，在进一步的核苷酸添加到生长的核酸链之前检测用于延伸引物的核酸，从而能进行逐碱基原位核酸测序。通过在引物延伸反应中包括一个或多个标记的核苷酸，有助于检测纳入的核苷酸。为了使适当的测序引物与待测序的核酸模板杂交，核酸模板通常应为单链形式。如果构成核酸特征的核酸模板以双链形式存在，则可使用本领域公知的方法(例如通过变性，裂解等)对其进行处理以提供单链核酸模板。与核酸模板杂交并用于引物延伸的测序引物优选短寡核苷酸，例如长度为15到25个核苷酸。测序引物可以以溶液或固定形式提供。一旦通过使核酸模板和测序引物经受适当条件将测序引物退火到待测序的核酸模板，则进行引物延伸，例如使用核酸聚合酶和核苷酸供应，其中至少一些以标记形式提供，以及如果提供合适的核苷酸，则适于引物延伸的条件。[1185]优选地，在每个引物延伸步骤之后，包括洗涤步骤以去除可干扰后续步骤的未纳入的核苷酸。一旦进行了引物延伸步骤，就对核酸群体进行监测，以确定标记的核苷酸是否已被纳入延伸的引物中。然后可以重复引物延伸步骤以确定下一个和随后纳入延伸的引物中的核苷酸。如果所确定的序列未知，应用于给定群体的核苷酸通常以选定的顺序应用，然后在整个分析过程中重复，例如datp、dttp、dctp、dgtp。[1186]可使用的sbs技术描述于例如，但不限于美国专利申请公开号2007/0166705，美国专利申请公开号2006/0188901，u.s.patent7,057,026，美国专利申请公开号2006/0240439，美国专利申请公开号2006/0281109，pct专利申请公开号wo05/065814，美国专利申请公开号2005/0100900，pct专利申请公开号wo06/064199，pct专利申请公开号wo07/010,251，美国专利申请公开号2012/0270305，美国专利申请公开号2013/0260372，和美国专利申请公开号2013/0079232中的技术，其全部内容通过引用纳入本文。[1187]在一些实施方式中，捕获的rna的直接测序通过顺序荧光杂交(例如，通过杂交进行测序)来进行。在一些实施方式中，原位进行rna与捕获探针杂交的杂交反应。在一些实施方式中，捕获的rna在与测序探针杂交之前不被扩增。在一些实施方式中，rna在与测序探针杂交之前被扩增(例如，逆转录到cdna和cdna的扩增)。在一些实施方式中，使用单分子杂交链式反应进行扩增。在一些实施方式中，使用滚动链扩增来进行扩增。[1188]顺序荧光杂交可包括探针的顺序杂交，包括简并引物序列和可检测的标记物。简并引物序列是能够与独立于所述核酸片段序列的任何核酸片段杂交的短寡核苷酸序列。例如，这种方法可以包括以下步骤：(a)提供包括四个探针的混合物，每个探针在5′端包括a、c、g或t，进一步包括长度为5到11个核苷酸的简并核苷酸序列，并且进一步包括对于在5′端有a、c、g或t的探针而言不同的功能域(例如，荧光分子)；(b)将步骤(a)的探针与目标多核苷酸序列相关联，其序列需求将通过该方法确定；(c)测量四个功能域的活性并记录活性的相对空间位置；(d)从目标多核苷酸序列移出来自步骤(a)‑(b)中的试剂；并且将步骤(a)‑(d)重复n个循环，直到确定每个珠的空间域的核苷酸序列，经过修改，步骤(a)中使用的寡核苷酸与靶多核苷酸序列的部分以及所述序列的部分侧接的位置1到n互补。由于条形码序列不同，在一些实施方式中，这些其它侧接序列是简并序列。来自阵列上每个点的循环1到n的荧光信号可用于确定目标多核苷酸序列的序列。[1189]在一些实施方式中，使用顺序荧光杂交对捕获的rna进行体外直接测序。在一些实施方式中，捕获的rna在与测序探针杂交之前被扩增(例如，逆转录到cdna和cdna的扩增)。在一些实施方式中，含有捕获的rna的捕获探针暴露于靶向rna编码区的测序探针。在一些实施方式中，一个或多个测序探针靶向每个编码区域。在一些实施方式中，测序探针被设计成与测序试剂(例如，染料标记的读出寡核苷酸)杂交。然后，测序探针可以与测序试剂杂交。在一些实施方式中，对测序反应的输出进行成像。在一些实施方式中，从测序反应的图像解析cdna的特定序列。在一些实施方式中，在与测序探针杂交之前进行对捕获的rna的逆转录。在一些实施方式中，测序探针被设计成靶向rna编码区的互补序列(例如，靶向cdna)。[1190]在一些实施方式中，使用基于纳米孔的方法直接对捕获的rna进行测序。在一些实施方式中，使用纳米孔直接rna测序进行直接测序，其中捕获的rna通过纳米孔易位。纳米孔电流可以被记录并转换成碱基序列。在一些实施方式中，捕获的rna在纳米孔测序期间保持附接到基材。在一些实施方式中，捕获的rna在纳米孔测序之前从基材释放。在一些实施方式中，其中感兴趣的分析物是蛋白质，可使用基于纳米孔的方法进行蛋白质的直接测序。可使用的基于纳米孔的测序方法的实例描述于deamer等，trendsbiotechnol.18，147‑151(2000)；deamer等，acc.chem.res.35：817‑825(2002)；li等，nat.mater.2：611‑615(2003)；soni等，clin.chem.53，1996‑2001(2007)；healy等，nanomed.2，459‑481(2007)；cockroft等，j.am.chem.soc.130，818‑820(2008)；以及美国专利号7,001,792。上述各参考文献的全部内容通过引用纳入本文。[1191]在一些实施方式中，使用通过连接的单分子测序来进行捕获的rna的直接测序。这种技术利用dna连接酶纳入寡核苷酸并鉴定这种寡核苷酸的纳入。寡核苷酸通常具有与寡核苷酸杂交的序列中的特定核苷酸的相同性相关的不同标记物。例如，在shendure等，science(2005)，309：1728‑1732和美国专利号5599675、5750341、6969488、6172218和6306597中描述了连接测序所涉及的方面和特征，其全部内容通过引用纳入本文中。[1192]在一些实施方式中，核酸杂交可用于测序。这些方法利用与条形码序列的至少部分互补的标记的核酸解码器探针。多重解码可以使用具有可分辨标签的许多不同探针的集来进行。例如在美国专利号8,460,865，和gunderson等，genomeresearch14：870‑877(2004)中描述了核酸杂交测序的非限制性实例，其全部内容通过引用纳入本文。[1193]在一些实施方式中，商用高通量数字测序技术可用于分析条形码序列，其中dna模板不是一次测序一个，而是在批量过程中测序，并且许多序列优选地以平行方式读出，或者也可以使用其自身可以平行化的超高通量串行过程。此类技术的实例包括测序(例如，基于流动池的测序技术)、使用修饰核苷酸的合成测序(例如在由加利福尼亚州圣迭戈的illumina公司的truseqtm和hiseqtm技术市售)，由马萨诸塞州剑桥的helicos生命科学集团提供的heliscopetm和加利福尼亚州门罗公园的太平洋生物科学公司提供的pacbiors)、离子检测技术测序(加利福尼亚州南旧金山的离子激流公司)和dna纳米球测序(加利福尼亚州山景城的完全基因组公司(completegenomics，inc.))。[1194]在一些实施方式中，在将核苷酸纳入延伸产物时释放的质子的检测可用于本文所述的方法中。例如，美国专利申请公开号2009/0026082、2009/0127589、2010/0137143和2010/0282617中描述的测序方法和系统可用于直接对条形码进行测序。[1195]在一些实施方式中，可在测序期间使用对dna聚合酶活性的实时监测。例如，如levene等，science(2003)，299，682‑686，lundquist等，opt.lett.(2008)，33，1026‑1028，和korlach等，proc.natl.acad.sci.usa(2008)，105，1176‑1181中所述，可通过荧光共振能量转移(fret)检测核苷酸纳入。上述各参考文献的全部内容通过引用纳入本文。[1196](v)时间分析[1197]在一些实施方式中，本文所述方法可用于随时间(例如，在用试剂处理之前或之后或不同分化阶段)评估细胞或生物样品中的分析物水平和/或表达。在一些示例中，本文所述的方法可以在于不同时间点(例如，在用药剂治疗之前或之后、分化的不同阶段、疾病进展的不同阶段、不同的对象的年龄，在物理扰动之前或之后，在用本文所述的扰动剂处理之前或之后，或者在对试剂产生抗性之前或之后)获得的多种相似生物样品或细胞上进行。如本文所述，“扰动剂”或“扰动试剂”可以是小分子、抗体、药物、适体、核酸(例如，mirna)、crisprcrrna/sgrna、talen、锌指核酸酶、反义寡核苷酸物理环境(例如，温度变化)和/或任何其它已知的扰动剂，其中该扰动剂改变平衡或体内稳态。[1198]在一些实施方式中，本文所述的方法可以对从对象获得的多个相似的生物样品或细胞进行2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。例如，多个相似的生物样品可以是来自相同对象、相同组织、相同类器官、相同细胞悬液或本文所述的任何其它生物样品的重复样品。在一些实施方式中，本文所述的方法可以在于不同时间点(例如，在用扰动剂治疗之前或之后、分化的不同阶段、疾病进展的不同阶段、对象的不同年龄，或在对药剂产生抗性之前或之后)获得的相同生物样品或细胞上进行。在一些实施方式中，扰动剂可以是小分子，抗体、核酸、肽和/或其它外部刺激(例如，温度变化)。在一些实施方式中，生物样品在每个时间点与不同的阵列接触。[1199]在一些实施方式中，可将样品置于允许细胞生长和/或维持和/或防止缺氧的受控环境中。在一些实施方式中，受控环境允许在不同时间点分析样品。条码化阵列可以置于样品附近(例如，顶部)并使用显微镜或其它合适的仪器成像以配准生物样品与条码化阵列的相对位置，任选地使用光学编码基准标志物。可以施加电场一段时间，从而使生物分析物(例如，dna、rna、蛋白质、代谢物、小分子、脂质等)从样品中释放并被空间条码化阵列上的捕获探针捕获，保存样品的空间信息。条码化阵列可以被移出，并且确定其中的空间和分子信息(例如，通过进行用于下一代测序或原位测序的文库构建)。测序之后可以进行计算分析以关联分子信息(例如，基因表达值与空间条形码)。这些步骤可以重复一次或多次以捕获分析物在不同时间点的空间信息。[1200]在一些实施方式中，如本文所述的方法可以与细胞迁移测定组合。细胞迁移测定可以包括一个或多个微打印线或悬浮的3d纳米纤维，细胞在其上迁移。可以通过对细胞迁移进行成像和/或将迁移的细胞与空间条码化阵列接触来使用这些测定法测量迁移。用于细胞迁移测定的阵列可以在阵列的基材上包含一个或多个通道，例如以将细胞迁移限制在沿基材的一维。此外，通道可以引导细胞的迁移，从而使它不接触阵列上的另一个细胞(例如，通道彼此不重叠)，并且在一些实施方式中，通道的宽度与细胞大致相同或比细胞更宽(例如，对于哺乳动物细胞，一个通道可以具有约2μm到约10μm的宽度)。可以使用本文所述的任何方法来识别空间条码化阵列上的细胞位置。[1201]在一些实施方式中，细胞可以布置在如本文所述的阵列上并允许迁移。细胞迁移测定中的细胞迁移可用于测量目标表型(例如，侵袭性表型)。在一些实施方式中，可以测量细胞迁移距离并将其与生物分析物相关联。可以将试剂添加到阵列中以促进细胞迁移。例如，阵列可以用一种或多种细胞外基质(ecm)成分(例如基材膜提取物(bme)、层粘连蛋白i、胶原蛋白i、胶原蛋白iv、纤连蛋白、玻连蛋白、弹性蛋白)、细胞培养基、化学引诱剂、化学驱除剂或它们的组合被覆。在一些实施方案中，试剂例如化学引诱剂或化学驱除剂可以仅布置在阵列的部分上，以沿着阵列的一个或多个轴或通道的梯度或其组合形式存在。[1202](vi)空间解析分析物信息[1203]在一些实施方式中，查找表(lut)可用于将特征的一个特性与另一个特性相关联。这些性质包括，例如，位置、条形码(例如，核酸条形码分子)、空间条形码、光学标记物、分子标签和其他性质。[1204]在一些实施方式中，查找表可以将核酸条形码分子与特征相关联。在一些实施方式中，特征的光学标记物可使将特征与生物颗粒(例如，细胞或细胞核)相关联。特征与生物颗粒的关联可进一步允许将生物颗粒的核酸分子的核酸序列与生物颗粒的一个或多个物理性质(例如，细胞的类型或细胞的位置)相关联。例如，基于条形码和光学标记物之间的关系，光学标记物可用于确定特征的位置，从而将特征的位置与特征的条形码序列相关联。后续分析(如测序)可将条形码序列与样品中的分析物相关联。因此，基于位置和条形码序列之间的关系，可以确定生物分析物(例如，在特定类型的细胞中或在生物样品的特定位置的细胞中)的位置。[1205]在一些实施方式中，特征可以具有附接在其上的多个核酸条形码分子。多个核酸条形码分子可以包括条形码序列。附接至给定特征的多个核酸分子可以具有相同的条形码序列，或者具有两个或更多个不同的条形码序列。可以使用不同的条形码序列来提高空间定位精度。[1206]如上所述，可以进一步处理从样品获得的分析物，例如rna、dna、肽、脂质和蛋白质。特别地，来自样品的个体细胞的内容物可以提供独特空间条形码序列，使得在对分析物进行表征时，可以将分析物归因于来自同一细胞。更一般地，空间条形码可用于将分析物归属于样品中相应的空间位置。例如，多个空间条形码的分层空间定位可用于识别和表征样品特定空间区域上的分析物。在一些实施方式中，空间区域对应于先前识别的特定感兴趣空间区域，例如，先前确定的细胞结构的特定结构。在一些实施方式中，空间区域对应于肉眼无法看到的小结构或细胞组。在一些实施方式中，独特分子标识符可用于在单细胞水平上识别和表征分析物。[1207]所述分析物可以包括核酸分子，所述核酸分子可以用核酸条形码分子的条形码序列进行条码化。在一些实施方式中，可以对条码化的分析物进行测序以获得核酸序列。在一些实施方式中，核酸序列可包括与样品相关的遗传信息。核酸序列可以包括条形码序列或其互补序列。核酸序列的条形码序列或其互补物可以电子方式与分析物的性质(例如，颜色和/或强度)相关联，使用lut以识别阵列中的相关特征。[1208](vii)邻近捕获[1209]在一些实施方式中，存在于生物样品中的一个或多个分析物的二维或三维空间概况分析可使用邻近捕获反应来进行，该反应是检测在空间上彼此接近和/或相互作用的两个分析物的反应。例如，邻近捕获反应可用于检测空间上彼此接近的dna序列，例如，dna序列可在同一染色体内，但相隔约700bp或更小。作为另一个示例，邻近捕获反应可用于检测蛋白质关联，例如相互相互作用的两种蛋白质。可以原位进行邻近捕获反应以检测在空间上彼此接近和/或在细胞内彼此相互作用的两种分析物。邻近捕获反应的非限制性示例包括dna纳米检查、dna显微镜检查和染色体构象捕获方法。染色体构象捕获(3c)和衍生实验程序可用于估计不同基因组元素之间的空间接近度。染色质捕获方法的非限制性示例包括染色体构象捕获(3‑c)、芯片构象捕获(4‑c)、5‑c、chia‑pet、hi‑c、靶向染色质捕获(t2c)。例如，在miele等，methodsmolbiol.(2009)，464，simonis等，nat.genet.(2006)，38(11)：1348‑54，raab等，embo.j.(2012)，31(2)：330‑350，和eagen等，trendsbiochem.sci.(2018)43(6)：469‑478中描述了此类方法的实例，其全部内容通过引用纳入本文。[1210]在一些实施方式中，邻近捕获反应包括邻近连接。在一些实施方式中，邻近连接可包括使用具有可参与连接、复制和序列解码反应的附接的dna链的抗体。例如，邻近连接反应可包括附接到抗体对上的寡核苷酸，如果抗体已接近每一寡核苷酸(例如通过结合相同的靶蛋白(复合物))则可通过连接将其接合，并且形成的dna连接产物随后用于模板pcr扩增，如等，methods.(2008)，45(3)：227‑32所述，其全部内容通过引用纳入本文。在一些实施方式中，邻近连接可包括染色体构象捕获方法。[1211]在一些实施方式中，对彼此之间约400nm距离(例如，约300nm、约200nm、约150nm、约100nm、约50nm、约25nm、约10nm或约5nm)内的分析物进行接近捕获反应。通常，邻近捕获反应可以是可逆的或不可逆的。[1212](viii)从阵列移出特征[1213]空间条码化阵列可以与生物样品接触以空间检测生物样品中存在的分析物。在一些实施方式中，可以从基材表面移除特征(例如凝胶垫、珠)以进行其它分析(例如成像、测序或量化)。在一些实施方式中，特征(例如凝胶垫、珠)可以通过机械反应(例如刮擦)、通过酶促反应或通过化学反应移除。在一些实施方式中，特征(例如，凝胶垫、珠)可以被抽吸。在一些实施方式中，在特征被移除(通过任何方法)之后，特征可以与独特条码化珠结合。在一些实施方式中，特征内的寡核苷酸可与条码化珠上的条形码序列连接或杂交。例如，特征内的空间条形码寡核苷酸可以连接到条码化珠上的条形码序列。此外，捕获探针可以连接到条码化珠上的条形码序列。在一些实施方式中，特征和珠可以被划分。在一些实施方式中，特征(例如，凝胶垫、珠)和独特条码化珠可被划分进入囊泡。在一些实施方式中，囊泡可具有脂质双层。在一些实施方式中，特征和珠可以被包封。在一些实施方式中，特征和珠可以包封在油乳液中。在一些实施方式中，特征和珠可以包封在油包水乳液中。一旦被划分，特征(例如，凝胶垫、珠)可以被处理用于进一步分析(例如，测序)，根据本文所述的任何方法。[1214](ix)其它应用[1215]本文所述的空间分析方法可用于检测和表征生物样品中一种或多种单倍型的空间分布。如本公开中所使用的，单倍型用于描述基因组的给定区段中的一个或多个突变、dna变异、多态性，其可用于对遗传区段，或包含单核苷酸多态性(snp)的等位基因或遗传区段的集合进行分类。单倍型关联研究用于更好地了解生物状况。例如，在人类推定的疾病基因座处或与之相关的单倍型变异体的鉴定和表征可以为了解疾病易感性的遗传原因提供基础。本领域中使用的术语“基因座(locus)”(复数“基因座(loci)”)可以是染色体上的固定位置，包括基因或遗传标志物的位置，其可以包含多个单倍型，包括等位基因和snp。[1216]变异单倍型检测是一种用于在单细胞研究中识别杂合细胞的技术。结合空间分析，变异单倍型检测可以进一步提供关于受各种生物状况影响或表现出各种生物状况的生物样品(例如，组织)中杂合细胞分布的新信息。这些数据可揭示变异单倍型与疾病结果之间的因果关系，以帮助识别疾病相关变异，或揭示生物样品中的异质性。[1217]在一些实施方式中，变异单倍型检测是可与本文所述的空间分析方法结合使用、附加于本文所述的空间分析方法或作为其部分使用的技术。简而言之，变异单倍型检测可以包括提供用于在计算机系统上进行算法的输入，以及进行分析以识别和确定单倍型的空间分布。一个输入可以是从与生物样品接触并随后与基因组比对的二维空间阵列获得的多个序列读数。序列读数还可以包含带有位置信息的空间条形码，这样序列读数可以映射到生物样品上的某个位置。其它输入可以包括基因序列变异或单倍型的电子数据文件，以及参考基因组。对于每个基因座，将相应的序列读数和变异单倍型进行比对以确定每个序列读数的单倍型同一性。然后对序列读数的单倍型特征(haplotypeidentity)和空间条形码进行分类，以确定生物样品中单倍型的空间分布。如上所述，该空间分布可用于表征样品的生物学状况。在一些实施方式中，序列读数是通过对基材上的二维位置阵列进行原位测序获得的，而在一些实施方式中，序列读数是通过高通量测序获得的。在一些实施方式中，使用用于生成本文所述的序列读数的其它方法，例如配对末端测序。[1218]在一些实施方式中，多个基因座中的各个基因座是双等位基因的并且各个基因座的相应单倍型组由第一等位基因和第二等位基因组成。在一些此类实施方式中，相应基因座包括杂合单核苷酸多态性(snp)、杂合插入或杂合缺失。[1219]在一些实施方式中，可以通过原位测序方法分析(例如，测序)由本文所述的任何空间分析方法捕获的分析物。例如，包括直接或间接(例如，通过特征)附接的多个捕获探针(例如，阵列)的基材，其包括空间条形码和捕获域。在一些实施方式中，捕获域可以被设置为与分析物(例如，mrna)相互作用(例如，杂交)。在一些实施方式中，生物样品可以与阵列接触，从而使捕获探针的捕获域与分析物相互作用(例如，杂交)。在一些实施方式中，捕获探针可用作与捕获的分析物进行杂交或连接反应的模板。例如，可以使用本文所述的任何示例性逆转录酶进行逆转录反应以延伸与分析物杂交的捕获探针的3′端，由此产生延伸的捕获探针(例如，包括空间条形码和与分析物中的序列互补的序列的延伸的捕获探针)。在合成延伸捕获探针后，可以合成与延伸捕获探针互补的第二链。在一些实施方式中，可以使用本文所述的任何方法进行第二链合成。在一些实施方式中，当产生延伸捕获探针或第二链或两者时，可以使用胺修饰的核苷酸。例如，胺修饰的核苷酸可以是氨基烯丙基(aa)‑dutp、aa‑dctp、aa‑dgtp和/或aa‑datp。[1220]在一些实施方式中，在产生延伸捕获探针，第二链或两者之后延伸捕获探针和/或第二链两者可以从基材表面释放。例如，延伸的捕获探针和/或第二链可以通过本文所述的任何方法(例如，加热或通过裂解域的裂解)释放。在一些实施方式中，纳入延伸捕获探针中的胺修饰核苷酸可交联至基材表面或利用其胺修饰核苷酸交联至生物样品。在一些实施方式中，基材的表面可以被覆有水凝胶。在一些实施方式中，基材的表面可以被覆有蛋白质基质。在一些实施方式中，交联可以是不可逆的。在一些实施方式中，交联的延伸捕获探针和/或第二链可以被环化。例如，环状模板连接可以通过dna连接酶(例如，t4dna连接酶)进行，或者环状无模板连接可以通过不依赖模板的连接酶(例如，circligase)进行。在一些实施方式中，延伸捕获探针用circligase环化。在一些实施方式中，可以扩增环化的延伸捕获探针。例如，可以用合适的dna聚合酶(例如)进行滚环扩增。在一些实施方式中，捕获探针包括功能域(例如，测序接头)。在一些实施方式中，可以用与功能域互补的引物(例如，测序接合物)进行滚环扩增。在一些实施方式中，可以进行滚环扩增以产生两个或更多个扩增子(例如，一个或多个扩增子包括本文所述的任何胺修饰的核苷酸)。在一些实施方式中，通过滚环扩增产生的两个或更多个扩增子可以交联至基材表面和/或交联至生物样品。在一些实施方式中，两个或更多个扩增子可以被原位测序。原位测序可以通过本文所述的任何方法进行(参见，lee，j.h.，用于基因表达概况分析的rna的荧光原位测序(fisseq)(fluorescentinsitusequencing(fisseq)ofrnaforgeneexpressionprofiling)，natprotoc.，10(3)：442‑458，doi：10.1038/nprot.2014.191(2015)，其通过引用方式纳入本文)。在一些实施方式中，两个或更多个扩增子可以被成像。[1221]在一些实施方式中，可以通过本文所述的任何方法对核糖体rna(rrna)进行空间分析，包括内源核糖体rna(例如，生物样品天然有的)和/或外源rna(例如也存在于生物样品中的微生物核糖体rna和/或病毒rna)。如本文所用，“宏基因组学”可以指对生物样品中存在的外源核酸(例如，dna、rna或本文所述的其它核酸)的研究。如本文所用，“空间宏基因组学”可以指对生物样品中存在的外源核酸的空间位置的研究。空间宏基因组学还可以指鉴定生物样品中存在的一种或多种物种(例如，病毒或微生物)和/或鉴定物种之间的接近性(例如，共定位)模式的研究。[1222]在一些实施方式中，微生物rrna可以从生物样品中空间检测、定量和/或扩增。在一些实施方式中，rrna(例如，16s核糖体rna)可与特定微生物物种相关联。例如，微生物核糖体rna(例如16s核糖体rna)可用于鉴定生物样品中存在的一种或多种微生物(参见例如kolbert，c.p.和persing，d.h.，核糖体dna测序作为工具用于鉴定细菌病原体(ribosomaldnasequencingasatoolforidentificationofbacterialpathogens)，currentopinioninmicrobiology.2(3)：299‑305.doi：10.1016/s1369‑5274(99)80052‑6.pmid10383862(1999)，其通过引用方式纳入本文)。在一些实施方式中，可以鉴定与一种或多种其它微生物物种接近的微生物物种的鉴定。[1223]在一些实施方式中，基材可以用可光交联的覆层(例如，条件溶解的聚合物，例如，dtt敏感水凝胶)覆盖(例如，被覆)。生物样品可以与可光交联的被覆基材接触。在一些实施方式中，将生物样品和可光交联的基材组装成流动池，并且可将可光交联的聚合物与生物样品一起孵育。可以使用光源和光掩模将生物样品交联成限定尺寸的水凝胶体素。在一些实施方式中，流动池可以被拆卸和洗涤以移除未聚合的水凝胶。可光交联覆层可以用dtt处理以产生单细胞分区或近似单细胞分区。[1224]在一些实施方式中，单细胞或近似单细胞分区可被包封在囊泡中。囊泡可包含条码化特征(例如，珠)，且条码化特征可包含捕获域。在一些实施方式中，捕获域可以捕获微生物rrna(例如，微生物16srrna)。在一些实施方式中，捕获的微生物rrna可以通过本文所述的任何方法进行扩增和分析(例如，测序)。在一些实施方式中，经扩增和测序的微生物rrna可以鉴定微生物物种和/或一种或多种物种的接近(例如，共定位)模式。[1225]或者，可用基材(例如阵列)上的多个捕获探针对外源rrna(例如微生物或病毒)进行空间分析，其中捕获探针包括空间条形码和捕获域。在一些实施方式中，捕获域可以被设置为与生物样品中存在的微生物rrna相互作用(例如，杂交)。捕获探针可以设置为与任何微生物rrna相互作用。在一些实施方式中，捕获探针被设置为与微生物16srrna相互作用。可以处理(例如，透化)生物样品，从而使捕获域和分析物(例如，微生物rrna)相互作用(例如，杂交)。在一些实施方式中，捕获的分析物(例如微生物rrna)可以被逆转录产生第一链cdna，然后进行本文所述的第二链cdna合成。第一链cdna和/或第二链cdna可以包括部分或全部捕获探针序列，或其互补序列。捕获探针序列或其互补序列可以包括空间条形码或其互补序列。在一些实施方式中，第一链cdna和任选的第二链cdna可以通过本文所述的任何方法扩增。扩增的捕获探针和分析物可以通过本文所述的任何方法进行分析(例如，测序)。空间条码化特征的空间信息可用于确定生物样品中捕获的分析物(例如，微生物rrna)的空间位置。在一些实施方式中，捕获的分析物可以识别生物样品中存在的微生物物种。在一些实施方式中，生物样品中存在的微生物物种的空间信息和身份可以相互关联，从而揭示能否发现某些微生物物种彼此接近(例如，共定位)。[1226]本文提供了用于对生物样品内的分析物进行空间分析的方法。生物样品(例如，单个细胞、细胞群、组织切片等)的概况可以与其它细胞(例如，“正常”或“健康”的生物样品)的概况进行比较。在本文描述的用于对分析物进行空间概况分析的任何方法的一些实施方式中，该方法可以提供疾病(例如，癌症、阿尔茨海默病、帕金森病)的诊断。在本文描述的用于对分析物进行空间概况分析的任何方法的一些实施方式中，该方法可用于药物筛选。在本文描述的用于对分析物进行空间概况分析的任何方法的一些实施方式中，该方法可用于用类器官进行药物筛选。在本文描述的用于对分析物进行空间概况分析的任何方法的一些实施方式中，该方法可用于检测(例如，改变的)细胞信号转导的变化。在本文描述的用于对分析物进行空间概况分析的任何方法的一些实施方式中，该方法可以包括将病原体引入生物样品和评价生物样品对病原体的反应。在本文所述的用于空间概况分析分析物的任何方法的一些实施方式中，所述方法包括将生物样品暴露于扰动剂(例如，本文所述的任何扰动剂)并评估生物样品对扰动剂的响应。在本文描述的用于对分析物进行空间概况分析的任何方法的一些实施方式中，这些方法包括监测生物样品(例如类器官)中的细胞分化。在本文描述的用于对分析物进行空间概况分析的任何方法的一些实施方式中，该方法包括分析组织形态发生。在本文描述的用于对分析物进行空间概况分析的任何方法的一些实施方式中，该方法包括鉴定生物样品中的空间异质性(例如，鉴定生物样品中的不同细胞类型或群体)。在本文描述的用于空间概况分析分析物的任何方法的一些实施方式中，该方法包括分析分子事件的时空顺序(例如，时间)。例如，对分析物进行空间概况分析的方法可以包括监测疾病过程中的表达水平。[1227]本文提供的方法还可用于确定对象中炎症的相对水平(例如，确定炎症评分)或对象对治疗的反应或对治疗的抗性的发展。本文所述的方法还可用于鉴定潜在治疗干预的候选靶标和/或鉴定与对象的不同疾病状态相关的生物标志物。[1228](h)质量控制[1229](i)对照样品[1230]如本文所用，术语“对照样品”通常是指不溶于水性液体的基材，其允许将测试分析物准确且可追踪地定位在基材上。对照样品可以是本领域技术人员已知的任何合适的基材。示例性对照样品包含半多孔材料。半多孔材料的非限制性示例包括硝化纤维素膜、水凝胶和尼龙过滤器。[1231]对照样品可以具有任何合适的尺寸或体积(例如，大小或形状)。在一些实施方式中，对照样品是规则形状(例如，正方形、圆形或矩形)。在一些实施方式中，对照样品的表面具有任何合适的形式或形态。例如，对照样品的表面可以是平坦的或弯曲的(例如，朝向基材和对照样品之间发生相互作用的区域凸出地或凹入地弯曲)。在一些实施方式中，对照样品具有圆角(例如，为了增加安全性或稳健性)。在一些实施方式中，对照样品具有一个或多个截止角(例如，用于滑动夹或交叉台)。[1232]对照样品可包含多种测试分析物。在一些实施方式中，多种测试分析物的成员以已知量和已知位置布置在基材上。例如，多种测试分析物以已知量布置在对照样品的一个或多个位置处。在一些实施方式中，多种测试分析物以限定的图案(例如，x‑y网格图案)布置在基材上。在一些实施方式中，限定的图案包括一个或多个位置或点。[1233]在一些实施方式中，每个位置包含多个相同种类的测试分析物。在一些实施方式中，每个位置包含多个一种或多种不同种类的测试分析物。在一些实施方式中，对照样品上的每个位置代表生物样品例如组织样品的不同区域。在一些实施方式中，对照样品上不包含多种测试分析物的区域代表不存在生物样品的区域。[1234]在一些实施方式中，多种测试分析物包括一种或多种测试分析物，例如，第一测试分析物、第二测试分析物、第三测试分析物、第四测试分析物等。在一些实施方式中，多种测试分析物包括核酸。在一些实施方式中，每个位置或特征包含核酸序列的群。在一些实施方式中，第一测试分析物的核酸序列与第二测试分析物的核酸序列的不同之处在于单个核酸残基。在一些实施方式中，每个位置或特征包含一群rna转录物和一种或多种特异性表面标志物蛋白质或一种或多种crispr引导rna。在一些实施方式中，多种测试分析物包括细菌人工染色体(bac)。在一些实施方式中，对照样品上的每个位置都包含独特的bac混合物。在一些实施方案中，蛋白质与bac交联，例如，以模拟dna上的组蛋白结合。[1235]在一些实施方式中，第一测试分析物的浓度不同于对照样品上不同位置或特征处的第二测试分析物的浓度。在一些实施方式中，第一测试分析物和第二测试分析物包含相同的核苷酸序列。[1236](ii)空间rna完整性数(srin)[1237]如本文所用，术语“空间rna完整性数”或“srin”是指基于完整性评分的rna质量的原位指示。较高的srin分数与本文所述的空间分布分析中较高的数据质量相关。例如，与srin分数低于第一个生物样品的第二个生物样品相比，具有高srin分数的第一个生物样品将具有更高的数据质量。在一些实施方式中，针对组织切片、组织切片的一个或多个区域或单个细胞计算srin。[1238]在一些实施方式中，给定生物样品(例如，组织切片、组织的一个或多个区域或单细胞)的一个或多个srin通过以下方式计算：(a)提供(i)包括基材上多个捕获探针的空间阵列，其中捕获探针包含捕获域，和(ii)用组织学染色剂(例如，本文所述的任何染色剂)染色的组织；(b)将空间阵列与生物样品(例如，组织)接触；(c)用捕获域从生物样品(例如，组织)中捕获生物分析物(例如，18srrna分子)；(d)从捕获的生物分析物(例如18srrna)生成cdna分子；(e)使一种或多种标记的寡核苷酸探针与cdna杂交；(f)对标记的cdna和组织学染色剂(例如，本文所述的任何染色剂)成像，和(g)生成空间阵列中某个位置的空间rna完整性数，其包括对于该位置的标记的cdna图像和组织学染色剂(例如，本文所述的任何染色剂)图像的分析。[1239]在一些实施方式中，生物样品(例如，组织)用组织学染色剂染色。如本文所用，“组织学染色剂”可以是本文所述的任何染色剂。例如，生物样品可以用本文所述的if/ihc染色剂染色。例如，生物样品(例如，组织)可以用苏木精和曙红(“h&e”)染色。在一些实施方式中，在用标记的寡核苷酸探针标记cdna之前、之时或之后，用组织学染色剂(例如，本文所述的任何染色剂)染色生物样品(例如，组织)。在一些实施方式中，染色的生物样品可以任选地脱色(例如，在hcl中洗涤)。例如，在进一步处理之前，可以通过在稀释的hcl(0.01m)中洗涤来任选地从生物样品中去除来自h&e染色剂的苏木精。在一些实施方式中，染色的生物样品可以任选地在成像之后和透化之前脱色。[1240]在一些实施方式中，空间阵列包括固定在基材上的多个捕获探针，其中捕获探针包括至少一个捕获域。在一些实施方式中，捕获域包括多聚(t)序列。例如，捕获域包括能够从生物样品中捕获18srrna转录物的多聚(t)序列。[1241]在一些实施方式中，计算生物样品的一个或多个空间rna完整性数包括将至少一种(例如，至少两种、至少三种、至少四种或至少五种)标记的寡核苷酸探针与从18srrna产生的cdna杂交。在一些实施方式中，标记的寡核苷酸探针包括与18scdna的部分互补的序列。在一些实施方式中，四个标记的寡核苷酸探针(p1‑p4)被设计成在跨越18srrna的整个基因体的四个不同位置杂交。在一些实施方式中，标记的寡核苷酸探针可包括如本文所述的任何可检测标记物。例如，寡核苷酸标记的探针可以包括荧光标记(例如，cy3)。在一些实施方式中，被设计为与18scdna序列内不同位置互补的一种或多种标记的寡核苷酸探针包括相同的可检测标记物。例如，四个标记的寡核苷酸探针，(p1‑p4)，每个都被设计为与18scdna序列内的不同位置具有互补性，都可以具有相同的可检测标记物(例如，cy3)。在一些实施方式中，被设计为与18scdna序列内不同位置互补的一种或多种标记的寡核苷酸探针包括不同的可检测标记物。例如，各自设计为与18scdna序列内的不同位置具有互补性的四个标记的寡核苷酸探针(p1‑p4)可以包括不同的可检测标记物。[1242]在一些实施方式中，确定生物样品(例如，组织切片、组织的一个或多个区域或单个细胞)的空间rna完整性数包括分析对于相同位置的获自空间阵列和组织学染色剂(例如，本文所述的任何染色剂)的图像。例如，对于空间阵列，在荧光标记的(例如，cy3)寡核苷酸探针已与18scdna杂交之后，通过用激光(例如，532nm波长)扫描来生成所有图像。每个探针生成一张图像(p1‑p4)，并且在其中没有荧光标记的探针杂交的情况下(p0)生成一张图像。荧光单位(fu)数据的归一化是通过减去用p0记录的自发荧光并除以p1来进行的。对齐后，五个图像(每个探针一个图像，p1‑p4，和来自没有结合探针的区域的一个图像)被加载到脚本中。该脚本生成两个不同的图，一个空间rin值的热图和一个图像对齐误差图，它结合了组织学染色剂(例如，本文描述的任何染色剂)图像。图像对齐误差图用于观察哪些像素和位置由于p0‑p4图像之间的对齐误差而应从分析中排除。[1243]iii.一般空间细胞型分析方法[1244](a)条码化生物样品[1245]在一些实施方式中，本文提供用于将具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，肽、脂质或核酸分子)附接和/或引入生物样品(例如，生物样品中的细胞)以用于空间分析的方法和材料。在一些实施方式中，将具有多个条形码(例如，多个空间条形码)的多个分子(例如，多个核酸分子)引入生物样品(例如，生物样品中的多个细胞))用于空间分析。[1246]图18是描绘利用分析物结合部分与细胞表面的共价偶联或与细胞膜元件的非共价相互作用的细胞加标(celltagging)的示意图。图18列出了共价分析物结合部分/细胞表面相互作用的非详尽示例，包括蛋白质靶向、利用nhs化学的胺偶联、氰尿酰氯、通过马来酰亚胺添加的硫醇偶联，以及通过点击化学靶向在细胞表面表达的糖蛋白/糖脂。与细胞膜元件的非共价相互作用的非穷举实例包括脂质修饰的寡核苷酸、细胞膜的生物相容性锚定物(bam，例如，油烯基‑peg‑nhs)、脂质修饰的阳性中性聚合物和膜蛋白抗体。细胞标签可与分析物捕获剂和可裂解或不可裂解的空间条码化捕获探针结合使用，用于空间和多重化应用。[1247]在一些实施方式中，将具有多个条形码(例如，多个空间条形码)的多个分子(例如，多个脂质或核酸分子)引入生物样品(例如，引入生物样品中的多个细胞)以用于空间分析，其中所述多个分子以阵列形式引入所述生物样品。在一些实施方式中，具有多个条形码的多个分子(例如，多个脂质或核酸分子)以在本文中描述的多种阵列形式中的任一种提供在基材(例如，本文所述的多种基材中的任一种)上，并且生物样品与基材上的分子接触，从而使分子被引入到生物样品中。在一些实施方式中，引入到生物样品中的分子可裂解地附接在基材上，并在与生物样品接触时从基材上裂解并释放到生物样品中。在一些实施方式中，引入生物样品的分子在裂解之前共价附接至基材。在一些实施方式中，引入生物样品的分子非共价附接到基材上(例如，通过杂交)，并且当与生物样品接触时从基材释放到生物样品。[1248]在一些实施方式中，具有多个条形码(例如，多个空间条形码)的多个分子(例如，多个脂质或核酸分子)从基材迁移或转移到生物样品的细胞。在一些实施方式中，使多个分子从基材迁移到生物样品的细胞包括向基材和/或生物样品施加力(例如机械力、离心力或电泳力)以促进多个分子从基材迁移到生物样品。[1249]在本文所描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，物理力用于促进将具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)附接或引入生物样品(例如，生物样品中存在的细胞)中。如本文所用，“物理力”是指利用物理力来抵消细胞膜屏障以促进分子的细胞内递送。可根据本文所描述的材料和方法使用的物理力仪器和方法的实例包括使用针、弹道dna(ballisticdna)、电穿孔、声穿孔、光穿孔、磁感染、水穿孔及其组合。[1250](i)将细胞加标剂引至细胞表面[1251]在一些实施方式中，可使用细胞加标剂对生物样品(例如，生物样品中的细胞)进行标记，其中细胞加标剂有助于将具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)引入生物样品(例如，引入生物样品中的细胞)。如本文所用，术语“细胞加标剂”是指具有能够附接到细胞表面(例如，从而将条形码附接到细胞表面)和/或穿透和通过细胞膜(例如，从而将条形码引入细胞内部)的部分的分子。在一些实施方式中，细胞加标剂包括条形码(例如，空间条形码)。条码化的细胞加标剂的条形码可以是本文所述的多种条形码中的任一种。在一些实施方式中，条码化的细胞加标剂的条形码是空间条形码。在一些实施方式中，细胞加标剂包含含有条形码(例如，空间条形码)的核酸分子。在一些实施方式中，条码化的细胞加标剂的条形码识别相关分子，其中每个条形码与特定分子相关。在一些实施方式中，将一种或多种分子施用于样品。在一些实施方式中，包括条形码的核酸分子共价附接至细胞加标剂。在一些实施方式中，包括条形码的核酸分子非共价附接至细胞加标剂。非共价附接的非限制性示例包括将包含条形码的核酸分子与细胞加标剂上的核酸分子杂交(所述细胞加标剂上的核酸分子可以共价或非共价地结合到细胞加标剂上)。在一些实施方式中，附接到包括条形码(例如，空间条形码)的细胞加标剂的核酸分子还包括一个或多个其它域。这种其它域包括但不限于pcr柄、测序引发位点、用于与另一核酸分子杂交的结构域及其组合。[1252]在一些实施方式中，细胞加标剂附接到细胞表面。当细胞加标剂包括条形码(例如，包括空间条形码的核酸)时，条形码也附接于细胞表面。在本文所述的任何空间分析方法的一些实施方式中，细胞加标剂共价附接到细胞表面以促进空间分析试剂的引入。在本文所述的任何空间分析方法的一些实施方式中，细胞加标剂非共价附接到细胞表面以促进空间分析试剂的引入。[1253]在一些实施方式中，一旦用细胞加标剂对生物样品中的一个或多个细胞进行空间标记，就进行生物样品中存在的分析物的空间分析。在一些实施方式中，此类空间分析包括解离生物样品的空间加标的细胞(或生物样品的空间加标的细胞的子集)并逐个细胞地分析那些细胞中存在的分析物。可以使用用于逐个细胞地分析存在于细胞中的分析物的多种方法中的任何一种。非限制性示例包括本文所述的各种方法中的任何一种以及pct申请公开号wo2019/113533a1中所述的方法，其内容通过引用全部纳入本文。例如，空间加标的细胞可以用包含具有条形码(例如细胞条形码)的一种或多种核酸分子的珠包封(例如乳液)。珠上存在的核酸可以具有与加标的细胞上存在的核酸上的结构域杂交的结构域(例如，连接到细胞加标剂的核酸上的结构域)，从而连接细胞的空间条形码细胞到珠的细胞条形码。一旦细胞的空间条形码和珠的细胞条形码连接，就可以使用捕获探针(例如，存在于珠上的捕获探针)分析细胞中存在的分析物。这允许(使用这些方法)从特定细胞产生的核酸被单独扩增和测序(例如，在单独的分区或液滴内)。[1254]在一些实施方式中，一旦用细胞加标剂对生物样品中的一个或多个细胞进行空间标记，就进行生物样品中存在的分析物的空间分析，其中生物样品的细胞不解离成单细胞。在这样的实施方式中，可以采用各种空间分析方法，例如本文提供的任何方法。例如，一旦生物样品中的一个或多个细胞被细胞加标剂空间加标，则细胞中的分析物就可以被捕获和分析。在一些实施方式中，细胞加标剂包括空间条形码和可用于捕获存在于细胞中的分析物的捕获域。例如，包括空间条形码和捕获域的细胞加标剂可以以使得细胞加标剂位置已知(或可以在将它们引入细胞后确定)的方式被引入生物样品的细胞中。将细胞加标剂引入生物样品的一个非限制性示例是以阵列形式提供细胞加标剂(例如，在基材上形成阵列，例如本文提供的多种基材和阵列中的任一种)，其中细胞加标剂在阵列上的位置在引入时是已知的(或可以在引入后确定)。细胞可根据需要被透化(例如，使用本文所述的透化试剂和方法)，可向细胞提供用于分析物分析的试剂(例如，在分析物是结合到捕获探针的核酸的情况下，逆转录酶、聚合酶、核苷酸等)，并且分析物可以被分析。在一些实施方式中，被测定的分析物(和/或其拷贝)可以从基材释放并被分析。在一些实施方式中，原位测定所测定的分析物(和/或其拷贝)。[1255]可根据本文提供的用于对生物样品中的一个或多个分析物进行空间概况分析的材料和方法使用的附接在细胞表面的细胞加标剂和系统的非限制性示例(例如，因此，引入细胞加标剂和附接在细胞外部的任何条形码)包括：脂质标记引物/亲脂标记部分，阳性或中性寡核苷酸偶联聚合物、抗体标记引物、链霉亲和素偶联寡核苷酸、染料标记寡核苷酸、点击化学、受体‑配体系统、通过胺或巯基官能团的共价结合系统及其组合。[1256](ii)将细胞加标剂引至细胞内部[1257]可根据本文提供的材料和方法使用的用于对生物样品中的分析物进行空间概况分析的穿透和/或穿过细胞膜的细胞加标剂和系统的非限制性示例(例如，因此将细胞加标剂和与其附接的任何条形码引入细胞内部)包括：细胞穿透剂(例如，细胞穿透肽)、纳米颗粒、脂质体，多聚体、基于肽的化学载体、电穿孔、声穿孔、慢病毒载体、逆转录病毒载体及其组合。[1258]图19是显示示例性细胞标记方法的示意图。寡核苷酸递送载剂的非详尽示例可包括细胞穿透肽或纳米颗粒。递送系统的非穷举性示例可包括基于脂质的聚合物和金属纳米颗粒或寡聚物，其可偶联或包封在递送系统内。细胞标签可以与捕获剂条码域和可裂解或不可裂解的空间条码化捕获探针结合使用，用于空间和多重化应用。[1259]1.细胞穿透剂[1260]在本文描述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，通过细胞穿透剂促进由具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)鉴定生物分析物。在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)与细胞穿透剂偶联，并且细胞穿透剂允许分子与细胞内的分析物相互作用。本文所用的“细胞穿透剂”可以指能够促进将具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)引入生物样品的细胞中的试剂(参见，例如，lovatt等，natmethods.2014年2月；11(2)：190‑6，全文通过引用纳入本文)。在一些实施方式中，细胞穿透剂是细胞穿透肽。如本文所用，“细胞穿透剂”可以指能够穿过细胞膜的肽(例如，短肽，例如通常不超过30个残基的肽)。在一些实施方式中，细胞穿透剂或细胞穿透肽可以共价或非共价地偶联至分子(例如，条码化核酸分子)，很可能是在该分子的5’端。细胞穿透肽可将条码化核酸分子引导至特定细胞器。[1261]在本文所描述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，耦合到具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)的细胞穿透肽可以使用能量依赖或能量非依赖机制穿过细胞膜。例如，细胞穿透肽可通过质膜的物理扰动、内吞(例如，通过网格蛋白介导)、适应性易位、孔形成、电穿孔样透化和/或进入微域边界的直接易位穿过细胞膜。细胞穿透肽的非限制性示例包括：穿透素、tat肽、pvec、转运蛋白、mpg、pep‑1、聚精氨酸肽、map、r6w3、(d‑arg)9、cys(npys)‑(d‑arg)9、抗‑βγ(mps‑光传感因子‑样蛋白c末端)、cys(npys)触角足、cys(npys)‑(arg)9、cys(npys)‑tat(47‑57)、hiv‑1tat(48‑60)、kala、乳清蛋白、渗透素‑精氨酸、pep‑1‑半胱胺、tat(47‑57)ggg‑cys(npys)、tat‑nr2bct、透皮肽、synb1、synb3、ptd‑4、ptd‑5、fhvcoat‑(35‑49)、bmvgag‑(7‑25)、htlv‑iirex‑(4‑16)、r9‑tat、sbp、fbp、mpg、mpg(δnls)、pep‑2、mts、plsl，和聚赖氨酸肽(参见例如，bechara等，febslett.2013年6月19日；587(12)：1693‑702，其通过引用全文的方式纳入本文)。[1262]在一些实施方式中，可有两个取向供细胞穿透肽(cpp)偶联。例如，一个取向可以是(n‑末端)‑cpp‑cys‑(c‑末端)‑接头‑nh2c6‑5′‑寡聚物‑3′；3′‑寡聚物‑5′‑nh2c6‑接头‑(n‑末端)‑cys‑cpp‑(c‑末端)。本文所述的方法可以用其它cpp偶联和取向进行。[1263]2.纳米颗粒[1264]在本文描述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，通过无机颗粒(例如纳米颗粒)促进由具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)捕获生物分析物。在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)与无机颗粒(例如纳米颗粒)偶联，并且，具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的该分子(例如，核酸分子)利用该纳米颗粒来接近细胞内的分析物。可用于本文实施方式中来递送具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)进入细胞和/或细胞珠(cellbead)的纳米颗粒的非限制性示例包括：由金属(例如铁、金和银)、无机盐和陶瓷(例如钙、镁或硅的磷酸盐或碳酸盐)制备的无机纳米颗粒。纳米颗粒的表面可被被覆以促进具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)和捕获域的结合，或者该表面可被化学修饰以促进具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子的附接。也可以使用磁性纳米颗粒(例如超磁性氧化铁)、富勒烯(例如可溶性碳分子)、碳纳米管(例如圆柱形富勒烯)、量子点和超分子系统。[1265]3.脂质体[1266]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，通过脂质体促进由具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)捕获生物分析物。各种类型的脂质，包括阳离子脂质，可用于脂质体递送。在一些情况下，具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)经由脂质纳米乳液递送至细胞。脂质乳液是指一种不混溶的液体在另一种液体中通过乳化剂稳定的分散体。标记细胞可以包括使用固体脂质纳米颗粒。[1267]4.聚合体[1268]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，通过聚合体促进由具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)捕获生物分析物。在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)包含在聚合体中，并且具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)使用聚合体以触及细胞内的分析物。本文所指的“聚合体(polymersome)”是人工囊泡。例如，聚合体可以是类似于脂质体的囊泡，但是膜包含两亲性合成嵌段共聚物(参见，例如，rideau等，chem.soc.rev.，2018，47，8572‑8610，通过引用将其全部纳入本文)。在一些实施方式中，聚合物体包含二‑(ab)或三嵌段共聚物(例如aba或abc)，其中a和c是亲水性嵌段，b是疏水性嵌段。在一些实施方式中，聚合物囊泡包含聚(丁二烯)‑b‑聚(环氧乙烷)、聚(乙基乙烯)‑b‑聚(环氧乙烷)、聚苯乙烯‑b‑聚(环氧乙烷)、聚(2‑乙烯基吡啶)‑b‑聚(环氧乙烷)、聚二甲基硅氧烷‑b‑聚(环氧乙烷)、聚二甲基硅氧烷‑g‑聚(环氧乙烷)、聚己内酯‑b‑聚(环氧乙烷)、聚异丁烯‑b‑聚(环氧乙烷)、聚苯乙烯‑b‑聚丙烯酸、聚二甲基硅氧烷‑b‑聚‑2‑甲基‑2‑噁唑啉或其组合(其中b＝嵌段且g＝接枝)。[1269]5.基于肽的化学载体[1270]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，通过基于肽的化学载体(例如，基于阳离子肽的化学载体)促进由具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)捕获生物分析物。阳离子肽可以富含碱性残基，如赖氨酸和/或精氨酸。在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，通过基于聚合物的化学载体促进由具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)捕获生物分析物。阳离子聚合物，当与具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)混合时，可以形成称为复合体(polyplex)的纳米级复合物。基于聚合物的载体可包含天然蛋白质、肽和/或多糖。基于聚合物的载体可以包括合成聚合物。在一些实施方式中，基于聚合物的载体包括聚乙烯亚胺(pei)。pei可以将dna浓缩成带正电的颗粒，这些颗粒与阴离子细胞表面残基结合，并通过内吞作用进入细胞。在一些实施方式中，基于聚合物的化学载体包含聚(l)‑赖氨酸(pll)、聚(dl‑乳酸)(pla)、聚(dl‑丙交酯‑共‑糖苷)(plga)、聚鸟氨酸、聚精氨酸、组蛋白、鱼精蛋白或其组合。基于聚合物的载体可以包含聚合物的混合物，例如peg和pll。聚合物的其它非限制性示例包括树枝状聚合物、壳聚糖、葡聚糖的合成氨基衍生物和阳离子丙烯酸聚合物。[1271]6.电穿孔[1272]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，通过电穿孔促进由具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)捕获生物分析物。通过电穿孔，由具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)的生物分析物可通过施用电形成的细胞膜中的一个或多个孔进入细胞。根据外加电场强度和脉冲持续时间，膜的孔隙可以是可逆的。[1273]7.声波穿孔[1274]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，通过声孔效应促进由具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)捕获生物分析物。细胞膜可以使用声波暂时透化，从而允许通过具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)的生物分析物的细胞摄取。[1275]8.慢病毒载体和逆转录病毒载体[1276]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，通过载体促进由具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)捕获生物分析物。例如，本文所述的载体可以是表达载体，其中表达载体包括启动子序列，该启动子序列操作性地连接至编码具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)的序列。载体的非限制性示例包括质粒、转座子、粘粒和病毒载体(例如，任何腺病毒载体(例如psv或pcmv载体)、腺相关病毒(aav)载体、慢病毒载体和逆转录病毒载体)，以及任何载体。例如，载体可以包括足够的用于表达的顺式作用元件，其中其它表达元件可以由宿主哺乳动物细胞或在体外表达系统中提供。熟练的从业者将能够选择合适的载体和哺乳动物细胞以引入本文所述的任何空间概况分析试剂。[1277]9.用于分子的细胞内引入的其它方法和细胞加标剂[1278]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，通过使用针(例如，注射(例如，微量注射)、颗粒轰击、光穿孔、磁转染和/或水穿孔促进由具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)捕获生物分析物。例如，通过颗粒轰击，具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)可以被重金属颗粒被覆并高速递送至细胞。在光穿孔中，可使用激光脉冲在细胞膜中产生瞬时孔，使细胞摄取具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)。在磁转染中，具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)可以与磁性颗粒(例如，磁性纳米颗粒、纳米线等)偶联并通过施加磁场定位至靶细胞。在水穿孔中，具有条形码(例如，空间条形码)和捕获域的分子(例如，核酸分子)可以通过流体动力压力递送至细胞和/或细胞珠。[1279](iii)脂质加标的引物/亲脂性加标的部分[1280]在本文描述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)耦合到亲脂性分子。在一些实施方式中，亲脂性分子能够将亲脂性分子递送至细胞膜或核膜。在一些实施方式中，具有与亲脂性分子偶联的条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以与脂质膜例如细胞膜和核膜结合和/或插入到脂质膜例如细胞膜中。在一些情况下，插入可以是可逆的。在某些情况下，亲脂性分子与细胞之间的结合可使得细胞在随后的处理(例如，划分、细胞透化、扩增、汇集等)期间保留亲脂性分子(例如，和相关组分，例如核酸条形码分子)。在一些实施方式中，具有与亲脂性分子偶联的条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以进入细胞内空间和/oligonucleotide)的甾醇脂质可以附接到寡核苷酸部分的5′或3′末端。在一些实施方式中，锚固寡核苷酸和/或共锚固寡核苷酸可以整合到生物样品中的细胞的细胞膜中(例如，锚固寡核苷酸和/或共锚固寡核苷酸的甾醇脂质)。[1286]在一些实施方式中，甾醇脂质(例如，木蜡酸)锚固寡核苷酸连接到寡核苷酸的5′末端。在一些实施方式中，锚固寡核苷酸可具有恒定序列。在一些实施方式中，锚固寡核苷酸的恒定序列可为约15至约30个核苷酸长。在一些实施方式中，锚固寡核苷酸可在恒定序列的3′端具有其它结构域。在一些实施方式中，附加结构域可以是衔接子序列(例如，测序衔接子)。在一些实施方式中，衔接子序列可为约15至约35个核苷酸长。[1287]在一些实施方式中，共锚固寡核苷酸(例如棕榈酸)的脂质(例如甾醇脂质)附接到寡核苷酸的3′末端。在一些实施方式中，共锚固寡核苷酸可具有恒定序列。例如，共锚固寡核苷酸的恒定序列可以是来自锚固寡核苷酸的恒定序列的反向互补序列。在一些实施方式中，锚固寡核苷酸的恒定序列和共锚固寡核苷酸的恒定序列可以彼此结合(例如，杂交)。在一些实施方式中，锚固寡核苷酸和共锚固寡核苷酸的脂质(例如甾醇脂质)可以整合到生物样品中的细胞膜中，并且各自的恒定序列可以同时彼此杂交。在一些实施方式中，可以将可以包括若干个结构域的条码化寡核苷酸引入到彼此杂交的锚固寡核苷酸和共锚固寡核苷酸的整合体中。条码化寡核苷酸可以在5′到3′方向包括功能域(例如测序衔接子域)、独特分子标识符、样品条形码、第二独特分子标识符和恒定序列的反向互补序列。例如，在用本文所述的任何细胞加标剂标记细胞后，细胞可以用条码化特征(例如，珠)分区(例如，包封在囊泡中)。在一些实施方式中，条形码寡核苷酸的恒定序列的反向互补序列可以与条码化特征上的恒定序列(例如，序列的部分)相互作用(例如，杂交)。[1288](iv)细胞内裂解域[1289]如本文所用，捕获探针可以任选地包括“细胞内裂解域”，其中捕获探针的一个或多个区段或区域(例如，捕获域、空间条形码和/或umi)能够可释放地或可裂解地附接到一个或多个捕获探针的更多其它区段或区域，例如细胞穿透剂，从而使捕获域、空间条形码和/或umi可以通过捕获域、空间条形码和/或umi与细胞穿透剂和/或细胞透化标签之间的连接的裂解被释放或变得可释放。在一些实施方式中，捕获域、空间条形码和/或umi和细胞穿透剂之间的连接的裂解在胞内环境中被诱导(例如，将捕获探针引入细胞后，细胞内裂解域被裂解)。例如，捕获域、空间条形码和/或umi与细胞穿透剂之间的连接可以是被细胞中的还原条件裂解的二硫键，例如，在细胞内裂解域包含二硫键的情况下。可以使用任何其它合适的接头来释放或裂解捕获探针的细胞内裂解域。[1290](v)阳性或中性寡聚物偶联的聚合物[1291]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可耦合到乙二醇‑壳聚糖衍生物。在一些实施方式中，二醇壳聚糖衍生物可以与具有条形码(例如，空间条形码)的两个或更多个分子(例如，核酸分子)偶联。在一些实施方式中，二醇壳聚糖衍生物可与约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10或更多个分子偶联。乙二醇‑壳聚糖衍生物(例如乙二醇‑壳聚糖‑胆固醇)可作为疏水锚定物(参见wang等，j.mater.chem.b.，30：6165(2015)，其全文通过引用纳入本文)。可与具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)耦合的壳聚糖衍生物的非限制性示例可在cheung等，marinedrugs，13(8)：5156‑5186(2015)中找到，其全文通过引用纳入本文。[1292](vi)双功能nhs接头细胞加标[1293]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可偶联到双功能nhs接头。在一些实施方式中，偶联的双功能nhs接头(例如，双功能接头和具有条形码的分子)可以促进空间条形码附接到细胞表面。在一些实施方式中，在促进附接到细胞表面之后，可以移除(例如，洗掉)过量的nhs接头。在一些实施方式中，具有条形码的分子的偶联过程可以在非无水条件下进行以保持未反应的双功能nhs的活性。在一些实施方式中，非无水条件可在dmso存在下。在一些实施方式中，非无水条件可在dmf存在下。[1294](vii)抗体加标的引物[1295]在本文所述的任何空间分析方法的一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以以促进具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)附接至细胞表面的方式耦合至抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，促进向细胞表面的附接促进将具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)引入细胞中。在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以与导向存在于细胞表面上的抗原的抗体偶联。在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以与导向存在于多个细胞(例如，生物样品中的多个细胞)表面上的抗原的抗体偶联。在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以与导向存在于生物样品中的细胞、多个细胞，或基本全部细胞的表面上的抗原的抗体偶联。在一些实施方式中，条码化抗体针对细胞内抗原。可以使用本文所述的将具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)附接至另一分子(例如，抗体或其抗原片段)的任何示例性方法。[1296](viii)链霉亲和素偶联的寡核苷酸[1297]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以使用生物素‑链霉亲和素附接到细胞表面。在一些实施方式中，细胞表面多肽的赖氨酸残基侧链中的伯胺用nhs活化的生物素试剂标记。例如，多肽的n末端可以与nhs活化的生物素试剂反应形成稳定的酰胺键。在一些实施方式中，细胞加标剂包括与链霉亲和素偶联的具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)。在一些情况下，如本文所述，链霉亲和素可以利用点击化学(例如，马来酰亚胺修饰)，偶联至具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)。在一些实施方式中，包含纳入细胞表面蛋白的赖氨酸侧链中的nhs活化的生物素的细胞与偶联至具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)的链霉亲和素形成非共价键。在一些实施方式中，具有与链霉亲和素偶联的条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)本身是细胞标记剂的部分。[1298](ix)染料加标的寡核苷酸[1299]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)直接联接到可检测标记物。在一些实施方式中，可检测标记物是本文所述的任何可检测标记物。在一些实施方式中，可检测标记物是荧光标签。在一些实施方式中，带荧光标签的物理性质(例如，具有疏水性质的荧光标签)可克服具有条形码(例如空间条形码)的分子(例如核酸分子)的亲水性质。例如，在其中分子是核酸分子的一些实施方式中，荧光标签(例如，bodipy、cy3、atto647n和罗丹明红c2)可以偶联至具有条形码(例如，空间条形码)的核酸分子的5′端。在其中分子是核酸分子的一些实施方式中，具有疏水性质的任何荧光标签可以克服核酸分子亲水性质的方式偶联至具有条形码(例如，空间条形码)的核酸分子。具有疏水性的荧光标签的非限制性示例包括bodipy、cy3、atto647n和罗丹明红c2。[1300](x)点击化学[1301]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)耦合到点击化学部分。如本文所使用的，术语“点击化学”通常指模块化的、范围广的、给出高产率的、产生副产物(例如那些可通过非色谱方法去除的副产物)并且具有立体特异性(但不一定具有对映选择性)的反应(参见例如angew.chem.int.ed.，2001，40(11)：2004‑2021，通过引用将其全部纳入本文)。在某些情况下，点击化学可以描述成对的官能团，它们可以在温和的水性条件下选择性地相互反应。[1302]点击化学反应的一个实例是叠氮化物和炔烃的huisgen1，3‑偶极环加成，即叠氮化物与炔烃的铜催化反应以形成5元杂原子环1，2，3‑三唑。该反应也称为cu(i)‑催化的叠氮‑炔环加成(cuaac)、cu(i)点击化学或cu 点击化学。用于点击化学的催化剂包括但不限于cu(i)盐或通过用还原剂将cu(ii)试剂还原为cu(i)试剂而原位制备的cu(i)盐(pharmres.2008，25(10)：2216‑2230，其通过引用其全文方式纳入本文)。用于点击化学的已知cu(ii)试剂可包括但不限于cu(ii)‑(tbta)络合物和cu(ii)(thpta)络合物。tbta是三‑(1‑苄基‑1h‑1，2，3‑三唑‑4‑基)甲基]胺，也称为三‑(苄基三唑基甲基)胺，可以作为cu(i)盐的稳定配体。thpta是三‑(羟丙基三唑基甲基)胺，是用于cu(i)的稳定剂的另一个例子。其他条件也可用于使用无铜点击化学从叠氮化物和炔烃构建1，2，3‑三唑环，例如菌株促进的叠氮化物‑炔烃点击化学反应(spaac)(参见，例如，chem.commun.，2011，47：6257‑6259和nature，2015，519(7544)：486‑90，其各自都通过引用整体纳入本文)。[1303](xi)受体‑配体系统[1304]在本文所描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可耦合到配体，其中配体是细胞表面上的受体‑配体相互作用的部分。例如，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以偶联至与细胞表面受体选择性相互作用的配体，从而将具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)靶向至特定细胞。可使用的受体‑配体系统的非限制性实例包括整合素‑受体‑配体相互作用、gpcr‑受体‑配体相互作用、rtk‑受体‑配体相互作用和tlr‑配体相互作用(参见juliano，nucleicacidsres.，44(14)：6518‑6548(2016)，其全文通过引用纳入本文)。可以使用本文描述的用于将具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)连接至配体的任何方法(例如，本文描述的涉及将具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)附接到抗体上的任何方法)。[1305](xii)通过胺或硫醇官能团的共价结合系统[1306]在本文所描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可在分子内的位点(例如，具有核酸序列)纳入反应性官能团。在这种情况下，反应性官能团可以促进与配体和/或表面的偶联。在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可包括设计成与广泛的活化的接受基团(例如，马来酰亚胺和金微球)反应的巯基修饰剂。例如，带有硫醇修饰剂的具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以与马来酰亚胺偶联的肽相互作用，从而导致对肽的标记。在一些实施方式中，马来酰亚胺偶联的肽存在于细胞表面上，因此与硫醇修饰的具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)相互作用，所述具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)与细胞表面偶联。巯基修饰剂的非限制性实例包括：5′巯基修饰剂c6s‑s、3′巯基修饰剂c3s‑s、二巯基、3′巯基修饰剂氧杂6‑s‑s和二巯基丝氨酸。[1307]在本文所描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可包括胺修饰剂，例如，设计用于在酰化剂存在下附接到另一分子的胺修饰剂。在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以包括胺修饰剂，所述胺修饰剂被设计为附接到连接基团(例如，羰基酰胺、硫脲、磺酰胺和甲酰胺)的广泛阵列(broadarray)。例如，具有条形码(例如，空间条形码)和胺修饰剂的分子(例如，核酸分子)可以与磺酰胺偶联的肽相互作用，从而导致对肽的标记。在一些实施方式中，磺酰胺偶联的肽存在于细胞表面上，因此与胺修饰的具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)相互作用，所述具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)与细胞表面偶联。胺修饰剂的非限制性示例包括：dms(o)mt‑氨基‑修饰剂‑c6、氨基‑修饰剂‑c3‑tfa、氨基‑修饰剂‑c12、氨基‑修饰剂‑c6‑tfa、氨基‑dt、氨基‑修饰剂‑5，氨基修饰剂‑c2‑dt、氨基修饰剂‑c6‑dt和3′‑氨基修饰剂‑c7。[1308]作为另一实例，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可在分子内的位点(例如，具有核酸序列)纳入反应性官能团，例如n‑羟基琥珀酰亚胺(nhs)。在一些实施方式中，胺(例如，含胺的肽)存在于细胞表面，于是与具有条形码(例如，空间条形码)的nhs修饰的分子(例如，核酸分子)相互作用，该具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)与细胞表面偶联。在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)与双功能nhs接头反应以形成具有条形码(例如，核酸分子)的nhs修饰的分子(例如，核酸分子)。[1309]在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可耦合到用于细胞膜(bam)的生物相容性锚固物。例如，bam可以包括包含油烯基和peg的分子。油烯基可促进将具有条形码(例如空间条形码)的分子(例如核酸分子)锚定到细胞，并且peg可增加水溶性。在一些实施方式中，油烯基‑peg‑nhs可使用nhs化学与具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)耦合。[1310](xiii)基于叠氮化物的系统[1311]在一些实施方式中，其中分子(例如，具有核酸序列)在分子内的位点处纳入反应性官能团，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可与细胞表面上的叠氮化物基团耦合。在一些实施方式中，反应性官能团是炔基。在一些实施方式中，如本文所述的点击化学可用于将具有条形码(例如，空间条形码)的炔基修饰的分子(例如，核酸分子)附接至细胞表面上的叠氮基团。叠氮基团可以通过多种方法附接到细胞表面。例如，nhs化学可用于将叠氮基团连接到细胞表面。在一些实施方式中，n‑叠氮基乙酰基甘露糖胺四酰化(ac4mannaz)，其包含叠氮基基团，可以与细胞表面的唾液酸反应，以使叠氮化物附接在细胞表面。在一些实施方式中，叠氮化物通过叠氮化物的生物正交表达附接到细胞表面。例如，叠氮化物与细胞一起孵育。在一些实施方式中，炔基修饰的具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以在铜的存在下通过叠氮化物基团附接到细胞表面。在一些实施方式中，炔基修饰的具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以在无铜存在的情况下通过叠氮化物基团附接到细胞表面。[1312](xiv)基于凝集素的系统[1313]在本文所述的任何空间分析方法的一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)可以耦合至凝集素，其促进具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)附接细胞表面。凝集素可以结合聚糖，例如细胞表面的聚糖。在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，核酸分子)具有纳入的反应性官能团，例如叠氮化物基团。在一些实施方式中，具有条形码(例如，空间条形码)和叠氮基团的分子(例如，核酸分子)与修饰的凝集素(例如，使用nhs化学修饰的凝集素)反应以引入叠氮化物反应基团。在一些实施方式中，活细胞用具有条形码(例如，空间条形码)的凝集素修饰的分子(例如，核酸分子)标记。在一些实施方式中，固定的细胞用具有条形码(例如，空间条形码)的凝集素修饰的分子(例如，核酸分子)标记。在一些实施方式中，透化的细胞用具有条形码(例如，空间条形码)的凝集素修饰的分子(例如，核酸分子)标记。在一些实施方式中，分泌途径中的细胞器可用具有条形码(例如，空间条形码)的凝集素修饰的分子(例如，核酸分子)标记。[1314](b)将样品分成单个细胞或细胞群的方法[1315]本文所描述的任何方法的一些实施方式可包括将生物样品分离成单细胞、细胞群、细胞类型或一个或多个感兴趣区域。例如，在与一个或多个捕获探针接触之前，可将生物样品分离成单细胞、细胞群、细胞类型或一个或多个感兴趣的区域。在其它示例中，首先将生物样品与一个或多个捕获探针接触，然后将其分离成单细胞、细胞群、细胞类型或一个或多个感兴趣的区域。[1316]在一些实施方式中，可以使用像素化将生物样品分离成块(chucks)。像素化可包括步骤：提供生物样品，并冲压出生物样品的一个或多个部分。然后可以使用生物样品的冲压出的部分来进行本文所述的任何方法。在一些实施方式中，生物样品的冲压出的部分可以是随机图案或设计图案。在一些实施方式中，生物样品的冲压出的部分可以集中在生物样品中的感兴趣区域或亚细胞结构上。[1317]图20a是说明用于“像素化”样品的示范性、非限制性、非穷尽性步骤的工作流示意图，其中样品通过空心针或微针切割、压印、显微解剖或转移，将样品的一小部分移动到个体分区或孔中。[1318]图20b是描绘多针像素化的示意图，其中针阵列穿过支架上的样品并穿入含有珠(例如，凝胶珠)和试剂的纳米孔中。一旦针进入纳米孔，细胞就会弹出。[1319]在一些实施方式中，与在进行本文所述的任何空间分析方法之前的原始生物样品大小(“块”)相比，生物样品(例如，组织样品或组织切片)被分成更小的部分。在一些实施方式中，该方法可包括通过按空间明确限定的图案(例如，阵列打印)施用的条形码对ffpe“块”进行空间条码化。为了将空间条形码与生物样品的特定“块”相关联，条形码(例如，空间条形码)可以具有足够的长度以防止条形码在后续步骤中扩散，或者条形码可被共价施加于ffpe样品。在一些实施方式中，空间条形码对于每个ffpe块是独特的。在一些实施方式中，空间条形码可以嵌入到ffpe载玻片上(例如，在基质例如蜡或水凝胶中)。在一些实施方式中，ffpe载玻片在添加空间条形码之前被加热(例如，蜡被加热)。在一些实施方式中，在添加空间条形码之后，ffpe载玻片可被冷却并切割或解离成块。分块(例如，切割)生物样品的方法是本领域已知的。例如，在一个非限制性示例中，生物样品的分块(chunking)可以以各种方式进行，例如激光显微裂解、机械手段、声学(例如，超声处理)方式或本文所述的任何其它方法。在一些实施方式中，可以将荧光团/量子点(qdots)等嵌入块中以保存关于生物样品的空间信息。这一步的条码化能够在保留局部空间信息的同时，对块进行大规模并行包封(例如，肿瘤对比正常/健康细胞)。在一些实施方式中，生物样品(例如，组织切片)的分块可导致生物样品的单细胞块。在其它实施方式中，可以进行生物样品的分块以获得对应于生物样品的患病部分的块。在另一个实施方式中，可以进行生物样品的分块以获得对应于生物样品的患病或健康部分的生物样品的离散块。在一些实施方式中，可以进行生物样品的分块以获得对应于生物样品中的特定细胞类型的分块(例如，基于结合目标蛋白的抗体的荧光或化学发光成像的分块)。[1320]在一些实施方式中，可以进一步处理空间条码化块。例如，空间条码化块可以单独包封(例如，基质、乳液或水凝胶)。在一些实施方式中，空间条码化块可以包封在分区(例如，孔、液滴、通道或囊泡)中。在一些实施方式中，空间条码化块可以包封在囊泡中。在一些实施方式中，囊泡可包含脂质双层。在一些实施方式中，空间条码化ffpe块可以用独特条码化珠包封。在一些实施方式中，独特条码化珠可具有功能域、裂解域、独特分子标识符和捕获域，或它们的组合。在一些实施方式中，包封的空间条码化ffpe块和独特条码化珠可被加热以使ffpe样品脱蜡。在一些实施方式中，包封的空间条码化ffpe块和独特条码化珠可用二甲苯处理以使ffpe样品脱蜡。在一些实施方式中，可以在单个步骤中处理脱石蜡样品以去交联亚甲基桥。在一些实施方式中，例如，当去交联化学与条码化或文库制备步骤不相容时，可以进行其它步骤。在一些实施方式中，在去交联亚甲基桥之后，源自或存在于块中的核酸可以结合独特条码化珠。在一些实施方式中，在空间条形码结合独特条码化珠之后，包封可被破坏(例如，裂解、熔化或移除)并且条码化珠可以被收集。在一些实施方式中，收集的条码化珠可以被洗涤并重新包封。在一些实施方式中，可根据本文所述的任何方法扩增(例如，pcr扩增)和处理(例如，测序)与珠相关联的核酸(例如，空间条形码、独特条形码、分析物转录物)。[1321]在一些实施方式中，可以使用激光捕获显微切割(例如，高度多重化的激光捕获显微切割)来分割或划分生物样品。[1322](c)分析物的释放和扩增[1323]在一些实施方式中，可将裂解试剂添加到样品中以促进从样品中释放分析物。裂解剂的实例包括但不限于生物活性试剂，例如用于裂解不同细胞类型的裂解酶，例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物，例如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌素、labiase酶、基他酶(kitalase)、溶细胞酶和多种其它市售的裂解酶。其它裂解剂可以附加地或替代地与生物样品共同划分以导致样品的内容物释放到分区中。在一些实施方式中，基于表面活性剂的裂解溶液可用于裂解细胞，尽管这些溶液对于表面活性剂可干扰稳定乳液的基于乳液的系统可能不太理想。裂解溶液可包括离子表面活性剂，例如肌氨酰和十二烷基硫酸钠(sds)。电穿孔、热的、声学的或机械的细胞分裂也可用于某些实施方式中，例如，基于非乳液的分配，例如可作为液滴划分的补充或代替液滴划分的生物材料的封装，在细胞破裂后，囊膜的任何孔体积足够小以保留给定大小的核酸片段。[1324]除透化剂外，还可添加其它试剂以与生物样品相互作用，包括例如dna酶和rna酶失活剂或抑制剂或螯合剂(例如edta)和其它试剂以使随后处理来自样品的分析物。在其它实施方式中，向样品中加入核酸酶，例如dna酶或rna酶，或蛋白酶，例如胃蛋白酶或蛋白酶k。[1325]可以添加至样品的其他试剂包括，例如，用于片段化dna的核酸内切酶、dna聚合酶和用于扩增核酸的dntp。也可以添加到样品中的其它酶包括但不限于聚合酶、转座酶、连接酶、蛋白酶k和dna酶等。其它试剂还可以包括逆转录酶，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和转换寡核苷酸。在一些实施方式中，模板转换可用于增加edna的长度，例如，通过将预定义的核酸序列附加到cdna。[1326]如果组织样品透化不够，则在基材上捕获的分析物的量可能过低，无法进行充分的分析。相反，如果组织样品透化性太强，则分析物可从其在组织样品中的来源扩散出去，从而失去组织样品中分析物的相对空间关系。因此，在充分透化组织样品以获得良好信号强度同时仍保持组织样品中分析物分布的空间分辨率之间的平衡是理想的。[1327]在一些实施方式中，在生物样品包括活细胞的情况下，可修改透化条件以使活细胞仅经历短暂的透化(例如，通过短时间重复脉冲的电场施加)，从而使一个或多个分析物从活细胞迁移到基材，同时保留细胞活力。[1328]在一些实施方式中，在将生物样品与包括捕获探针的基材接触之后，进行移出步骤以从基材移出全部或部分生物样品。在一些实施方式中，移出步骤包括生物样品的透化的细胞的酶促或化学降解。例如，移出步骤可包括用酶(例如，蛋白酶k)处理生物样品以从第一基材去除生物样品的至少部分。在一些实施方式中，移出步骤可包括组织的消融(例如，激光消融)。[1329]在一些实施方式中，其中rna是捕获自样品中的细胞的分析物，可以选择性地富集一种或多种感兴趣的rna物质。例如，感兴趣的一种或多种rna物质可通过添加一个或多个寡核苷酸来选择。可以使用多种方法中的任何一种来选择性地向下选择(例如，去除)一种或多种rna。例如，可以将探针给予选择性地与核糖体rna(rrna)杂交的样品，从而减少样品中rrna的集和浓度。随后将捕获探针应用于样品可导致由于样品中存在的非特异性rna的减少所得到的改善的rna捕获。在一些实施方式中，其它寡核苷酸是用于通过聚合酶引发反应的序列。例如，与一种或多种感兴趣的rna具有序列互补性的一种或多种引物序列可用于扩增一种或多种感兴趣的rna，从而选择性地富集这些rna。在一些实施方式中，与捕获的rna(例如cdna)的互补链具有序列互补性的寡核苷酸可结合到cdna。在一个非限制性示例中，具有与一种或多种感兴趣的cdna互补的序列的生物素化寡核苷酸能够结合到cdna并且可以利用生物素化‑链霉亲和素亲和力，使用本领域已知的任何数量的方法中的任何一种(例如，链霉亲和素珠)来选择。[1330]在一些实施方式中，本文所述的任何空间分析方法可包括调节来自生物样品的生物分析物与阵列上的捕获探针之间的相互作用速率。在一些实施方式中，可以通过调节生物样品(例如调节温度或ph)来调节相互作用的速率。在一些实施方式中，调节相互作用的速率包括使用外部刺激。可用于调节相互作用速率的外部刺激的非限制性示例包括光、温度、小分子、酶和/或活化剂。在一个示例中，光可用于活化核酸延伸反应中的聚合酶。在另一个示例中，温度可用于调节两个互补核酸分子之间的杂交。[1331]核酸分析物可使用聚合酶链反应(例如，数字pcr、定量pcr或实时pcr)、等温扩增或本文所述或本领域已知的任何核酸扩增或延伸反应进行扩增。[1332](d)划分(分区)[1333]如上所述，在一些实施方式中，样品可以任选地被分成单个细胞、细胞组(例如，基于细胞亚型或基因表达谱)或小于原始样品的其它片段/片。可以分析样品的这些较小部分中的每一个以获得样品的空间解析的分析物信息。本文描述了非限制性划分方法。[1334]对于已被分离成更小片段的样品‑特别是对于已被分解、解离或以其他方式分离成个体细胞的样品‑分析片段的一种方法涉及将片段划分进入个体分区(例如液滴)，然后分析分区的内容物。通常，每个分区都保持其自身内容物与其他分区的内容物的分离。例如，分区可以是乳液中的液滴。[1335]本文所述的方法提供用于将细胞(例如，细胞)从样品区室化(compartmentalization)或划分进入离散区室或体素(voxel)。如本文所用，每个“体素”表示一个三维体积单位。在一些实施方式中，体素保持其自身内容与其它体素的内容的分离。体素可以是体积的多个分区的阵列的一个分区。例如，体素可以是其中划分了三维客体的多个离散分区的阵列的一个分区。作为另一个示例，多个可光交联聚合物前体的成员可以交联成体素，所述体素是覆盖基材或基材的部分的光交联聚合物的阵列的部分。独特标识符，例如条形码，可以在之前、之后或同时传递给细胞，以允许稍后将细胞的特征归属于特定体素。在一些实施方式中，体素具有限定的尺寸。在一些实施方式中，体素包括单个细胞。[1336]例如，基材可被覆有dtt敏感的水凝胶，然后与生物样品接触。任选地，使附接于基材的捕获探针从基材释放，从而使释放的捕获探针被引入生物样品中，并且至少一种释放的捕获探针通过捕获域与生物样品中存在的至少一种生物分析物相互作用。生物样品和基材可以组装成流动池，并添加可光交联的聚合物前体。然后可以使用光源将生物样品的细胞交联成具有限定尺寸的水凝胶体素。可以拆卸和洗涤流动池以移除未聚合的聚合物前体。覆层可以用dtt处理以产生用于下游应用的单细胞分区。可以分析捕获探针/生物分析物，并且可以使用空间条码化特征的空间信息来确定生物样品中捕获的生物分析物的空间位置。[1337]除分析物外，分区可包括其它组分，尤其是一个或多个珠。分区可以包括单个凝胶珠、单个细胞珠或单个细胞珠和单个凝胶珠两者。[1338]分区还可以包括一种或多种试剂。例如条形码之类的独特标识符可在液滴生成之前、之后或与液滴生成同时注入到液滴中，例如经由微胶囊(例如，珠)。微流体通道网络(例如，在芯片上)可用于生成分区。替代机制也可用于个体生物颗粒的划分，包括多孔膜，通过多孔膜，细胞的水性混合物被挤压成非水流体。[1339]分区可以在流体流中流动。所述分区可包括例如具有围绕内部流体中心或核心的外部屏障的微泡。在某些情况下，分区可包括多孔基材，其能够在其基材内夹带和/或保持材料。所述分区可以是第二相内第一相的液滴，其中所述第一相和第二相是不混溶的。例如，分区可以是非水性连续相(例如油相)内的水性流体液滴。在另一实例中，该分区可为水相中非水性流体的液滴。在一些示例中，分区可以在油包水乳液或水包油乳液中提供。各种不同的容器在例如美国专利申请公开号2014/0155295中描述，其全部内容通过引用纳入本文。例如，在美国专利申请公开号2010/0105112中描述了用于在非水或油连续相中产生稳定液滴的乳液系统，其全部内容通过引用纳入本文。[1340]对于乳液中的液滴，可通过例如将水性流体中的颗粒流动流引入非水性流体的流动流，使得液滴在两个流的接合部产生来实现将个体颗粒分配到离散分区。可对流体特性(例如，流体流速、流体粘度等)、粒子特性(例如，体积分数、粒子大小、粒子浓度等)、微流体结构(例如，通道几何形状等)和其它参数进行调整以控制所得分区的占用率(例如，每个分区的分析物数量、每个分区的珠数量等)。例如，可以通过以分析物的特定浓度和/或流速提供水性流来控制分区占用率。[1341]为了生成单个分析物分区，可以选择不混溶流体的相对流速，使得平均而言，分区每个分区可以包含少于一个分析物，以确保被占用的分区主要是单独占用的。在某些情况下，多个分区中的分区最多可包含一个分析物。在一些实施方式中，可以选择或调整各种参数(例如，流体性质、颗粒性质、微流体结构等)，使得大多数分区被占用，例如，仅有小百分比的未占用分区。可以控制流和信道架构以确保给定数量的单占用分区、小于某一水平的未占用分区和/或小于某一水平的多占用分区。[1342]本文所述的通道段可以耦合到各种不同的流体源或接收部件中的任何一个，包括储层、管道、歧管或其他系统的流体部件。如将理解的，微流体通道结构可以具有各种几何形状。例如，微流体通道结构可以具有一个或多个通道连接。作为另一实例，微流体通道结构可具有2、3、4或5个通道段，每个通道段携带在通道接合部相遇的颗粒。流体可以通过一个或多个流体流动单元被引导沿着一个或多个通道或储层流动。流体流动单元可包括压缩机(例如，提供正压力)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。流体也可以通过施加的压差、离心力、电动泵、真空、毛细管和/或重力流来控制。[1343]分区可以包括一个或多个独特标识符，例如条形码。条形码可以是先前的、随后的或同时传送到容纳被分隔或被划分的生物颗粒的分区。例如，条形码可以在液滴生成之前、之后或同时注入液滴。将条形码传递到特定分区使稍后将个体生物颗粒的特性归因于特定分区。条形码可以例如在核酸分子(例如寡核苷酸)上通过任何合适的机制传递到分区。条码化核酸分子可以通过微胶囊传递到分区。在一些情况中，微胶囊可包括珠。[1344]在一些实施方式中，条形码核酸分子最初可与微胶囊结合，然后从微胶囊释放。条形码核酸分子的释放可以是被动的(例如，通过扩散出微胶囊)。另外或可选择地，可在施加使条码化核酸分子离解或从微胶囊释放的刺激物时从微胶囊释放。这种刺激可以破坏微胶囊，这种相互作用使条码化核酸分子与微胶囊或在微胶囊内耦合，或两者结合。这种刺激可以包括，例如，热刺激、光刺激、化学刺激(例如，ph值的改变或还原剂的使用)、机械刺激、辐射刺激、生物刺激(例如，酶)或其任何组合。[1345]在一些实施方式中，一个或多个条形码(例如，空间条形码、umi或其组合)可作为分析物的部分引入到分区中。如前所述，条形码可直接结合到分析物，或可形成捕获探针或分析物捕获剂的部分，所述捕获探针或分析物捕获剂与分析物杂交、偶联或以其他方式关联，使得当分析物被引入分区时，条形码也被引入。[1346]图21描述了示例性工作流，其中样品与空间条码化捕获探针阵列接触，并且样品被固定、染色和成像2101，如本文别处所述。可以使用本文所述的任何方法从阵列2102上裂解捕获探针。如本文他处所述，捕获探针可通过被动或主动迁移向细胞扩散。然后可将捕获探针引入本文别处所述的样品2103，其中捕获探针能够使用本文所述的细胞穿透肽或脂质递送系统之一在没有细胞透化的情况下进入细胞。然后可以任选地对样品进行成像以通过结合在捕获探针2104内的报告分子来确认探针摄取。然后样品可从阵列中分离并经历解离2105，其中样品被分离成单细胞或小细胞群。一旦样品被解离，可将单细胞引入水包油液滴2106中，其中单细胞与液滴内的试剂结合并处理以使得穿透细胞的空间条形码标记液滴内该细胞的内容物。其它细胞分开地同时进行分区反应。然后对液滴的内容物进行测序2107，以便将一个或多个特定细胞与样品内的特定空间位置相关联2108。[1347]如上所述，图16示出了用于将个体分析物(例如，细胞)划分进入离散分区的微流体通道结构的示例。图17a和17c还展示了可用于将珠输送到液滴的微流体通道结构的其他示例。[1348]如上所述，可以将各种不同的珠合并到分区中。在一些实施方式中，例如，可以将非条码化珠纳入分区中。例如，在纳入分区中的生物颗粒(例如，细胞)携带一个或多个条形码(例如，空间条形码、umi及其组合)的情况下，珠可以是非条码化珠。[1349]在一些实施方式中，携带条形码的珠可以纳入分区中。例如，核酸分子(例如寡核苷酸)可通过可释放连接(例如二硫键接头)耦合到珠。同一珠可与一个或多个其它核酸分子耦合(例如，通过可释放连接)。核酸分子可以是或包括条形码。如本文别处所述，条形码的结构可以包括多个序列元件。[1350]所述核酸分子可包括可用于后续加工的功能域。例如，功能域可包括测序仪特异性流动池附接序列(例如，用于测序系统的p5序列)和测序引物序列(例如，用于测序系统的r1引物)中的一个或多个。核酸分子可包括用于对样品(例如dna、rna、蛋白质等)进行条码化的条形码序列。在某些情况下，条形码序列可以是珠特异性的，使得条形码序列对于耦合到同一珠的所有核酸分子是共同的。可选地或另外，条形码序列可以是分区特异性的，使得条形码序列对于耦合到被划分到相同分区中的一个或多个珠的所有核酸分子是共同的。核酸分子可包括特定引发序列，例如mrna特定引发序列(例如，多聚(t)序列)、靶向的引发序列和/或随机引发序列。核酸分子可包括锚定序列以确保特定引发序列在序列末端(例如，mrna的)杂交。例如，锚定序列可包括核苷酸的随机短序列，例如1‑聚体、2‑聚体、3‑聚体或更长的序列，其可确保多聚(t)片段更有可能在mrna的多聚(a)尾的序列末端杂交。[1351]核酸分子可包括独特分子识别序列(例如，独特分子标识符(umi))。在一些实施方式中，独特分子识别序列可包括约5至约8个核苷酸。或者，独特分子识别序列可包括少于约5个或多于约8个核苷酸。独特分子识别序列可以是在耦合到单个珠的个体核酸分子之间变化的独特序列。[1352]在一些实施方式中，独特分子识别序列可以是随机序列(例如，随机n‑聚体序列)。例如，umi可以提供捕获的起始mrna分子的独特标识符，以便能够对原始表达rna的数量进行定量。[1353]一般来说，个体珠可以耦合到任意数量的个体核酸分子，例如，从一个到几十个到几十万个甚至数百万个个体核酸分子。个体核酸分子的相应条形码可以包括共同序列段或相对共同序列段以及耦合到同一珠的不同个体核酸分子之间的可变或独特序列段。[1354]在任何给定的分区内，个体mrna分子的所有edna转录物都可以包含一个共同的条形码序列区段。然而，由给定分区内的不同mrna分子产生的转录物可以在独特分子识别序列区段(例如，umi区段)处变化。有益的是，即使在随后对给定分区的内容物进行任何扩增之后，不同umi的数目也可以指示源自给定分区的mrna的量。如上所述，转录物可被扩增、净化和测序以鉴定mrna的cdna转录物的序列，以及对条形码区段和umi区段进行测序。在描述多聚(t)引物序列的同时，其它靶向或随机引发序列也可用于起始逆转录反应。同样地，尽管描述为将条码化寡核苷酸释放到分区中，但在某些情况下，结合到珠的核酸分子可用于杂交并捕获珠固相上的mrna，例如，以促进rna与其他细胞内容物的分离。[1355]在一些实施方式中，包括具有反应性或能够被活化以使其变得具有反应性的官能团的前体可与其它前体聚合以生成包括所述活化或可活化官能团的凝胶珠。然后可以使用官能团将其它物质(例如，二硫键接头、引物、其他寡核苷酸等)附接到凝胶珠上。例如，特征为羧酸(cooh)基团的一些前体可与其它前体共聚合以形成也包括cooh官能团的珠。在一些情况中，丙烯酸(包括游离cooh基团的物质)、丙烯酰胺和双(丙烯酰)胱胺可共聚合在一起以产生包括游离cooh基团的珠。珠的cooh基团可被活化(例如，经由1‑乙基‑3‑(3‑二甲氨基丙基)碳二亚胺(edc)和n‑羟基琥珀酰亚胺(nhs)或4‑(4，6‑二甲氧基‑1，3，5‑三嗪‑2‑基)‑4‑甲基吗啉氯化物(dmtmm))以使其具有反应性(例如，与胺官能团反应，其中edc/nhs或dmtmm用于活化)。活化的cooh基团随后可与连接到珠的部分的适当的物质(例如，包括胺官能团的物质，其中羧酸基团被活化以可与胺官能团反应)反应。[1356]在一些实施方式中，可降解珠可引入到分区中，使得珠在分区内降解并且当施加适当的刺激时，任何相关物质(例如，寡核苷酸)在液滴内释放。游离物质(例如，寡核苷酸、核酸分子)可以与分区中包含的其他试剂相互作用。例如，特征为胱胺并通过二硫键连接到条形码序列的聚丙烯酰胺珠可与油包水乳液液滴内的还原剂结合。在液滴内，还原剂可以破坏各种二硫键，导致珠降解，条形码序列释放到液滴的水性内部环境中。在另一实例中，在碱性溶液中加热具有珠结合条形码序列的液滴也可导致珠降解并将所附接的条形码序列释放到液滴的水性内部环境中。[1357]任何适当数量的物质(例如，引物，条码化寡核苷酸)可与珠粒相关联，使得在从珠释放时，物质(例如，引物，例如，条码化寡核苷酸)以预定浓度存在于分区中。可选择该预定浓度以促进某些反应以在分区内产生测序文库(例如扩增)。在某些情况下，引物的预定浓度可通过产生带有核酸分子(例如寡核苷酸)的珠的过程来限制。[1358]可降解珠可包括具有不稳定键的一种或多种物质，使得当珠/物质暴露于适当的刺激物时，键被破坏并且珠降解。不稳定键可以是化学键(例如，共价键、离子键)或者可以是另一种类型的物理相互作用(例如，范德华相互作用、偶极‑偶极相互作用等)。在一些实施方式中，用于生成珠的交联剂可包括不稳定键。当暴露在适当的条件下时，不稳定的键会断裂，珠会降解。例如，当将包含胱胺交联剂的聚丙烯酰胺凝胶珠暴露于还原剂时，胱胺的二硫键可被破坏且珠降解。[1359]与不降解的珠相比，当对珠施加适当的刺激时，可降解珠可用于更快速地从珠释放附接的物质(例如，核酸分子、条形码序列、引物等)。例如，对于结合到多孔珠的内表面的物质或在包封的物质的情况下，在珠降解时，该物质可对溶液中的其他物质具有更大的移动性和可及性。在一些实施方式中，物质还可经由可降解接头(例如，二硫键接头)附接到可降解珠。所述可降解接头可对与所述可降解珠相同的刺激作出响应，或者所述两种可降解物质可对不同的刺激作出响应。例如，条形码序列可以通过二硫键附接到包含胱胺的聚丙烯酰胺珠。当条码化珠暴露于还原剂时，珠降解并且在条形码序列和珠之间的二硫键和珠中胱胺的二硫键断裂时释放空间条形码序列。[1360]如将从上述描述中了解到的，虽然被称为珠的降解，但在许多实施方式中，降解可指结合或夹带物质与珠的解离，具有或不具有物理珠本身的结构降解。例如，由于化学环境的变化，夹带的物质可以通过渗透压差从珠中释放出来。举例来说，由于渗透压差引起的珠孔体积的改变通常可以在珠本身没有结构降解的情况下发生。在一些情况中，由于珠的透化溶胀导致的孔体积增大可使珠内夹带的物质释放。在一些实施方式中，由于孔体积收缩，珠的透化收缩可导致珠更好地保留夹带的物质。[1361]许多化学触发物可用于触发分区内珠的降解。这些化学变化的实例可包括但不限于ph介导的珠内组分完整性的改变、通过交联键的裂解降解珠的组分以及珠的组分的解聚。[1362]在一些实施方式中，珠可由包括可降解化学交联剂(例如bac或胱胺)的材料形成。这种可降解交联剂的降解可以通过各种机制来实现。在一些实例中，珠可与可引起氧化、还原或其它化学变化的化学降解剂接触。例如，化学降解剂可以是还原剂，例如二硫苏糖醇(dtt)。还原剂的其他实例可包括β‑巯基乙醇、(2s)‑2‑氨基‑1，4‑二巯基丁烷(二硫丁胺或dtba)、三(2‑羧乙基)膦(tcep)或其组合。还原剂可降解形成珠的凝胶前体之间形成的二硫键，从而降解珠。[1363]在某些实施方式中，溶液ph值的变化(例如ph值的增加)可触发珠的降解。在其他实施方式中，暴露于水溶液(例如水)可触发水解降解，从而引发珠的降解。在某些情况下，任何刺激组合都可能引发珠降解。例如，ph值的变化可以使化学试剂(例如dtt)成为有效的还原剂。[1364]在应用热刺激时，也可以诱导珠释放其内容物。温度的变化会引起珠的各种变化。例如，热会使固体珠液化。热的变化会导致珠熔化，使珠的部分降解。在其他情况中，热可增加珠组分的内部压力，使得珠破裂或爆炸。热也可以作用于热敏聚合物作为材料来构建珠。[1365]除了珠和分析物之外，形成的分区可以包括各种不同的试剂和物质。例如，当裂解试剂存在于分区内时，裂解试剂可促进分区内分析物的释放。裂解剂的实例包括生物活性试剂，例如用于裂解不同细胞类型的裂解酶，例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物等，例如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌素、labiase酶、基他酶、溶细胞酶和多种其它市售的裂解酶，例如来自西格玛奥德里奇公司(密苏里州圣路易斯)，以及其他市售的裂解酶。其他裂解剂可另外或可选地共划分以使分析物释放到分区中。例如，在某些情况下，基于表面活性剂的裂解溶液可用于裂解细胞，尽管这些溶液对于表面活性剂可干扰稳定乳液的基于乳液的系统可能不太理想。在一些实施方式中，裂解溶液可包括非离子表面活性剂，例如tritonx‑100和tween20。在一些实施方式中，裂解溶液可包括离子表面活性剂，例如肌氨酰和十二烷基硫酸钠(sds)。电穿孔、热的、声学的或机械的细胞分裂也可用于某些实施方式中，例如，基于非乳液的分配，例如可作为液滴划分的补充或代替液滴划分的分析物的封装，在细胞破裂后，囊膜的任何孔体积足够小以保留给定大小的核酸片段。[1366]可与分区中的分析物共划分的其它物质的实例包括但不限于dna酶和rna酶失活剂或抑制剂或螯合剂(例如edta)以及用于去除或以其它方式降低不同细胞裂解物组分对核酸后续加工的负活性或影响的其它试剂。其他试剂也可以被共划分，包括用于片段化dna的核酸内切酶、dna聚合酶和用于扩增核酸片段和将条形码分子标签附接到扩增的片段的dntp。[1367]其他试剂还可包括逆转录酶，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和寡核苷酸，以及可用于模板转换的转换寡核苷酸(在本文中也称为“转换寡核苷酸”或“模板转换寡核苷酸”)。在一些实施方式中，模板转换可用于增加cdna的长度。模板转换可用于将预先定义的核酸序列附加到cdna。在模板转换的实例中，cdna可由模板(例如，细胞mrna)的逆转录产生，其中具有末端转移酶活性的逆转录酶可以非模板依赖的方式向cdna添加其它的核苷酸(例如，多聚(c))。转换寡核苷酸可以包括与其它核苷酸互补的序列，例如多聚(g)。cdna上的其它核苷酸(例如，多聚(c))可与转换寡核苷酸上的其它核苷酸(例如，多聚(g))杂交，由此转换寡核苷酸可被逆转录酶用作模板以进一步延伸cdna。[1368]模板转换寡核苷酸可以包括杂交区和模板区。杂交区可以包括能够与靶标杂交的任何序列。在一些情况中，杂交区包括一系列g碱基以与cdna分子3′端的突出端c碱基互补。连续g碱基可包括1个g碱基、2个g碱基、3个g碱基、4个g碱基、5个g碱基或超过5个g碱基。模板序列可以包括待纳入cdna的任何序列。在一些情况中，模板区包括至少1个(例如，至少2个、3个、4个、5个或更多)标签序列和/或功能序列。模板转换寡核苷酸可包括脱氧核糖核酸；核糖核酸；修饰的核酸，包括2‑氨基嘌呤、2,6‑二氨基嘌呤(2‑氨基‑da)、反向dt、5‑甲基dc、2′‑脱氧肌苷、超t(5‑羟基丁基‑2′‑脱氧尿苷)、超g(8‑氮杂‑7‑脱氮鸟苷)、锁核酸(lna)、解锁核酸(una，例如，una‑a、una‑u、una‑c、una‑g)、iso‑dg、iso‑dc、2′氟碱基(例如，氟c、氟u、氟a和氟g)和上述的任何组合。[1369]在一些实施方式中，与分析物划分的珠可包括结合到珠的不同类型的寡核苷酸，其中不同类型的寡核苷酸结合到不同类型的分析物。例如，珠可以包括一个或多个第一寡核苷酸(例如，可以是捕获探针)和一个或多个第二寡核苷酸(例如，可以是捕获探针)，第一寡核苷酸可以结合或杂交到第一类型的分析物，例如mrna，第二寡核苷酸可以结合或杂交到第二类型的分析物，例如gdna。分区还可以包括有助于从共划分的细胞释放核酸的裂解剂，并且还可以包括可以降解珠和/或破坏寡核苷酸和珠之间的共价键的剂(例如还原剂)，从而将寡核苷酸释放到分区中。释放的条码化寡核苷酸(也可以条码化)可以与从细胞释放的mrna以及从细胞释放的gdna杂交。[1370]由此由杂交形成的条码化构建体可包括第一类构建体，其包括对应于来自珠的原始条形码序列的序列和对应于来自细胞的转录物的序列，以及第二类构建体，其包括对应于来自珠的原始条形码序列的序列和对应于来自细胞的基因组dna的序列。然后可以从分区中释放/移出条码化构建体，并且在一些实施方式中，进一步加工以添加任何其他序列。然后可以对得到的构建体进行测序，对测序数据进行加工，并将结果用于在空间上表征来自细胞的mrna和gdna。[1371]在另一实例中，分区包括珠，其包括具有第一条形码序列的第一类寡核苷酸(例如，第一捕获探针)、可与mrna转录物的多聚(a)尾杂交的多聚(t)引发序列以及可独特地识别给定转录物的umi条形码序列。该珠还包括具有第二条形码序列的第二类寡核苷酸(例如，第二捕获探针)、能够与结合到划分细胞表面的抗体的第三条码化寡核苷酸(例如，分析物捕获剂)特异性杂交的靶向引发序列。第三条码化寡核苷酸包括独特地识别抗体的umi条形码序列(因此，它所结合的特定细胞表面特征)。[1372]在该示例中，第一和第二条码化寡核苷酸包括相同的空间条形码序列(例如，第一和第二条形码序列相同)，这使条码化核酸与分区的下游关联。然而，在一些实施方式中，第一和第二条码化序列不同。[1373]分区还可以包括有助于从细胞释放核酸的裂解剂，并且还可以包括可以降解珠和/或破坏条码化寡核苷酸和珠之间的共价键的剂(例如还原剂)，从而将它们释放到分区中。第一类释放的条码化寡核苷酸可与从细胞释放的mrna杂交，第二类释放的条码化寡核苷酸可与第三类条码化寡核苷酸杂交，形成条码化构建体。[1374]第一类条码化构建体包括与来自珠的第一条形码序列相对应的空间条形码序列和与来自第一类寡核苷酸的umi条形码序列相对应的序列，其识别细胞转录物。第二类条码化构建体包括与来自第二类寡核苷酸的第二条形码序列相对应的空间条形码序列和与第三类寡核苷酸(例如，分析物捕获剂)相对应的umi条形码序列，并用于识别细胞表面特征。然后可以从分区中释放/移出条码化构建体，并且在一些实施方式中，进一步加工以添加任何其他序列。然后对得到的构建体进行测序，对测序数据进行处理，结果用于表征细胞的mrna和细胞表面特征。[1375]前面的讨论涉及两个带有寡核苷酸的珠的具体例子，用于分析一个分区内的两种不同分析物。更一般地，被划分的珠可以具有先前描述的任何结构，并且可以包括所描述的用于分析分区内两个或更多个(例如，三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、八个或更多个、十个或更多个、12个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个，40个或更多个，50个或更多个)的不同类型的分析物的寡核苷酸的任何组合。用于同时分析分区内分析物的不同组合的具有不同类型寡核苷酸(例如，捕获探针)组合的珠的实例包括但不限于：(a)基因组dna和细胞表面特征(例如，使用本文所述的分析物捕获剂)；(b)mrna和谱系追踪构建体；(c)mrna和细胞甲基化状态；(d)mrna和可及染色质(例如，atac‑seq、dna酶‑seq和/或微球菌酶‑seq)；(e)mrna和细胞表面或细胞内蛋白质和/或代谢物；(f)条码化分析物捕获剂(例如，本文所述的mhc多聚体)和免疫细胞受体(例如，t细胞受体)的v(d)j序列；和(g)mrna和扰动剂(例如，crispr‑crrna/sgrna、talen、锌指核酸酶和/或本文所述的反义寡核苷酸)。在一些实施方式中，扰动剂可以是小分子、抗体、药物、适体、核酸(例如mirna)、物理环境(例如，温度变化)，或任何其它已知扰动剂。[1376](e)测序分析[1377]在来自样品的分析物已根据上述与基于一般空间细胞的分析方法相关的任何方法与捕获探针、分析物捕获剂或其他条码化寡核苷酸序列杂交或以其他方式结合之后，杂交/结合产生的条码化构建体通过测序进行分析以鉴定分析物。[1378]在一些实施方式中，如上文所述，通过与与细胞表面杂交、结合或关联或引入细胞的捕获探针或分析物捕获剂杂交直接对样品进行条码化，可对完整样品进行测序。或者，如上文所述，如果条码化样品已被分离成片段、细胞群或个体细胞，则可对个体片段、细胞群或细胞进行测序。如上所述，对于已通过珠划分进行条码化的分析物，可通过打破分区从分区中提取个体分析物(例如，细胞或细胞裂解后的细胞内容物)，然后通过测序来分析以识别分析物。[1379]多种不同的测序方法可用于分析条码化的分析物构建体。一般来说，测序的多核苷酸可以是例如核酸分子，例如脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)，包括其变体或衍生物(例如，单链dna或dna/rna杂合体，以及具有核苷酸类似物的核酸分子)。[1380]多核苷酸的测序可以通过各种商业系统进行。更一般地，可以使用核酸扩增、聚合酶链反应(pcr)(例如，数字pcr和液滴数字pcr(ddpcr)、定量pcr、实时pcr、多重pcr、基于pcr的单重方法、乳液pcr)和/或等温扩增来进行测序。[1381]对遗传物质进行测序的方法的其他示例包括但不限于dna杂交方法(例如，southern印迹法)、限制性酶消化方法、sanger测序方法、下一代测序方法(例如，单分子实时测序、纳米孔测序和polony测序)，连接法和微阵列法。可使用的测序方法的其他示例包括靶向测序、单分子实时测序、外显子测序、基于电子显微镜的测序、面板测序、晶体管介导测序、直接测序、随机鸟枪测序、sanger双脱氧终止测序、全基因组测序，杂交测序、焦磷酸测序、毛细管电泳、凝胶电泳、双链体测序、循环测序、单碱基延伸测序、固相测序、高通量测序、大规模平行标记测序、低温共扩增pcr(cold‑pcr)、可逆染料终止子测序、双端测序、近期测序、核酸外切酶测序、连接测序、短读测序、单分子测序、合成测序、实时测序、反向终止子测序、纳米孔测序、454测序、solexa基因组分析仪测序、solidtm测序、ms‑pet测序及其任何组合。[1382]核酸分子(包括条码化核酸分子或其衍生物)的序列分析可以是直接的或间接的。因此，序列分析基材(可被视为经受序列分析步骤或过程的分子)可直接为条码化的核酸分子或其可为从其衍生的分子(例如，其互补物)。因此，例如，在测序反应的序列分析步骤中，测序模板可以是条码化的核酸分子，也可以是从其衍生的分子。例如，第一和/或第二链dna分子可以直接进行序列分析(例如测序)，即可以直接参与序列分析反应或过程(例如测序反应或测序过程，或者是被测序或以其他方式识别的分子)。或者，可在序列分析(例如，通过另一技术进行测序或鉴定)之前对条码化核酸分子进行第二链合成或扩增的步骤。因此，序列分析底物(例如模板)可以是扩增子或条码化核酸分子的第二链。[1383]在一些实施方式中，双链分子的两条链可经序列分析(例如，测序)。在一些实施方式中，可以分析(例如测序)单链分子(例如条码化核酸分子)。为了进行单分子测序，可以在3′末端修饰核酸链。[1384]在一些实施方式中，大规模平行焦磷酸测序技术可用于核酸测序。在焦磷酸测序中，核酸在油溶液中的水滴内扩增(乳液pcr)，每个液滴包含单一的核酸模板，其附接在单一的涂有引物的珠上，然后形成克隆群体。测序系统包含许多皮升体积孔，每个孔包含一个珠和测序酶。焦磷酸测序使用荧光素酶产生光来检测添加到新生核酸中的个体核苷酸，并且组合数据用于产生序列读取。[1385]作为焦磷酸测序的另一个示例应用，释放的ppi可通过atp磺酰化酶立即转化为三磷酸腺苷(atp)来检测，并且产生的atp水平可通过荧光素酶产生的光子来检测，如ronaghi等anal.biochem.242(1)，84‑9(1996)；ronaghi，genomeres.11(1)，3‑11(2001)；ronaghi等，science281(5375)，363(1998)；以及美国专利号6,210,891，6,258,568和6,274,320所述，其全部内容通过引用纳入本文。[1386]大规模平行测序技术可用于核酸测序，如上所述。在一个实施方式中，大规模平行测序技术可基于可逆染料终止剂。例如，首先将dna分子附接到例如玻璃或硅基材上的引物上，并进行扩增以形成局部克隆群体(例如，通过桥式扩增)。添加四种类型的ddntp，并冲走未结合的核苷酸。与焦磷酸测序不同，由于阻断基团(例如，ddntp的糖部分上存在3′阻断基团)，dna一次仅延伸一个核苷酸。检测器获取荧光标记的核苷酸的图像，然后染料连同末端3′阻断基团从dna中化学去除，作为后续循环的前体。可以重复此过程，直到获得所需的序列数据。[1387]在一些实施方式中，通过检测在dna聚合期间释放的氢离子来进行测序。含有待测序的模板dna链的微孔可以充满单一类型的核苷酸。如果引入的核苷酸与前导模板核苷酸互补，则它被纳入生长的互补链。这会导致氢离子释放，从而触发超敏离子传感器，这表明发生了反应。若模板系列中存在均聚重复系列，单次循环中会纳入多个核苷酸。这导致对应数量的氢离子释放，和成比例的更高电子信号。[1388]在一些实施方式中，可以原位进行测序。原位测序方法特别有用，例如，当样品表面上的分析物(例如，细胞表面分析物)或样品内的分析物(例如，细胞内分析物)已被条码化后，生物样品保持完整。原位测序通常涉及以连续的、模板依赖的方式将标记的核苷酸(例如，荧光标记的单核苷酸或二核苷酸)纳入或将标记的引物(例如，标记的随机六聚体)杂交到核酸模板上，使得可以确定纳入的核苷酸或标记的引物延伸产物的核苷酸序列的相同性(即，核苷酸序列)，从而测定相应模板核酸的核苷酸序列。例如，在mitra等，(2003)anal.biochem.320，55‑65，和lee等，(2014)science，343(6177)，1360‑1363中描述了原位测序的各个方面，通过引用将其全部内容纳入本文。[1389]此外，pct专利申请公开号wo2014/163886、wo2018/045181、wo2018/045186和美国专利号10138509和10179932中描述了用于进行原位测序的方法和系统的示例，其全部内容通过引用纳入本文中。用于原位测序的示例技术包括但不限于starmap(例如在wang等，(2018)science，361(6499)5691中描述)、merfish(例如在moffitt，(2016)methodsinenzymology，572，1‑49中描述)和fisseq(例如在美国专利申请公开号2019/0032121中描述)。上述各参考文献的全部内容通过引用纳入本文。[1390]对于已通过划分进行条码化的分析物，条码化核酸分子或其衍生物(例如，已添加一个或多个功能序列的条码化核酸分子，或已从中移出一个或多个特征的条码化核酸分子)可汇集并一起加工以用于后续分析，例如在高分辨率测序仪上测序。可以使用条形码序列实现汇集处理。例如，给定分区的条码化核酸分子可以具有相同的条形码，这与其他空间分区的条形码不同。或者，可以分开处理不同分区的条码化核酸分子以进行后续分析(例如，测序)。[1391]在一些实施方式中，在捕获探针不包含空间条形码的情况下，可以在捕获探针从生物样品捕获分析物之后和分析分析物之前添加空间条形码。当在捕获分析物之后添加空间条形码时，可在扩增分析物之后添加条形码(例如，rna的逆转录和聚合酶扩增)。在一些实施方式中，分析物分析使用一个或多个捕获的分析物的直接测序，例如杂交的rna的直接测序。在一些实施方式中，在杂交的rna的逆转录之后进行直接测序。在一些实施方式中，在杂交的rna的逆转录的扩增之后进行直接测序。[1392]在一些实施方式中，通过合成测序(sbs)进行捕获的rna的直接测序。在一些实施方式中，测序引物与捕获探针的一个或多个域(例如，功能域)中的序列互补。在此类实施方式中，通过合成进行测序可包括逆转录和/或扩增以产生模板序列(例如，功能域)，其中引物序列可与模板序列结合。[1393]sbs可涉及将适当的引物(有时称为测序引物)与待测序的核酸模板杂交、延伸引物以及检测用于延伸引物的核苷酸。优选地，在进一步的核苷酸添加到生长的核酸链之前检测用于延伸引物的核酸，从而能进行逐碱基原位核酸测序。通过在引物延伸反应中包括一个或多个标记的核苷酸，有助于检测纳入的核苷酸。为了使适当的测序引物与待测序的核酸模板杂交，核酸模板通常应为单链形式。如果构成核酸特征的核酸模板以双链形式存在，则可使用本领域公知的方法(例如通过变性，裂解等)对其进行处理以提供单链核酸模板。与核酸模板杂交并用于引物延伸的测序引物优选短寡核苷酸，例如长度为15到25个核苷酸。测序引物的长度也可以大于25个核苷酸。例如，测序引物的长度可为约20至约60个核苷酸，或长度超过60个核苷酸。测序引物可以以溶液或固定形式提供。一旦通过使核酸模板和测序引物经受适当条件将测序引物退火到待测序的核酸模板，则进行引物延伸，例如使用核酸聚合酶和核苷酸供应，其中至少一些以标记形式提供，以及如果提供合适的核苷酸，则适于引物延伸的条件。[1394]优选地，在每个引物延伸步骤之后，包括洗涤步骤以去除可干扰后续步骤的未纳入的核苷酸。一旦进行了引物延伸步骤，就对核酸群体进行监测，以确定标记的核苷酸是否已被纳入延伸的引物中。然后可以重复引物延伸步骤以确定下一个和随后纳入延伸的引物中的核苷酸。如果所确定的序列未知，应用于给定群体的核苷酸通常以选定的顺序应用，然后在整个分析过程中重复，例如datp、dttp、dctp、dgtp。[1395]可使用的sbs技术描述于例如，但不限于美国专利申请公开号2007/0166705，美国专利申请公开号2006/0188901，u.s.patent7,057,026，美国专利申请公开号2006/0240439，美国专利申请公开号2006/0281109，pct专利申请公开号wo05/065814，美国专利申请公开号2005/0100900，pct专利申请公开号wo06/064199，pct专利申请公开号wo07/010,251，美国专利申请公开号2012/0270305，美国专利申请公开号2013/0260372，和美国专利申请公开号2013/0079232中的技术，其全部内容通过引用纳入本文。[1396]在一些实施方式中，捕获的rna的直接测序通过顺序荧光杂交(例如，通过杂交进行测序)来进行。在一些实施方式中，原位进行rna与捕获探针杂交的杂交反应。在一些实施方式中，捕获的rna在与测序探针杂交之前不被扩增。在一些实施方式中，rna在与测序探针杂交之前被扩增(例如，逆转录到cdna和cdna的扩增)。在一些实施方式中，使用单分子杂交链式反应进行扩增。在一些实施方式中，使用滚动链扩增来进行扩增。[1397]顺序荧光杂交可包括探针的顺序杂交，包括简并引物序列和可检测的标记物。简并引物序列是能够与独立于所述核酸片段序列的任何核酸片段杂交的短寡核苷酸序列。例如，这种方法可以包括以下步骤：(a)提供包括四个探针的混合物，每个探针在5′端包括a、c、g或t，进一步包括长度为5到11个核苷酸的简并核苷酸序列，并且进一步包括对于在5′端有a、c、g或t的探针而言不同的功能域(例如，荧光分子)；(b)将步骤(a)的探针与目标多核苷酸序列相关联，其序列需求将通过该方法确定；(c)测量四个功能域的活性并记录活性的相对空间位置；(d)从目标多核苷酸序列移出来自步骤(a)‑(b)中的试剂；并且将步骤(a)‑(d)重复n个循环，直到确定每个珠的空间域的核苷酸序列，经过修改，步骤(a)中使用的寡核苷酸与靶多核苷酸序列的部分以及所述序列的部分侧接的位置1到n互补。由于条形码序列不同，在一些实施方式中，这些其它侧接序列是简并序列。来自阵列上每个点的循环1到n的荧光信号可用于确定目标多核苷酸序列的序列。[1398]在一些实施方式中，使用顺序荧光杂交对捕获的rna进行体外直接测序。在一些实施方式中，捕获的rna在与测序探针杂交之前被扩增(例如，逆转录到cdna和edna的扩增)。在一些实施方式中，含有捕获的rna的捕获探针暴露于靶向rna编码区的测序探针。在一些实施方式中，一个或多个测序探针靶向每个编码区域。在一些实施方式中，测序探针被设计成与测序试剂(例如，染料标记的读出寡核苷酸)杂交。然后，测序探针可以与测序试剂杂交。在一些实施方式中，对测序反应的输出进行成像。在一些实施方式中，从测序反应的图像解析cdna的特定序列。在一些实施方式中，在与测序探针杂交之前进行对捕获的rna的逆转录。在一些实施方式中，测序探针被设计成靶向rna编码区的互补序列(例如，靶向edna)。[1399]在一些实施方式中，使用基于纳米孔的方法直接对捕获的rna进行测序。在一些实施方式中，使用纳米孔直接rna测序进行直接测序，其中捕获的rna通过纳米孔易位。纳米孔电流可以被记录并转换成碱基序列。在一些实施方式中，捕获的rna在纳米孔测序期间保持附接到基材。在一些实施方式中，捕获的rna在纳米孔测序之前从基材释放。在一些实施方式中，其中感兴趣的分析物是蛋白质，可使用基于纳米孔的方法进行蛋白质的直接测序。可使用的基于纳米孔的测序方法的实例描述于deamer等，trendsbiotechnol.18，147‑151(2000)；deamer等，acc.chem.res.35：817‑825(2002)；li等，nat.mater.2：611‑615(2003)；soni等，clin.chem.53，1996‑2001(2007)；healy等，nanomed.2，459‑481(2007)；cockroft等，j.am.chem.soc.130，818‑820(2008)；以及美国专利号7,001,792。上述各参考文献的全部内容通过引用纳入本文。[1400]在一些实施方式中，使用通过连接的单分子测序来进行捕获的rna的直接测序。这种技术利用dna连接酶纳入寡核苷酸并鉴定这种寡核苷酸的纳入。寡核苷酸通常具有与寡核苷酸杂交的序列中的特定核苷酸的相同性相关的不同标记物。例如，在shendure等，science(2005)，309：1728‑1732和美国专利号5599675、5750341、6969488、6172218和6306597中描述了连接测序所涉及的方面和特征，其全部内容通过引用纳入本文中。[1401]在一些实施方式中，核酸杂交可用于测序。这些方法利用与条形码序列的至少部分互补的标记的核酸解码器探针。多重解码可以使用具有可分辨标签的许多不同探针的集来进行。例如在美国专利号8,460,865，和gunderson等，genomeresearch14：870‑877(2004)中描述了核酸杂交测序的非限制性实例，其全部内容通过引用纳入本文。[1402]在一些实施方式中，商用高通量数字测序技术可用于分析条形码序列，其中dna模板不是一次测序一个，而是在批量过程中测序，并且许多序列优选地以平行方式读出，或者也可以使用其自身可以平行化的超高通量串行过程。此类技术的实例包括测序(例如，基于流动池的测序技术)、使用修饰核苷酸的合成测序(例如在由加利福尼亚州圣迭戈的illumina公司的truseqtm和hiseqtm技术市售)，由马萨诸塞州剑桥的helicos生命科学集团提供的heliscopetm和加利福尼亚州门罗公园的太平洋生物科学公司提供的pacbiors)、离子检测技术测序(加利福尼亚州南旧金山的离子激流公司)和dna纳米球测序(加利福尼亚州山景城的完全基因组公司(completegenomics，inc.))。[1403]在一些实施方式中，在将核苷酸纳入延伸产物时释放的质子的检测可用于本文所述的方法中。例如，美国专利申请公开号2009/0026082、2009/0127589、2010/0137143和2010/0282617中描述的测序方法和系统可用于直接对条形码进行测序。上述各参考文献的全部内容通过引用纳入本文。[1404]在一些实施方式中，可在测序期间使用对dna聚合酶活性的实时监测。例如，如levene等，science(2003)，299，682‑686，lundquist等，opt.lett.(2008)，33，1026‑1028，和korlach等，proc.natl.acad.sci.usa(2008)，105，1176‑1181中所述，可通过荧光共振能量转移(fret)检测核苷酸纳入。上述各参考文献的全部内容通过引用纳入本文。[1405]iv.多重化[1406](a)一般多重化[1407]在如本文所述的空间分析的各种实施方式中，特征可以包括用于分析个体细胞的内在和外在信息的不同类型的捕获探针。例如，特征可以包括以下一个或多个：1)具有能够结合到细胞中的一个或多个内源性核酸的捕获域的捕获探针；2)具有能够结合到细胞中的一个或多个外源性核酸的捕获域的捕获探针(例如，来自感染细胞的微生物(例如，病毒，细菌)的核酸、引入细胞的核酸(例如质粒或从中衍生的核酸)、用于基因编辑的核酸(例如crispr相关rna，例如crrna、导向rna)；3)具有能够结合到分析物捕获剂的捕获域的捕获探针(例如，与寡核苷酸偶联的抗体，该寡核苷酸包括具有结合捕获域的分析物捕获序列的捕获剂条形码结构域)，和4)具有能够结合到蛋白质(例如，在细胞中表达的外源性蛋白质、来自感染细胞的微生物(例如，病毒、细菌)的蛋白质)的结构域的捕获部分，或所述细胞蛋白质的结合伴侣(例如，免疫细胞受体的抗原)。[1408]在如本文所述的任何空间分析方法的一些实施方式中，空间概况分析包括对两种不同类型的分析物的同时分析。特征可以是一个凝胶珠，它偶联(例如，可逆偶联)到一个或多个捕获探针。捕获探针可包括空间条形码序列和可与mrna转录物的多聚(a)尾杂交的多聚(t)引发序列。捕获探针还可以包括能够独特地识别给定转录物的umi序列。捕获探针还可以包括空间条形码序列和能够与gdna随机杂交的随机n‑聚体引发序列。在这种设置中，捕获探针可以包含相同的空间条形码序列，这允许下游测序读数与特征的关联。[1409]在如本文所述的任何空间分析方法的一些实施方式中，特征可以是凝胶珠，其耦合(例如，可逆耦合)至捕获探针。捕获探针可包括空间条形码序列和可与mrna转录物的多聚(a)尾杂交的多聚(t)引发序列。捕获探针还可以包括能够独特地识别给定转录物的umi序列。捕获探针可以包括空间条形码序列和能够与分析物捕获剂特异性杂交的捕获域。分析物捕获剂可以包括寡核苷酸，该寡核苷酸包括与与特征偶联的捕获域相互作用的分析物捕获序列。分析物捕获剂的寡核苷酸可以与结合到细胞表面的抗体偶联。寡核苷酸包括独特地识别抗体(和因此，其结合到的特定细胞表面特征)的条形码序列(因此，它所结合的特定细胞表面特征)。在这种设置中，捕获探针包括相同的空间条形码序列，这允许条码化核酸与空间阵列上位置的下游关联。在本文所描述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，可通过任何合适的路线产生分析物捕获剂，包括经由本文别处所描述的示例性耦合方案。[1410]在本文所述的任何空间分析方法的一些实施方式中，可同时测量的两个或更多个生物分析物的其他组合包括但不限于：(a)基因组dna和细胞表面特征(例如，通过结合到细胞表面特征的分析物捕获剂)，(b)mrna和谱系追踪结构，(c)mrna和细胞甲基化状态，(d)mrna和可及染色质(例如atac‑seq、dna酶‑seq和/或微球菌酶‑seq)，(e)mrna和细胞表面或细胞内蛋白质和/或代谢物，(f)mrna和染色质(细胞中染色质的空间组织)，(g)分析物捕获剂(例如，本文所述的任何mhc多聚体)和免疫细胞受体(例如t细胞受体)的v(d)j序列，(h)mrna和扰动剂(例如crisprcrrna/sgrna、talen、锌指核酸酶和/或本文所述的反义寡核苷酸)，(i)基因组dna和扰动剂，(j)分析物捕获剂和扰动剂，(k)可及染色质和扰动剂，(1)染色质(例如，细胞中染色质的空间组织)和扰动剂，和(m)细胞表面或细胞内蛋白质和/或代谢物和扰动剂(例如，本文所述扰动剂中任一种)，或其任何组合。[1411]在本文所描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，第一分析物可包括具有编码免疫细胞受体(例如tcr或bcr)的v(d)j序列的至少部分的核酸序列(例如，mrna，源自mrna逆转录的互补dna)的核酸分子。在一些实施方式中，具有编码免疫细胞受体的v(d)j序列的至少部分的核酸序列的核酸分子是首先使用含多聚(t)的引物从相应mrna的逆转录产生的cdna。然后可以使用引物对所生成的cdna进行条码化，所述引物的特征为与所生成的cdna的至少部分杂交的空间条形码序列(和可选的umi序列)。在一些实施方式中，结合末端转移酶或具有末端转移酶活性的逆转录酶的模板转换寡核苷酸可用于在cdna上产生引发区，条码化引物可在cdna产生期间与其杂交。末端转移酶活性可例如将多聚(c)尾添加至cdna的3′端，使得模板转换寡核苷酸可经由多聚(g)引发序列结合且cdna的3′端可进一步延伸。原始mrna模板和模板转换寡核苷酸随后可从cdna变性，并且包含与cdna上所生成的引发区的至少部分互补的序列的条码化引物随后可与cdna和包含条形码序列(和任何可选的umi序列)和产生的cdna互补物的条码化构建体杂交。在pct专利申请号wo2018/075693和美国专利申请公开号2018/0105808中描述了适用于对从mrna转录物生成的cdna进行条码化的其他方法和组合物，所述mrna转录物包括编码免疫细胞受体的v(d)j区域的那些，和/或包括模板转换寡核苷酸的组合物和条码化方法，各自均通过引用全文纳入本文。[1412]在一些实施方式中，可以使用类似于本文所述的方法来进行v(d)j分析。例如，v(d)j分析可以通过使用与免疫细胞的特定表面特征结合并与条形码序列(例如，分析物结合部分条形码)相关联的一种或多种分析物捕获剂来完成。一种或多种分析物捕获剂可包括mhc或mhc多聚体。条码化的寡核苷酸与可用于v(d)j分析的珠偶联。寡核苷酸通过可释放的连接如二硫键接头偶联到珠上。寡核苷酸可以包括对后续处理有用的功能序列，例如可以包括测序仪特异性流动池附接序列(例如p5序列)的功能序列，以及可以包括测序引物序列(例如r1引物结合位点)的功能序列。在一些实施方式中，该序列可以包括p7序列和r2引物结合位点。条形码序列可包含在结构中以用于对模板多核苷酸进行条码化。可选择功能性序列可以与各种不同测序系统中的任何一种兼容，例如454测序、离子激流质子或pgm、illuminax10等及其要求。在一些实施方式中，条形码序列、功能序列(例如，流动池附接序列)和附加序列(例如，测序引物序列)可以是附接到给定珠的全部寡核苷酸所共有的。条码化的寡核苷酸还可以包括促进模板转换的序列(例如，多聚(g)序列)。在一些实施方式中，如本文别处所述，其他序列提供独特分子标识符(umi)序列区段。[1413]在使用条形码寡核苷酸的细胞多核苷酸分析的示例性方法中，将细胞与带有条码化寡核苷酸和例如逆转录酶、引物、寡核苷酸(例如，模板转换寡核苷酸)、dntp和还原剂的其他试剂的珠一起共划分到分区中(例如，乳液中的液滴)。在该分区内，细胞可被裂解以产生多个模板多核苷酸(例如，dna例如基因组dna、rna例如mrna等)。[1414]具有来自细胞的模板多核苷酸和(i)具有朝向3′末端的序列的引物的反应混合物，该序列与模板多核苷酸杂交(例如，多聚(t))和(ii)模板转换寡核苷酸，其包括朝向5′末端的第一寡核苷酸，可经受扩增反应以产生第一扩增产物。在一些实施方式中，模板多核苷酸是具有多聚(a)尾的mrna，并且与模板多核苷酸杂交的引物包括朝向3′末端的多聚(t)序列，其与多聚(a)区段互补。第一寡核苷酸可包括以下的至少一个：衔接子序列、条形码序列、独特分子标识符(umi)序列、引物结合位点和测序引物结合位点或其任何组合。在一些情况中，第一寡核苷酸是能够由多个分区的全部分区所共有的序列。例如，第一寡核苷酸可包括流动池附接序列、扩增引物结合位点或测序引物结合位点，并且第一扩增反应促进该寡核苷酸与来自细胞的模板多核苷酸的附接。在一些实施方式中，第一寡核苷酸包括引物结合位点。在一些实施方式中，第一寡核苷酸包括测序引物结合位点。[1415]朝向引物3′端(例如，多聚(t))的序列与模板多核苷酸杂交。在第一扩增反应中，延伸反应试剂，例如逆转录酶、三磷酸核苷、辅因子(例如，mg2 或mn2 )(它们也是共同划分的)可以利用细胞的核酸作为模板来延伸引物序列，产生转录物，例如cdna，其具有与引物退火的细胞核酸的链互补的片段。在一些实施方式中，逆转录酶具有末端转移酶活性，并且逆转录酶以非模板依赖的方式向cdna添加其它的核苷酸，例如多聚(c)。[1416]模板转换寡核苷酸，例如包括多聚(g)序列的模板转换寡核苷酸，可与cdna杂交并促进第一扩增反应中的模板转换。因此，转录物可以包括引物的序列、与来自细胞的模板多核苷酸互补的序列和与模板转换寡核苷酸互补的序列。[1417]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，在第一扩增反应之后，第一扩增产物或转录物可经受第二扩增反应以产生第二扩增产物。在一些实施方式中，附加序列(例如，功能序列，例如流动池附接序列、测序引物结合序列、条形码序列等)被附接。第一和第二扩增反应可以在相同体积中进行，例如在液滴中。在一些实施方式中，第一扩增产物在有条码化寡核苷酸存在的情况下经历第二扩增反应，以产生具有条形码序列的第二扩增产物。条形码序列对于分区可以是独特的，即每个分区可以具有独特条形码序列。条码化的寡核苷酸可以包括具有模板转换寡核苷酸的至少一个区段和至少第二寡核苷酸的序列。条码化寡核苷酸上的模板转换寡核苷酸的区段能促进条码化寡核苷酸与转录物(例如cdna)的杂交，以促进第二扩增产物的产生。除了条形码序列之外，条码化寡核苷酸可包括第二寡核苷酸，例如以下的至少一个：衔接子序列、独特分子标识符(umi)序列、引物结合位点和测序引物结合位点，或其任何组合。[1418]在本文所描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，第二扩增反应使用第一扩增产物作为模板并且使用条码化寡核苷酸作为引物。在一些实施方式中，条码化寡核苷酸上的模板转换寡核苷酸的区段可与所述cdna或具有与模板转换寡核苷酸互补的序列的互补片段或从模板转换寡核苷酸拷贝的序列的部分杂交。在第二扩增反应中，延伸反应试剂，例如聚合酶、三磷酸核苷、辅因子(例如mg2 或mn2 )(其也是被共划分的)，可以使用第一扩增产物作为模板来延伸引物序列。第二扩增产物可包括第二寡核苷酸、模板多核苷酸(例如，mrna)区段的序列和与引物互补的序列。[1419]在本文所描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，第二扩增反应使用条码化寡核苷酸作为模板并且使用第一扩增产物的部分作为引物。具有与模板转换寡核苷酸互补的序列的第一扩增产物(例如，cdna)的区段能与包含模板转换寡核苷酸的至少一个区段的序列的条码化寡核苷酸的区段杂交。在第二扩增反应中，延伸反应试剂，例如聚合酶、三磷酸核苷、辅因子(例如mg2 或mn2 )(其也是被共同划分的)，可以使用条码化寡核苷酸作为模板来延伸引物序列。第二扩增产物可以包括引物的序列、与模板多核苷酸(例如mrna)的序列互补的序列和与第二寡核苷酸互补的序列。[1420]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，可以同时测量三类或更多类的生物分析物。例如，特征可以包括可以通过三个不同的捕获域参与至少三种不同类型的分析物的测定的捕获探针。珠可耦合到条码化寡核苷酸，所述条码化寡核苷酸包括包含用于mrna分析的多聚(t)引发序列的捕获域；条码化寡核苷酸，所述条码化寡核苷酸包括包含用于gdna分析的随机n‑聚体引发序列的捕获域；以及条码化寡核苷酸，所述条码化寡核苷酸包括可特异性地通过其分析物捕获序列与分析物捕获剂(例如，带有空间条形码的抗体)结合。[1421]在本文所述的任何空间分析方法的一些实施方式中，可同时测量的三种或更多生物分析物的其他组合包括但不限于：(a)mrna，谱系追踪构建体，以及细胞表面和/或细胞内蛋白质和/或代谢物；(b)mrna，可及染色质(例如，atac‑seq，dna酶‑seq和/或微球菌酶‑seq)和细胞表面和/或细胞内蛋白质和/或代谢物；(c)mrna、基因组dna和扰动剂(例如，如本文所述的crispr‑crrna/sgrna、talen、锌指核酸酶和/或反义寡核苷酸)；(d)mrna，可及染色质和扰动剂；(e)mrna，分析物捕获试剂(例如，本文所述的任何mhc多聚体)和扰动剂；(f)mrna，细胞表面和/或细胞内蛋白质和/或代谢物和扰动剂；(g)mrna，免疫细胞受体(例如，t细胞受体)的v(d)j序列和扰动剂；(h)mrna，分析物捕获剂和免疫细胞受体的v(d)j序列；(i)细胞表面和/或细胞内蛋白质和/或代谢物，分析物捕获剂(例如，本文所述mhc多聚体)和免疫细胞受体的v(d)j序列；(j)甲基化状态，mrna和细胞表面和/或细胞内蛋白质和/或代谢物；(k)mrna，染色质(例如，细胞中染色质的空间组织)和扰动剂；(1)免疫细胞受体的v(d)j序列，染色质(例如，细胞中染色质的空间组织)；和扰动剂；和(m)mrna，免疫细胞受体的v(d)j序列和染色质(例如，细胞中染色质的空间组织)，或其任何组合。[1422]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，可以同时测量四类或更多类的生物分析物。特征可以是与条码化引物偶联的珠，所述引物各自可以参与不同类型分析物的测定。所述特征耦合(例如，可逆耦合)到捕获探针，所述捕获探针包括用于mrna分析的多聚(t)引发序列的捕获域，并且还耦合(例如，可逆耦合)到捕获探针，所述捕获探针包括用于gdna分析的随机n‑聚体引发序列的捕获域。此外，该特征还偶联(例如，可逆偶联)至捕获探针，该捕获探针通过其捕获域结合分析物捕获剂的分析物捕获序列。该特征还可偶联(例如，可逆偶联)至捕获探针，该捕获探针可通过其捕获域特异性地结合能够以扰动剂方式起作用的核酸分子(例如，crisprcrrna/sgrna、talen、锌指核酸酶和/或反义寡核苷酸，如本文所述)。[1423]在本文描述的任何空间分析方法的一些实施方式中，存在于给定特征或给定珠上的各种空间条码化捕获探针中的每一个包括相同的空间条形码序列。在一些实施方式中，每个条码化的捕获探针可以以适合于分析其各自分析物的方式从特征中释放。例如，条码化构建体a、b、c和d可以如本文他处所述产生并分析。条码化构建体a可以包括对应于来自珠的条形码序列(例如，空间条形码)的序列和对应于目标mrna的dna序列。条码化构建体b可以包括对应于来自珠的条形码序列(例如，空间条形码)的序列和对应于基因组dna的序列。条码化构建体c可以包括对应于来自珠的条形码序列(例如，空间条形码)的序列和对应于与分析物捕获剂相关联的条形码序列(例如，分析物结合部分条形码)的序列。条码化构建体d可以包括对应于来自珠的条形码序列(例如，空间条形码)的序列和对应于crispr核酸的序列(其在一些实施方式中还包括条形码序列)。可以分析每个构建体(例如，通过多种测序方法中的任一种)并且结果可以与各种分析物来源的给定细胞相关联。条码化(或甚至非条码化)构建体可以定制用于分析与核酸相关并且能够与这样的构建体结合的任何给定分析物。[1424]在本文所述的任何空间分析方法的一些实施方式中，可同时测量的四种或更多生物分析物的其他组合包括但不限于：(a)mrna，谱系追踪构建物，细胞表面和/或细胞内蛋白质和/或代谢物，以及gdna；(b)mrna，可获得的染色质(例如，atac‑seq、dna酶‑seq和/或微球菌酶‑seq)，细胞表面和/或细胞内蛋白质和/或代谢物以及扰动剂(例如，如本文所述的crispr‑crrna/sgrna、talen、锌指核酸酶和/或反义寡核苷酸)；(c)mrna、细胞表面和/或细胞内蛋白质和/或代谢物，分析物捕获剂(例如免疫细胞受体(例如，t细胞受体)的v(d)j序列；(d)mrna，基因组dna，扰动剂和可及染色质；(e)mrna，细胞表面和/或细胞内蛋白质和/或代谢物，分析物捕获剂(例如，本文所述mhc多聚体)和扰动剂；(f)mrna，细胞表面和/或细胞内蛋白质和/或代谢物，扰动剂和免疫细胞受体(例如t细胞受体)的v(d)j序列；(g)mrna，扰动剂，分析物捕获剂(例如本文所述的mhc多聚体)和免疫细胞受体(例如t细胞受体)的v(d)j序列；(h)mrna，染色质(例如，细胞中染色质的空间组织)和扰动剂；(i)免疫细胞受体的v(d)j序列，染色质(例如，细胞中染色质的空间组织)；和扰动剂；(j)mrna，免疫细胞受体的v(d)j序列，染色质(例如，细胞中染色质的空间组织)和基因组dna；(k)mrna，免疫细胞受体的v(d)j序列，染色质(例如，细胞中染色质的空间组织)和扰动剂，或其任何组合。[1425](b)用于多分析物分析的空间阵列的构建[1426]本公开还提供用于构建能够进行多分析物分析的空间阵列的方法和材料。在一些实施方式中，空间阵列包括在基材上的多个特征，其中多个特征的一个或多个成员包括多个具有第一类型功能序列的寡核苷酸和具有第二不同类型的功能序列的寡核苷酸。在一些实施方式中，特征可包括具有两种类型功能序列的寡核苷酸。特征可以与包含truseq功能序列的寡核苷酸偶联，并且也可以与包含nextera功能序列的寡核苷酸偶联。在一些实施方式中，多个特征的一个或多个成员包括两种类型的功能序列。在一些实施方式中，多个特征的一个或多个成员包括第一类型的功能序列。在一些实施方式中，多个特征的一个或多个成员包括第二类型的功能序列。在一些实施方式中，可将其他寡核苷酸添加到功能性序列以产生全寡核苷酸，其中全寡核苷酸包括空间条形码序列、可选umi序列、引发序列和捕获域。这些序列的附接可以通过连接(包括美国专利申请公开号20140378345中描述的通过夹板连接，其全部内容通过引用并入本文)或任何其它合适的途径实现。如本文所讨论的，寡核苷酸可以与有助于构建完整的完整寡核苷酸(例如，能够进行空间分析的寡核苷酸)的夹板序列杂交。[1427]在一些实施方式中，与位于特征上的功能序列(例如，truseq和nextera)杂交的寡核苷酸包括能够捕获不同类型的分析物(例如，mrna、基因组dna、细胞表面蛋白质或可及染色质)的捕获域。在一些示例中，可结合至truseq功能序列的寡核苷酸可包括包含多聚(t)捕获序列的捕获域。除了多聚(t)捕获序列之外，能够结合truseq官能团的寡核苷酸还可以包括捕获域，所述捕获域包括用于捕获基因组dna的随机n聚体(n‑mer)序列(例如，或能够捕获本文所述的任何生物分析物的本文所述的任何其它序列或结构域)。在这种情况下，空间阵列可以通过将truseq‑多聚(t)和truseq‑n聚体寡核苷酸的比率施用于包含功能性truseq序列的特征来构建。这可以产生空间阵列，其中部分寡核苷酸可以捕获mrna，另一不同部分寡核苷酸可以捕获基因组dna。在一些实施方式中，多个特征的一个或多个成员包括truseq和nextera功能性序列。在这种情况下，包括两种类型的功能序列的特征能够结合对每个功能序列具有特异性的寡核苷酸。例如，能够与truseq功能序列结合的寡核苷酸可用于递送包含多聚(t)捕获域的寡核苷酸，而能够与nextera功能序列结合的寡核苷酸可用于递送包含n聚体捕获域的寡核苷酸，用于捕获基因组dna。本领域普通技术人员将认识到，捕获域(例如，具有本文所述的能够结合到本文所述的任何不同类型的分析物的各种捕获序列中的任何一种的捕获域，如本文所述)的任何组合可与能够结合到truseq和nextera功能性序列的寡核苷酸组合以构建空间阵列。[1428]在一些实施方式中，包括捕获域(例如，能够耦合到分析物的寡核苷酸)或分析物捕获剂的寡核苷酸可包括能够结合或连接到分析引物的寡核苷酸序列。衔接子可允许捕获探针或分析物捕获剂附接至任何合适的测定引物并用于任何合适的测定。所述分析引物可以包括引发区和能够结合或连接到衔接子的序列。在一些实施方式中，衔接子可以是非特异性引物(例如，5′突出端)并且测定引物可包括能够被连接到5′突出端的3′突出端。分析引物上的引发区可以是本文所述的任何引物，例如多聚(t)引物、随机n‑聚体引物、靶向特异性引物或分析物捕获剂捕获序列。[1429]在一些实例中，寡核苷酸可包括衔接子，例如具有10个核苷酸的5′突出端。衔接子可以连接到测定引物，其各自包括一个3′突出端，其中10个核苷酸与衔接子的5′突出端互补。捕获探针可通过附接到为该测定设计的测定引物而用于任何分析。[1430]衔接子和分析引物可用于允许捕获探针或分析物捕获剂附接到任何合适的测定引物并用于任何合适的测定。包含空间条形码的捕获探针可以附接到包含多聚(dt)序列的珠上。包括空间条形码和多聚(t)序列的捕获探针可用于测定如本文一般描述的多种生物分析物(例如，生物分析物包括多聚(a)序列或偶联至分析物捕获剂或以其它方式与分析物捕获剂相关联，所述分析物捕获剂包含多聚(a)序列作为分析物捕获序列)。[1431]具有多聚(a)序列的夹板寡核苷酸可用于促进耦合到捕获探针，捕获探针包括空间条形码和促进耦合到分析引物的第二序列。测定引物包括与夹板寡核苷酸第二序列互补的序列和确定测定引物功能的测定特异性序列(例如，多聚(t)引物、随机n聚体引物、目标特异性引物或分析物捕获剂捕获序列，如本文所述)。[1432]在本文所描述的任何空间概况分析方法的一些实施方式中，特征可以包括捕获探针，其包括包括例如具有3′末端3rg的转换寡核苷酸的空间条形码。例如，可以使用具有用3rg序列功能化的空间条形码的特征(例如，凝胶珠)，其能够实现模板切换(例如，逆转录酶模板切换)，但对于任何聚体测定都不是特异性的。在一些实施方式中，添加到反应中的测定引物可以确定分析哪种类型的分析物。例如，测定引物可以包括能够结合目标生物分析物的结合域(例如，用于mrna的多聚(t)，用于基因组dna的n聚体等)。捕获探针(例如，能够进行空间概况分析的寡核苷酸)可以通过使用逆转录酶/聚合酶进行延伸来产生，随后模板转换到条码化衔接子寡核苷酸上以纳入条形码和其他功能性序列。在一些实施方式中，测定引物包括能够结合用于mrna分析的多聚(t)序列的捕获域、用于基因组dna分析的随机引物或能够结合与分析物结合部分偶联的核酸分子的捕获序列(例如，分析物捕获剂的分析物捕获序列)或可用作扰动剂的核酸分子(例如，如本文所述的crisprcrrna/sgrna、talen、锌指核酸酶和/或反义寡核苷酸)。[1433]v.样品分析系统[1434]上述用于分析生物样品的方法可以使用各种硬件组件来实现。在本节中，将描述此类组件的示例。然而，应当理解，一般来说，本文讨论的各种步骤和技术可以使用各种不同的装置和系统组件来进行，并非所有这些都被明确地阐述。[1435]图22a是示出示例样品处理设备2200的示意图。样品处理设备2200包括样品室2202，其在关闭或密封时是流体密封的。在室2202内，第一保持器2204保持样品2208所在的第一基材2206。样品室2202还包括第二保持器2210，其保持具有特征阵列2214的第二基材2212，如上所述。[1436]流体储器2216经由流体入口2218连接到样品室2202的内部体积。流体出口2220还连接到样品室2202的内部体积和阀2222。反过来，阀2222连接到废物储器2224，并且可选地连接到分析装置2226。控制单元2228电连接到第二保持器2210、阀2222、废物储器2224和流体储器2216。[1437]在设备2200的操作期间，上述任何试剂、溶液和其它生化组分可经由流体入口2218从流体储器2216输送到样品室2202。控制单元2228连接到流体储器2216，可以控制试剂、溶液和组分的递送，并根据各种样品类型和分析程序的编程分析方案调整体积和流速。在一些实施方式中，流体储器2216包括可由控制单元2228控制的泵，以便于将物质输送到样品室2202中。[1438]在某些实施方式中，流体储器2216包括多个室，每个室通过歧管(未示出)连接到流体入口2218。控制单元2228可以通过调节歧管来选择性地将来自多个室中的任何一个或多个室的物质输送到样品室2202中，以确保所选择的室在流体上连接到流体入口2218。[1439]一般而言，控制单元2228可被配置成在第一基材2212上的样品2208与第一基材2212上的特征阵列2214相互作用之前、之后或之前和之后将物质从流体储器2216引入样品室2202。前面已经描述了许多此类物质的例子。此类物质的实例包括但不限于透化剂、缓冲剂、固定剂、染色溶液、洗涤溶液和各种生物试剂的溶液(例如，酶、肽、寡核苷酸、引物)。[1440]为了起始样品2208和特征阵列2214之间的相互作用，样品和阵列在空间上接近。为了促进该步骤，第二保持器2210——在控制单元2228的控制下——可以在x‑、y‑和z‑坐标方向中的任何一个方向上平移第二基材2212。具体地，控制单元2228可以指示第二保持器2210在z方向上平移第二基材2212，使得样品2208接触或接近接触特征阵列2214。[1441]在一些实施方式中，设备2200可以任选地包括对准子系统2230，其可以电连接到控制单元2228。对准子系统2230的功能是确保样品2208和特征阵列2214在z方向上平移第二基材2212之前在x‑y平面上对齐，以便样品2208接触或近乎接触特征阵列2214。[1442]对准子系统2230可以以多种方式实现。在一些实施方式中，例如，对准子系统2230包括成像单元，其获得显示第一基材2206和/或第二基材2212上的基准标识(marking)的一个或多个图像。控制单元2218分析图像以确定第二基材2212在x和/或y坐标方向上的适当平移，以确保样品2208和特征阵列2214在z坐标方向上的平移之前对齐。[1443]在某些实施方式中，控制单元2228可任选地调节从样品室2202移出物质。例如，控制单元2228可以选择性地调整阀2222，使得从流体储器2216引入样品室2202的物质被引导到废物储器2224。在一些实施方式中，废物储器2224可以包括电连接到控制单元2228的减压源(未示出)。控制单元2228可调节流体出口2220中的流体压力，以控制流体从样品室2202移入废物储器2224的速率。[1444]在一些实施方式中，来自样品2208或来自特征阵列2214的分析物可通过控制单元2228对阀2222的适当调节选择性地输送到分析装置2226。如上所述，在一些实施方式中，分析装置2226包括电连接到控制单元2228的减压源(未示出)，以便控制单元2228可以调整将分析物输送到分析装置2226的速率。因此，流体出口2220有效地起到分析物收集器的作用，而分析物的分析由分析装置2226进行。应当注意，并非本文所描述的所有工作流和方法都经由分析装置2226来实现。例如，在一些实施方式中，由特征阵列2214捕获的分析物保持与阵列结合(即，不从阵列上裂解)，并且直接分析特征阵列2214以识别特定结合的样品组分。[1445]除了上述组件之外，设备2200还可以任选地包括其它特征。在一些实施方式中，例如，样品室2202包括电连接到控制单元2228的加热子系统2232。控制单元2228可激活加热子系统2232以加热样品2208和/或特征阵列2214，这可有助于促进本文所述方法的某些步骤。[1446]在某些实施方式中，样品室2202包括与控制单元2228电连接的电极2234。控制单元2228可以任选地激活电极2234，从而在第一和第二基材之间建立电场。例如，此类场可用于促进分析物从样品2208向特征阵列2214迁移。[1447]在本文描述的一些方法中，获取样品和/或特征阵列的一个或多个图像。通常可以以各种方式实现用于获得这种图像的成像设备。图22b示出了成像设备2250的一个示例。成像设备2250包括光源2252、光调整光学元件2254、光传送光学元件2256、光收集光学元件2260、光调节光学元件2262和检测子系统2264。上述每个部件可以可选地连接到控制单元2228，或者可选地连接到另一个控制单元。为了下面的说明，假设控制单元2228连接到成像设备2250的部件。[1448]在成像设备2250的操作期间，光源2252产生光。通常，由光源2252产生的光可以包括电磁光谱的紫外光、可见光和/或红外区域中的任何一个或多个区域中的光。可以使用各种不同的光源元件来产生光，包括(但不限于)发光二极管、激光二极管、激光源、荧光源、白炽灯源和辉光放电源。[1449]光源2252产生的光由光调整光学元件2254接收。一般而言，光调整光学元件2254针对特定成像应用修改光源2252产生的光。例如，在一些实施方式中，光调整光学元件2254例如通过滤除光的某些波长来修改光的光谱特性。为此，光调整光学元件2254可以包括各种光谱光学元件，例如滤光器、光栅、棱镜和色差分束器。[1450]在某些实施方式中，光调整光学元件2254修改由光源2252产生的光的空间特性。可用于此目的的组件的示例包括(但不限于)孔径、相位掩模、变迹元件和扩散器。[1451]在通过光调整光学器件2254进行修改之后，光被光传送光学器件2256接收并且被引导到样品2208或特征阵列2214上，其中任一样品2208或特征阵列2214被定位在支架2258上。光调整光学元件2254通常用于收集光并将光引导到样品或阵列的表面上。各种不同的光学元件可用于此目的，且此类元件的实例包括但不限于透镜、镜、分束器及具有非零光功率的各种其它元件。[1452]从样品2208或特征阵列2214射出的光由光收集光学元件2260收集。一般而言，光收集光学元件2260可以包括与上述与光传送光学元件2256相关的那些元件中的任何元件类似的元件。然后可以任选地通过光调节光学元件2262来修改收集的光，光调节光学元件2262通常可以包括上述与光调整光学元件2254相关的任何元件。[1453]然后由检测子系统2264检测光。通常，检测子系统2264通过检测来自样品或特征阵列的光来生成样品2208或特征阵列2214的一个或多个图像。检测子系统2264中可以使用各种不同的成像元件，包括ccd检测器和其他图像捕获装置。[1454]如图22b所示，上述每个组件可以任选地连接到控制单元2228，使得控制单元2228可以调整成像设备的各种特性。例如，控制单元2228可以相对于入射光的位置并且也相对于入射光的焦平面(如果入射光被聚焦)来调整样品2208或特征阵列2214的位置。控制单元2228还可以选择性地过滤入射光和从样品中射出的光。[1455]成像设备2250通常可以获得各种不同成像模式的图像。在一些实施方式中，例如，图像是透射光图像，如图22b所示。在某些实施方式中，设备2250被配置为获得反射图像。在一些实施方式中，设备2250可以被配置成获得双折射图像、荧光图像、磷光图像、多光子吸收图像，以及更一般地，任何已知的图像类型。[1456]一般而言，控制单元2228可以通过向样品处理设备2200和/或成像设备2250的组件发送适当的控制信号来进行本文中描述的不明确要求用户干预的任何方法步骤。为了进行这些步骤，控制单元2228通常包括软件指令，当进行这些指令时，使控制单元2228进行特定步骤。在一些实施方式中，控制单元2228包括电子处理器和电子处理器可读的软件指令，并使处理器进行本文描述的步骤。在某些实施方式中，控制单元2228包括一个或多个应用特定的整合电路，所述整合电路具有有效地用作软件指令的电路配置。[1457]控制单元2228可以以多种方式实现。图22c是示出控制单元2228的一个示例的示意图，其包括电子处理器2280、存储单元2282、存储设备2284和输入/输出界面2286。处理器2280能够处理存储在存储器单元2282或存储设备2284中的指令，并且在输入/输出界面2286上显示信息。[1458]存储器单元2282存储信息。在一些实施方式中，存储单元2282是计算机可读介质。存储单元2282可以包括易失性存储器和/或非易失性存储器。存储设备2284能够提供大容量存储，并且在一些实施方式中，存储设备2284是计算机可读介质。在某些实施方式中，存储设备2284可以是软盘设备、硬盘设备、光盘设备、磁带设备、固态设备或另一种类型的可写介质。[1459]输入/输出界面2286实现输入/输出操作。在一些实施方式中，输入/输出界面2286包括键盘和/或指针设备。在一些实施方式中，输入/输出界面2286包括用于显示图形用户界面和/或显示信息的显示单元。[1460]进行并使控制单元2228进行本文所述的任何步骤或过程的指令可以在数字电子电路、或计算机硬件、固件或这些的组合中实现。这些指令可以在有形地体现在信息载体(例如，在机器可读存储设备)中的计算机程序产品中实现，以便由可编程处理器(例如，处理器2280)进行。计算机程序可以用任何形式的编程语言编写，包括编译或解释语言，并且可以用任何形式部署，包括作为独立程序或作为模块、组件、子程序或适合在计算环境中使用的其他单元。适于有形地体现计算机程序指令和数据的存储设备包括所有形式的非易失性存储器，包括例如半导体存储器设备，例如eprom、eeprom和闪存设备；磁盘，例如内部硬盘和可移动磁盘；磁光盘；以及cd‑rom和dvd‑rom光盘。处理器和存储器可由asic(专用整合电路)补充或纳入asic中。[1461]处理器2280可以包括各种合适的处理器中的任何一个或多个。例如，用于进行指令程序的合适处理器包括通用和专用微处理器，以及任何类型的计算机或计算设备的唯一处理器或多个处理器中的一个。[1462]示例性实施方式[1463]在本文所述的工作流的一些非限制性示例中，可将样品浸入100％冷冻甲醇中，并在‑20℃下孵育30分钟。20分钟后，可移出样品并在超纯水中冲洗。冲洗样品后，制备新鲜的曙红溶液，随后样品可以用异丙醇覆盖。将样品在异丙醇中孵育1分钟后，可以通过将载玻片保持一定角度来移除试剂，此时载玻片的底部边缘可以与实验室抹布接触并风干。样品可以被均一地覆盖于苏木精溶液中，并在室温下孵育7分钟。将样品在苏木精中孵育7分钟后，可以通过将载玻片保持一定角度来移除试剂，此时载玻片的底部边缘可以与实验室擦拭物接触。可以将含有样品的载玻片浸入水中，移除多余的液体。之后，样品可以用发蓝缓冲液覆盖，并可以在室温下孵育2分钟。将装有样品的载玻片再次浸入水中，均一覆盖伊红溶液，室温孵育1分钟。载玻片可以风干不超过30分钟，然后在37℃孵育5分钟。可以使用明场成像设置对样品进行成像。[1464]此外，可以通过以下示例性步骤处理生物样品以进行样品透化和cdna生成。样品可以暴露于透化酶并在37℃孵育预定的透化时间(这是组织类型特异性的)。通过添加0.1xssc缓冲液，可以移除透化酶并准备用于分析物捕获的样品。然后可以对样品进行预平衡热循环方案(例如，53℃盖温和预平衡，53℃逆转录45分钟，然后保持在4℃)，ssc缓冲液可被移除。可以将含有无核酸酶水、逆转录酶试剂、模板转换寡核苷酸、还原剂和逆转录酶的主混物(mastermix)加入生物样品和基材中，并且可以对带有主混物的样品进行热循环方案(例如，在53℃进行逆转录45分钟并在4℃保持)。可以通过使基材经受热循环方案(例如，在65℃预平衡，在65℃合成第二条链15分钟，然后在4℃保持)在基材上进行第二条链合成。可以从样品中移除主混物试剂，然后加入0.8mkoh并在室温下孵育5分钟。可以移除koh，可以添加洗脱缓冲液并将其从样品中移除。可以将包含第二链试剂、第二链引物和第二链酶的第二链混合物(secondstrandmix)添加到样品中，并且可以密封和孵育样品。在孵育结束时，可以移除试剂，加入洗脱缓冲液并将其从样品中移除，再次向样品中加入0.8mkoh，使样品在室温下孵育10分钟。可以添加tris‑hcl，混合试剂。可以将样品转移至新管中，涡旋并置于冰上。[1465]此外，生物样品可以通过以下用于cdna扩增和质量控制的示例性步骤进行处理。可以制备qpcr混合物(qpcrmix)，包括无核酸酶水、qpcr主混物(qpcrmastermix)和cdna引物，并将其移液到qpcr板的孔中。可将少量样品加入铺板的qpcr混合物，并根据预定的热循环方案进行热循环(例如，步骤1：98℃3分钟，步骤2：98℃5秒，步骤3：63℃30秒，步骤4：记录扩增信号，步骤5：重复98℃5秒，63℃30秒，共25个循环)。完成热循环后，可以制备cdna扩增混合物，其包括扩增混合物和cdna引物，并使其与剩余样品合并且混合。然后可以对样品进行孵育和热循环(例如，盖温105℃持续约45‑60分钟；步骤1：98℃3分钟，步骤2：98℃15秒，步骤3：63℃20秒，步骤4：72℃1分钟，步骤5：[循环次数由qpcrcq值确定]，步骤6：72℃1分钟，步骤7：保持在4℃)。然后可以将样品在4℃储存至多72小时或在‑20℃储存至多1周，或者重新悬浮在0.6xspriselect试剂中并移液以确保正确混合。然后可以将样品在室温下孵育5分钟，并通过将样品放在磁体上(例如，磁体处于高位)对样品进行清洁。去除上清液，向沉淀物中加入80％乙醇，孵育30秒。乙醇可以被去除，沉淀物可以被再次清洗。然后可以将样品离心并置于磁体上(例如，磁体处于低位)。可以移除任何剩余的乙醇，并且可以将样品风干至多2分钟。可移出磁体，将洗脱缓冲液添加到样品中，混合，并在室温下孵育2分钟。然后可以将样品置于磁体上(例如，在低位)直到溶液变清。样品可以转移至新的试管条上，并在4℃储存至多72小时或在‑20℃储存至多4周。部分样品可以在安捷伦生物分析仪高灵敏度芯片上运行，在该芯片上可以选择一个区域并测量cdna浓度以计算总cdna产量。或者，可以通过安捷伦bioanalyzer或安捷伦tapestation进行定量。[1466]此外，生物样品可以通过以下示例性步骤进行空间基因表达文库构建。可在冰上制备片段化混合物(fragmentationmix)，其包括片段化缓冲液和片段化酶。可以将洗脱缓冲液和片段化混合物添加到每个样品中，混合并离心。然后可将样品混合物置于热循环仪中，并根据预定方案循环(例如，盖温65℃持续约35分钟，预冷块降至4℃，然后在32℃片段化5分钟，65℃末端修复和a‑加尾30分钟，4℃保持)。可以将0.6xspriselect试剂添加到样品中并在室温下孵育5分钟。样品可以放在磁体上(例如，在高位)，直到溶液澄清，上清液可以转移到新的管带上。可以将0.8xspriselect试剂添加到样品中，混合并在室温下孵育5分钟。可以将样品置于磁体上(例如，在高位)直到溶液变清。去除上清液，向沉淀物加入80％乙醇，沉淀物孵育30秒，可除去乙醇。可以重复乙醇洗涤并将样品置于磁体上(例如，在低位)直到溶液变清。可以除去剩余的乙醇，向样品中添加洗脱缓冲液，混合，并在室温孵育2分钟。可将样品放在磁体上(例如，在高位)，直到溶液澄清，并将部分样品移到新的管带上。可以制备衔接子连接混合物(adaptorligationmix)，其包括连接缓冲液、dna连接酶和衔接子寡聚物，然后可对其进行离心。衔接子连接混合物可被添加至样品，移液管混合，然后简短离心。然后可以根据预定方案对样品进行热循环(例如，盖温30℃约15分钟，步骤1：20℃保持15分钟，步骤2：4℃保持)。样品可经涡旋以重新悬浮spriselect试剂，可以另将0.8xspriselect试剂添加到样品并在室温孵育5分钟，然后置于磁体上(例如，在高位)直到溶液澄清。可移除上清液，可用80％乙醇洗涤沉淀，孵育30秒，可移除乙醇。乙醇洗涤可以重复进行，样品可以在将样品放在磁体上(例如，在低位)之前短暂离心。可以移除任何剩余的乙醇，并且可以将样品风干至多2分钟。可以移开磁体，可以向样品添加洗脱缓冲液，并且样品可以用移液管混合，在室温孵育2分钟，然后置于磁体上(例如，在低位)直到溶液澄清。部分样品可以转移到一个新的管带上。扩增混合物，可制备并与样品合并。可以将单独的dualindextt组a添加至样品，移液器混合并进行预先确定的热循环方案(例如，盖温105℃持续约25‑40分钟，步骤1：98℃持续45秒，第2步：98℃持续20秒，第3步：54℃持续30秒；第4步：72℃持续20秒，第5步：恢复到第2步进行预定数量的循环，第6步：72℃持续1分钟，4℃保持)。涡旋以重新悬浮spriselect试剂，可以向每个样品中另添加0.6xspriselect试剂，混合并在室温孵育5分钟。样品可以放在磁体上(例如，在高位)，直到溶液澄清，上清液可以转移到新的管带上。可以将0.8xspriselect试剂添加到每个样品中，移液器混合，并在室温孵育5分钟。然后可以将样品置于磁体上(例如，在高位)直到溶液变清。可以移除上清液，用80％乙醇洗涤沉淀，孵育30秒，然后可移除乙醇。可以重复乙醇洗涤，将样品离心，并置于磁体上(例如，在低位)以移除任何剩余的乙醇。可以从磁体移出样品，然后将洗脱缓冲液添加到样品，移液器混合，并在室温孵育2分钟。可将样品放在磁体上(例如，在高位)，直到溶液澄清，并将部分样品移到新的管带上。样品可在4℃储存至多72小时，或在‑20℃长期储存。平均片段大小可以使用bioanalyzer痕迹或安捷伦tapestation确定。[1467]可以使用可用的测序平台对文库进行测序，包括miseq、nextseq500/550、hiseq2500、hiseq3000/4000、novaseq和iseq。[1468]在上述工作流程的替代实施方式中，可以通过将样品暴露于大于约1.0w/v％(例如，大于约2.0w/v％、大于约3.0w/v％、大于约3.0w/v％、大于约大于约4.0w/v％、大于约5.0w/v％、大于约6.0w/v％、大于约7.0w/v％、大于约8.0w/v％、大于约9.0w/v/v％、大于约10.0w/v％、大于约11.0w/v％、大于约12.0w/v％或大于约13.0w/v％)的十二烷基硫酸钠(sds)来对生物样品进行透化。在一些实施方式中，可通过将样品暴露至约1.0w/v％至约14.0w/v％(例如，约2.0w/v％至约14.0w/v％、约2.0w/v％至约12.0w/v％，约2.0w/v％至约10.0w/v％，约4.0w/v％至约14.0w/v％，约4.0w/v％至约12.0w/v％，约4.0w/v％至约10.0w/v％、约6.0w/v％至约14.0w/v％、约6.0w/v％至约12.0w/v％、约6.0w/v％至约10.0w/v％，约8.0w/v％至约14.0w/v％，约8.0w/v％至约12.0w/v％，约8.0w/v％至约10.0w/v％，约10.0％w/v％至约14.0w/v％、约10.0w/v％至约12.0w/v％或约12.0w/v％至约14.0w/v％)的sds和/或蛋白酶k(例如，在约35℃至约50℃、约35℃至约45℃、约35℃至约40℃、约40℃至约50℃、约40℃至约45℃或约45℃至约50℃的温度)(例如，持续约5分钟至约1小时、约5分钟至约40分钟、约5分钟至约30分钟、约5分钟至约20分钟或约5分钟至约10分钟)来使生物样品透化。[1469]在本文所述的任何工作流程的非限制性示例中，产生包括连续核苷酸序列的核酸分子，所述连续核苷酸序列包含：(a)第一引物序列(例如，读数1)；(b)空间条形码；(c)独特分子序列(umi)；(d)捕获域；(e)与来自生物样品的核酸中存在的序列互补的序列；(f)与模板转换寡核苷酸(tso)的序列基本互补的第二引物序列(例如，读数2)。在这些核酸分子的一些实施方式中，核酸分子是单链核酸分子。在这些核酸分子的一些实施方式中，核酸分子是双链核酸分子。在这些核酸分子的一些实施方式中，(a)到(f)以5′到3′方向位于连续核苷酸序列中。在这些核酸分子中的任一个的一些实施方式中，核酸分子连接至基材(例如，载玻片)。在这些核酸分子中的任一个的一些实施方式中，连续核酸序列的5′末端连接至基材(例如载玻片)。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，连续核苷酸序列是嵌合rna和dna序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，连续核苷酸序列是dna序列。[1470]在本文所述的任何工作流程的非限制性示例中，产生包括连续核苷酸序列的核酸分子，所述连续核苷酸序列包含：(a)与第一引物序列互补的序列(例如，与读数1互补的序列)；(b)与空间条形码互补的序列；(c)与独特分子序列互补的序列；(d)与捕获域互补的序列；(e)存在于来自生物样品的核酸中的序列；和(f)模板转换寡核苷酸(tso)的序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，核酸分子是单链的。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，核酸分子是双链的。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，连续核苷酸序列是dna序列。在这些核酸分子的一些实施方式中，(a)到(f)以3′到5′方向位于连续核苷酸序列中。[1471]在本文所述的任何工作流程的非限制性示例中，产生包括连续核苷酸序列的核酸分子，所述连续核苷酸序列包含：(a)第一引物序列(例如，读数1)；(b)空间条形码；(c)独特分子序列(umi)；(d)捕获域；(e)与来自生物样品的核酸中存在的序列互补的序列；和(f)第二引物序列(读数2)。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，核酸分子是单链核酸分子。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，核酸分子是双链核酸分子。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，(a)至(f)以5′至3′方向位于连续核苷酸序列中。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，连续核苷酸序列是dna序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，连续核苷酸序列还包含，从3′至(f)：(g)与第一衔接子序列互补的序列；和(h)与第三引物序列互补的序列。在任何核酸分子的一些实施方式中，第一衔接子序列是i7样品索引序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，第三引物序列是p7引物序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，(h)在连续核苷酸序列中相对于(g)位于3′。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，连续核苷酸序列还包含，5′至(a)：(i)第二衔接子序列；和(ii)第四引物序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，第二衔接子序列是i5样品索引序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，第四引物序列是p5引物序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，(ii)在连续核苷酸序列中相对于(i)位于5′。[1472]在本文所述的任何工作流程的非限制性示例中，产生包括连续核苷酸序列的核酸分子，所述连续核苷酸序列包含：(a)与第一引物序列互补的序列；(b)与空间条形码互补的序列；(c)与独特分子序列互补的序列；(d)与捕获域互补的序列；(e)存在于来自生物样品的核酸中的序列；和(f)与第二引物序列互补的序列。在这些核酸分子的一些实施方式中，与第一引物序列互补的序列是与读数1互补的序列。在这些核酸分子的一些实施方式中，与第二引物序列互补的序列是与读数2互补的序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，核酸分子是单链核酸分子。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，核酸分子是双链核酸分子。在这些核酸分子的一些实施方式中，(a)到(f)以3′到5′方向位于连续核苷酸序列中。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，连续核苷酸序列是dna序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，连续核苷酸序列还包含，5′至(f)：(g)第一衔接子序列；和(h)第三引物序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，第一衔接子序列是i7样品索引序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，第三引物序列是p7引物序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，(h)在连续核苷酸序列中相对于(g)位于5′。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，连续核苷酸序列还包含，3′至(a)：(i)与第二衔接子序列互补的序列；和(ii)与第四引物序列互补的序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，第二衔接子序列是i5样品索引序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，第四引物序列是p5引物序列。在任何这些核酸分子的一些实施方式中，(ii)在连续核苷酸序列中相对于(i)位于3′。[1473]空间rin[1474]本文提供了用于确定组织中的空间rin的方案的非限制性示例，其可以包括收集乳腺癌组织和在液氮中快速冷冻。组织可以嵌入oct中，并在‑20℃以10或12μm的厚度切片，然后直接安装在空间阵列上，其包括具有18srrna捕获域的捕获探针。可以使用苏木精和伊红(h&e)染色方案对组织进行固定和染色。简言之，可以添加mayer苏木精，在水中洗涤，在发蓝缓冲液(bluingbuffer)中孵育，在水中洗涤，用曙红染色，然后在水中洗涤，最后干燥。为了观察h&e染色，切片可以用85％的甘油封固，并用盖玻片覆盖。明场成像可以使用metafer载玻片扫描平台(metasystems)进行，其中原始图像与vslide软件(metasystems)拼接在一起。可以通过以下方式来移除甘油：将空间阵列或载玻片保持置于水中直至盖玻片脱落然后风干直至剩余液体蒸发。可以任选地从组织切片中移除来自h&e染色剂的苏木精，例如，在进一步处理之前用稀hcl(0.01m)洗涤。然后组织切片准备好进行进一步处理。[1475]染色后，存在于组织切片中的18srrna被空间阵列上的18srrna特定捕获域捕获。然后将18srrna原位转化为cdna。具体而言，通过添加70μl反应混合物在密封杂交盒中于空间阵列上进行逆转录，所述反应混合物包括1x第一链缓冲液、5mmdtt、1m甜菜碱、6mmmgcl2、1mmdntp、0.2mg/mlbsa、50ng/μl放线菌素d、10％dmso、20u/μlsuperscriptiii逆转录酶、2u/μlrna酶out重组核糖核酸酶抑制剂。反应在42℃进行过夜。孵育后移除cdna合成混合物，并用0.1xssc缓冲液洗涤组织。[1476]为了制备用于寡核苷酸探针标记和成像的空间阵列，移出乳腺癌组织和rrna。组织移出可以如下进行：首先在rlt裂解缓冲液中用β‑巯基乙醇以3∶100的比例在56℃孵育1小时，并以300rpm的连续振荡。所有组织都可以在56℃使用1∶7比例的蛋白酶k和pkd缓冲液孵育1小时，以短间隔以300rpm轻轻振荡。然后如下以300rpm连续振荡洗涤空间阵列：首先在50℃于含有0.1％sds的2xssc中洗涤10分钟，然后在室温于0.2xssc中洗涤1分钟，最后在室温于0.1xssc中洗涤1分钟。然后将空间阵列旋转干燥并放回杂交盒中。可以使用反应混合物来进行rrna移除，所述反应混合物包含以下终浓度的：1x第一链缓冲液，0.4mg/mlbsa和16.3mu/μlrna酶h。反应可以在37℃进行1小时，并在300rpm下使用短间隔轻轻振荡。然后用0.1xssc缓冲液洗涤空间阵列，并在室温用60％dmso处理5分钟，然后用0.1xssc缓冲液洗涤3次。[1477]为了检测从18srrna产生的cdna，产生了与18scdna序列具有序列互补性的标记的寡核苷酸探针。鉴定寡核苷酸长度在18‑23个核苷酸之间，最佳为20个核苷酸，解链温度(tm)为38‑50℃，最佳温度为42℃，鸟嘌呤和胞嘧啶的含量为30‑60％，最佳值为50％。3′端的前五个碱基被设置为包括鸟嘌呤或胞嘧啶中的两个或各一个。使用mfold(二级结构测定)、oligocalc：寡核苷酸特性计算器(自二聚化和发夹形成测定)和blast(脱靶结合测定)检查寡核苷酸的质量。就与人类(nr_003286.2)和小鼠(nr_003278.3)18srrna的相容性选择序列位置。所选的寡核苷酸探针之四包括：探针1(p1；seqidno：4)gaggaattcccagtaagt，探针2(p2；seqidno：5)gagattgagcaataacag，探针3(p3；seqidno：6)gtagttccgaccataaac，和探针4(p4；seqidno：7)ggtgactctagataacct。对照寡核苷酸探针可经设计以一次包含三个检测探针的互补序列，每个探针之间有20个碱基的间隔序列。然后可以设计所选寡核苷酸探针以纳入cy3荧光团。[1478]接下来，标记的寡核苷酸探针与包含由18srrna产生的cdna或包含控制捕获探针的空间阵列杂交。该步骤可以包括至少4轮连续的杂交和成像，其中对于四个标记的寡核苷酸探针中的每一个进行至少一轮。在每轮杂交和成像之后，在继续下一轮杂交和成像之前，可以洗涤空间阵列以移除杂交的探针。[1479]标记的寡核苷酸探针的杂交包括向空间阵列添加预热(例如加热至50℃)的杂交混合物(10mmtris‑hcl、1mmedta、50mmnacl和0.5μm荧光加标探针)，其中包含至少0.5μm的荧光标记寡核苷酸探针之一(例如p1、p2、p3或p4之一)。然后可以使用具有以下设置的dna微阵列扫描仪对空间阵列进行成像：激发波长532nm设置为增益70，635nm设置为1。成像后，空间阵列用60％dmso在室温孵育5分钟并用0.1xssc缓冲液洗涤3次以移除杂交探针。随后的几轮杂交和成像使用在每一轮中使用的不同标记寡核苷酸探针进行(例如，第2轮使用p2，第3轮使用p3，第4轮使用p4)。进行初始的预杂交轮(p0)成像以评估背景荧光。[1480]每个标记的寡核苷酸探针(p1‑p4)生成一张图像，还有一张没有荧光标记的探针杂交的图像(p0)。荧光单位(fu)数据的归一化是通过减去用p0记录的自发荧光并除以p1来进行的。对齐组织中特定位置的五幅图像(来自每个探针的一幅图像，p1‑p4，以及来自该位置的一幅未标记的图像)后，将图像加载到脚本中并在rstudio中运行。该脚本可以生成两个不同的图，一个空间rin值的热图和一个图像对齐误差图。[1481]高质量的rna被定义为全长(或接近全长)的转录物，而低质量的rna被定义为片段化的转录物。空间rin值与传统rin值相似，其中rin值的范围从1到10，数字越大表示质量越高(例如，降解越少、片段化越少)的rna样品。[1482]空间atac组合物[1483]本文提供了用于鉴定分析物在生物样品中的位置的组合物。在一些实施方式中，核苷酸分子组合物包括a)空间条形码；b)独特分子；c)捕获域；d)功能域；和e)夹板寡核苷酸。在一些实施方式中，部分双链核苷酸分子组合物包括：a)空间条形码；b)独特分子标识符；c)捕获域；d)功能域；和e)夹板寡核苷酸。在一些实施方式中，组合物包括a)捕获探针，其包括i)空间条形码；ii)独特分子标识符；iii)捕获域；iv)功能域；和v)夹板寡核苷酸，和b)片段化的基因组dna，其包括i)包含转座子末端序列和与捕获域互补的序列的第一衔接子序列；和ii)包含转座子末端序列和第二衔接子序列的第二衔接子序列。在一些实施方式中，组合物包括a)与第一衔接子复合的转座酶单体，其包括i)转座子末端序列；和ii)与捕获域互补的序列；和b)与第二衔接子复合的转座酶第二单体，其包括i)转座子末端序列；和ii)第二衔接子序列；c)基因组dna；和d)捕获探针，其包括i)空间条形码；ii)独特分子标识符；iii)捕获域；iv)功能域；和v)夹板寡核苷酸。在一些实施方式中，组合物包括a)与第一衔接子复合的转座酶单体，其包括i)转座子末端序列；ii)与捕获域互补的序列；其中第一衔接子的5′末端被磷酸化，和b)与第二衔接子复合的转座酶第二单体，其包括i)转座子末端序列；ii)第二衔接子序列；其中第二衔接子的5′末端被磷酸化；c)基因组dna；和d)捕获探针，其包括i)空间条形码；ii)独特分子标识符；iii)捕获域；iv)功能域；和v)夹板寡核苷酸。在一些实施方式中，组合物包括a)转座酶二聚体，其包括i)与第一衔接子复合的转座酶单体，其包括1)转座子末端序列，2)与捕获域互补的序列；ii)与第二衔接子复合的转座酶第二单体，其包括1)转座子末端序列；2)第二衔接子序列；b)基因组dna；c)捕获探针，其包括i)空间条形码；ii)独特分子标识符；iii)捕获域；iv)功能域；和v)夹板寡核苷酸。在一些实施方式中，组合物包括a)转座酶二聚体，其包括i)与第一衔接子复合的转座酶单体，其包括1)转座子末端序列，2)与捕获域互补的序列，其中第一衔接子的5′末端被磷酸化；ii)与第二衔接子复合的转座酶第二单体，其包括1)转座子末端序列；2)第二衔接子序列，其中第二衔接子的5′末端被磷酸化；c)基因组dna；d)捕获探针，其包括i)空间条形码；ii)独特分子标识符；iii)捕获域；iv)功能域；和v)夹板寡核苷酸。[1484]空间转录组学[1485]在一些实施方式中，本文提供用于从生物样品(例如，存在于生物样品例如组织切片中)中空间检测分析物(例如，检测分析物如生物分析物的位置)的方法，其包括：(a)在基材上提供生物样品；(b)对基材上的生物样品进行染色，对染色后的生物样品进行成像，和选择生物样品或生物样品的切片进行空间分析；(c)提供阵列，其在基材上包含一组或多组多个捕获探针；(d)使生物样品与阵列接触，由此允许一组或多组多个捕获探针中的捕获探针捕获感兴趣的生物分析物；和(e)分析捕获的生物分析物，由此对感兴趣的生物分析物进行空间分析。可根据本文所述的方法使用本文所述的或本领域已知的任何种类的染色和成像技术。在一些实施方式中，染色包括如本文所述的光学标记物，包括但不限于荧光、放射性、化学发光、量热或比色可检测标记物。在一些实施方式中，染色包括针对生物样品中的目标分析物(例如，细胞表面或细胞内蛋白质)的荧光抗体。在一些实施方式中，染色包括针对生物样品中的目标分析物(例如，细胞表面或细胞内蛋白质)的免疫组织化学染色。在一些实施方式中，染色包括化学染色，例如苏木精和伊红(h&e)或高碘酸希夫(pas)。在一些实施方式中，在对生物样品进行染色和/或成像与进行空间转录组学分析之间可以经过相当长的时间(例如，数天、数月或数年)。在一些实施方式中，在阵列与生物样品接触之前、之时或之后将用于进行空间分析的试剂添加到生物样品中。在一些实施方式中，步骤(d)包括将阵列置于生物样品上。在一些实施方式中，阵列是柔性阵列，其中多个空间条码化特征(例如，捕获探针)附接到柔性基材。在一些实施方式中，在阵列与生物样品接触之前，采取措施以减慢反应(例如，在阵列与生物样品接触之前降低生物样品的温度或使用优先在与其最佳功能温度相比更低或更高温度下进行其主要功能的酶)。在一些实施方式中，在不使生物样品与阵列脱离接触的情况下进行步骤(e)。在一些实施方式中，在生物样品不再与阵列接触之后进行步骤(e)。在一些实施方式中，在生物样品的染色和/或成像之前、之时或之后用分析物捕获剂对生物样品加标。在这种情况下，在染色和/或成像与进行空间分析之间可相隔相当长的时间(例如，数天、数月或数年)。在一些实施方式中，使阵列适于促进生物分析物从染色和/或成像的生物样品迁移到阵列上(例如，使用本文所述的任何材料或方法)。在一些实施方式中，生物样品在与阵列接触之前被透化。在一些实施方式中，在生物样品与阵列接触之前减慢透化速率(例如，以限制分析物从其在生物样品中的原始位置扩散)。在一些实施方式中，调节透化速率(例如调节透化试剂的活性)可以通过调节生物样品所暴露的条件(例如调节温度、ph和/或光)来发生。在一些实施方式中，调节透化速率包括使用外部刺激(例如，小分子、酶和/或活化试剂)来调节透化率。例如，可以在与阵列接触之前向生物样品提供透化试剂，该透化试剂在条件(例如，温度、ph和/或光)改变之前或提供外部刺激(例如，小分子、酶和/或活化剂)之前是无活性的。[1486]侵袭性导管癌的空间解析基因表达和聚类[1487]对来自女性患者(er ，pr‑，her2 )的侵袭性导管癌组织的空间基因表达进行了概况分析(bioivt：asterand‑案件编号66320；样本编号116899f)。作为对照，获得邻近肿瘤的健康组织切片。每种组织类型使用4个重复。[1488]侵袭性导管癌中的空间解析基因表达和聚类揭示肿瘤内异质性显示在图75a‑h。图75a显示了由病理学家注释的侵袭性导管癌的组织切片。该切片包含大部分侵袭性癌(用粗黑线表示的22.344mm2部分(彩色图中黑色勾勒出的部分))，三个独立的导管原位癌区域(用中粗黑线表示的部分1.329mm2，1.242mm2和0.192mm2(在彩色图中以绿色勾勒出轮廓))和纤维组织。图75b显示了具有由转录物的无监督聚类着色的点的组织图。图75c显示了由转录物的无监督聚类着色的点的t‑sne图。图75d显示了9个鉴别的簇之间变化最大的基因的基因表达热图。定义为纤维组织的区域主要对应于簇1、7和8。有趣的是，病理学家注释为侵袭性癌的大区域包含分配至dcis(簇5)的空间点。此外，还鉴定了四种具有不同分子特性的侵袭性癌亚型(簇2、3、4和6)，揭示了肿瘤内的异质性。[1489]组织切片中人表皮生长因子受体2(her2)、雌激素受体(er)、孕激素受体(pgr)对应基因的表达水平见图75e。可以清楚地看到，her2和er在侵袭癌和dcis区域高表达，而pr不表达，与患者的诊断一致。选择来自侵袭癌区域中每个簇的最高差异表达基因之一(图75d中的矩形框)，且其表达水平定位于组织中，如图75f所示，并如图75g所示在一个图中重叠。除了pgr，与邻近的正常组织相比，所有这些基因在癌组织中都高度上调(图75h)。分析表明，所有这些上调基因都与癌症进展有关。有趣的是，在簇3的子集中，一种长非编码rna，其异常表达于最近发现与肿瘤发展有关(参见例如，zhangt等.长非编码rna和乳腺癌(longnon‑codingrnaandbreastcancer).technolcancerrestreat.2019，18，1533033819843889，通过引用其全文方式纳入本文)，是最为差异表达的基因之一。在胶质母细胞瘤中，linc00645通过诱导tgf‑β来促进上皮‑间质转化(参见例如，li，c.等.长非编码rnalinc00645通过调节胶质瘤中的mir‑205‑3p‑zeb1轴来促进tgf‑β诱导的上皮‑间质转化(longnon‑codingrnalinc00645promotestgf‑β‑inducedepithelial‑mesenchymaltransitionbyregulatingmir‑205‑3p‑zeb1axisinglioma).celldeath&dis.2019，10，272，通过引用其全文方式纳入本文)。[1490]在乳腺癌进展过程中，持续围绕浸润前原位癌的肌上皮细胞逐渐消失(参见例如，gudjonsson，t.等.肌上皮细胞：它们在乳腺形态发生和肿瘤中的起源和功能(myoepithelialcells：theiroriginandfunctioninbreastmorphogenesisandneoplasia).j.mammaryglandbiol.neoplasia.2009，10，261，其通过引用其全文的方式纳入本文)。这种现象在图75i和75j中清楚地观察到，其中krt14(肌上皮细胞的基因签名)在正常组织中的导管内衬周围高度表达，而它在idc组织中的dcis区域中消失(图75i))。在idc中，与侵袭和转移相关联的关键基因，胞外基质基因(例如col1a1和fn1)高度上调，而平滑肌和基底角蛋白下调(图75j)。[1491]序列表[1492]合成多肽序列[1493][1494]合成eak16多肽序列[1495][1496]合成kld12多肽序列[1497][1498]18scdna探针1(p1)[1499][1500]18scdna探针2(p2)[1501][1502]18scdna探针3(p3)[1503][1504]18scdna探针4(p4)[1505][1506]vi.用于成像的控制载玻片[1507]上述用于获得生物样品和/或特征阵列的图像的成像设备和系统(例如，标准落射荧光系统和共焦显微系统)在其分辨率和灵敏度方面可以是固有地可变的。评估成像设备和系统的质量和分辨率的方法可以使用本文公开的任何控制载玻片来实现。在本节中，描述了各种方法和控制载玻片的示例。然而，应当理解，一般来说，本文讨论的各种步骤和技术可以使用各种不同的装置和系统组件来进行，并非所有这些都被明确地阐述。[1508]在一些实施方式中，可以使用控制载玻片来执行评估成像设备和系统的质量和分辨率以及优化成像采集过程。控制载玻片可以包括一个或多个基材，所述基材提供了在其上沉积、印刷、蚀刻、压印和/或附着物质(例如，化合物或分子)的表面。基材可由光学透明材料形成，包括但不限于玻璃、透明聚合物和玻璃纤维。玻璃的非限制性示例包括钠钙玻璃、硅酸盐玻璃、硼硅酸盐玻璃和熔融石英。在一些实施方式中，基材具有约1毫米(mm)的厚度。在一些实施方式中，基材具有约0.17毫米(mm)的厚度。在一些实施方式中，基材具有约0.085mm至约2mm的厚度(例如，1.9mm或更小、1.7mm或更小、1.5mm或更小、1.35mm或更小、1mm或更小、0.9mm或更小、0.8mm或更小、0.7mm或更小、0.64mm或更小、0.43mm或更小、0.35mm或更小、0.23mm或更小、0.19mm或更小、0.18mm或更小、0.17mm或更小、0.16mm或更小，0.13mm或更小、0.1mm或更小、0.095mm或更小、0.09mm或更小)。在一些实施方式中，具有小于约1mm的厚度的基材可以使用户能够定性地评估成像系统(超出标准落射荧光和共聚焦显微镜)以包括全内反射荧光(tirf)显微镜和/或成像。tirf显微镜利用激发光的全内反射产生的倏逝波(evanescentwave)从基材表面激发约100nm的荧光团。[1509]透明聚合物的非限制性示例包括紫外线(uv)透光丙烯酸、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、丙烯酸、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、无定形共聚酯、聚氯乙烯(pvc)、环烯烃共聚物、聚乙烯(pe)、离聚物树脂、聚丙烯(pp)、氟化乙烯丙烯(fep)、苯乙烯甲基丙烯酸甲酯(smma)和聚苯乙烯。在一些实施方式中，基材是玻璃显微镜载玻片。[1510]在一些实施方式中，基材是玻璃盖玻片。在一些实施方式中，基材是盖玻片。在一些实施方式中，基材是浇铸丙烯酸基材。在一些实施方式中，基材具有表面覆层。表面覆层或处理的非限制性示例包括硅烷、气体等离子体、聚‑l‑赖氨酸、3‑氨基丙基三乙氧基硅烷和氨基烷基硅烷。在一些实施方式中，基材具有疏水性表面。在一些实施方式中，基材具有亲水性表面。在一些实施方式中，基材是灭菌(例如，伽马灭菌或高压灭菌)的。[1511]在一些实施方式中，基材包括荧光标志物。在一些实施方式中，阵列包括多个荧光标志物。在一些实施方式中，荧光标志物是非金属的。荧光标志物可以是可直接或间接偶联到基材表面的化合物和/或分子。荧光标志物可以以不同的图案(例如，以阵列形式)排列在基材的表面上。在一些实施方式中，荧光标志物被提供在基材的表面上。在一些实施方式中，基材包括布置在基材表面上的阵列。基材上具有已知光学特性的荧光标志物可用于定性评估成像设备或系统的兼容性、分辨率和灵敏度。[1512]在一些实施方式中，多个荧光标志物各自包括荧光团(例如，荧光探针)。荧光标志物可由包括但不限于荧光团(例如荧光染料和荧光蛋白)的材料形成。荧光标志物可以包括来自上述任何组的荧光团。荧光染料的非限制性示例包括吖啶染料、氟酮染料、花青染料、荧光素、噁嗪染料、菲啶染料和罗丹明染料。荧光蛋白的非限制性示例包括绿色荧光蛋白(gfp)、标签蓝色荧光蛋白(tagbfp)、天蓝色、红色荧光蛋白(rfp)、青色荧光蛋白(cfp)、金星、黄水晶、黄色荧光蛋白(yfp)、单体增强型绿色荧光蛋白(egfp)、mcherry、mkate2、光活化绿色荧光蛋白(pa‑gfp)、光活化mcherry(pa‑mcherry)和荧光蛋白融合蛋白。在一些实施方式中，荧光标志物具有约200纳米(nm)至约850nm的激发波长(例如，800nm或更小、750nm或更小、700nm或更小、600nm或更小、650nm或更小、600纳米或更小、550纳米或更小、500纳米或更小、450纳米或更小、400纳米或更小、350纳米或更小、300纳米或更小、250纳米或更小)。在一些实施方式中，荧光标志物具有约10nm至约850nm的发射波长(例如，800nm或更小、750nm或更小、600nm或更小、650nm或更小、600nm或更小、550nm或更小、500nm或更小、450nm或更小、400nm或更小、350nm或更小、300nm或更小、250nm或更小、200nm或更小、150nm或更小、100nm或更小、50nm或更小、15nm或更小)。[1513]在一些实施方式中，基材可包括非荧光标志物(例如，纳米颗粒)。非荧光标志物可由包括但不限于金属、反射、放射性、化学发光和比色探针的材料形成。[1514]在一些实施方式中，基材包括基准标志物。在一些实施方式中，基准标志物是蚀刻的基准标志物、模制的基准标志物或其它物理形成的基准标志物。在一些实施方式中，基准标志物是金属的。在一些实施方式中，基准标志物是非金属的。在一些实施方式中，多个金属基准标志物以在阵列周围形成周界的框架图案布置在基材的表面上。基准标志物可以是布置在成像系统的视场中并且在样品、阵列、基材或本文所述的任何其它方面的图像中捕获的任何一个或多个目标对象。基准标志物通常用作对准的参考点或测量标度(例如，以对准样品和阵列、以对准两个基材、以确定基材上样品或阵列相对于标志物的位置)和/或用于尺寸和/或距离的定量测量。[1515]基准标志物可以由包括但不限于金属、反射、荧光、放射性、化学发光和比色标记物的材料形成。在一些实施方式中，基准标志物不包括荧光材料。在一些实施方式中，基准标志物可存在于基材上以提供生物样品的取向。使用基准标志物来稳定和定向生物样品描述于例如美国专利号7,848,553，和美国专利公开号2003/0153850，其均通过引用其全文方式纳入本文。[1516]图23a‑23b显示了示例样品载玻片2300(例如，控制载玻片)，其具有标记物2302，所述标记物2302包括用于样品识别的条形码2304。具体地，基材2300包括至少一个阵列2306。图23a‑23b显示标记为“a1”、“a2”、“b1”、“b2”、“c1”、“c2”、“d1”和“d2”的阵列2306。[1517]在一些实施方式中，本文所述的基材可与样品载玻片2300一起使用。在一些实施方式中，本文所述的基材可以与上述基于空间阵列的一般分析方法一起使用。例如，用户可以获得本文描述的基材的图像，以便在获得样品载玻片2300的图像之前调整成像设备或成像系统的某些参数。因此，在一些实施方式中，本文所述的基材可具有与样品载玻片2300类似的物理尺寸。在一些实施方式中，样品载玻片2300具有约76mm的长度和约30mm的宽度。在一些实施方式中，样品载玻片2300具有约75mm的长度和约25mm的宽度。在一些实施方式中，样品2300具有范围从约20mm至约200mm的长度l(例如，175mm或更小、150mm或更小、125mm或更小、100mm或更小、75mm或更小、50mm或更小、30mm或更小)。在一些实施方式中，样品2300具有范围从约20mm至约200mm的宽度w(例如，175mm或更小、150mm或更小、125mm或更小、100mm或更小、75mm或更小、50mm或更小、30mm或更小)。[1518]如图23a‑23b所示，样品载玻片2300可以具有约28.5mm的长度a。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约21mm的长度a。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约10mm至约50mm的长度a(例如，45mm或更小，40mm或更小，35mm或更小，30mm或更小，25mm或更小，20mm或更小，15mm或更小)。具有长度a的样品载玻片2300的区段可以容纳标记物2302。样品载玻片2300可以具有约36mm的长度b。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约10mm至约40mm的长度b(例如，35mm或更小、30mm或更小、25mm或更小、20mm或更小、15mm或更小)。具有长度b的样品载玻片2300的区段可以容纳多个阵列2306。样品载玻片2300可以具有约11.5mm的长度c。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约5mm至约40mm的长度c(例如，35mm或更小、30mm或更小、25mm或更小、20mm或更小、15mm或更小、10mm或更小)。具有长度c的样品载玻片2300的区段阵列可以容纳具有与多个阵列2306的表面积基本相同的表面积的其它阵列。在一些实施方式中，具有长度c的样品载玻片2300的区段可以容纳具有大于图23a中所示的多个阵列2306的表面积的表面积的其它阵列。[1519]样品载玻片2300可具有约64.5mm的长度g。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约30mm至约70mm的长度g(例如，65mm或更小、60mm或更小、55mm或更小、50mm或更小、45mm或更小、40mm或更小、35mm或更小、30mm或更小、25mm或更小)。长度g可以是长度a和b的总和，并且可以包括标记物2302和四行阵列2306(例如，a1、a2、b1、b2、c1、c2、d1和d2)。具有长度g的样品载玻片2300的区段可容纳多于四行阵列或少于四行阵列。[1520]样品载玻片2300可以具有约3.5mm的宽度d。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约0.5mm至约20mm的长度c(例如，15mm或更小、10mm或更小、5mm或更小、1mm或更小)。具有宽度d的样品载玻片2300的区段可以定义为从样品载玻片2300的边缘到阵列2306的边缘的距离，如图23a‑23b所示。在一些实施方式中，宽度d可以根据阵列2306的尺寸而变化。同样，样品载玻片2300可以具有约3.5mm的宽度e。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约0.5mm至约20mm的宽度e(例如，15mm或更小、10mm或更小、5mm或更小、1mm或更小)。具有宽度e的样品载玻片2300的区段可以定义为从样品载玻片2300的边缘到阵列2306的边缘的距离。在一些实施方式中，宽度d和e是阵列2306的外边缘的相对侧上的距离。宽度e和d可以是相等的，如在图23a‑23b中说明。在一些实施方式中，距离d不同于距离e。[1521]样品载玻片2300可具有约18mm的宽度f。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约5mm至约30mm的长度f(例如，25mm或更小、20mm或更小、15mm或更小、10mm或更小、2.5mm或更小)。宽度f可以被定义为阵列2306的两列的宽度，如图23a中说明。在一些实施方式中，宽度f可以被定义为第一阵列2306(例如，阵列a1)的外边缘或侧边缘和第二阵列2306(例如，阵列a2)的外边缘之间的距离。在一些实施方式中，宽度何以根据阵列2306的尺寸和阵列2306的列数而变化。[1522]样品载玻片2300可以具有约55.5mm的长度h。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约30mm至约60mm的长度h(例如，55mm或更小、50mm或更小、45mm或更小、40mm或更小、35mm或更小、30mm或更小，25mm或更小)。长度h可以包括标记物2302和三行的阵列2306(例如，a1、a2、b1、b2、c1和c2)。具有长度g的样品载玻片2300的区段可以容纳多于三行的阵列或少于三行的阵列。[1523]样品载玻片2300可以具有约46.5mm的长度i。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约30mm至约50mm的长度i(例如，45mm或更小、40mm或更小、35mm或更小、30mm或更小、25mm或更小)。长度i可以包括标记物2302和两行的阵列2306(例如，a1、a2、b1和b2)。具有长度i的样品载玻片2300的区段可以容纳多于两行的阵列或少于两行的阵列。[1524]样品载玻片2300可以具有约28.5mm的长度j。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约20mm至约30mm的长度j(例如，29mm或更小、28mm或更小、27mm或更小、26mm或更小、25mm或更小、24mm或更小、23mm或更小、22mm或更小、21mm或更小)。长度j可以包括标记物2302和一行的阵列2306(例如，a1和a2)。具有长度j的样品载玻片2300的区段可以容纳多于一行的阵列或少于一行的阵列。[1525]样品载玻片2300可以具有约11.25mm的长度k。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约60mm至约5mm的长度j(例如，55mm或更小、50mm或更小、45mm或更小、40mm或更小、35mm或更小、30mm或更小、25mm或更小、20mm或更小、15mm或更小、10mm或更小)。长度k可以定义为阵列2306的底部边缘(例如，d1或d2)与载玻片2300的底部边缘之间的距离。长度k可以根据阵列2306的尺寸而变化。[1526]样品载玻片2300可具有约6.5mm的长度m。在一些实施方式中，样品载玻片2300可具有约1mm至约76mm的长度m(例如，70mm或更小、65mm或更小、60mm或更小、36mm或更小、30mm或更小、29mm或更小、25mm或更小、20mm或更小、15mm或更小、12mm或更小、10mm或更小、5mm或更小)。[1527]样品载玻片2300可以具有约6.5mm的长度n。在一些实施方式中，样品玻片2300可具约1mm至约76mm的长度n(例如，70mm或更小，65mm或更小，60mm或更小，36个mm或更小，30mm或更小，29mm或更小、25mm或更小、20mm或更小、15mm或更小、12mm或更小、10mm或更小、5mm或更小)。[1528]各阵列2306(例如，a1)可以是四边形，其具有m×n的尺寸，如图23a和23b所示。在一些实施方式中，样品载玻片2300具有8个阵列。在一些实施方式中，样品载玻片2300具有20个阵列或更少、18个阵列或更少、16个阵列或更少、14个阵列或更少、12个阵列或更少、10个阵列或更少、8个阵列或更少、6个阵列或更少、4个阵列或更少、2个阵列或更少，或1个阵列。例如，在一些实施方式中，样品载玻片2300具有尺寸为约65mm×18mm的一个四边形阵列。在一些实施方式中，样品载玻片2300具有尺寸为约36mm×18mm的一个四边形阵列。在一些实施方式中，样品载玻片2300具有尺寸各自为约36mm×6.5mm的两个四边形阵列。在一些实施方式中，样品载玻片2300具有尺寸各自为约18mm×18mm的两个四边形阵列。在一些实施方式中，样品载玻片2300具有尺寸各自为约6.5mm×6.5mm的10个四边形阵列。在一些实施方式中，样品载玻片2300具有尺寸各自为约6.5mm×6.5mm的6个四边形阵列。在一些实施方式中，样品载玻片2300具有尺寸各自为约6.5mm×6.5mm的4个四边形阵列。在一些实施方式中，阵列可具有圆形、多边形、三角形或任何其它合适的几何或非几何形状。[1529]图24a和24b显示了具有包括基材区域2402a‑h的表面2401的基材2400的示例。在一些实施方式中，基材2400可以是控制载玻片(例如，样品载玻片)的部分。在一些实施方式中，基材2400是控制载玻片(例如，样品载玻片)。在一些实施方式中，基材2400可以是校准载玻片的部分。在一些实施方式中，基材2400是校准载玻片。基材2400可以包括第一基材区域2402a、第二基材区域2402b、第三基材区域2402c、第四基材区域2402d、第五基材区域2402e、第六基材区域2402f、第七基材区域2402g和第八基材区域2402h。在一些实施方式中，基材2400可具有少于八个基材区域或多于八个基材区域。每个基材区域可以被包围在框架2406的限定的周界内。[1530]八个基材区域2402a‑h可以位于基材2400的中心。例如，八个基材区域2402a‑h可以在基材2400上居中，从而使得从第一基材区域2402a、第二基材区域2402b、第三基材区域2402c或第四基材区域2402d之一的框架2406的外边缘延伸至基材2400的纵向边缘(即，沿长度l)的第一距离与从框架2406的外边缘延伸到第五基材区域2402e、第六基材区域2402f，第七基材区域2402g，或第八基材区域2402h之一的框架2406的外边缘延伸到基材2400的纵向边缘(即，沿长度l)的第二距离基本相同。例如，当基材如图24a所示垂直定向时，基材阵列可以定位在距离基材的顶部边缘2432约28.5mm、距离基材的底部边缘2434约11.25mm和距离基材的左边缘2436和右边缘2438约3.5mm的位置。[1531]在一些实施方式中，八个基材区域2402a‑h可以在基材2400上居中，从而使得从第一基材区域2402a、第二基材区域2402b、第三基材区域2402c或第四基材区域2402d之一的框架2406的外边缘延伸至基材2400的横向边缘(即，沿宽度w)的第一距离与从框架2406的外边缘延伸到第五基材区域2402e、第六基材区2402f，第七基材区域2402g，或第八基材区域2402h之一的框架2406的外边缘延伸到基材2400的横向边缘(即，沿宽度w)的第二距离基本相同。[1532]在一些实施方式中，基材2400具有与如上所述的样品载玻片2300(例如，控制载玻片)相同的尺寸。在一些实施方式中，基材2400可以是矩形形状。在一些实施方式中，基材2400具有约100mm至约10mm的长度l(例如，90mm或更小、85mm或更小、90mm或更小、75mm或更小、70mm或更小、65mm或更小、60mm或更小、55mm或更小、50mm或更小、45mm或更小、40mm或更小、35mm或更小、30mm或更小、25mm或更小、20mm或更小、15mm或更小)。在一些实施方式中，基材2400具有约100mm至约10mm的宽度w(例如，90mm或更小、85mm或更小、90mm或更小、75mm或更小、70mm或更小、65mm或更小、60mm或更小、55mm或更小、50mm或更小、45mm或更小、40mm或更小、35mm或更小、30mm或更小、25mm或更小、20mm或更小、15mm或更小)。在一些实施方式中，本公开的基材的形状可为正方形或圆形。在一些实施方式中，本公开的基材可为矩形、三角形、六边形、八边形、五边形或任何其它合适的二维几何形状。[1533]在一些实施方式中，基材2400包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个基材阵列。基材2400包括四个基材阵列2404，如图24a所示。基材2400可以包括布置在框架2406内的基材阵列2404。例如，基材阵列2404可以位于基材区域的中心。在一些实施方式中，基材阵列2404可以是相同的(例如，可以具有相同的图案)。在一些实施方式中，基材阵列2404可以是不同的(例如，可以具有不同的图案)。四个基材阵列2404，如图24a所示，可以是重复的并以格子(或方格)图案排列。也即，基材阵列2404位于第一基材区域2402a、第三基材区域2402c、第六基材区域2402f和第八基材区域2402h的中央。如图24a所示的格子图案对应于载玻片2300的阵列a1、b2、c1和d2。在一些实施方式中，该图案旨在占据基材表面的尽可能多的面积以确保在扫描基材的不同区域时图像采集的一致性。[1534]在一些实施方式中，基材区域2402a‑h可以垂直排列成两列，如图24a所示。在一些实施方式中，基材区域以一列的形式布置在基材上。在一些实施方式中，基材区域以3、4、5、6、7、8、9、10或更多列布置在基材上。在一些实施方式中，基材阵列2404可以彼此相邻放置。例如，在一些实施方式中，基材阵列2404可以垂直排列成一列(例如，位于前四个基材区域2402a‑2402d上)。或者，在其它实施方式中，基材阵列2404可位于基材区域2402a、2402b、2402e和2402f上。在一些实施方式中，基材阵列2404可以位于基材区域2402e、2402f、2402g和2402h上。在一些实施方式中，基材阵列2404可以位于基材区域2402c、2402d、2402e和2402h上。在一些实施方式中，基材阵列2404可以位于基材区域2402e、2402b、2402g和2402d上。在一些实施方式中，基材阵列2404不以特定图案布置。在一些实施方式中，基材阵列2404的尺寸个体地变化。例如，在一些实施方式中，第一基材阵列的尺寸可以大于第二基材阵列的尺寸。在一些实施方式中，第一基材阵列的尺寸可以小于第二基材阵列的尺寸。在一些实施方式中，基材阵列之间的距离可以变化并且不同。例如，在一些实施方式中，第一基材阵列和第二基材阵列之间的距离可以不同于第三基材阵列和第四基材阵列之间的距离。在各种实施方式中，基材2400可具有八个基材阵列2404或更少(例如，7个基材阵列或更少、6个基材阵列或更少、5个基材阵列或更少、4个基材阵列或更少、3个基材阵列或更少、2个基材阵列或更少)。在一些实施方式中，基材阵列以一列排列在基材上。在一些实施方式中，基材阵列以2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多列排列在基材上。[1535]图24a显示了包括阵列(例如，基材阵列)2404的基材区域2402f的放大图。在一些实施方式中，基材阵列是荧光阵列。在各种实施方式中，基材阵列是比色阵列。在一些实施方式中，基材阵列是非荧光阵列。在一些实施方式中，基材阵列是金属阵列。在一些实施方式中，基材阵列是反射阵列。在一些实施方式中，基材阵列是放射性阵列。在一些实施方式中，基材阵列是化学发光阵列。[1536]基材阵列2404可以具有设置在基材的表面2401上的多个荧光标志物2426。多个荧光标志物2426可以包括荧光探针或荧光染料。在各种实施方式中，荧光探针或荧光染料可以是四甲基罗丹明(tritc)、红色荧光蛋白(dsred)、吸收波长在约590nm处达到峰值的染料(例如，)、花青‑3(cy3)、吸收波长在约650nm处达到峰值的染料(例如)、花青‑5(cy5)或其任何组合。在一些实施方式中，多个荧光标志物2426可以包括来自上述任何组的任何荧光团。在一些实施方式中，荧光探针可与有机或无机化合物或分子偶联。在一些实施方式中，荧光探针包含寡核苷酸和荧光团。在一些实施方式中，荧光团连接到寡核苷酸的5′末端。在一些实施方式中，荧光团连接到寡核苷酸的3′末端。在一些实施方式中，寡核苷酸的5′末端附着于基材表面。在一些实施方式中，寡核苷酸的3′末端自由地任选地与荧光团偶联。在一些实施方式中，荧光染料与寡核苷酸偶联。在一些实施方式中，寡核苷酸是如上定义的dna寡核苷酸或rna寡核苷酸。在一些实施方式中，荧光探针由15个碱基的寡核苷酸组成，其中荧光分子连接到5′‑末端。在一些实施方式中，非荧光寡核苷酸可偶联至基材阵列2404的表面并可用于杂交任何合适的探针。[1537]基材阵列可以具有多个特征(例如荧光标志物)的特定排列，这些特征要么是不规则的，要么形成规则图案。基材阵列中的各个特征可以基于它们的相对空间位置、荧光探针的类型和荧光探针的浓度而彼此不同。基材阵列2404可以使用多种技术来制造，包括上述阵列制造技术和基于光刻的技术。此类技术包括但不限于“点样”、印刷、冲压和直接合成到基材上。在一些实施方式中，阵列用与荧光探针偶联的寡核苷酸“点样”或“印刷”，然后这些荧光标记的寡核苷酸附接至基材以形成荧光标志物。如上所述，荧光标记的寡核苷酸可以通过非接触印刷或接触印刷施加到基材表面上。除上述特征外，还可以使用多种其他特征来形成本文所述的阵列。例如，在一些实施方式中，由喷射印刷、丝网印刷或静电沉积在基材表面上的荧光共轭聚合物和/或生物聚合物形成的特征可用于形成基材阵列。在一些实施方式中，聚合物和生物聚合物是荧光偶联聚合物和生物聚合物。在一些实施方式中，还可以原位合成多个特征。[1538]在一些实施方式中，基材包括布置在基材表面上的阵列。在一些实施方式中，该阵列包括布置成形成第一图案的多个荧光标志物。在一些实施方式中，每个荧光标志物包括荧光探针。在一些实施方式中，多个基准标志物布置在表面上。在一些实施方式中，多个基准标志物的至少一个子集以第二图案布置。在一些实施方式中，第二图案不同于第一图案。[1539]荧光标志物2426具有圆形点的形状，如图24a‑24b中所示。在一些实施方式中，基材阵列2404的第一区段2428和第二区段2430个体地包含直径约100微米(μm)的荧光标志物2426。在一些实施方式中，荧光探针包含寡核苷酸和荧光团。在一些实施方式中，荧光团连接到寡核苷酸的3′末端。在其它实例中，荧光团连接到寡核苷酸的5′末端。通常，当在平行于基材的平面中观察时，荧光标志物可以具有多种二维形状。在一些实施方式中，荧光标志物2426以六边形、正方形、矩形、三角形、五边形、七边形、八边形、九边形、十边形、椭圆形、正多边形或任何其它规则或不规则的几何形状提供。在一些实施方式中，以非几何形状的形状提供荧光标志物2426。[1540]在一些实施方式中，当基材2400包括多于一个基材阵列时，多个基材阵列可包括具有基本相同形状的荧光标志物。在一些实施方式中，基材阵列2404的一些或全部荧光标志物具有相同或相似的形状。在一些实施方式中，当基材2400包括多于一个基材阵列时，多个基材阵列可包括具有实质上不同形状的荧光标志物。在一些实施方式中，基材阵列的一些荧光标志物具有第一形状，并且一些荧光标志物具有不同于第一形状的第二形状。在一些实施方式中，当基材2400包括多于一个基材阵列，多个基材阵列可以包括具有一种或多种形状图案的荧光标志物。在一些实施方式中，多个基材阵列可包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20个形状图案的荧光标志物。例如，基材阵列可以包括具有第一形状(例如，圆形点)的第一行荧光标志物和具有第二形状(例如，三角形)的第二行荧光标志物，它们在整个基材阵列行中交替。在另一个示例中，基材阵列可以包括重复单元，所述重复单元包括具有第一形状(例如，圆形点)的第一荧光标志物、具有第二形状(例如，三角形)的第二荧光标志物和具有在同一行内以图案交替的第三形状(例如，方形)的第三荧光标志物。在一些实施方式中，基材阵列可包括荧光标志物图案，其具有重复单元，所述重复单元包括不同形状的任何组合。在一些实施方式中，基材阵列的一些或全部荧光标志物可以具有相同的尺寸(例如，相同的直径)。在一些实施方式中，基材阵列的一些或全部荧光标志物可具有不同的尺寸(例如，第一直径不同于第二直径)。[1541]在一些实施方式中，荧光标志物2426具有第一浓度(或第一平均浓度)和第二浓度(或第二平均浓度)。换言之，在各种实施方式中，第一荧光标志物可以具有第一浓度的荧光偶联寡核苷酸，并且在与第一荧光标志物相同的基材阵列内的第二荧光标志物可以具有第二浓度的荧光偶联寡核苷酸。在一些实施方式中，第一浓度不同于第二浓度。在一些实施方式中，第一浓度范围(或第一平均浓度范围)为约0.01微摩尔(μm)至约100μm、约0.05μm至约50μm、约0.1μm至约10μm或约0.5μm至约5μm。在一些实施方式中，第二浓度范围(或第二平均浓度范围)为约0.01微摩尔(μm)至约100μm、约0.05μm至约50μm、约0.1μm至约10μm或约0.5μm至约5μm。在一些实施方式中，第一浓度(或第一平均浓度)大于第二浓度(或第二平均浓度)。在一些实施方式中，第一浓度(或第一平均浓度)小于第二浓度(或第二平均浓度)。[1542]个体荧光标志物2426或点(spot)可以包含荧光标记的寡核苷酸和空白寡核苷酸(即，未在5′‑末端或3′末端与荧光团偶联的寡核苷酸)的混合物。在一些实施方式中，荧光标记的寡核苷酸和空白寡核苷酸的混合物具有约50皮升(pl)的体积。在一些实施方式中，个体荧光标志物2426(其含有荧光标记的寡核苷酸和空白寡核苷酸的混合物)的体积为约10pl至约1000pl(例如，900pl或更少、800pl或更少、700pl或更少、600pl或更少、500pl或更少，400pl或更少、300pl或更少、200pl或更少、100pl或更少、50pl或更少、25pl或更少、15pl)。[1543]图24b图示了显示各荧光标志物2426的各种浓度的一行的区段2428的示例。例如，第一荧光标志物2426a和第十荧光标志物2426j具有相同浓度的荧光标记的寡核苷酸(例如，约50微摩尔(μm))。在一些实施方式中，第一荧光标志物2426a和第十荧光标志物2426j具有最高浓度的荧光标记的寡核苷酸。在一些实施方式中，第一荧光标志物2426a和第十荧光标志物2426j是允许用户容易地识别区段(例如，区段2428)的每一行的开始和结束的最暗点。荧光标记的寡核苷酸的浓度从第二荧光标志物2426b开始且通过第九荧光标志物2426i连续降低(例如，从约20μm到约0.5μm)。即，第二荧光标志物2426b具有约20μm的浓度，第三荧光标志物2426c具有约10μm的浓度，第四荧光标志物2426d具有约5μm的浓度，第五荧光标志物2426e具有具有约3μm的浓度，第六荧光标志物2426f具有约2μm的浓度，第七荧光标志物2426g具有约1μm的浓度，第八荧光标志物2426h具有约0.75μm的浓度，并且第九荧光标志物2426i具有约0.5μm的浓度。[1544]在一些实施方式中，荧光标记的寡核苷酸的浓度范围为约0.01μm至约100μm(例如，90μm或更小、80μm或更小、70μm或更小、60μm或更小、50μm或更小、40μm或更小、30μm或更小、20μm或更小、10μm或更小、1μm或更小、0.1μm或更小、0.05μm或更小)。在一些实施方式中，荧光标记的寡核苷酸的浓度从第二荧光标志物2426b开始且通过第九荧光标志物2426i连续增加(例如，从约0.5μm至约20μm)。[1545]第一区段2428和第二区段2430可以分别在y轴上具有25个荧光标志物并且在x轴上具有10个荧光标志物。水平地穿过x轴，每个荧光标志物可以用浓度降低(例如，约50μm至约0.5μm)的荧光标记的寡核苷酸印刷，其中第十荧光标志物(例如，2426j)用最高浓度(约50μm)再印刷以表示最后一个点。这种荧光标记的寡核苷酸浓度的组合和顺序可以在y轴上的25行荧光标志物中重复。[1546]在一些实施方式中，通过降低荧光标记的寡核苷酸的浓度，同时与空白寡核苷酸的浓度成比例地增加以维持均匀的总浓度，来产生递减的荧光浓度。在一些实施方式中，保持含有荧光标记的寡核苷酸和空白寡核苷酸的混合物的等体积以确保个体荧光标志物(即，点)的均匀分布和形状。[1547]类似地，在各种实施方式中，第一荧光标志物可以包括第一荧光探针，并且在与第一荧光标志物相同的基材阵列内的第二荧光标志物可以包括第二荧光探针。例如，图24a显示了具有荧光标志物的第一区段2428和第二区段2430的基材阵列2404。在该示例中，第一区段2428中的多个荧光标志物用第一荧光探针(例如，与花青‑3偶联的寡核苷酸)标记。另一方面，第二区段2430中的多个荧光标志物用第二荧光探针(例如，与花青‑5偶联的寡核苷酸)标记。因此，用户可以使用基材2400同时优化两个荧光团的图像采集。在一些实施方式中，用户可以使用基材2400同时优化3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100或更多个荧光团的图像采集。[1548]仍然参考图24a，双通道基材阵列2400可位于框架2406的中心。在一些实施方式中，基材阵列2400可以定位在距框架2406的顶侧2418的距离b′处以及在距框架2406的底侧2422的距离d′处。在一些实施方式中，基材阵列2400可以定位在距框架2406的左侧2416的距离a′处和距框架2406的右侧2420的距离c′处。在一些实施方式中，距离b′约为1300μm。在一些实施方式中，距离b′可以在约100至约2000μm的范围内(例如，约1900μm或更小、1800μm或更小、1700μm或更小、1600μm或更小、1500μm或更小、1400μm或更小、1300μm或更小、1200μm或更小、1100μm或更小、1000μm或更小、900μm或更小、800μm或更小、700μm或更小、600μm或更小、500μm或更小、400μm或更小，300μm或更小、200μm或更小、150μm或更小)。在一些实施方式中，距离d′约为1300μm。在一些实施方式中，距离d′可以在约100至约2000μm的范围内(例如，约1900μm或更小、1800μm或更小、1700μm或更小、1600μm或更小、1500μm或更小、1400μm或更小、1300μm或更小、1200μm或更小、1100μm或更小、1000μm或更小、900μm或更小、800μm或更小、700μm或更小、600μm或更小、500μm或更小、400μm或更小，300μm或更小、200μm或更小、150μm或更小)。[1549]在一些实施方式中，距离a′约为1400μm。在一些实施方式中，距离a′可以在约100至约2000μm的范围内(例如，约1900μm或更小、1800μm或更小、1700μm或更小、1600μm或更小、1500μm或更小、1400μm或更小、1300μm或更小、1200μm或更小、1100μm或更小、1000μm或更小、900μm或更小、800μm或更小、700μm或更小、600μm或更小、500μm或更小、400μm或更小，300μm或更小、200μm或更小、150μm或更小)。在一些实施方式中，距离c′为约1400μm。在一些实施方式中，距离c′可以在约100至约2000μm的范围内(例如，约1900μm或更小、1800μm或更小、1700μm或更小、1600μm或更小、1500μm或更小、1400μm或更小、1300μm或更小、1200μm或更小、1100μm或更小、1000μm或更小、900μm或更小、800μm或更小、700μm或更小、600μm或更小、500μm或更小、400μm或更小，300μm或更小、200μm或更小、150μm或更小)。[1550]在一些实施方式中，基材包括阵列，所述阵列包括设置在基材表面上的荧光标志物。在一些实施方式中，多个荧光标志物各自包括荧光探针。在一些实施方式中，多个基准标志物以框架图案布置在表面上，形成围绕阵列的周界。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为至少约50微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为至少约100微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为至少约500微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为至少约1,000微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为至少约1,500微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为至少约2,000微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为约50至约3,000微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为约500至约2,000微米。在一些实施方式中，荧光标志物和基准标志物之间的最小间距为约1,000至约1,500微米。[1551]在一些实施方式中，基材阵列对于肉眼是不可见的。即，基材阵列可以通过成像设备或系统对人眼可见。成像设备或系统可以提供激发波长，该激发波长进而激发荧光探针并引起荧光发射。荧光发射的强度(即，荧光强度)可由用户定性地评估或可由成像设备或系统检测和测量。一般而言，荧光强度与荧光团浓度之间存在线性关系。在一些实施方式中，荧光强度和荧光团浓度之间存在对数关系[1552]在一些实施方式中，多个荧光标志物包括在第一激发波长下具有第一荧光强度的第一部分和在第二激发波长下具有第二荧光强度的第二部分。在各种实施方式中，多个荧光标志物包括在第一激发波长具有第一荧光发射的第一部分和在第二激发波长具有第二荧光发射的第二部分。[1553]在一些实施方式中，第一激发波长不同于第二激发波长。在一些实施方式中，第一激发波长为约488纳米(nm)至约768nm(例如，约488nm至约525nm、约531nm至约577nm或约568nm至约668nm)。在一些实施方式中，第一激发波长为约554nm。在一些实施方式中，第一激发波长为约618nm。在一些实施方式中，第一激发波长为约488nm。在一些实施方式中，第一激发波长为约550纳米(nm)至约600nm。[1554]在一些实施方式中，第二激发波长为约488纳米(nm)至约768nm(例如，约488nm至约525nm、约531nm至约577nm或约568nm至约668nm)。在一些实施方式中，第二激发波长为约554nm。在一些实施方式中，第二激发波长为约618nm。在一些实施方式中，第二激发波长为约488nm。在一些实施方式中，第二激发波长为约600纳米(nm)至约750nm。[1555]仍参考图24a，以框架2406的形式布置在基材2400的表面2401上的基准标志物2424勾勒出各基材区域2402a‑2402h的外周，从而使得各基材区域由多个基准标志物2424限定。框架2406提供允许将生物样品合适地放置在基材区域之一上或允许在图像采集过程期间正确放置基材的视觉指引。在一些实施方式中，基准标志物不包括荧光材料。[1556]通常，基材2400可以是本文所述的任何基材，并且基准标志物2424可以布置在基材2400的任何表面上。此外，生物样品通常可以是本文所述的任何不同类型的生物样品，包括(但不限于)组织切片。[1557]可以使用多种技术制造基准标志物2424。此类技术包括但不限于光刻、喷射印刷、丝网印刷、喷砂、蚀刻、气相沉积、光掩模和各种其它沉积工艺。[1558]如图29a所示，在一些实施方式中，基材2500可以任选地包括提供识别信息例如但不限于样品名称和/或样品编号的标记物2502。标记物2502可以以下方式实现：条形码标记物、激光划线标识符、电子识别标签和其它类型的标记物和/或它们的组合。[1559]图24a显示了第六基材区域2402f的放大图。第六基材区域2402f包括以多种图案布置的多个基准标志物2424以形成框架2406。在一些实施方式中，多个基准标志物以框架图案排列，形成围绕基材区域的周界。在一些实施方式中，多个基准标志物以框架图案排列，在包括多个荧光标志物的阵列周围形成周界。在一些实施方式中，框架图案为矩形或正方形。在一些实施方式中，框架2406可以提供用于将生物样品放置在合适位置的视觉指示器，从而使得生物样品将被定位在由框架2406限定的周界内的基材区域2402f上。在其它实施方式中，用户可以使用框架2406来调整和/或设置他们的成像系统的扫描和采集区域。成像系统包括但不限于独立显微镜(例如nikon、zeiss、olympus或leica)和载玻片扫描仪(例如hamamatsu、leica、zeiss或innopsys)。在一些实施方式中，左列上的四个基材区域(例如，基材区域2402a‑d)和/或两列上的八个基材区域(例如，基材区域2402a‑h)可以对应于载玻片(例如，用于基于空间阵列的分析中的显微镜载玻片)中的捕获区域的间隔和定位。[1560]框架2406可以包括左侧2416、顶侧2418、右侧2420和底侧2422。框架2406的各侧具有不同的基准标志物图案。例如，顶侧2418包括以形成二维斜格结构的三个交错行布置的基准标志物。在各种实施方式中，每一行可以以堆叠或交错布置相对于相邻行定位。[1561]在一些实施方式中，一行基准标志物2424可以包括间隔开设定距离的相邻基准标志物。在一些实施方式中，基准标志物到标记的距离是两个相邻基准标志物的几何中心之间的距离。在一些实施方式中，基准标志物2424的部分或全部与一个或多个相邻标志物等距。在一些实施方式中，至少一个或多个基准标志物2424可位于距一个或多个相邻标志物不同距离处。[1562]在一些实施方式中，行的一些或全部基准标志物2424可以以线性几何图案排列。在一些实施方式中，一行的一些或全部基准标志物2424可以以非线性几何图案布置，例如，交替交错设置，其中一个基准标志物在两个正交坐标方向(即，x和y方向)上从连续的基准标志物移位，如左侧2416所示。[1563]在一些实施方式中，顶侧2418具有以插入图案布置的三行基准标志物2424。类似地，右侧2420，底侧2422，和左侧2416包括布置在与顶侧2418的图案不同的几何图案的基准标志物。在一些实施方式中，第一基材区域2402a、第二基材区域2402b、第三基材区域2402c、第四基材区域2402d、第五基材区域2402e、第六基材区域2402f、第七基材区域2402g和第八基材区域2402h(图24a中所示)各自具有由基准标志物形成的不同框架(注意，框架的不同特征未在图24a中显示)，其使各阵列能够根据其相应基准标志物框的图案几何形状而被区分。[1564]在一些实施方式中，单个框的每一侧包含基准标志物的独特图案，该图案使特定侧与框中的其他侧自动区分，以便于确定阵列方向。可以由人类用户手动地识别各个侧或将其彼此区分开来，或者可替换地，通过捕获框的图像并使用执行基于软件的指令的电子处理器分析图像中的基准标识以将基准标识的特定图案与特定侧相关联，可以自动地识别单独侧或将其彼此区分开。在一些实施方式中，基准标志物2424的图案包括多个重复的图案区段，使基于软件的图案识别更容易，甚至在一些基准标志物被生物样品遮挡时也是如此。[1565]形成框的基准标志物的图案可以进一步包括框的角部中的图示符，如图24a所示。第一图示符2408显示为矩形形状并且可以定位在顶侧2418和左侧2416之间的角中。此外，第二图示符2410显示为具有空的六边形形状并且可以定位在顶侧2418和右侧2420之间的角中。类似地，第三图示符2412显示为具有填充的六边形形状并且可以定位在底侧2422和右侧2420之间的角中。第四图示符2414显示为三角形并且可以定位在左侧2416和底侧2422之间的角中。虽然图24a中说明的图示符具有用于说明目的的特定图案，但是应当理解，通常，对应于基准标志物的任何特定图案或形状的图示符可以定位在基材上的任何位置。图中所示的示例绝不意在暗示限制。[1566]一般来说，“图示符”是形成几何形状的基准标志物的独特图案。此类形状的示例包括但不限于圆形、沙漏形、六边形、正方形、矩形、三角形、五边形、七边形、八边形、九边形、十边形、椭圆形、规则多边形和/或任何其它非几何、规则或不规则形状。图示符也可以对应于上述任何形状的组合。图示符可以进一步对应于“空”或“填充”形状。[1567]在一些实施方式中，可以在图像(例如，亮场显微镜图像)中观察图示符，并由人类用户在手动分析过程中识别。在一些实施方式中，形成图示符和框架的基准标志物可以包括着色剂或标记物(包括上述任何标记物)，其允许定义图示符或框架的基准标志物的图案在有或没有放大倍数(例如，在光学显微镜中)辅助的情况下对肉眼可见。在某些实施方式中，基准标志物可以包括一种或多种荧光物质，从而使得图示符和框架可以被入射光激发并且可以观察和成像来自基准标志物的荧光发射。[1568]在一些实施方式中，一个或多个基准标志物2424可以印刷或沉积在基材的表面上。例如，在一些实施方式中，可以使用接触或非接触印刷来印刷一个或多个基准标志物2424。在另一示例中，一个或多个基准标志物2424可以光刻制造。在一些实施方式中，制造的基材具有暴露在表面上的羧基，并且基准标志物包括反应性化学基团(例如，胺基团或或任何其它合适的附接化学物)，其与基材表面上的所需官能团形成共价键。合适的表面改性化学的非限制性示例包括电化学改性、醛改性、基于物理吸附的改性、环氧改性、羧酸酯改性、重氮化改性、用超分子(例如杯芳烃)进行的表面改性、碳纳米管改性、胺改性、基于硫醇的改性、酰肼改性、静电改性、基于亲和的改性、生物素化、炔烃的改性、腺苷酸化和叠氮化物改性。[1569]在一些示例中，一个或多个基准标志物2424包括金属纳米颗粒。在一些实施方式中，金属基准标志物包括金。在一些实施方式中，金属基准标志物包括纳米颗粒。合适的金属纳米颗粒包括但不限于金纳米颗粒。在一些实施方式中，金属纳米颗粒具有约10纳米(nm)的平均直径。在一些实施方式中，金属纳米颗粒具有50nm的平均直径。在一些实施方式中，金属纳米颗粒具有15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm或45nm的平均直径。在一些实施方式中，金属纳米颗粒具有约1nm至约20nm，或约5nm至约15nm的平均直径。在一些实施方式中，金属纳米颗粒具有5nm至1微米的平均直径(例如，10nm至50nm、10nm至100nm、50nm至100nm、100nm至200nm、200nm至300nm、300至400nm、400至500nm、500至600nm、600至700nm、700至800nm、800至900nm、900nm1000nm、10nm至1微米、20nm至1微米、20nm至800nm、20nm至600nm、20nm至400nm、30nm至100nm)。在一些实施方式中，金纳米颗粒具有约1015个纳米颗粒/毫升的浓度。在一些实施方式中，金纳米颗粒的浓度为约101纳米颗粒/毫升至约1030纳米颗粒/毫升(例如，1025纳米颗粒/毫升或更少、1020纳米颗粒/毫升或更少、1015纳米颗粒/毫升或更少、1010纳米颗粒/毫升、105纳米颗粒/毫升)。[1570]在一些实施方式中，用涂层材料涂覆金属纳米颗粒。合适的覆层材料包括例如各种聚合物材料。在一些实施方式中，金属纳米颗粒可连接至聚合物配体。例如，金纳米颗粒可以连接到长度约为50nm的聚合物配体上。[1571]与金属纳米颗粒相连的聚合物配体，以及金属纳米颗粒本身，可以以各种方式官能化。在一些实施方式中，金属纳米颗粒连接至在末端具有胺基团的聚合物配体。在一些实施方式中，金属纳米颗粒可以用在其末端具有羧酸基团的化合物官能化，该羧酸基团能共价附接至与涂覆的金纳米颗粒相关联的胺基团。此外，在一些实施方式中，金属纳米颗粒是荧光的。[1572]在一些实施方式中，基准标志物由例如铬的金属材料形成，并且可以通过使用化学沉积来施加。例如，可以将离散标志物的图案或包含金属(例如铬)的薄膜/层电镀到基材上，从而为基材上的各个阵列建立可见框架。在一些实施方式中，基准标志物被激光蚀刻到基材的表面上。在某些实施方式中，基准标志物由tubewritertm360墨水、永久性标记墨水、钢笔墨水、喷墨打印机墨水或其组合形成。在一些实施方式中，基准标志物由有色和/或荧光微球或微珠形成。[1573]在一些实施方式中，基准标志物由胺官能化氧化铁纳米颗粒形成。在一些实施方式中，基准标志物由胺官能化的铥掺杂上转换纳米磷光体形成。在一些实施方式中，基准标志物由胺官能化的量子点形成，例如但不限于基于镉的量子点。在一些实施方式中，基准标志物包括比色标记物，例如荧光寡核苷酸(例如，具有荧光部分的寡核苷酸)。[1574]一般来说，当在平行于基材的平面上观察时，基准标志物可以具有各种二维形状。例如，在一些实施方式中，基准标志物2424具有圆形点的形状，如图24a所示。在一些实施方式中，基准标志物2424以六边形、正方形、矩形、三角形、五边形、七边形、八边形、九边形、十边形、椭圆形、正多边形或任何其它规则或不规则的几何形状提供。在一些实施方式中，框架的一些或全部基准标志物具有相同的形状。在一些实施方式中，框架的一些基准标志物具有第一形状，并且一些基准标志物具有不同于第一形状的第二形状。[1575]在一些实施方式中，基准标志物可以围绕阵列的全部或部分。在一些实施方式中，基准标志物可以完全包围阵列。或者，在一些实施方式中，基准标志物可以不完全包围阵列(例如，可以仅包围阵列的部分)。在一些实施方式中，基准标志物识别阵列的角或其它特定部分，例如阵列的中心。[1576]在一些实施方式中，形成框架的基准标志物的平均最大横截面尺寸为50微米至500微米(例如，50微米至400微米、50微米至300微米、100微米至500微米、100微米至300微米)。[1577]在一些实施方式中，基准标志物的排列方式使得一个基准标志物的中心距阵列周围最近的下一个基准标志物的中心在100微米和200微米之间(例如，在110微米和190微米之间，在120微米和170微米之间，在120微米和150微米之间)。在一些实施方式中，基准标志物以如下方式排列，即一个基准标志物的中心距阵列周围最近的下一个基准标志物的中心的距离为100纳米(nm)至200nm(例如，110nm至190nm、120nm至170nm、120nm至150nm)。在一些实施方式中，基准标志物以如下方式排列，即一个基准标志物的中心距阵列周围最近的下一个基准标志物的中心的距离为1厘米(cm)至5cm。[1578]在一些实施方式中，具有周围基准标志物的阵列在基材上的最大尺寸为30mm或更小(例如，25mm或更小、20mm或更小、15mm或更小、10mm或更小、9mm或更小、8mm或更小、6mm或更小、5mm或更小、4mm或更小、3mm或更小)。在一些实施方式中，阵列是边长为约8mm的正方形或矩形阵列。[1579]在一些实施方式中，基准标志物可存在于基材上以提供生物样品的取向。在一些实施方式中，微球可耦合至基材以帮助生物样品的定向。在一些示例中，耦合至基材的微球可产生光信号(例如，荧光)。在另一实例中，微球可以特定图案或设计(例如六角形图案)附接于阵列的部分(例如角部)，以帮助生物样品在基材上的特征阵列上的取向。[1580]在一些实施方式中，基准标志物可为固定化分子，可检测信号分子可与之相互作用以产生信号。例如，标志物核酸可连接或耦合到当接受特定波长(或波长范围)的光时能够发出荧光的化学部分。这种标志物核酸分子可以在组织样品染色之前、同时或之后与阵列接触，以使组织切片可视化或成像。尽管不是必需的，但是使用可使用用于检测标记的cdna的相同条件(例如成像条件)来检测的标志物可能是有利的。[1581]在一些实施方式中，包括基准标志物以促进组织样品或其图像相对于固定在基材上的捕获探针的定向。可以使用任何数量的用于对阵列进行标识的方法，使得仅当对组织切片成像时才可检测到基准标志物。例如，分子，例如产生信号的荧光分子，可以直接或间接地固定在基材的表面上。[1582]在一些实施方式中，基准标志物可以随机地位于基材表面上。例如，含有荧光团的寡核苷酸可在基材上的随机位置随机印刷、压印、合成或附接到基材(例如载玻片)上。组织切片可与基材接触，使得含有荧光团的寡核苷酸接触或接近来自组织切片的细胞或细胞的组分(例如，mrna或dna分子)。可以获得基材和组织切片的图像，并且可以确定荧光团在组织切片图像中的位置(例如，通过回顾覆盖有荧光团检测的组织切片的光学图像)。[1583]在一些实施方式中，基准标志物可以施加到在基材上的已知选择位置。例如，可以在基材上压印、附着或合成基准标志物。获得包括基准标志物的基材的图像，并且基准标志物在基材上的位置可以通过观察所述图像来定性地确定，和/或通过测量基准标志物在所述图像中的位置来定量地确定。[1584]如上所述，单个基材(例如，载玻片)可包括多个成框阵列，其中至少一个框具有使特定阵列与基材上的其他阵列区分的独特图案。特别地，与其它框架相比，至少一个框架的基准标志物的图案可以包含轻微的变化。在一些实施方式中，基准标志物图案中的特定基序可在框与框之间变化，以便区分同一载玻片内的个体阵列。在一些实施方式中，与第一框架的顶侧(例如，顶侧2418)中的第一基序对应的区域可以通过改变附加框架(例如，第二框架)的相应区域中的基准标志物的数量而变化。通过这样做，附加框架的相应区域中的图案包括独特的、可区分的基准标志物图案，其可用于区分每个框架。[1585]在一些实施方式中，可以改变框和/或图示符的任何一个或多个侧面内的一个或多个其他区域，以在每个阵列内生成基准标志物的独特图案。例如，位于框架的左侧或右侧的第一侧向基序，第二侧向基序，第三侧向基序和第四侧向基序(例如，2416、2420)可包括基准标志物的独特图案，作为各框架顶部基序的基准标志物的独特图案的附加或替代。基准标志物图案化的这种变化可以允许用户和/或分析软件确定四个阵列中的哪一个正在被扫描和/或评估。在一些实施方式中，终端用户和/或分析软件还可以确定阵列是否在方向上“移动”(例如，围绕与基材平面正交或平行的轴旋转)，从而允许在样品分析进行之前校正阵列旋转。[1586]在一些实施方式中，基材包括阵列，所述阵列包括设置在基材表面上的多个荧光标志物，多个荧光标志物包括荧光标志物的第一子集，其各自具有第一荧光探针，和荧光标志物的第二子集，其各自具有第二荧光探针。在一些实施方式中，第一探针不同于第二荧光探针。在一些实施方式中，基材包括阵列，所述阵列包括布置在基材表面上的多个非金属荧光标志物。在一些实施方式中，多个荧光标志物各自包括荧光染料。在一些实施方式中，多个基准标志物以框架图案布置在表面上，形成围绕阵列的周界。[1587]图25a‑e显示基材2400的显微图像。图25a显示了用成像系统采集的基材2400的明场图像。如图25a所示，框架2406通过透射白光的样品照明而可由眼睛观察到；因此，允许用户在不需要荧光显微术的情况下识别基材区域2402a‑h。在一些实施方式中，多个金属基准标志物的形状和尺寸被设计成使得框架图案(即，框架2406)对于肉眼可见。肉眼可以检测到具有至少0.1mm尺寸的物体。因此，在一些实施方式中，基材阵列包括各自具有约0.1mm或更大的尺寸(例如，约0.2mm、约0.3mm、约0.4mm、约0.5mm、约0.6mm、约0.7mm、约0.8mm、约0.9mm或1.0mm)的离散标志物。在一些实施方式中，基材阵列包括离散标志物，各标志物具有约0.1mm至约1.0mm、约0.2mm至约0.8mm或约0.04mm至约0.6mm的尺寸。在一些实施方式中，离散标志物的平均尺寸为约0.1mm或更大(例如，约0.2mm、约0.3mm、约0.4mm、约0.5mm、约0.6mm、约0.7mm、约0.8mm、约0.9mm，或1.0mm)。在一些实施方式中，离散标志物的平均尺寸为约0.1mm至约1.0mm、约0.2mm至约0.8mm或约0.04mm至约0.6mm。[1588]与多个基准标志物相反，在图25a中的明场显微镜下可能看不到基材阵列(例如，荧光阵列)。类似地，在一些实施方式中，基材阵列(例如，荧光阵列)对于肉眼可能不可见。肉眼可能无法检测到最大尺寸小于0.1mm的物体。因此，在一些实施方式中，基材阵列包括离散的标志物，其各自的最大尺寸小于0.1mm。在一些实施方式中，基材阵列包括离散标志物，其各自的最大尺寸小于0.075mm、小于0.05mm或小于0.001mm。在一些实施方式中，基材阵列包括离散标志物，其各自具有约0.001mm至约0.1mm、约0.005mm至约0.05mm或约0.01mm至约0.075mm的最大尺寸。[1589]图25b‑e显示了包括第一区段2428和第二区段2430的基材阵列2404的荧光显微图像。第一区段2428包括具有与第一荧光探针(例如，花青‑3或tritc)偶联的寡核苷酸的多个荧光标志物。第二区段2430包括多个具有与第二荧光探针(例如，花青‑5)偶联的寡核苷酸的荧光标志物。在这个例子中，基材阵列2404的第一区段2428用对应于花青‑3或tritc的激发波长的第一激发波长(例如，通过具有554±23nm的激发带通区域的荧光滤光器)照射。结果，多个荧光标志物发射出通过609±54nm发射荧光滤光器可见的荧光发射，如图25b所示。[1590]此外，基材阵列2404的第二区段2430用对应于花青‑5的激发波长的第二激发波长(例如，通过具有618±50nm激发带通区域的荧光滤光器)照射。因此，多个荧光标志物发射通过698±70nm发射荧光滤光器可见的荧光发射，如图25c所示。图25d显示了图25b‑25c的荧光显微镜合并图像。图25e显示了图25d所示的荧光显微图像的放大视图。[1591]如图25b‑e所示，在荧光显微镜下不容易看到多个基准标志物。然而，在一些实施方式中，用户可能能够通过检测多个基准标志物的低亮度反射来在荧光显微镜下识别框架。在一些实施方式中，多个荧光标志物在第一和/或第二激发波长下发荧光，而多个基准标志物在第一和/或第二激发波长下不发可检测得到的荧光。在一些实施方式中，多个基准标志物在第一和/或第二激发波长下不发可检测得到的荧光。在一些实施方式中，多个金属基准标志物在第一激发波长下不发可检测得到的荧光。在一些实施方式中，多个金属基准标志物在第二激发波长下不发可检测得到的荧光。[1592]如本文所用，术语“发可检测得到的荧光”是指可由标准光学显微镜或配备有滤光器立方体(例如，荧光滤光器立方体)的载玻片扫描仪检测到的荧光强度水平。因此，在一些实施方式中，多个金属基准标志物在第一和/或第二激发波长下不发可检测得到的荧光意味着多个金属基准标志物不发射可由标准光学显微镜或装有滤光器立方体(例如荧光滤光器立方体)的载玻片扫描仪检测得到的荧光强度水平。[1593]滤光器立方体可包括激发器滤光器立方体、屏障滤光器、二色分束器或它们的任何组合。滤光器立方体可以是带通滤光器立方体或长通滤光器立方体。可以使用一个或多个滤光器立方体，在这种情况下，滤光器立方体可以是带通滤光器立方体和长通滤光器立方体的组合、所有带通滤光器立方体或所有长通滤光器立方体。在一些实施方式中，滤光器立方体是dapi(4′，6‑二脒基‑2‑苯基吲哚)滤光器立方体、绿色荧光蛋白(gfp)滤光器立方体、异硫氰酸荧光素(fitc)滤光器立方体、四甲基罗丹明(tritc)过滤器立方体、德克萨斯红过滤器立方体、青色荧光蛋白(cfp)过滤器立方体、黄色荧光蛋白(yfp)过滤器立方体、cy3过滤器立方体、cy5过滤器立方体、mcherry过滤器立方体或其任何组合。[1594]在一些实施方式中，滤光器立方体具有激发滤光器，其允许约347nm至约680nm范围内的波长通过(例如，源自照明器的波长，在通向样品的途中通过激发滤光器)。在一些实施方式中，滤光器立方体具有允许约347nm至约403nm范围内的波长通过的激发滤光器(例如，375/28激发滤光器)。在一些实施方式中，滤光器立方体具有允许约430nm至约510nm范围内的波长通过的激发滤光器(例如，470/40激发滤光器)。在一些实施方式中，滤光器立方体具有允许约450nm至约510nm范围内的波长通过的激发滤光器(例如，480/30激发滤光器)。在一些实施方式中，滤光器立方体具有允许约515nm至约565nm范围内的波长通过的激发滤光器(例如，540/25激发滤光器)。在一些实施方式中，滤光器立方体具有允许约520nm至约600nm范围内的波长通过的激发滤光器(例如，560/40激发滤光器)。[1595]在一些实施方式中，滤光器立方体具有阻挡约400nm至约775nm范围的波长通过的屏障滤光器。在一些实施方式中，滤光器立方体具有允许约400nm至约520nm范围的波长通过的屏障滤光器(例如，460/60激发滤光器)。在一些实施方式中，滤光器立方体具有允许约485nm至约585nm范围的波长通过的屏障滤光器(例如，535/50激发滤光器)。在一些实施方式中，滤光器立方体具有允许约550nm至约660nm范围的波长通过的屏障滤光器(例如，605/55激发滤光器)。在一些实施方式中，滤光器立方体具有允许约515nm至约565nm范围的波长通过的屏障滤光器(例如，540/25激发滤光器)。在一些实施方式中，滤光器立方体具有允许约570nm至约690nm范围的波长通过的屏障滤光器(例如，630/60激发滤光器)。[1596]在一些实施方式中，为了增加稳定性，可以安装(例如，干式安装或湿式安装)基材并且可以将盖玻片施加到基材的表面上以覆盖框架、基材区域和基材阵列。在一些实施方式中，用盖玻片固定和覆盖使能够导致荧光团氧化和漂白的环境和大气接触最小化。[1597]参考图26a‑26b，基材2600在构造、设计和功能上类似于上述基材2400。例如，基材2600的设计可以通过基材2400顺时针旋转90度来获得。因此，基材2600包括第一基材区域2602a、第二基材区域2602b、第三基材区域2602c、第四基材区域2602d、第五基材区域2602e、第六基材区域2602f、第七基材区域2602g，以及第八基材区域2602h。每个基材区域可以被包围在框架2606的限定的周界内。八个基材区域2602a‑h可以位于基材2600的中心。虽然图24a和26a具有用于说明目的的特定图案，但是应理解，通常，对应于基准标志物和/或荧光标志物的任何特定图案或形状的基材可以定位在基材上的任何位置。图中所示的示例绝不意在暗示限制。[1598]在一些实施方式中，基材阵列2604可以定位在距框架2606的顶侧2618的距离b”处以及在距框架2606的底侧2622的距离d”处。在一些实施方式中，基材阵列2600可以定位在距框架2606的左侧2616的距离a”处和距框架2606的右侧2620的距离c”处。在一些实施方式中，距离b”约为1600μm。在一些实施方式中，距离b”可以在约100至约2000μm的范围内(例如，约1900μm或更小、1800μm或更小、1700μm或更小、1600μm或更小、1500μm或更小、1400μm或更小、1300μm或更小、1200μm或更小、1100μm或更小、1000μm或更小、900μm或更小、800μm或更小、700μm或更小、600μm或更小、500μm或更小、400μm或更小，300μm或更小、200μm或更小、150μm或更小)。在一些实施方式中，距离d”约为1600μm。在一些实施方式中，距离d”可以在约100至约2000μm的范围内(例如，约1900μm或更小、1800μm或更小、1700μm或更小、1600μm或更小、1500μm或更小、1400μm或更小、1300μm或更小、1200μm或更小、1100μm或更小、1000μm或更小、900μm或更小、800μm或更小、700μm或更小、600μm或更小、500μm或更小、400μm或更小，300μm或更小、200μm或更小、150μm或更小)。[1599]在一些实施方式中，距离a”约为1100μm。在一些实施方式中，距离a”可以在约100至约2000μm的范围内(例如，约1900μm或更小、1800μm或更小、1700μm或更小、1600μm或更小、1500μm或更小、1400μm或更小、1300μm或更小、1200μm或更小、1100μm或更小、1000μm或更小、900μm或更小、800μm或更小、700μm或更小、600μm或更小、500μm或更小、400μm或更小，300μm或更小、200μm或更小、150μm或更小)。在一些实施方式中，距离c”为约1600μm。在一些实施方式中，距离c”可以在约100至约2000μm的范围内(例如，约1900μm或更小、1800μm或更小、1700μm或更小、1600μm或更小、1500μm或更小、1400μm或更小、1300μm或更小、1200μm或更小、1100μm或更小、1000μm或更小、900μm或更小、800μm或更小、700μm或更小、600μm或更小、500μm或更小、400μm或更小，300μm或更小、200μm或更小、150μm或更小)。[1600]图26b图示了显示各荧光标志物2626的各种浓度的一列的区段2628的示例。例如，第一荧光标志物2626a和第九荧光标志物2426i具有相同浓度的荧光标记的寡核苷酸(例如，约100微摩尔(μm))。在一些实施方式中，第一荧光标志物2626a和第九荧光标志物2626i是允许用户容易地识别区段(例如，区段2630)的每一列的开始和结束的最暗点。荧光标记的寡核苷酸的浓度从第二荧光标志物2626b开始且通过第八荧光标志物2426h连续降低(例如，从约50μm到约0.01μm)。也即，第二荧光标志物2626b具有约50μm的浓度，第三荧光标志物2626c具有约20μm的浓度，第四荧光标志物2626d具有约10μm的浓度，第五荧光标志物2626e具有约5μm的浓度，第六荧光标志物2626f具有约1μm的浓度，第七荧光标志物2626g具有约0.1μm的浓度，和，第八荧光标志物2626h具有约0.01μm的浓度。[1601]在一些实施方式中，荧光标记的寡核苷酸的浓度范围为约0.001μm至约200μm(例如，190μm或更低，180μm或更低，170μm或更低，160μm或更低，150μm或更低，140μm或更低，130μm或更低，120μm或更低，110μm，100μm或更低，90μm或更低，80μm或更低，70μm或更低，60μm或更低，50μm或更低，40μm或更低，30μm或更低，20μm或更低，10μm或更低，1μm或更低，0.1μm或更低，0.05μm或更低，0.005μm或更低)。在一些实施方式中，荧光标记的寡核苷酸的浓度从第二荧光标志物2626b开始且通过第八荧光标志物2426h连续增加(例如，从约0.01μm至约50μm)。[1602]在一些实施方式中，多个非金属荧光标志物的第一子集各自具有第一浓度并且多个非金属荧光标志物的第二子集各自具有第二浓度。在一些实施方式中，多个非金属荧光标志物的第一子集具有第一平均浓度并且多个非金属荧光标志物的第二子集具有第二平均浓度。在一些实施方式中，第一浓度(或第一平均浓度)不同于第二浓度(或第二平均浓度)。第一区段2428和第二区段2430个体地可以在x轴上具有25个荧光标志物，在y轴上具有9个荧光标志物。垂直于y轴，每个荧光标志物可以递减浓度(例如，约100μm至约0.01μm)的荧光标记的寡核苷酸打印，其中第九个荧光标志物(例如，2426i)以最高浓度(约100μm)重印，以表示最后一个点。这种荧光标记的寡核苷酸浓度的组合和顺序可以在x轴上的25列荧光标志物中重复。[1603]图26c显示了包括第一区段2628和第二区段2630的基材阵列2604的荧光显微镜合并图像。第一区段2628包括具有与第一荧光探针(例如，花青‑3或tritc)偶联的寡核苷酸的多个荧光标志物。第二区段2630包括多个具有与第二荧光探针(例如，花青‑5)偶联的寡核苷酸的荧光标志物。在这个例子中，基材阵列2604的第一区段2628用对应于花青‑3或tritc的激发波长的第一激发波长(例如，通过具有554±23nm的激发带通区域的荧光滤光器)照射。结果，多个荧光标志物发射通过609±54nm发射荧光滤光器可见的荧光发射。在一些实施方式中，多个非金属荧光标志物包括在第一激发波长具有第一荧光强度峰值的第一子集和在第二激发波长具有第二荧光强度峰值的第二子集。在一些实施方式中，第一激发波长不同于第二激发波长。[1604]此外，基材阵列2604的第二区段2630用对应于花青‑5的激发波长的第二激发波长(例如，通过具有618±50nm激发带通区域的荧光滤光器)照射。结果，多个荧光标志物发射通过698±70nm发射荧光滤光器可见的荧光发射。[1605]图27a显示了在明场显微镜下观察的包括尺寸校准阵列2702和动态范围阵列2704的基材2700。尺寸校准阵列2702可以解决成像系统的空间分辨率，其包括但不限于检测器(例如，照相机)、显微镜物镜和采集软件(例如，用于图像输出)。在一些实施方式中，预期低分辨率图像不能分辨较小尺寸点的边界。尺寸校准阵列2702可以包括不同尺寸的六个点2706。例如，2706a可具有约100μm的直径，2706b可具有约200μm的直径，2706c可具有约300μm的直径，2706d可具有约400μm的直径，2706e可以具有约500μm的直径，2706f可具有约600μm的直径。水平地，各个点2706可以以约1000μm的几何中心到中心水平距离2710隔开。垂直地，各个点2706可以以约1800μm的几何中心到中心垂直距离2712间隔开，以用于附加间隔校准。在一些实施方式中，点2706a‑f可以利用微阵列印刷头印刷。[1606]在一些实施方式中，尺寸校准阵列2702包括至少一个点至约100个点(例如，90个点或更少、80个点或更少、70个点或更少、60个点或更少、50个点或更少、40个点或更少、30个或更少、20个或更少、10个或更少、5个或更少)。在一些实施方式中，尺寸校准阵列2702包括直径范围为约10μm至约1500μm的点(例如，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小，1400μm或更小)。在一些实施方式中，一个或多个点可具有相同或不同的尺寸。[1607]在一些实施方式中，点可具有非圆形点的形状。此类形状的示例包括但不限于圆形、沙漏形、六边形、正方形、矩形、三角形、五边形、七边形、八边形、九边形、十边形、椭圆形、规则多边形和/或任何其它非几何、规则或不规则形状。点也可以对应于上述任何形状的组合。在一些实施方式中，点可以具有不同的形状(例如，第一点具有第一形状，其不同于第二点的第二形状)。[1608]在一些示例中，一个或多个点2706包括金属纳米颗粒。合适的金属纳米颗粒包括但不限于金纳米颗粒。在一些实施方式中，用涂层材料涂覆金属纳米颗粒。合适的覆层材料包括例如多种聚合物材料。在一些实施方式中，金属纳米粒子可连接至聚合物配体。例如，金纳米颗粒可以连接到长度约为50nm的聚合物配体上。在一些实施方式中，点2706包括直径为约10nm的多个金纳米颗粒。[1609]与金属纳米颗粒相连的聚合物配体，以及金属纳米颗粒本身，可以以各种方式官能化。与金属纳米颗粒相连的聚合物配体以及金属纳米颗粒本身可以通过多种方式进行功能化。在一些实施方式中，金属纳米颗粒可以用在其末端具有羧酸基团的化合物官能化，该羧酸基团能共价连接至与涂覆的金纳米颗粒相关联的胺基团。此外，在一些实施方式中，金属纳米颗粒是荧光的。[1610]在一些实施方式中，点2706由例如铬的金属材料形成，并且可以通过使用化学沉积来施加。例如，可以将离散标志物的图案或包含金属(例如铬)的薄膜/层电镀到基材上，从而为基材上的各个阵列建立可见框架。在一些实施方式中，基准标志物被激光蚀刻到基材的表面上。在某些实施方式中，基准标志物由tubewritertm360墨水、永久性标记墨水、钢笔墨水、喷墨打印机墨水或其组合形成。在一些实施方式中，基准标志物由有色和/或荧光微球或微珠形成。[1611]在一些实施方式中，点2706在荧光显微镜下是不可见的。在一些实施方式中，点2706是人肉眼可见的。[1612]仍然参考图27a，基材2700包括动态范围阵列2704，其可以相对于尺寸校准阵列2702以交替图案布置。动态范围阵列2704可以评估成像系统的动态范围。例如，动态范围阵列2704可以评估检测器(例如，照相机)、显微镜物镜、显微镜滤光器和/或采集软件(用于图像输出)的动态范围。在一些实施方式中，动态范围阵列2704是比色动态范围阵列。动态范围阵列2704可以包括多个比色标志物2708。类似于以荧光标志物为特征的基材阵列，比色动态范围阵列可包含浓度递减的染料、颜料、微球和/或纳米颗粒(例如金属或聚合物纳米颗粒)，以评估明场成像的动态范围。可以使用染料和颜料的组合来复制已知的组织化学染色。例如，粉红色和蓝色染料和/或颜料的组合可用于评估苏木精和曙红成像的理想成像条件。在一些实施方式中，比色标志物2708包括金纳米颗粒。在一些实施方式中，比色标志物2708包括与荧光探针偶联的金纳米颗粒。在一些实施方式中，比色标志物2708包括具有约10nm直径的金纳米颗粒。在一些实施方式中，比色标志物2708包括第一荧光探针和第二荧光探针。在一些实施方式中，第一荧光探针不同于第二荧光探针。[1613]在一些实施方式中，尺寸校准阵列2702和动态范围阵列2704可以包括形成框架图案的多个基准标志物，类似于上述基材阵列的框架。[1614]图27b‑d显示基材2700的显微图像。图27b显示了在约488nm的激发下观察到的动态范围阵列2704的荧光显微图像，所述动态范围阵列2704包括含第一荧光探针(例如，异硫氰酸荧光素(fitc))的第一组荧光标志物2708a。图27c显示了在约594nm的激发下观察到的动态范围阵列2704的荧光显微图像，所述动态范围阵列2704包括含第二荧光探针(例如，花青‑3或tritc)的第二组荧光标志物2708b。图27d显示了在约647nm的激发下观察到的动态范围阵列2704的荧光显微图像，所述动态范围阵列2704包括含第三荧光探针(例如，花青‑5)的第三组荧光标志物2708c。[1615]图28a‑d显示了基材2800的又一个示例的图像。如图28a所示，基材2800包括两个动态范围阵列2804，其进一步包括多个动态荧光标志物2810。各个动态范围阵列2804可以被包围在框架2808的限定的周界内。框架2808可以包括多个基准标志物，类似于上文讨论的基材阵列的框架。基材2800还包括样品区域2806。各个样品区域2806被配置为在框架2808的限定周长内接收生物样品2802。在一些实施方式中，组织(小鼠脑、小鼠肾、小鼠肝脏、组织培养物、人体活检物等)可以放置在样品区域2806上、经染色(例如，组织化学染色、免疫组织化学染色或荧光染色)，并用盖玻片封固。在一些实施方式中，基材不包括样品区域2806。即，在一些实施方式中，将生物样品放置在基材上是可任选的。在一些实施方式中，将生物样品放置在样品区域2806上有助于成像装置的校准(例如，在明场显微镜的校准中)。在一些实施方式中，样品区域2806提供具有由框架2808限定的周界的区域，用户可以任选地使用该区域来练习将生物样品2802(例如，组织切片)定位在框架2808内。在一些实施方式中，用户不在样品区域2806内放置任何样品。[1616]图28b‑d显示基材2800的显微图像。图28b显示了在约594nm的激发下观察到的动态范围阵列2804的荧光显微图像，所述动态范围阵列2804包括含第一荧光探针(例如，花青‑3或tritc)的第一组荧光标志物2810a。图28c显示了在约488nm的激发下观察到的动态范围阵列2804的荧光显微图像，所述动态范围阵列2804包括含第二荧光探针(例如，异硫氰酸荧光素(fitc))的第二组荧光标志物2810b。图28d显示了在约647nm的激发下观察到的动态范围阵列2804的荧光显微图像，所述动态范围阵列2804包括含第三荧光探针(例如，花青‑5)的第三组荧光标志物2810c。[1617]图29a‑29d示出具有包括四个阵列的表面2901的示例基材2900。具体地说，基材2900包括第一阵列2904a、第二阵列2904b、第三阵列2904c和第四阵列2904d，其中每个阵列被配置成在阵列的限定周界内接收生物样品2928。即，第一阵列2904a、第二阵列2904b、第三阵列2904c和第四阵列2904d是如上所述的特征阵列。[1618]以框架2934的形式布置在基材2900的表面2901上的基准标志物2932勾勒出各个阵列2904a‑2904d的外周界，从而使得各个阵列由多个基准标志物2932定义，如图29b‑d所示。框架2934提供允许将生物样品2928正确放置在阵列之一上(或允许将样品正确放置在多个阵列上)的视觉指引。[1619]通常，基材2900可以是本文所述的任何基材，并且基准标志物2932可以布置在基材2900的任何表面上。此外，生物样品2928通常可以是本文所述的任何不同类型的生物样品，包括(但不限于)组织切片。[1620]可以使用多种技术制造基准标志物2932。此类技术包括但不限于光刻、喷射印刷、丝网印刷、喷砂、蚀刻、气相沉积、光掩模和各种其它沉积工艺。[1621]在一些实施方式中，基材2900可任选地包括提供例如但不限于样品名称和/或样品编号的识别信息的标志物2902。标志物2902可以以下方式实现：条形码标志物、激光划线标识符、电子识别标签和其它类型的标志物和/或其组合。[1622]图29b示出了第一阵列2504a的放大视图。第一阵列2504a包括以多种图案布置以形成框架2534的多个基准标志物2532。框2534提供了一个视觉指示器，用于将生物样品2528放置在适当的位置，使得样品将位于框2534定义的周界内的阵列2504a上。[1623]图29c‑d显示框2534或其部分的放大视图(为了说明目的，排除了阵列2504a的其余部分)。框架2934包括第一侧2520、第二侧2522、第三侧2524和第四侧2526。框架2534的各侧具有不同的基准标志物图案。例如，第一侧2520包括布置成形成二维斜格结构的三个交错行2506(在图29d中的虚线部分中描绘)的基准标志物。在各种实施方式中，每一排可以以堆叠或交错布置相对于相邻排定位。[1624]在一些实施方式中，基准标志物2532的行2506可以包括间隔距离e的邻近标志物，如图29d所示。在一些实施方式中，标志物到标志物的距离是两个邻近标志物的几何中心之间的距离。在一些实施方式中，行2506的标志物2532的部分或全部与一个或多个邻近标志物等距。在一些实施方式中，至少一个或多个标志物2532可以定位在与一个或多个邻近标志物不同的距离处。[1625]在一些实施方式中，行的一些或全部基准标志物2532可以以线性几何图案排列。在一些实施方式中，一行的一些或全部基准标志物2532可以以非线性几何图案布置，例如，交替交错设置，其中一个基准标志物在两个正交坐标方向(即，x和y方向)上从连续的基准标志物移位，如第四侧2526所示。[1626]仍参考图29c‑d，第一侧2520具有以插入模式排列的三排基准标志物2532。类似地，第二侧2522，第三侧2524，和第四侧2526包括布置成与第一侧2520的图案不同的几何图案的基准标志物。在一些实施方式中，第一阵列2504a、第二阵列2504b、第三阵列2504c和第四阵列2504d(如图29a所示)各自具有由基准标志物形成的不同框架(注意，图29a中未显示第二、第三和第四阵列的框架的不同特征)，这使得各个阵列能够基于其对应的基准标志物框架的图案几何形状而被区分。[1627]在一些实施方式中，单个框的每一侧包含基准标志物的独特图案，该图案使特定侧与框中的其他侧自动区分，以便于确定阵列方向。可以由人类用户手动地识别各个侧或将其彼此区分开来，或者可替换地，通过捕获框的图像并使用执行基于软件的指令的电子处理器分析图像中的基准标识以将基准标识的特定图案与特定侧相关联，可以自动地识别单独侧或将其彼此区分开。在一些实施方式中，基准标志物2932的图案包括多个重复的图案区段，使基于软件的图案识别更容易，甚至一些基准标志物被生物样品遮挡时也是如此。[1628]形成框的基准标志物的图案可以进一步包括框的角部中的图示符，如图29b‑c所示。第一图示符2512显示为矩形形状并且可以定位在第一侧2520和第四侧2526之间的角中。此外，第二图示符2514显示为具有填充的六边形形状并且可以定位在第一侧2520和第二侧2522之间的角中。类似地，第三图示符2516显示为三角形形状，并且可以位于第四侧2526和第三侧2524之间的角中。第四图示符2518显示为具有空的六边形形状并且可以位于第二侧2522和第三侧2524之间的角中。虽然图29b‑c中说明的图示符具有用于说明目的的特定图案，但是应当理解，通常，对应于基准标志物的任何特定图案或形状的图示符可以定位在基材上的任何位置。图中所示的示例绝不意在暗示限制。[1629]一般来说，“图示符”是形成几何形状的基准标志物的独特图案。此类形状的示例包括但不限于圆形、沙漏形、六边形、正方形、矩形、三角形、五边形、七边形、八边形、九边形、十边形、椭圆形、规则多边形和/或任何其它规则或不规则形状。图示符也可以对应于上述任何形状的组合。图示符可以进一步对应于“空”或“填充”形状。[1630]在一些实施方式中，可以在图像(例如，亮场显微镜图像)中观察图示符，并由人类用户在手动分析过程中识别。在一些实施方式中，形成图示符和框架的基准标志物可以包括着色剂或标签(包括上述任何标签)，其允许定义图示符或框架的基准标志物的图案在有或没有放大倍数(例如，在光学显微镜中)辅助的情况下对肉眼可见。在某些实施方式中，基准标志物可以包括一种或多种荧光物质，从而使得图示符和框架可以被入射光激发并且可以观察和成像来自基准标志物的荧光发射。[1631]在一些实施方式中，一个或多个基准标志物2532可以印刷或沉积在基材的表面上。例如，在一些实施方式中，可以使用接触或非接触印刷来印刷一个或多个基准标志物2532。在另一示例中，一个或多个基准标志物2532可以光刻制造。在一些实施方式中，制造的基材具有暴露在表面上的羧基，并且基准标志物包括反应性化学基团(例如，胺基团)，其与基材表面上的所需官能团形成共价键。[1632]在一些示例中，一个或多个基准标志物2532包括金属纳米颗粒。合适的金属纳米颗粒包括但不限于金纳米颗粒。在一些实施方式中，金属纳米颗粒的平均直径为5nm至1微米(例如，10nm至1微米，20nm至1微米，20nm至800nm，20nm至600nm，20nm至400nm，30nm至100nm)。[1633]在一些实施方式中，用涂层材料涂覆金属纳米颗粒。合适的覆层材料包括例如多种聚合物材料。在一些实施方式中，金属纳米颗粒可连接至聚合物配体。例如，在图29c中，金纳米颗粒2530联接至具有约50nm长度的聚合物配体。[1634]与金属纳米颗粒相连的聚合物配体，以及金属纳米颗粒本身，可以以各种方式官能化。与金属纳米颗粒相连的聚合物配体以及金属纳米颗粒本身可以通过多种方式进行功能化。在一些实施方式中，金属纳米颗粒(例如，金纳米颗粒2530)可以用在其末端具有羧酸基团的化合物官能化，该羧酸基团能共价附接至与涂覆的金纳米颗粒2530相关联的胺基团。此外，在一些实施方式中，金属纳米颗粒是荧光的。[1635]在一些实施方式中，基准标志物由诸如铬的金属材料形成，并且可以通过使用化学沉积来施加。例如，可以将离散标志物的图案或包含金属(例如铬)的薄膜/层电镀到基材上，从而为基材上的各个阵列建立可见框架。在一些实施方式中，基准标志物被激光蚀刻到基材的表面上。在某些实施方式中，基准标志物由tubewritertm360墨水、永久性标记墨水、钢笔墨水、喷墨打印机墨水或其组合形成。在一些实施方式中，基准标志物由有色和/或荧光微球或微珠形成。[1636]在一些实施方式中，基准标志物由胺官能化氧化铁纳米颗粒形成。在一些实施方式中，基准标志物由胺官能化的铥掺杂上转换纳米磷光体形成。在一些实施方式中，基准标志物由胺官能化的量子点形成，例如但不限于基于镉的量子点。在一些实施方式中，基准标志物包括比色标记物，例如荧光寡核苷酸(例如，具有荧光部分的寡核苷酸)。[1637]一般来说，当在平行于基材的平面上观察时，基准标志物可以具有各种二维形状。例如，在一些实施方式中，基准标志物2532具有圆形点的形状，如图29a‑d所示。在一些实施方式中，基准标志物2532以六边形、正方形、矩形、三角形、五边形、七边形、八边形、九边形、十边形、椭圆形、正多边形或任何其它规则或不规则的几何形状提供。在一些实施方式中，框架的一些或全部基准标志物具有相同的形状。在一些实施方式中，框架的一些基准标志物具有第一形状，并且一些基准标志物具有不同于第一形状的第二形状。[1638]在一些实施方式中，基准标志物可以围绕阵列的全部或部分。在一些实施方式中，基准标志物可以完全包围阵列。或者，在一些实施方式中，基准标志物可以不完全包围阵列(例如，可以仅包围阵列的部分)。在一些实施方式中，基准标志物识别阵列的角或其它特定部分，例如阵列的中心。[1639]在一些实施方式中，形成框架的基准标志物的平均最大横截面尺寸为50微米至500微米(例如，50微米至400微米、50微米至300微米、100微米至500微米、100微米至300微米)。[1640]在一些实施方式中，基准标志物的排列方式使得一个基准标志物的中心距阵列周围最近的下一个基准标志物的中心在100微米和200微米之间(例如，在110微米和190微米之间，在120微米和170微米之间，在120微米和150微米之间)。[1641]在一些实施方式中，具有周围基准标志物的阵列在基材上具有10mm或更小(例如，8mm或更小、6mm或更小、5mm或更小、4mm或更小、3mm或更小)的最大尺寸。在一些实施方式中，阵列是边长为约8mm的正方形或矩形阵列。[1642]在一些实施方式中，基准标志物可存在于基材上以提供生物样品的取向。在一些实施方式中，微球可耦合至基材以帮助生物样品的定向。在一些示例中，耦合至基材的微球可产生光信号(例如，荧光)。在另一实例中，微球可以特定图案或设计(例如六角形图案)附接于阵列的部分(例如角部)，以帮助生物样品在基材上的特征阵列上的取向。[1643]在一些实施方式中，基准标志物可为固定化分子，可检测信号分子可与之相互作用以产生信号。例如，标志物核酸可连接或耦合到当接受特定波长(或波长范围)的光时能够发出荧光的化学部分。这种标志物核酸分子可以在组织样品染色之前、同时或之后与阵列接触，以使组织切片可视化或成像。尽管不是必需的，但是使用可使用用于检测标记的cdna的相同条件(例如成像条件)来检测的标志物可能是有利的。[1644]在一些实施方式中，包括基准标志物以促进组织样品和基材(例如，玻璃载玻片)或其图像相对于固定在基材上的捕获探针的定向和定位。可以使用任何数量的用于对阵列进行标识的方法，使得仅当对组织切片成像时才可检测到基准标志物。例如，分子，例如产生信号的荧光分子，可以直接或间接地固定在基材的表面上。[1645]在一些实施方式中，基准标志物可以随机地位于基材表面上。例如，含有荧光团的寡核苷酸可在基材上的随机位置随机印刷、压印、合成或附接到基材(例如载玻片)上。组织切片可与基材接触，使得含有荧光团的寡核苷酸接触或接近来自组织切片的细胞或细胞的组分(例如，mrna或dna分子)。可以获得基材和组织切片的图像，并且可以确定荧光团在组织切片图像中的位置(例如，通过回顾覆盖有荧光团检测的组织切片的光学图像)。[1646]在一些实施方式中，基准标志物可以施加到在基材上的已知选择位置。例如，可以在基材上压印、附着或合成基准标志物。获得包括基准标志物的基材的图像，并且基准标志物在基材上的位置可以通过观察所述图像来定性地确定，和/或通过测量基准标志物在所述图像中的位置来定量地确定。[1647]如上所述，单个基材(例如，载玻片)可包括多个成框阵列，其中至少一个框具有使特定阵列与基材上的其他阵列区分的独特图案。特别地，与其它框架相比，至少一个框架的基准标志物的图案可以包含轻微的变化。例如，图30示出由第一框3010包围的第一阵列3002、由第二框3012包围的第二阵列3004、由第三框3016包围的第三阵列3006和由第四框3014包围的第四阵列3008。在一些实施方式中，基准标志物图案中的特定基序可在框与框之间变化，以便区分同一载玻片内的个体阵列。如图30所示，对应于框3010中的第一顶部基序3018a的区域可通过改变基准标志物在框3012、3014和3016的对应区域的数量而不同。通过这样的方式，第二顶部基序3018b、第三顶部基序3018c和第四顶部基序3018d包括可用于区分各个阵列的独特的、可区分的基准标志物图案。[1648]在一些实施方式中，可以改变框和/或图示符的任何一个或多个侧面内的一个或多个其他区域，以在每个阵列内生成基准标志物的独特图案。例如，第一侧基序3020a、第二侧基序3020b、第三侧基序3020c和第四侧基序3020d可以包括除了每个框的顶部基序的基准标志物的独特图案之外的或作为每个框的顶部基序的基准标志物的独特图案的替代品的基准标志物的独特图案。基准标志物图案化的这种变化可以允许用户和/或分析软件确定四个阵列中的哪一个正在被扫描和/或评估。在一些实施方式中，终端用户和/或分析软件还可以确定阵列是否在方向上“移动”(例如，围绕与基材平面正交或平行的轴旋转)，从而允许校正样品分析进行之前的阵列旋转。[1649]vii.使用控制载玻片和基材的方法[1650]在一些实施方式中，本文所述的控制载玻片和基材可用于调整成像设备或系统的设置的方法中。在一些实施方式中，本文所述的基材可用于校准成像设备或系统的方法中。在一些实施方式中，本文所述的基材可用于评估显微镜的成像分析兼容性的方法。即，在一些实施方式中，基材阵列可以被设计成建立基线荧光条件，用户可以参考该基线荧光条件来进行本文所述的生物样品的基于空间阵列的分析的cdna足迹观察。在一些实施方式中，成像设备或系统是独立显微镜(例如nikon、zeiss、olympus或leica)或载玻片扫描仪(例如hamamatsu、leica、zeiss或innopsys)。[1651]在第一步骤中，该方法可以包括将基材加载到成像设备的台架上。在下一步骤中，所述方法可包括识别包括多个基准标志物的框架，所述基准标志物布置在基材的表面上。例如，用户(例如人类用户)可启动白光向基材上的传输，并且在亮光显微镜下检测框架。在下一步骤中，所述方法可包括使基材经历激发波长。例如，该方法可以包括照射基材或使基材暴露于第一波长的辐射。在一些实施方式中，激发波长为约488纳米(nm)至约768nm(例如，约488nm至约525nm、约531nm至约577nm或约568nm至约668nm)。在一些实施方式中，激发波长为约554nm。在一些实施方式中，激发波长为约618nm。在一些实施方式中，激发波长为约488nm。[1652]接着，所述方法可包括检测由设置在由框架限定的周界内的表面上的阵列发射的发射波长。例如，该方法可以包括测量由基材阵列发射的光。在一些实施方式中，阵列包括多个荧光标志物。在一些实施方式中，阵列包括具有第一浓度和第二浓度的荧光探针。在一些实施方式中，第一和第二浓度不同。接下来，所述方法可以包括在目标对象的视觉表示上验证多个荧光标志物的存在或不存在，其中所述目标对象的视觉表示包括至少两个正交空间维度中的相对维度信息。在一些实施方式中，目标对象是基材阵列。如本文所用，术语“图像”可定义为由光学装置(例如透镜或镜子)或电子装置产生的目标对象的光学对应物。接下来，所述方法可以包括基于图像的定性分析来调节显微镜的参数。[1653]在一些实施方式中，用户可以查看基材(例如，基材2400)的图像并调节成像设备或系统的参数(例如，过滤器、曝光时间、激发光强度和/或增益)，从而使得十个“点”(例如，荧光标志物2426a‑2426i)中的十个在限定的通道处可见。在一些实施方式中，如果全部十个点都可见，则用户具有基线以参考并相应地调节，以观察cdna足迹。或者，在其它实施方式中，如果用户无法识别十个点(例如，荧光标志物2426a‑2426j)中的十个，那么这表明用户的成像系统可能难以观察cdna足迹。[1654]viii.采用用于成像的基材和控制载玻片的系统[1655]在一些实施方式中，本文所述的控制载玻片和基材可用于调节或优化成像设备或成像系统的设置的系统中。在一些实施方式中，本文所述的控制载玻片和基材可用于校准成像设备或成像系统的系统中。例如，校准系统可以是自动化系统，其检测本文所述的基材的图像并基于可测量的因素(例如，荧光发射强度)自动调节参数。[1656]在一些实施方式中，所述系统包括阵列，所述阵列还包括设置在基材表面上的多个荧光标志物。在一些实施方式中，多个荧光标志物包括在第一激发波长具有第一荧光发射的第一部分和在第二激发波长具有第二荧光发射的第二部分。在一些实施方式中，第一荧光发射不同于第二荧光发射。在一些实施方式中，多个基准标志物以框架图案布置在表面上，形成围绕阵列的周界。在一些实施方式中，所述系统包括计算装置，所述计算装置包括操作性地联接到显微镜的处理器。在一些实施方式中，计算装置包括具有计算机程序的非暂时性计算机可读存储介质，所述计算机程序包括可由处理器执行的指令。在一些实施方式中，指令使处理器：生成包括至少两个正交空间维度中的相对维度信息的目标对象的视觉表示。在一些实施方式中，指令使处理器基于对象的视觉表示来调节显微镜的参数。在一些实施方式中，指令使处理器生成目标对象的视觉表示的定性和/或定量分析。在一些实施方式中，目标对象包括至少一种框架图案和至少一种荧光阵列。[1657]成像测试载玻片的大小、定位和方向与基因表达载玻片和组织优化载玻片一致。最左边的四个区域对应于基因表达载玻片，而所有八个区域对应于组织优化载玻片。用户可以将这些排列用作模板，用于调整扫描区域、位置、采集分辨率、放大倍数、曝光质量等。这些参数可以在执行实际基因表达和组织之前预先设置和预先建立优化实验。用户可以确保捕获的区域将完全包含基准框，并且最终图像的拼接是合适的，以便整个框架是直的，并且个体点是对准的。利用该方法，用户也能使成像系统自动化以在实验之前捕获多个捕获区域和/或多个载玻片。[1658]本文提供的装置可用于确保在样品制备和/或分析方案期间均匀且一致地控制基材和支持在基材表面上的任何样品和/或试剂的温度。在此类方案中，加热不均会导致样品制备失败。此外，即使样品加热相对均匀，接触样品的冷凝也可能会损害作为方案部分的某些反应，或以其它方式影响发生的化学反应。在各种实施方式中，所描述的装置提供基材的多个表面(例如，在载玻片盒或基材保持器中)的加热，并且可以包括能够促进从加热元件到基材的热传递的特征，并且可以减少或防止在基材的某些区域(例如，在样品孔或基材表面上的区域)中形成冷凝。[1659]一般地参考图31‑43，用于加热基材的系统3102可以包括板3110和基材保持器3150。板3110可以被配置为能被加热装置(例如，热循环仪)接收并且在加热装置和基材保持器3150之间提供热传递。基材保持器3150保持一个或多个基材(例如一个或多个显微镜载玻片)，并且可以可移除方式连接到板3110以促进从板3110到一个或多个基材的热传递。[1660]参考图32和33，板3110可以包括具有第一表面3314和第二表面3216的平台3212。板3110还可包括从第一表面3314延伸的多个构件3318。在一些实施方式中，板3110可包括一个或多个支持构件3220。[1661]板3110通常由导热材料形成，以促进加热装置和基材保持器3460之间的热传递。在一些实施方式中，板3110可由金属制成，例如(但不限于)铝和/或不锈钢。[1662]通常，平台3212被配置为能被加热装置接收。更具体地，平台3212通常被配置为使得在加热装置的加热元件和平台3212之间能够发生热传递。传递到平台3212的热量然后被进一步传递到基材，如下文将更详细地讨论的。[1663]多个构件3318的尺寸可设计成由加热装置的不同区域接收。例如，在一些实施方式中，多个构件3318的尺寸可被设计成被接收在热循环仪的各个样品孔中(例如，热循环仪孔的尺寸通常被设计成接收例如200μl管的小体积试管)。通常，平台3212可以包括任何数量的构件3318。例如，在一些实施方式中，平台3212包括4个到96个构件。通常，当构件3318的数量更大时，热量被更均匀地传递到平台3212，并且它们在表面3314上分布相对均匀。[1664]支持构件3220可以从平台3212延伸并且被配置为联接到基材保持器3150。在一些实施方式中，支持构件3220可以包括一个或多个凹部或凸部，所述凹部或凸部联接到基材保持器3150上的一个或多个互补凸部或凹部，以帮助将基材保持器3150联接到板3110。在一些实施方式中，支持构件3220可以完全由基材保持器3150的部分接收。在一些实施方式中，支持构件3220的部分可以被基材保持器3150的部分接收。在一些实施方式中，支持构件3220在顶面上可以是基本上平坦的。在一些实施方式中，支持构件3220的尺寸和定位可以使得板3110可以包括多个支持构件3220。例如，在一些实施方式中，板3110可以包括两个支持构件3220。[1665]一般地参考图34‑43，基材保持器3150可以包括底部构件3460和顶部构件3480。在一些实施方式中，基材保持器3150还可包括载玻片3452。在一些实施方式中，基材保持器3150可包括衬垫3454(也参见图41)。[1666]参考图35和36，底部构件3460可包括基部3562、第一侧壁3566和第二侧壁3568。底部构件3460可以被配置为安装载玻片52。[1667]在一些实施方式中，基部3562可包括标志物3564。标志物3564可以帮助以特定取向联接底部构件3460和顶部构件3480。例如，在一些实施方式中，底部构件3460和顶部构件3480可能仅能够以单一方向联接在一起。在一些实施方式中，标志物3564可以是线，沟槽，凹痕，凸部，符号，颜色等，以区分基部3562的一侧与基部3562的另一侧。[1668]第一侧壁3566和第二侧壁3568可定位在基部3562的相对纵向侧上。侧壁3566和3568可以从基部3562基本垂直地延伸。在一些实施方式中，侧壁3566和3568在基部3562的边缘上轻微偏移，从而使得基部3562的部分暴露在侧壁3566和3568两者中的任一侧上。侧壁3566和3568可以帮助将载玻片3452固定在底部构件3460中。在一些实施方式中，当载玻片3452固定在底部构件3460中时，载玻片3452可以搁置在基部3562上。在一些实施方式中，侧壁3566和3568可被配置为与顶部构件3480接合。例如，在一些实施方式中，侧壁3566和3568可包括一个或多个凹部3570。在一些实施方式中，侧壁3566可包括单个凹部3570，而侧壁3568包括多个凹部(例如，两个凹部)。这种配置可以提供底部构件3460和顶部构件3480的单向联接以便于使用。[1669]基部3562还可包括用于固定载玻片3452的装置。例如，在一些实施方式中，基部3562可以包括紧固件外壳3572和端部固定构件3574。端部固定构件3574可以帮助将载玻片3452固定在底部构件3460中。在一些实施方式中，端部固定构件3574可包括脊以限制载玻片3452远离基部3452的运动。紧固件外壳3572可为紧固件3458提供外壳(参见例如图39和40)。紧固件3458可以是夹子、脊或将载玻片3452以可移除方式联接到底部构件3460的其它装置。在一些实施方式中，紧固件3458可包括弹簧，使得将载玻片3452推靠在紧固件3458上导致紧固件3458移动经过端部固定构件3574的脊，从而允许载玻片3452进入底部构件3460。一旦载玻片3452被释放，弹簧可以将紧固件3458返回到更中间的位置，使载玻片3452邻接端部固定构件3574。[1670]底部构件3460可以包括用于联接到板3220的支持构件3220的装置。例如，在一些实施方式中，基部3562可以包括在侧壁3566和3568内延伸穿过基部3562的孔口3576。参考图37和38，底部构件3460显示为联接到板3110。在一些实施方式中，孔口3576的尺寸可设计成使得支持构件3220基本上填充孔口3576(见图37)。在一些实施方式中，孔口3576可大于支持构件3822，从而使得支持构件3220仅填充孔口3576的部分(见图38)。在一些实施方式中，支持构件3220、底部构件3460和孔口3576被配置为使得载玻片3452紧邻支持构件3220。在一些实施方式中，支持构件3220、底部构件3460和孔口3576被配置为使得载玻片3452与支持构件直接接触3220。在一些实施方式中，支持构件3220、底部构件3460和孔口3576被配置为使得载玻片3452的样品区域的部分靠近支持构件3220。在一些实施方式中，载玻片3452的样品区域的部分是样品区域的50％至100％。在一些实施方式中，样品区域的部分是样品区域的至少60％。在一些实施方式中，样品区域的部分是样品区域的至少75％。在一些实施方式中，样品区域的部分是样品区域的至少80％。在一些实施方式中，样品区域的部分是样品区域的至少85％。[1671]回转参考图34‑43，底部构件3460可以包括用于将底部构件3460联接到顶部构件3480的接合机构。在一些实施方式中，接合机构包括螺钉3496。因此，基部3562可包括一个或多个螺纹孔3578，其被配置为接收螺钉3496。基部3562的尺寸可以设计成使得螺钉3496不突出基部3562的下侧。[1672]衬垫3454可以定位在基材保持器3150内部。衬垫3454可以包括多个孔口4156(也参见图41)，其中，当衬垫3454邻接载玻片3452时，这些孔口可以产生多个孔。在一些实施方式中，衬垫3454可由橡胶、硅树脂或类似材料制成，以与载玻片3452形成密封。在一些实施方式中，衬垫3454可由疏水材料制成。因此，可以在衬垫3454的各个孔中进行不同的反应。在一些实施方式中，底部构件3460和顶部构件3480的接合产生足够的压力以维持由孔口4156产生的孔之间的分隔。[1673]参考图42和43，顶部构件3480可包括具有壁4284的主体4282。在一些实施方式中，主体4282和/或壁4284的一侧可以包括标志物4286。标志物4286可以帮助以特定取向联接底部构件3460和顶部构件3480。例如，在一些实施方式中，底部构件3460和顶部构件3480可能仅能够以单一方向联接在一起。在一些实施方式中，标志物4286可以是线，沟槽，凹痕，凸部，符号，颜色等，以区分主体4282的一侧与主体4282的另一侧。[1674]在一些实施方式中，壁4284可被配置为与底部构件3460接合。例如，在一些实施方式中，壁4284可包括一个或多个凸部4388。在一些实施方式中，第一壁4284可包括单一凸部4388，而第二壁4284可包括多个凸部4388(例如，两个凸部)。这种配置可以提供底部构件3460和顶部构件3480的单向联接以便于使用。[1675]主体4282还可包括用于将顶部构件3480联接到底部构件3460的接合机构。在一些实施方式中，接合机构包括螺钉3496。因此，主体4282可包括一个或多个螺纹孔4290，其被配置为接收螺钉3496。主体4282可被配置以使得当孔口4290接受螺钉3496时，螺钉3496的头部齐平或低于主体4282的上表面。因此，顶部构件3480可被配置以使得加热装置的顶板能够邻接顶部构件3480，以提供对基材保持器3150的加热。[1676]在一些实施方式中，主体4282可包括位于主体4282下侧的凹部4392。在一些实施方式中，凹部4392可以接收衬垫3454。在一些实施方式中，凹部4392可以可移除方式联接衬垫3454。在一些实施方式中，主体4282可包括衬垫3454，从而使得衬垫3454与主体4282成为一体。[1677]在一些实施方式中，主体4282可包括多个孔口4294。在一些实施方式中，多个孔口4294可以被配置为使得试剂能够被添加到载玻片3452上的基材。在一些实施方式中，多个孔口4294可被配置为与衬垫3454的多个孔口4156对准。在一些实施方式中，多个孔口4294可以被配置为具有能够与多通道移液管一起使用的格式和间距。在一些实施方式中，多个孔口4294可以仅位于主体4282的部分上。在一些实施方式中，主体4282可包括与多个孔口4294相邻的标记物或标记。[1678]虽然基材保持器3150被描述为包括多件(例如，底部构件3460、顶部构件3480、载玻片3452、衬垫3454等)，但基材保持器3150的部件可彼此整合。例如，在一些实施方式中，衬垫3454可以与顶部构件3480整合。又例如，顶部构件3480和底部构件3460可以是被配置为接收载玻片3452的多个单件。[1679]在一些实施方式中，基材保持器3150可由可重复使用的材料制成。例如，在一些实施方式中，基材保持器3150可经清洗和消毒以重新使用。任选地，在这样的实施方式中，衬垫3454可以是可重复使用或可更换的。在一些实施方式中，基材保持器3150可以被制成用于单次使用并且可以是一次性的。[1680]一般地参考图44‑46，装置4498的另一个实施方式可以包括基材保持器4400、衬垫3454和基材安装件，例如载玻片3452。载玻片3452包括第一表面和第二表面。在一些实施方式中，载玻片3452的第一表面可联接(或被联接)到支持构件(例如，如图32中所示的支持构件3220)。在一些实施方式中，基材保持器4400被配置为接收载玻片3452。在一些实施方式中，基材保持器4400包括附接机构以将载玻片3452联接到基材保持器4400。载玻片3452的第二表面可以提供用于接收样品的基材。在一些实施方式中，基材保持器4400是塑料部件(例如，注模塑料部件)。在一些实施方式中，衬垫3454被配置为定位在基材保持器4400和载玻片3452之间。在一些实施方式中，装置4498(或其任何一个组件)可以是一次性装置(或组件)。在一些实施方式中，装置4498完全是一次性的或至少部分地由一次性组件组成。[1681]图44a显示了处于组装状态的装置4498。特别地，图44a显示了接收衬垫3454和载玻片3452的基材保持器4400。基材保持器4400具有纵向侧4505和横向侧4407。基材保持器4400可以包括一个或多个紧固件，例如用于卡扣接合的侧面安装的压锁4410。可以使用允许可释放接合的任何类型的紧固件，例如螺钉和压配合型连接器。压锁4410可以安装在基材保持器4400的纵向侧4505，如图44a‑44c所示。或者，在一些实施方式中，压锁4410可安装在基材保持器4400的横向侧4407中。在一些实施方式中，基材保持器4400可包括两个、三个或四个压锁。压锁4410可以被配置为用于接合载玻片3452。在一些实施方式中，压锁4410可以是杠杆、夹子或夹。在一些实施方式中，压锁4410还可以包括一个或多个弹簧。[1682]基材保持器4400还可包括一个或多个接合特征，例如第一接片4412a和第二接片4412b。第一和第二接片4412a和4412b可以分别从基材保持器4498的纵向侧4505突出，该纵向侧4505与具有压锁4410的纵向侧相对。在一些实施方式中，基材保持器4498包括三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个接片。在一些实施方式中，接片从纵向侧4505或横向侧4407突出基材保持器4400。第一和第二接片4412a和4412b可被配置以接合载玻片3452。在一些实施方式中，第一和第二接片4412a和4412b是刚性的并且在接合载玻片3452时不弯曲。在一些实施方式中，接片4412a和4412b可以是柔性的。[1683]参考图44b，基材保持器4400包括底表面4401。底表面4401包括多个横向肋部4414和纵向肋部4416，其被配置为当装置4498被组装时支持载玻片3452和衬垫3454。底表面4401进一步限定多个孔口4294，当装置4498被组装时，这些孔口4294被配置为与由衬垫3454限定的多个孔口4156对准。基材保持器4400还包括c形接片4422，其形状为用户提供符合人体工程学的抓握表面以帮助促进与压锁4410的接合。[1684]参考图44c，载玻片3452包括第一表面4446、第二表面4448和侧边缘4418。当将载玻片3452插入基材保持器4400时，可首先插入侧边缘4418，使得第一和第二接片4412a和4412b在载玻片3452搁置在衬垫3454上和多个横向肋部4414上时接合侧边缘4418。在一些实施方式中，侧面4418可以测量约3英寸。在一些实施方式中，比侧面4418短的侧面可以测量约1英寸。在一些实施方式中，载玻片3452可测量约75毫米(mm)×25mm。在一些实施方式中，载玻片3452可测量约75毫米(mm)×50mm。在一些实施方式中，载玻片3452可测量约75毫米(mm)×28mm。在一些实施方式中，载玻片3452可测量约46毫米(mm)×27mm。在一些实施方式中，载玻片3452是玻璃载玻片。[1685]参考图45a，基材保持器4400包括顶表面4503。顶表面4503限定了多个孔口4294。此外，顶表面4503包括标志4502、第一标识符4504和第二标识符4506。第一标识符4504可以识别多个孔口4294的列。第二标识符4506可以识别多个孔口4294的行。在一些实施方式中，第一标识符4504和第二标识符4506是字母或数字。在一些实施方式中，第一标识符4504和第二标识符4506可以帮助将载玻片3452以特定方向对准和/或插入到基材保持器4400中。在一些实施方式中，载玻片3452可以在其表面的部分上包括与多个孔4294中的一个或多个对准的样品(例如，生物材料样品)。在一些实施方式中，样品(例如，生物材料样品)可以以与多个孔口4294中的对应孔口相同的方式识别。例如，在一些实施方式中，载玻片3452可以包括名为“a1”的样品，其对应于图45a中由第一标识符4504和第二标识符4506标记为“a1”的孔口4511。因此，在一些实施方式中，第一标识符4504和第二标识符4506引导用户将载玻片3452正确地放置到基材保持器4400中。在一些实施方式中，第一标识符4504和第二标识符4506可以是线、凹部、缩进、凸部、符号、颜色等，以区分多个孔口4294的行和列。[1686]参考图45b，基材保持器4400包括第一横向肋部4414a，第二横向肋部4414b，第三横向肋部4414c，第四横向肋部4414d和第五横向肋部4414e，其具有宽度w。多个横向肋部4414被配置为支持载玻片3452。第一、第二、第三、第四和第五横向肋部4414a、4414b、4414c、4414d和4414e可以具有相等的宽度w，如图45b所示。在一些实施方式中，多个横向肋部的宽度可以变化。第一、第二和第三横向肋部4414a、4414b和4414c分别从靠近基材保持器4400的第一端4515a的底表面4401垂直延伸。第五横向肋部4414e从靠近基材保持器4400的第二端4515b的底表面4401基本垂直地延伸。在一些实施方式中，基材保持器4400可以包括6、7、8、9、10、15、20或更多个横向肋部。[1687]基材保持器4400还包括从底表面4401基本垂直地延伸的第一纵向肋部4416a、第二纵向肋部4416b、第三纵向肋部4416c和第四纵向肋部4416d。多个纵向肋部4416被配置为向衬垫3454提供纵向支持。例如，在一些实施方式中，多个纵向肋部4416邻接衬垫3454的纵向侧。此外，连同第四和第五横肋部4414c和4414e，多个纵向肋部框住底表面4401的区域(例如，足够大小和配置以接收衬垫3454的衬垫区域)。第一纵向肋部4416a，第二纵向肋部4416b，第三纵向肋部4416c，和第四纵向肋部4416d可被设置为平行于沿侧边缘的纵向侧4505。第一纵向肋部4416a、第二纵向肋部4416b、第三纵向肋部4416c和第四纵向肋部4416d具有第二高度4426，如图44b所示。第一、第二、第三、第四和第五横向肋部4414a、4414b、4414c、4414d和4414e具有第一高度4424，如图44b所示。第一高度4424可以大于第二高度4426，如图44‑45所示。在一些实施方式中，第一高度4424等于第二高度4426。在一些实施方式中，第一高度4424小于第二个高度4426。第一和第二纵向肋部4416a和4416b具有长度l′。第三和第四纵向肋部4416c和4416d具有长度l″。长度l′可以大于长度l″，如图45b所示。在一些实施方式中，长度l′等于长度l″。在一些实施方式中，长度l′小于长度l″。在一些实施方式中，基材保持器4400可包括5、6、7、8、9、10、15、20或更多个纵向肋部。[1688]基材保持器4400还包括帮助用户定位和/或定向基材保持器4400的第三标识符4508。例如，在一些实施方式中，第三标识符4508帮助识别第一端4515a或帮助区分第一端4515a和第二端4515b。而在进一步的实施方式中，第三标识符可以是帮助用户将载玻片3452正确地定位到基材保持器4400中的线、凹部、凹痕、凸部、符号、颜色等。[1689]参考图45c，基材保持器包括第一柔性接片4513a和第二柔性接片4513b。第一和第二柔性接片4513a和4513b可以分别从与具有第一和第二接片4412a和4412b的纵向侧105相对的压锁4410的顶部4517突出。第一和第二柔性接片4513a和4513b可以从压锁4410的顶部4517的内表面45109突出。为了使用基材保持器4400，用户可以在底表面4401朝上(即，面向用户)的情况下用一只手握住基材保持器4400。接下来，用户可以将衬垫3454放置在多个孔口4294之上。接下来，用户可以用一只手压下压锁4410，这使得第一和第二柔性接片4513a和4513b在一个纵向侧4505上沿箭头a的方向弯曲打开。因此，用户可以先将载玻片3452加载到第一和第二接片4412a和4412b，然后将载玻片3452铰接进入相对的纵向侧(即，具有第一和第二柔性接片4513a和4513b的侧)。最后，用户可以释放压锁4410，从而使得载玻片3452可以卡入第一和第二柔性接片4513a和4513b。[1690]参考图46，衬垫3454包括多个孔口4156。在一些实施方式中，衬垫3454包括八个孔口。在一些实施方式中，衬垫3454包括十六个孔口。在一些实施方式中，衬垫3454包括24个孔口。在一些实施方式中，衬垫3454包括96个孔口。在一些实施方式中，衬垫3454由可承受高达约60摄氏度的温度的材料制成。在一些实施方式中，衬垫3454由耐热材料制成。在一些实施方式中，衬垫3454由柔性或柔韧材料制成。柔性或柔韧材料的非限制性示例包括橡胶、硅树脂和聚氨酯。[1691]参考图47，基材加载器4728包括限定凹部4730的第一表面4734a和第二表面4734b，凹部4730被配置为接收基材保持器4400。第一和第二表面4434a和4434b接合基材保持器4400的纵向侧4505。基材加载器4728可用作工具以帮助用户通过接合压锁4410且将基材保持器4400保持在打开位置来将载玻片3452加载到第一和第二接片4412a和4412b。基材加载器4728由足够柔顺的材料制成，其允许用户充分弯曲基材加载器4728以将基材保持器4400插入到凹部4730中。基材加载器4728还包括可以帮助弯曲基材加载器4728的槽4732。在一些实施方式中，槽4732可被配置于载玻片。[1692]图48a和48b显示了与基材保持器4400和载玻片3452一起使用的基材加载器4728。参考图48a，基材保持器4400显示为处于打开位置；即，压锁4410被基材加载器4728的第一表面4734a压下。此外，图48a显示了以一定角度且未完全插入第一和第二突片4412a和4412b中的载玻片3452。通过这种方式，用户可以将载玻片3452插入第一和第二接片4412a和4412b，而无需用手连续压下压锁4410以将其保持在打开状态。图48b显示了在其已经完全插入第一和第二接片4412a和4412b并且搁置在衬垫3454的顶部之后的载玻片3452。[1693]基材加载器在几个方面的构造和功能可以与上文讨论的基材加载器4728基本相似，但是可以不包括槽4732，如图49a、49b和49c所示。为了使用第二基材加载器4944，用户可以开始将基材保持器4400插入凹部47130中，从而使得基材保持器4400的纵向侧邻接第二表面4734b并且载玻片3452处于一定角度。接下来，用户按下基材保持器的相对纵向侧4400以将基材保持器4400完全插入到凹部47130中。因此，第一表面4734a接合压锁4410并将第一和第二柔性接片4513a和4513b向远侧撬开。接下来，用户可以用一只手或两只手将载玻片3452插入基材保持器4400，同时第一和第二柔性接片4513a和4513b被基材加载器49144向远侧拉离多个孔口4294。在一些实施方式中，基材加载器可以降低在插入基材保持器4400期间使载玻片3452断裂或碎裂的风险。[1694]参考图50a、50b和50c，基材保持器工具5036包括刀片5038和终止于尖端5040的锥形端5042。基材保持器工具5036可以帮助将载玻片3452推入基材保持器4400和/或从基材保持器4400移出载玻片3452。例如，当处于组装配置时，尖端5040可用于从基材保持器4400拾取载玻片3452。在另一个示例中，刀片5038可用于将载玻片3452向下推入基材保持器4400。在一些实施方式中，基材保持器工具5036由塑料或金属材料制成。[1695]基材保持器在结构和功能的几个方面可以与上文讨论的基材保持器4400基本相似，但是可以包括替代的载玻片加载机构，如图72‑74所示，来代替上述利用压锁4410，第一和第二柔性接片4513a和4513b，以及第一和第二接片4412a和4412b的基材加载机构(如图44‑45所示)。下面描述了示例替代基材加载机构的特征。[1696]图72a显示了具有处于组装状态的基材的又一示例基材保持器。所示基材保持器的该实施方式可有利地提供单件式部件，当需要时，该单件式部件可布置成打开配置或闭合配置。具体地，图72a显示了处于关闭位置的基材保持器7200的顶表面7293(其可以放置在加热装置的顶表面上)。类似于图44‑45所示的实施方式，基材保持器7200包括多个孔口7256。基材保持器7200的基材加载机构由第一接片7250a和第二接片7250b便利化，并且在下文更详细地描述。在一些实施方式中，可以使用允许以可释放方式接合的任何类型的紧固件或接合特征来代替第一和第二接片7250a和7250b，例如螺钉和压配合型连接器。在一些实施方式中，基材保持器7200包括5个或更少的接片(例如，4个或更少的接片、3个或更少的接片、2个或更少的接片，或1个接片)。在一些实施方式中，基材保持器7200是单一模制单元。任何合适的塑料或聚合物都可以用作合适的模塑材料。[1697]在一些实施方式中，支持性保持器7200(例如，支持装置)包括具有第一表面和第二表面的基材安装件，其中基材安装件的第二表面是被配置用于接收样品的基材。支持性保持器还可以包括基材保持器，该基材保持器包括构造成接收衬垫的第一部分，第一部分包括从基材保持器的表面延伸的多个肋部；以及第二部分，第二部分被配置为接收基材安装件，其中第一和第二部分通过铰链联接在一起，从而使得当基材保持器处于关闭状态时，第一部分被配置为折叠在第二部分上以固定基材安装件在第一和第二部分之间。在一些实施方式中，基材安装件是玻璃载玻片。在一些实施方式中，基材保持器包括设置在基材保持器的第一部分和第二部分之间的衬垫。在一些实施方式中，基材保持器的第一部分包括可释放的接合机构，其被配置为当基材保持器处于关闭状态时将第一部分固定到第二部分。在一些实施方式中，基材安装件的第一表面与从基材保持器的表面延伸的多个肋部中的至少一个接合。在一些实施方式中，第二部分限定了形成在基材保持器中的凹腔，该凹腔被配置为接收基材安装件。在一些实施方式中，第二部分限定被配置为接收基材安装件的腔。[1698]图72b显示了包括衬垫7254和接收载玻片7252的基材保持器7200的底表面7297(例如，当放置在加热装置的顶表面上时)。基材保持器7200具有纵向侧7205和横向侧7207。第一和第二接片7250a和7250b分别可以从基材保持器7200的纵向侧7205突出。在一些实施方式中，基材保持器7200是包括衬垫7254的单一模制单元。即，在一些实施方式中，基材保持器7200和衬垫7254是一个部件。在一些实施方式中，基材保持器7200是“包覆成型的(overmold)”。在一些实施方式中，基材保持器7200是第一注模塑料部件，其上模制有第二部件(例如，柔韧材料)。在一些实施方式中，柔韧材料是弹性体。在一些实施方式中，柔韧材料是硅橡胶。在一些实施方式中，衬垫7254是不与基材保持器7200一起模制的单独部件。[1699]图73a显示了处于打开位置的基材保持器7200的顶视图。基材保持器7200的打开和关闭机构是铰接的机构。基材保持器7200的底部组件7362可以通过铰链7360被铰接到基材保持器7200的顶部部件7364。在一些实施方式中，铰链7360是活动铰链。在一些实施方式中，基材保持器7200包括10个或更少铰链(例如，9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少或1个铰链)。基材保持器7200可以包括的铰链的非限制性示例包括直或平的活动铰链、蝶形活动铰链、儿童安全铰链、双活动铰链和三活动铰链。[1700]基材保持器7200还包括一个或多个接合特征，例如第一凹口7358a和第二凹口7358b。当压在一起时，第一和第二凹口7358a和7358b分别接合第一和第二接片7250a和7250b。第一和第二凹口7358a和7358b分别可以从基材保持器7200的顶部组件7364的纵向侧7205突出。在一些实施方式中，基材保持器7200包括三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个凹口。在一些实施方式中，凹口从基材保持器7200的横向侧7207突出。在一些实施方式中，第一和第二凹口7358a和7358b分别是刚性的并且在分别接合第一和第二接片7250a和7250b时不弯曲。在一些实施方式中，第一和第二凹口7358a和7358b分别可以是柔性的。[1701]图73b显示了横向侧7207的侧视图。第一和第二凹口7358a和7358b，分别可以向上突出，并包括接合接片凸缘7368的凹口凸缘7366，如图73c所示。或者，在一些实施方式中，基材保持器7200包括用于以可释放方式接收和以可释放方式固定载玻片7252的搭扣配合锁定机构。待在基材保持器7200的锁定机构中使用的其它类型的紧固件的非限制性示例包括卡扣、突出部、公连接器和母连接器。[1702]图74a和74b图示了将载玻片7252放置到基材保持器7200中。在一些实施方式中，载玻片7252可以被“加载”到基材保持器7200的底部部件7362的内缘或内边缘上。一旦加载，顶部部件7364通过将第一凹口7358a和第二凹口7358b分别压靠在第一和第二接片7250a和7250b上而被关闭，从而与载玻片7252形成紧密密封。在一些实施方式中，用户不需要在接片7250或任何其它接片下方倾斜载玻片。在一些实施方式中，基材保持器7200包括一个或多个接片以帮助将载玻片加载到基材保持器7200的底部部件7362的内缘或内边缘上。[1703]一方面，本公开描述了用于生物样品的空间分析的装置、系统、方法和组合物。组织和细胞可以从任何来源获得。例如，组织和细胞可以从单细胞或多细胞生物体(例如哺乳动物)获得。从哺乳动物(例如，人)获得的组织和细胞通常具有不同的分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)，这可导致细胞形态和/或功能的差异。细胞在组织中的位置可以影响细胞的命运、行为、形态以及与组织中其他细胞的信号转导和串扰。关于哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平(基因和/或蛋白质表达)的差异的信息也可以帮助医生基于检测到的组织中不同细胞内分析物水平的差异来选择或给予对单细胞或多细胞生物体(例如哺乳动物)有效的治疗。哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平的差异也可以提供组织(例如，健康和患病组织)如何发挥功能和/或发展的信息。哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平的差异也可以提供组织中疾病发病机制的不同信息以及组织内治疗作用机制的信息。哺乳动物组织中不同细胞内分析物水平的差异也可以提供有关耐药机制以及哺乳动物组织中耐药机制发展的信息。多细胞生物体(例如哺乳动物)组织中不同细胞内存在或不存在分析物的差异可提供多细胞生物体组织中耐药性机制及其发展的信息。[1704]空间分析方法用于检测哺乳动物组织中的不同细胞内或哺乳动物的单个细胞内的分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)的差异。例如，空间分析方法可用于检测组织切片样品中不同细胞内分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)的差异，来自其中的数据可重组以生成从哺乳动物获得的组织样品的分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)的三维图，例如以一定程度的空间分辨率(例如单细胞分辨率)。[1705]发育系统中的空间异质性通常是通过rna杂交、免疫组织化学、荧光报告物、预定义的亚群的纯化或诱导以及随后的基因组概况分析(例如rna‑seq)来研究的。然而，这类方法依赖于一组相对较小的预定义标志物，因此引入了限制发现的选择偏差。这些先前的方法也依赖于先验知识。传统上，空间rna分析依赖于有限数量的rna物质的染色。相比之下，单细胞rna测序允许对细胞基因表达(包括非编码rna)进行深度概况分析，但已建立的方法将细胞从其天然空间环境(nativespatialcontext)中分离出来。[1706]当前的空间分析方法以高空间分辨率为样品中的多种分析物提供大量分析物水平和/或表达数据，例如，同时保留天然空间环境。空间分析方法包括，例如，使用捕获探针，该捕获探针包括空间条形码(例如，提供关于捕获探针在细胞或组织样品(例如，哺乳动物细胞或哺乳动物组织样品)内的位置的信息的核酸序列)和能够结合到由细胞产生或存在于细胞中的分析物(例如，蛋白质和/或核酸)的捕获域。如本文所述，空间条形码可以是具有独特序列、独特荧光团或荧光团的独特组合、独特氨基酸序列、独特重金属或重金属的独特组合，或任何其他独特可检测试剂的核酸。捕获域可以是能够结合到由细胞产生和/或存在于细胞中的分析物的任何试剂(例如，能够与来自细胞的核酸(例如，mrna、基因组dna、线粒体dna或mirna)杂交的核酸)、分析物的基材或结合伴侣，或能与分析物特异性结合的抗体)。捕获探针还可以包括与通用正向和/或通用反向引物序列互补的核酸序列。捕获探针还可包括裂解位点(例如，限制性核酸内切酶的裂解识别位点)、光不稳定键、热敏键或化学敏感键。[1707]可使用多种不同方法检测分析物与捕获探针的结合，例如，核酸测序、荧光团检测、核酸扩增、核酸连接检测和/或核酸裂解产物检测。在一些示例中，检测用于将特定空间条形码与由细胞(例如哺乳动物细胞)产生和/或存在于细胞中的特定分析物相关联。[1708]捕获探针可以例如附接在表面上，例如固体阵列、珠或盖玻片。在某些示例中，捕获探针未附接到表面。在一些示例中，捕获探针可封装于可透化组合物(例如，本文所述的任一基材)的表面内、嵌入该表面内或分层于该表面上。例如，捕获探针可被封装或布置在可透化珠(例如，凝胶珠)内。在一些示例中，捕获探针可封装于基材(例如，本文所述的任一示例性基材，例如水凝胶或多孔膜)的表面内、嵌入该表面内或分层于该表面上。[1709]在一些实施方式中，使细胞或包括细胞的组织样品与附接于基材(例如，基材的表面)的捕获探针接触，并且细胞或组织样品被透化以使分析物从细胞释放并结合到附接于基材的捕获探针。在一些示例中，可使用多种方法(例如，电泳、化学梯度、压力梯度、流体流、磁场，或被动运输(例如，扩散))将从细胞释放的分析物主动引导至附接于基材的捕获探针。[1710]在其它示例中，可使用多种方法引导捕获探针与细胞或组织样品相互作用，例如，包括捕获探针中的脂质锚定剂、包括能与捕获探针中膜蛋白特异性结合或与膜蛋白形成共价键的试剂、流体流、压力梯度、化学梯度、或磁场。[1711]例如，在2019年8月27日提交的pct专利申请号pct/us2019/048428中描述了空间分析方法的一般非限制性方面，其全部内容通过引用方式纳入本文。空间分析方法的其它非限制性方面在wo2011/127099、wo2014/210233、wo2014/210225、wo2016/162309、wo2018/091676、wo2012/140224、wo2014/060483、美国专利号10,002,316、美国专利号9,727,810、美国专利申请公开号2017/0016053、rodriques等，science363(6434)：1463‑1467，2019；wo2018/045186、lee等，nat.protoc.10(3)：442‑458，2015；wo2016/007839、wo2018/045181、wo2014/163886、trejo等，plosone14(2)：e0212031，2019、美国专利申请公开号2018/0245142、chen等，science348(6233)：aaa6090，2015、gao等，bmcbiol.15：50，2017、wo2017/144338、wo2018/107054、wo2017/222453、wo2019/068880、wo2011/094669、美国专利号7,709,198、美国专利号8,604,182、美国专利号8,951,726、美国专利号9,783,841、美国专利号10,041,949、wo2016/057552、wo2017/147483、wo2018/022809、wo2016/166128、wo2017/027367、wo2017/027368、wo2018/136856、wo2019/075091、美国专利号10,059,990、wo2018/057999、wo2015/161173、和gupta等，naturebiotechnol.36：1197‑1202，2018中描述，其各自的完整内容通过引用方式纳入本文，并且其可以任何组合用于本文中。本文描述了空间分析方法的进一步非限制性方面。[1712]样品和阵列对准装置和方法[1713]空间分析工作流程通常涉及将样品与特征阵列联系起来。在一些实施方式中，为了实现样品和阵列之间的接触，样品在第一基材(例如，载玻片)上制备并且阵列在第二基材(例如，载玻片)上制备，并且将两个载玻片靠近，从而使得第一基材上的样品与第二基材上的特征阵列对准并接触。图51是显示安装在第一基材5102上的样品5100和第二基材5106上的特征阵列5104的示意图。[1714]在某些工作流程中，对准和接触操作是手动执行的。然而，手动对准容易出现操作员误差和不一致：样品5100和特征阵列5104之间的对准操作可能不一致和/或不完美。由于多种原因，样品5100和特征阵列5104的不正确对准可能是不利的。例如，如果发生接触时样品和阵列未完全对准，则可能无法成功移出样品并尝试重新对准，并且阵列可能无法使用。对于昂贵的特征阵列，这会导致分析成本显著增加。[1715]此外，某些测定涉及通过特征阵列对样品进行成像。如果样品和阵列未正确对准，成像可能会不完美，并且可能会受到未对准引起的缺陷的不利影响。[1716]此外，许多组织样品都以存档(即载玻片封固)的形式提供。因此，依赖于将组织样品直接物理放置在特征阵列上的工作流程可能无法容纳此类样品。这将此类工作流程的适用性限制至仅为可用样品的子集。[1717]本公开的特征在于用于对准样品5100和特征阵列5104的装置和方法。所述装置和方法确保样品和特征阵列之间的正确对准和接触，从而可以以不受对准误差的系统变化的显著影响的方式进行可再现的空间分析。所述装置和方法减少了耗材浪费(即浪费的特征阵列)和成本，并且还减少了样品浪费。在一些实施方式中，特征阵列5104包括印刷点、条码化凝胶、条码化微球、凝胶膜或其任何组合。特征阵列5104也可以是探针的均匀覆层，例如在组织优化载玻片中。[1718]图52a是一个样品保持器5200的一例的示意性俯视图且图52b和52c是样品保持器5200的示意性侧视图。样品保持器5200包括第一构件5202，该第一构件5202包括第一保持机构5204，该第一保持机构5204保留具有样品5100的基材5102。样品保持器5200还包括第二构件5206，其包括第二保持机构5208，该第二保持机构5208保留具有特征阵列5104的第二基材5106。对准机构5210被连接到第一和第二构件5202和5206中的至少一个(至图52a和52b中所示的第一和第二部件5202和5206两者)。在对准和接触操作中，对准机构5210用于对准第一和第二构件5202和5206，由此确保样品5100和特征阵列5104也被对准并接触，以促进样品5100的分析。[1719]如图52a‑52c所示，在一些实施方式中，对准机构5210可以实施为连接到第一和第二构件5202和5206的旋转致动器。这种旋转致动器的一个例子是铰链。如图52b所示，一旦基材安装的样品5100定位在第一构件5202中并且基材安装的特征阵列5104定位在第二构件5206中，所述构件之一围绕铰链轴的旋转对准构件5202和5206，并且还对准样品5100和特征阵列5104。构件可以围绕铰链轴线旋转，直到，如图52c所示，样品5100和特征这列5104被对准且接触。[1720]虽然在一些实施方式中，旋转致动器可以以铰链形式实施，如图52a‑52c所示，其它实现方式也是可行的。例如，在某些实施方式中，旋转致动器被实施为折叠构件。图52d显示了示例样品保持器5200的示意性侧视图，其包括连接到第一和第二构件5202和5206的折叠构件5212。折叠构件5212以类似于上述铰链的方式起作用，对准构件5202和5206，以及样品5100和特征阵列5104。折叠构件可由多种材料形成，包括柔性材料，例如橡胶和乙烯基、金属和金属合金以及塑料。[1721]在某些实施方式中，旋转致动器5210可包括至少一个臂。图52e显示了示例样品保持器5200的示意性侧视图，其包括实施为连接到第一和第二构件5202和5206的臂5214的旋转致动器。臂5214包括内部枢转机构5216(例如，销)，其允许臂5214折叠，使构件5202和5206对准，从而对准样品5100和特征阵列5104。虽然图52e中仅显示一个臂5214，更一般地旋转致动器5210可以包括多个臂(例如，2个或更多、3个或更多、4个或更多，或甚至更多)。[1722]在上文讨论的样品保持器5200的各个示例中，样品保持器5200作为一体式(即，一件式)装置形式实施。样品保持器5200也可以作为两件式装置被实施，其中第一和第二构件5202和5206是分开的但可通过对准机构5210可重复地连接。图52f显示了两件式样品保持器5200的示例的示意性侧视图。对准机制可以以各种方式实现。在图52f中，对准机构由定位在第二构件5206上的连接器5218和定位在第一构件5202上的接收器5220组成。当第一和第二构件5202和5206接近时，连接器5218与接收器5220接合，对准第一和第二构件5202和5206，并且也将样品5100与特征阵列5104对准。应该注意的是，虽然在图52f中，连接器5218位于第二构件5206上并且接收器5220位于第一构件上5202，反过来也是可行的。此外，第一和第二构件5202和5206可以各自具有一个或多个连接器5218和一个或多个接收器5220。[1723]第一保持机构5204可以以各种方式实施。在一些实施方式中，第一保持机构5204可对应于尺寸设计成接收第一基材5102的凹部。此外，衬垫可以任选地定位在凹部内以保持凹部的边缘和第一基材5102之间的过盈配合。[1724]在某些实施方式中，第一保持机构5204可以对应于被定位以向第一基材5102施加力，特别是以保持第一基材5102和第一构件5202之间的接触的一个或多个构件。这种构件的示例包括但不限于夹子、螺钉和其它螺纹保持紧固件，以及与第一构件5202卡扣紧固或以其它方式接合的构件。构件可以将力施加到第一基材5102的样品支承表面和/或第一基材5102的一个或多个侧表面。[1725]一般而言，第二保持机构5208可对应于上文联合第一保持机构5204讨论的任何不同类型的保持机构。第一和第二保持机构5204和5208可以不同或相同。[1726]在一些实施方式中，第一构件5202包括第一孔口5222。第一孔口5222可以被定位，例如，使得当第一基材5102被保持在第一构件5202中时，第一孔口5222与第一基材5102的样品区域(例如，样品5100通常位于的区域，或被指定用于放置样品5100的区域)对准。孔口5222可以定位成使得可以从第一构件5202的后表面(即，与支持第一基材5102的表面相对的表面)通过第一孔口5222观察样品5100，并且可以通过第一孔口5222获得样品5100的一个或多个图像。[1727]如上所述，特征阵列5104可以定位在第二基材5106上。然而，更一般地，第二基材5106支持用于分析样品5100的试剂介质。在一些实施方式中，试剂介质对应于特征阵列5104。在某些实施方式中，试剂介质包括特征阵列5104和一种或多种附加组分。例如，附加组分可包括透化试剂(例如，固体、液体、凝胶或干燥的透化试剂)。作为其它例子，其它组分可以包括具有嵌入的透化试剂的水凝胶化合物或层。[1728]在一些实施方式中，第二构件5206包括至少一个孔口。图53显示了样品保持器5200的示例的示意性侧视图，其中第二构件5206包括孔口5224。更一般地，第二构件5206可包括一个或多个(例如，2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、8个或更多、10个或更多、15个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多，甚至更多)第二孔口5224。在某些实施方式中，当第一和第二构件5202和5206对准时，第二孔口5224与基材5102上的样品区域的至少部分对准。[1729]第二孔口5224可用于各种目的。在一些实施方式中，例如，特征阵列5104和/或样品5100可以通过第二孔口5224被观察或成像。例如，观察/成像可用于调节特征阵列5104和样品5100的相对位置以改进对准。[1730]在某些实施方式中，第二孔口5224的一个或多个边界表面和第二基材5106的后表面(即，与第二基材5106的面向样品5100的表面相对并且支持特征阵列5104的第二基材5106的表面)配合，以形成试剂孔。添加到试剂孔的试剂溶液5226(例如，包含透化试剂)被第二孔口5224的边界表面所包含。如果第二基材5106由可透过性或半透过性材料形成，则试剂溶液5226可以透过(例如，通过扩散)第二基材5106的背表面并接触样品5100。[1731]在一些实施方式中，样品保持器5200包括连接到第一构件5200的第一调节机构5228。第一调节机构5228在平行于第一基材的表面5102(其支持样品5100)的至少一个方向平移第一基材5102。在一些实施方式中，第一调节机构5228以平行于第一基材5102的表面的两个方向平移第一基材5102。[1732]第一调节机构5228可以以各种方式实施。在一些实施方式中，例如，第一调节机构5228包括一个或多个翼形螺钉(例如，如图52a所示)或可用于平移第一基材5102的线性致动器。[1733]除了对准第一和第二构件5202和5206之外，对准机构5210还被配置为当基材(和构件)对准时保持第一和第二基材5102和5106(以及第一和第二构件5202和5206)之间的间隔。例如，可以保持间隔以使样品5100的至少部分接触试剂介质(例如，具有试剂介质的特征阵列5104)。[1734]第一和第二基材5102和5106之间的间隔可以保持在50微米至1mm(例如，50微米至800微米，50微米至700微米，50微米至600微米，50微米至500微米，50微米至400微米、50微米至300微米、50微米至200微米、50微米至100微米)，在垂直于支持样品5100的第一基材5102的表面的方向上测量。[1735]在某些实施方式中，当基材(以及第一和第二构件5202和5206)对准时，对准机构5210将第一和第二基材5102和5106保持在近似平行的关系中。在这种情况下，第一和第二基材5102和5106之间的夹角可以是2度或更小(例如，1度或更小、0.5度或更小、0.25度或更小)。[1736]在一些实施方式中，样品保持器5200可以包括一个或多个间隔构件5230，其有助于保持第一和第二基材5102和5106的间隔和/或近似平行布置。这种间隔构件5230的示例在图52c中显示。间隔构件5230可以连接到第一和第二构件5202和5206之一或两者。[1737]在某些实施方式中，样品保持器5200包括第二调节机构5232，如图52c所示。第二调节机构5232调节第一和第二基材5102和5106之间的间隔的距离(即，以正交于第一基材的表面5102(其支持样品5100)的方向)。如图52c所示，在一些实施方式中，第二调节机构5232连接至第一构件5202和第二构件5206中的至少一个；在某些实施方式中，调节机构5232连接到构件5202和5206两者。第二调节机构5232可以是调节机构5210的一个部件，或者替代地，可以作为如图52c中所示的单独部件形式实现。[1738]第二调节机构5232可以以各种方式实施。在一些实施方式中，第二调节机构5232包括一个或多个翼形螺钉或可调节销或柱。在某些实施方式中，第二调节机构5232包括一个或多个线性致动器。在一些实施方式中，第二调节机构5232包括定位在第一和第二构件5202和5206之间的可膨胀或可扩展膜、衬垫或层。[1739]作为分析工作流程中的后续步骤，在样品保持器5200使样品5100和特征阵列5104接触之后，样品保持器5200可被引入热循环仪，以促进特征阵列5104从样品5100中捕获分析物。为此，可将样品保持器5200直接插入合适的热循环仪中。或者，在一些实施方式中，样品保持器5200可以联接到热循环仪适配器并且将联接的保持器和适配器插入到热循环仪中。适用于样品保持器5200的热循环仪适配器例如，在2019年4月26日提交的美国临时专利申请第62/839,575号中进行了描述，其全部内容通过引用方式纳入本文。[1740]样品保持器5200与用于使样品5100与透化试剂接触以促进分析物捕获的多种不同方案兼容。在一些实施方式中，透化试剂溶液直接沉积在第二基材5106上(例如，形成包括透化试剂和特征阵列5104的试剂介质)和/或直接沉积在第一基材5102上，然后样品5100与特征阵列5104接触(例如，通过关闭样品保持器5200，如图52c所示)。[1741]在某些实施方式中，在接触样品5100和特征阵列5104之前，干燥的透化试剂被施加或形成为第一基材5102或第二基材5106或两者上的层。例如，可以将试剂以溶液形式沉积在第一基材5102或第二基材5106或两者上，然后干燥。干燥方法包括但不限于旋涂试剂的稀溶液，然后蒸发包含在试剂中的溶剂或试剂本身。或者，在其它实施方式中，可以将试剂以干燥形式直接施加到第一基材5102或第二基材5106或两者上。在一些实施方式中，可以在分析工作流程之前完成被覆过程并且第一基材5102和第二基材5106可预先被覆以存储。或者，被覆过程可以作为分析工作流程的部分来完成。在一些实施方式中，试剂是透化试剂。在一些实施方式中，试剂是透化酶、缓冲液、去污剂或其任何组合。在一些实施方式中，透化酶是胃蛋白酶。在一些实施方式中，试剂是干燥的试剂(例如，不含水分或液体的试剂)。[1742]图68显示了在包括特征阵列5104的第一基材5102上使用干燥透化试剂6801的示例分析工作流程。在第一步骤6802中，可以用干燥的透化试剂6804涂覆第一基材5102。如上所述，透化试剂可以溶液形式沉积在第一基材5102上，然后干燥。或者，在其它实施方式中，透化试剂可以以干燥形式直接施加到第一基材5102上。在一些实施方式中，干燥的透化试剂6804覆盖至少包括特征阵列5104的第一基材5102的表面区域。在一些实施方式中，干燥的透化试剂6804覆盖第一基材5102的表面积，该表面积大于包括特征阵列5104的表面积。在一些实施方式中，干燥的透化试剂6804是干燥的胃蛋白酶。在一些实施方式中，干燥的透化试剂6804是干燥的透化酶、干燥的缓冲液、干燥的去污剂或其任何组合。在一些实施方式中，干燥的去污剂是干燥的辛基苯酚乙氧基化物。[1743]在第二步骤6806中，包括样品5100(例如，组织学切片)的第二基材5106被水合。可以通过使样品5100与不包括透化试剂的缓冲液6810接触来水合样品5100。在一些实施方式中，缓冲液6810是盐酸。在一些实施方式中，缓冲液6810是溶剂。在一些实施方式中，缓冲液6810是不包含任何透化试剂的透化缓冲液。例如，第二基材5106上的样品5100可以在盐酸中水合，而第一基材5102可用干燥胃蛋白酶被覆。[1744]在第三步骤6812中，可以将第一基材5102和第二基材5104布置在夹心组件中，如图68所示。当与缓冲液6810接触时，第一基材5102上的干燥透化试剂6804被溶解。在一些实施方式中，当样品5100和干燥的透化试剂6804与缓冲液6810接触时，组织透化过程开始。在透化过程中，分析物可以从样品5100中释放出来。在一些实施方式中，从透化样品释放的分析物扩散到第一基材5102的表面并被捕获在特征阵列5104上(例如，在条码化探针上)。在一些实施方式中，第一基材5102可以被放置为与第二基材5104上的样品5100直接接触，确保没有扩散空间分辨率损失。[1745]在第四步骤6814中，第一基材5102和第二基材5106分离(例如，拉开)。在一些实施方式中，可以在第一基材5102和第二基材5106分离之后，在第一基材5102上进行样品分析(例如，cdna合成)。在一些实施方式中，在第一基材5102和第二基材5106分离之后，第二基材5106可以被丢弃或存档。[1746]分析工作流程在几个方面可以与图68所示的示例分析工作流程基本相似，但可以包括在整个分析过程中控制第一和第二基材5102和5106的温度而不是不控制温度的替代方法。图69显示了分别使用样品保持器5200的温度控制的第一和第二构件5202和5206的示例分析工作流程。在一些实施方式中，使第一和第二构件5202和5206的温度降低到低于室温(例如，25摄氏度)的第一温度(例如，20摄氏度或更低、15摄氏度或更低、10摄氏度或更低、5摄氏度或更低、4摄氏度或更低、3摄氏度或更低、2摄氏度或更低、1摄氏度或更低、0摄氏度或更低、‑1摄氏度或更低、‑5摄氏度或更低)。在一些实施方式中，样品保持器5200包括温度控制系统(例如，加热和冷却导电线圈)，其允许用户控制样品保持器5200的温度。或者，在其它实施方式中，样品保持器5200的温度由外部控制(例如，通过制冷或加热板)。在第一步骤6908中，设置为或处于第一温度的第二构件5206接触第一基材5102，并且设置为或处于第一温度的第一构件5202接触第二基材5104，从而降低第一基材5102和第二基材5104的温度至第二温度。在一些实施方式中，第二温度等于第一温度。在一些实施方式中，第一温度低于室温(例如，25摄氏度)。在一些实施方式中，第二温度范围从约‑10摄氏度到约4摄氏度。在一些实施方式中，第二温度低于室温(例如，25摄氏度)(例如，20摄氏度或更低、15摄氏度或更低、10摄氏度或更低、5摄氏度或更低、4摄氏度或更低)、3摄氏度或更低、2摄氏度或更低、1摄氏度或更低、0摄氏度或更低、‑1摄氏度或更低、‑5摄氏度或更低)。[1747]包括特征阵列5104的第一基材5102与干燥的透化试剂6804接触。在一些实施方式中，第一基材5102与为凝胶或液体形式的透化试剂接触。同样在第一步骤6908中，样品5100与缓冲液6810接触。第一和第二基材5102和5106均置于较低温度下以减慢扩散和透化效率。或者，在一些实施方式中，样品5100可以直接与液体透化试剂接触，而不会由于基材处于第二温度而引起不希望的透化起始。在一些实施方式中，低温减慢或阻止透化起始。[1748]在第二个步骤6910中，将样品保持器5200和基材保持在低温(例如，在第一或第二温度)继续减慢或防止样品5100的透化。在第三步骤6912中，样品保持器5200(以及因此第一和第二基材5102和5106)被加热以开始透化。在一些实施方式中，样品保持器5200被加热到第三温度。在一些实施方式中，第三温度高于室温(例如，25摄氏度)(例如，30摄氏度或更高、35摄氏度或更高、40摄氏度或更高、50摄氏度或更高、60摄氏度或更高)。在一些实施方式中，从样品5100的透化组织释放的分析物扩散到第一基材5102的表面并被捕获在第二基材5106的特征阵列5104(例如，条码化探针)上。在第四步骤6914中，第一基材5102和第二基材5106被分离(例如，拉开)并且温度控制被停止。[1749]在一些实施方式中，其中第一基材5102或第二基材5106(或两者)包括孔，透化溶液可被引入一些或全部孔中，然后样品5100和特征阵列5104可通过关闭样品保持器5200而接触，以透化样品5100。在某些实施方式中，可将透化溶液浸入直接施加到样品5100的水凝胶膜中，和/或浸入形成特征阵列5104的特征(例如，珠)中。当样品5100和特征阵列5104通过关闭样品保持器5200而接触时，透化溶液促进分析物从样品5100迁移到特征阵列5104。[1750]在某些实施方式中，不同的透化剂或不同浓度的透化剂可被注入阵列特征(例如珠)或如上所述的水凝胶层。通过局部改变透化试剂的性质，可以在空间上调节从样品5100捕获分析物的过程。[1751]还应注意，结合任何上述透化方法，在一些实施方式中，透化剂向样品5100的迁移可以是被动的(例如，通过扩散)。或者，在某些实施方式中，透化剂向样品5100的迁移可以主动进行(例如，电泳，通过施加电场以促进迁移)。[1752]图70a‑70d显示了经历电泳透化的基材和样品5100的不同示例配置。电场“‑e”的施加导致第一分析物7002(例如，带负电的分析物)在图70a‑70d中所示的箭头方向上向第二分析物7004(例如，带正电的分析物)移动。在一些实施方式中，第一分析物7002是蛋白质或核酸。在一些实施方式中，第一分析物7002是带负电荷的蛋白质或核酸。在一些实施方式中，第一分析物7002是带正电荷的蛋白质或核酸。在一些实施方式中，第二分析物7004是蛋白质或核酸。在一些实施方式中，第二分析物7004是带正电荷的蛋白质或核酸。在一些实施方式中，第二分析物7004是带负电荷的蛋白质或核酸。在一些实施方式中，第一分析物7002是带负电荷的转录物。在一些实施方式中，第一分析物7002是多聚a转录物。在一些实施方式中，第二分析物7004是捕获探针。在一些实施方式中，第二分析物7004是与覆层7010接触的覆层。在一些实施方式中，第二分析物7004是特征阵列。在一些实施方式中，第一分析物7002朝向第二分析物7004移动距离“h”。在一些实施方式中，透化试剂7012可与样品5100、第一基材7006、第二基材7008或其任何组合接触。透化试剂7012可包括上文公开的任何透化试剂，包括但不限于干燥透化试剂、透化缓冲液、不含透化试剂的缓冲液、透化凝胶和透化溶液。[1753]图70a显示了在具有覆层7010的第二基材7008上的样品5100。如图70a所示，样品5100与第一基材7006的表面之间可存在间隙7014。在一些实施方式中，覆层7010是导电覆层。在一些实施方式中，覆层7010是氧化铟锡覆层。图70b展示另一实例配置，其中样品5100在第一基材7006上，且在样品5100和覆层7010之间存在间隙7014。图70c显示了另一示例配置，其中样品5100在第二基材7008的覆层7010上，但样品5100和基材之间不存在间隙。图70d显示了另一示例配置，其中样品5100在第一基材7006上，但是样品5100和基材之间不存在间隙。[1754]图71显示了用于样品5100的电泳透化的示例设置。第一和第二基材7006和7008可以包括导电环氧树脂7104。来自电源7102的电线7016可以连接到导电环氧树脂7104，从而允许用户在第一和第二基材7006和7008之间施加电流并产生电场。在一些实施方式中，仅第一基材7006包括覆层7010。在一些实施方式中，仅第二基材7008包括覆层7010。在一些实施方式中，第一基材7006和第二基材7008都包括覆层7010。在一些实施方式中，7102是高压电源7102。间隔体7106可以放置在样品5100附近并且在第一基材7006和第二基材7008之间，如图71所示。通过这样做，间隔体7106可以建立一个腔室，在整个电泳透化过程中，透化试剂7012包含在该腔室中。在一些实施方式中，与在不施加电场的情况下随机扩散到匹配基材上(例如，通过两个基材的手动对准)相比，电泳透化导致更高的分析物捕获效率和捕获的分析物(例如，在特征阵列上)的更好的空间保真度)。[1755]在样品保持器5200的前述描述中，如图52c所示的样品保持器5200的组装或关闭可以手动进行。或者，在一些实施方式中，样品保持器5200可以使用一个或多个电动致动器(例如，作为对准机构5210)关闭，由专用控制器或通过运行在包括一个或多个电子设备的专用或通用计算装置上的软件控制，所述通用计算装置包括一个或多个电子处理器、专用整合电路和/或专用可编程控制器。[1756]虽然第一和第二基材5102和5106在图52a中显示为具有相同的尺寸，更一般地，第一和第二构件5202和5206可以容纳不同尺寸和/或形状的第一和第二基材5102和5106。在某些实施方式中，第一和/或第二保持机构5204和5208成形为适应第一和第二基材5102和5106的特定尺寸和/或形状。在某些实施方式中，第一和/或第二保持机构5204和5208是可调节的，并且可以容纳具有不同尺寸和/或形状的基材。[1757]在一些实施方式中，第一和第二基材5102和5106在一个横向上比在另一个横向上更长，如图51所示，样品保持器5200可以被配置为接收第一和第二基材5102和5106，从而使得当样品保持器5200关闭时，基材的较长尺寸正交对准。这种布置在图54中示意性地显示。因为在图54中，第一调节机构5228允许第一基材5102平行于方向5402平移，样品5100可以定位在基材5102上的几乎任何位置并且仍然与特征阵列5104对准(通过调节第一调节机构5228)。[1758]为了确保样品5100和特征阵列5104被样品保持器5200对准，在一些实施方式中，第一基材5102和/或第二基材5106上的基准标志物可以被观察或成像(例如，通过第一孔口5222和/或第二孔口5224，且第一调节机构5228可以被调节以使得基准标志物彼此对准。[1759]即使当第一和第二基材5102和5106不包括基准标志物时，也可以调节第一和第二基材5102和5106之间的对准。图55是样品保持器5200的第一和第二构件5202和5206的示意图，各个构件包括基准标志物5240和5242(例如，边界)。第一调节机构可被调节以确保当样品保持器5200关闭时基准标志物5240和5242对准。当第一基材5102被引入第一构件5202时，第一保持机构5204被调节，从而使得样品5100与基准标志物5240对准。类似地，当第二基材5106被引入到第二构件5206中时，特征阵列5104与基准标志物5242对准。以此方式，当样品保持器5200关闭时，自动确保样品5100与特征阵列5104之间的对准。[1760]在一些实施方式中，第二基材5106可以包括用于分析多个样品的多个特征阵列5104。第一基材5102可以包括对应于样品放置位置的多个对应基准标志物5250。图56是显示与该分析方法相关联的工作流程的示意图。如图56所示，一些或全部基准标志物5250填充有样品，然后第一基材5102与第二基材5106一起安装在样品保持器5200中(包括多个对应的特征阵列5104)。当样品保持器5200关闭时，第一基材5102上的各个样品与第二基材5106上的特征阵列中的不同的一个对准。[1761]当分析物从样品5100迁移到特征阵列5104并且扩散迁移的分量(component)发生在横向(例如，侧向)方向上时(大致平行于其上安装有样品5100的第一基材5102的表面)，可能会出现空间分辨率的损失。为了解决这种分辨率损失，在一些实施方式中，可以将通过各向异性扩散沉积在或注入材料中的透化剂应用于样品5100或特征阵列5104。图57a是显示使用具有各向异性扩散的材料的示例分析工作流程的示意图。第一基材和第二基材5102和5106由样品保持器5200对准并接触。包括注入各向异性材料的透化溶液的透化层位于第二基材5106上。[1762]图57b是说明分析物从样品5100到特征阵列5104的流动的示意图。分析物只能通过在透化剂承载层5702中形成的某些通道迁移到特征阵列5104。结果，分析物的横向扩散——否则会在没有透化剂承载层5702的情况下发生——显著减少。图57c显示了形成在透化剂承载层5702中的单个通道的放大示意图。样品5100中的分析物被限制为通过通道迁移，没有从通道向外扩散，朝向特征阵列5104。[1763]在一些实施方式中，特征阵列5104可以构建在灌注有透化剂的水凝胶层顶上。水凝胶层可以安装在第二基材5106上，或者，水凝胶层本身可以用作第二基材5106。图58显示了安装在水凝胶层5802顶上的示例特征阵列5104。当第一和第二基材5102和5106对准时，透化剂扩散出水凝胶层5802并穿过或围绕特征阵列5104到达样品5100。来自样品5100的分析物迁移到特征阵列5104。特征阵列5104和样品5100之间的直接接触有助于减少分析物的横向扩散，减轻在分析物的扩散路径更长时会发生的空间分辨率损失。[1764]在一些实施方式中，在样品5100和透化剂之间的初始接触之后，透化剂可以在短于样品5100完全透化的时间的时间之后从与样品5100的接触中移开(例如，通过打开样品保持器5200)。实际上，只有部分样品5100被透化，并且只有部分样品5100中的分析物可以被特征阵列5104捕获。[1765]然而，由于样品5100的不完全透化导致横向扩散的减少，可以抵消捕获和可用于检测的分析物的减少的量。一般而言，测定的空间分辨率由分析物在横向方向(即，与样品5100的表面的法线方向正交)的扩散程度确定。样品5100和特征阵列5104之间的距离越大，横向扩散的程度越大，从而造成分辨率损失。分析物仅从最靠近特征阵列5104的样品5100的上部释放具有较短的扩散路径，因此不会像来自样品5100的离特征阵列5104最远的部分的分析物那样横向扩散。结果，样品5100的不完全透化(通过减少透化剂和样品5100之间的接触间隔)可用于在测定中保持足够的空间分辨率。[1766]信息标记物[1767]如本文所用，术语“信息标记物”通常是指贴在固体支持物如载玻片上的一张印刷纸、塑料、乙烯基或其它包含书面或印刷信息的材料。在一些实施方式中，直接印刷在固体支持物或产品上的信息被认为是信息标记性的。在一些实施方式中，信息标记物提供关于产品或物品的信息。此外，信息标记物还可用于标识、信息、警告、使用说明、环境建议或广告的任意组合。它们可能是贴纸、永久或临时标记物或印刷包装。[1768]在一些实施方式中，信息标记物可以通过热活化粘合剂附接。热活化粘合剂在常温下不会粘合，但一旦加热到一定温度，化学物质就会被激活以形成粘合。在一些实施方式中，热活化粘合剂需要在升高的温度(通常为180°f或更高)下经过一段确定的时间以达到最终的粘合强度。它们可用于粘合多种材料组合(例如，塑料、金属和木材)。从热源激活后，热活化的粘合剂可以经历两个阶段，第一阶段发生在热活化和粘合发生后几秒钟内，粘合剂开始冷却，第二阶段发生在粘合剂开始冷却、化学物质开始结晶后，显著增加了材料的粘合强度。[1769]在一些实施方式中，信息标记物可以通过压敏粘合剂附接。压敏粘合剂是一种非反应性粘合剂，当施加压力以将粘合剂与被粘物粘合时形成粘合。在一些实施方式中，不需要溶剂、水或热来活化粘合剂。粘合程度受用于将粘合剂施加到表面的压力量的影响，而表面因素如光滑度、表面能和污染物的去除对于正确粘合也很重要。压敏粘合剂通常设计用于形成粘合并在室温下正确保持。然而，它们会在低温下降低或失去粘性，并在高温下降低其剪切保持能力。[1770]在一些实施方式中，信息标记物可以通过静电粘附来附着，其中静电粘附标记物具有静电荷，使它们能够在没有化学粘合剂的情况下粘附到光滑且无孔的表面，例如玻璃。静电粘附标记物可以由薄塑料薄膜(例如，非邻苯二甲酸酯、聚乙烯、烯烃、聚烯烃、聚丙烯、聚氯乙烯)制成，并且由于它们不含粘合剂，因此可以很容易地移除、重新定位和重复使用。这些材料附着在最光滑的光滑表面上，例如玻璃、光滑的塑料和闪亮的金属。在一些实施方式中，静态粘附标记物在被压到类似的内聚力或表面上时以类似微型吸盘的模式作用。材料的两面都能够粘附在无孔表面上。[1771]在一些实施方式中，信息标记物是永久性的。在一些实施方式中，信息标记物是可移除的。有许多不同类型的可移除粘合剂，有些几乎是永久性的，有些非常容易去除。可移除信息标记物在正常情况下不会脱落，但是信息标记物可以相对容易地移除而不会损坏或在固体支持物上留下粘合剂。在一些实施方式中，容易移除的信息标记物主要设计用于超光滑的无孔表面，例如玻璃，并且当移除这些粘性信息标记物时，不会留下任何残留物。[1772]带有印刷指引的信息标记物旨在帮助用户将组织放置到载玻片上。基准标志物(例如，点、数字和字母)可以为载玻片上印刷的阵列位置提供视觉指引。点可以指示阵列的中心，而数字和字母可以标识个体孔。在一些实施方式中，带有印刷指引的信息标记物通过以载玻片和其它表面之间的物理屏障模式作用来减少表面污着，并减少与低温恒温器表面的直接接触。在一些实施方式中，信息标记物是一次性的。[1773]在一些实施方式中，信息标记物可以是透明的。信息标记物可能具有用墨水(例如，白色墨水、黑色墨水、彩色墨水或荧光墨水)印刷的印刷指引。在一些实施方式中，信息标记物可以使用热印刷来印刷，该热印刷使用热量将印记转移到信息标记物上。在一些实施方式中，蚀刻可用于在信息标记物上印刷指引。信息标记物的纹理可以通过在信息标记物表面印刷不同的图案来改变。在一些实施方式中，信息标记物具有哑光饰面。在一些实施方式中，信息标记物具有光泽饰面。信息标记物的内部可以有孔洞或切口。在一些实施方式中，信息标记物占据所有固体支持物。在一些实施方式中，信息标记物占据固体支持物的部分。在一些实施方式中，信息标记物能够具有导热性和导电性。在一些实施方式中，信息标记物能够导热。在一些实施方式中，信息标记物能够导电。在一些实施方式中，信息标记物包含元数据。元数据的非限制性示例包括组织放置指引、阵列/孔标识、载玻片标识条形码、载玻片方向、失效日期、载玻片类型、载玻片尺寸或其它用户指令。在一些实施方式中，可以使用固定装置将载玻片保持在适当位置以施加信息标记物并防止损坏载玻片。使用这种固定装置来施加信息标记物可以在将信息标记物施加到载玻片时减少表面污迹。[1774]实施例[1775]实施例1[1776]为了评估使用样品保持器5200的不同透化方案，进行了一系列实验。在第一个实验中，将透化溶液施加到第二基材5106的表面，并且使第一和第二基材5102和5106对准，从而使得样品5100接触特征阵列5104，并且透化溶液扩散到样品5100中，促进释放来自样品5100的分析物。分析物被阵列5104捕获。共使用20μl4x透化溶液，在37℃下进行透化和分析物迁移6分钟。[1777]在打开样品保持器5200和拆卸第一和第二基材5102和5106之后，对两个基材进行成像。图60a是用苏木精和伊红(h&e)染色的组织学切片的明场图像。图60b和60c分别是第一基材5102和第二基材5106的组织样品的组织切片的图像。图60d是显示图60b和60c的图像的比较信号强度的图，关于图61b和61c将在下文进行讨论。[1778]图61a是用h&e染色的另一个组织学切片的明场图像。图61b和61c分别是透化和分析物迁移后第一基材5102和第二基材5106的组织样品的另一个组织切片的图像。图61d是显示图60b和60c，以及61b和61c的图像的比较信噪比(snr)的图。[1779]从这些结果可以明显看出，可以从第一和第二基材5102和5106两者获得样品图像，虽然从第一基材5102获得的图像比从第二基材5106获得的图像明显更亮。这可能表明需要增加样品5100的透化。观察到空间分辨率的损失，尽管这种影响并不严重。[1780]在另一个实验中，阵列特征(凝胶珠)浸泡在透化溶液中，并且特征阵列5104和样品5100对准并接触以促进分析物从样品5100迁移到特征阵列5104。图62是说明与该实验相关联的工作流程的示意图。不存在流体渗透层；透化剂扩散出珠并进入样品5100。对于相对较短的透化和分析物捕获间隔，扩散损失显著减少。[1781]在另一实验中，将浸泡在透化溶液中的150μm厚的水凝胶膜6302应用于样品5100的表面，并且在37℃下进行透化和分析物捕获6分钟。图63是说明与该实验相关联的工作流程的示意图。透化剂从膜6302扩散到样品5100。[1782]图64a显示了一系列不同的分析的组织样品的图像(如图63所示)。上行中的图像是明场组织学图像，而下行中的图像是第一和第二基材5102和5106的图像。图64b是显示下行图像之间的比较信号强度的图。[1783]这些结果表明样品5100可以成功地被水凝胶膜6302透化，并且虽然膜6302的厚度约为150微米，然而甚至更薄的水凝胶膜也可能用于样品5100的透化。[1784]实施例2‑使用带有印刷指引的可移除信息标记物进行组织切片放置[1785]在非限制性示例中，带有印刷指引的可移除透明静态粘附信息标记物(例如，图65中所示的示例性标记物)提供用于印刷阵列位置和组织切片放置的视觉指引。信息标记物上的印刷指引包括指示阵列中心的点和围绕个体微阵列的框，其中一张载玻片包括多个微阵列。用户使用打印的指引在印刷的盒内定向和放置组织切片，从而将组织切片放置在阵列上。如果载玻片包含多个微阵列，则用户能够在载玻片上放置多个组织切片，其中各个组织切片都在印刷的盒内。然后用户对载玻片进行成像并在载玻片上进行空间转录组学。信息标记物包含元数据，包括在成像期间捕获的载玻片/阵列序列号，因此利用特定的信息标记的阵列识别特定生物样品。图66和67显示了在应用于载玻片之前清晰的静态粘附信息标记物的附加示例性变化形式。[1786]其它实施方式[1787]应理解，虽然结合具体说明描述了本发明，但上述说明旨在阐释而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书来限定。[1788]公开了系统、装置(例如，装置)、方法和组合物，其可以用于、可以结合使用、可以用于制备所公开的方法和组合物或者是所公开的方法和组合物的产品。本文公开了这些和其它系统、设备、方法和组合物，并且应当理解公开了这些系统、设备、方法和组合物的组合、子集、相互作用、组等。也即，虽然可能没有明确公开对这些系统、装置组合物和方法的各个不同的个体和集体组合和排列的具体参考，但在本文中对它们进行了具体考虑和描述。例如，如果公开和讨论了特定系统、设备、物质组成或特定方法并且讨论了许多系统，装置、组合物或方法，则系统、装置、组合物和方法的每一种组合和排列都是具体考虑的，除非具体相反地指示的情况。同样地，还特别考虑和公开了这些的任何子集或组合。[1789]其他方面、优点和改进也在下述权利要求书的范围内。当前第1页12当前第1页12
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