溶血磷脂酶变体及其构建方法和在黑曲霉菌株中的表达与流程

1.本发明属于基因工程育种领域，涉及一种能够在黑曲霉宿主菌中大量表达，且具有更高溶血磷脂酶比酶活的多肽，以及其黑曲霉重组表达菌株的构建及应用。


背景技术：

2.溶血磷脂酶被广泛应用在多种行业中。然而，其相对较高的价格仍然限制了其更加广泛的应用。溶血磷脂酶的生产基本是采用微生物发酵的方式。而提高其在微生物发酵过程中的表达量，是提高其工业化生产量，降低其工业生产价格的优良方式。


技术实现要素：

3.本发明提供了一种具有溶血磷脂酶活性的多肽序列，使用本公司之前申请的专利方法，将其在相应的黑曲霉宿主中表达，其上清液活性、以及分子比酶活，比野生型的黑曲霉来源的溶血磷脂酶在黑曲霉宿主中的表达，分别提高了20.7％和21.12％。
4.本发明提供了一种溶血磷脂酶变体的序列，以及构建其黑曲霉重组表达菌株的方法。
5.本发明的重组表达菌株可以通过基因工程方法构建，具体描述为：
6.一种构建重组黑曲霉表达菌的方法，构建包含溶血磷脂酶变体基因序列的重组表达盒，该重组表达盒为包含溶血磷脂酶变体基因序列、启动子、终止子、信号肽、筛选标记等元件的基因片段。
7.所述的溶血磷脂酶变体基因为具有如seq id no.1所示的核苷酸序列；所述的宿主细胞为黑曲霉。
8.启动子可以是黑曲霉内源启动子：如黑曲霉糖化酶启动子，中性淀粉酶启动子，酸性淀粉酶启动子，α
‑
葡萄糖苷酶启动子等；也可以是外源启动子：如米曲霉中性淀粉酶启动子，米根酶糖化酶启动子；本发明优选黑曲霉糖化酶启动子或黑曲霉中性淀粉酶启动子。
9.与启动子3’末端连接的可以是调控序列：如合适的前导序列(5’utr)，即对于宿主细胞的翻译重要的mrna非翻译区，如米曲霉中性淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶前导序列。
10.为了分泌表达特定蛋白，需要信号肽序列介导，在黑曲霉中常用的信号肽序列有糖化酶信号肽，酸性淀粉酶信号肽，黑曲霉植酸酶信号肽，米曲霉taka淀粉酶信号肽，在本发明中利用的是溶血磷脂酶变体基因序列本身编码的信号肽。
11.优选的终止子从如下酶的基因获得：黑曲霉糖化酶、米曲霉taka淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α
‑
葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
12.特定的基因在与启动子，调控序列，信号肽序列及终止子相连接后形成表达盒。通过常规方法导入到黑曲霉基因组中，可以随机插入到基因组中，也可以定点整合到某个或多个基因座上。可选的基因座有gla(糖化酶)，amya(中性淀粉酶)，amyb(中性淀粉酶)，aa(酸性淀粉酶),agda(α葡萄糖苷酶)，agdb(α葡萄糖苷酶)。
13.所述表达盒优选地可以与一个或多个选择性标记连接，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞或菌株。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amds(乙酰胺酶)、argb(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦)乙酰转移酶)、hyg(潮霉素磷酸转移酶)、niad(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrg(乳清酸核苷
‑5’‑
磷酸脱羧酶)(orotidine
‑5’‑
phosphate decarboxylase)、sc(硫酸腺苷酰转移酶)和trpc(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉(aspergillus nidulans)或米曲霉的amds或hyg。
14.所述表达盒优选地可以与一个或多个反向选择标记(负选择标记)连接。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amds(乙酰胺酶)、pyrg(乳清酸核苷
‑5’‑
磷酸脱羧酶),hsvtk(单纯疱疹病毒胸苷激酶)。
15.所述的表达盒通过常规方法导入随机插入到宿主黑曲霉基因组中，或定点整合到宿主黑曲霉的某个或多个基因座上。
16.所述的基因座选自糖化酶gla，中性淀粉酶amya，中性淀粉酶amyb，酸性淀粉酶aa,α葡萄糖苷酶agda，α葡萄糖苷酶agdb。
17.所述的宿主为敲除糖化酶基因、真菌淀粉酶基因和酸性淀粉酶基因的黑曲霉。
18.本发明的有益效果：
19.本发明提供了一种溶血磷脂酶变体的基因序列及其多肽序列，并且提供了其在黑曲霉中的表达方法。通过表达本变体序列，获得了高产溶血磷脂酶变体黑曲霉表达菌株。跟表达溶血磷脂酶原始序列的菌株相比，在相同条件下，其上清液活性、以及分子比酶活，比野生型的黑曲霉来源的溶血磷脂酶在黑曲霉宿主中的表达，分别提高了20.7％和21.12％。
附图说明
20.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
21.图1是酶活对比图。
具体实施方式
22.以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
23.实施例
24.p
‑
zyan02
‑
lppl
‑
t质粒的构建
25.具体主要包含以下两个步骤：1.制备中间质粒p
‑
zyan01。2.线性化中间质粒p
‑
zyan01，并将溶血磷脂酶变体基因表达盒及上下游同源片段整合进p
‑
zyan01，组成p
‑
zyan02
‑
lppl
‑
t质粒
26.制备中间质粒p
‑
zyan01方法如下：
27.p
‑
zyan01主要由如下几部分及必须的连接序列结合而成，或者由以下几部分直接结合而成。
28.(1)puc57质粒xbai
‑
psci双酶切后得到的2305bp片段；
29.(2)hyg基因表达盒，序列见seq id no.5；
30.(3)amds表达盒，序列见seq id no.6。
31.将puc57质粒xbai
‑
pcii双酶切后得到的2305bp片段，hyg基因表达盒，以及amds表达盒，三个基因片段序列片段通过gibson master mix kit(e2611，new england biolabs)进行重组，得到重组质粒p
‑
zyan01。将溶血磷脂酶变体表达盒整合到黑曲霉糖化酶基因座以进行表达，使用糖化酶启动子和糖化酶终止子。构建溶血磷脂酶变体整合表达质粒p
‑
zyan02
‑
lppl
‑
t。整合质粒构建方法如下：将p
‑
zyan01质粒通过业界通用的方法进行线性化；以黑曲霉基因片段seq id no.7为5’端同源片段，以黑曲霉基因片段seq id no.8为3’端同源片段，每个片段长2000bp。将上述线性化的p
‑
zyan01载体、同源片段和溶血磷脂酶变体表达盒片段通过gibsonmaster mix kit(e2611，new england biolabs)进行重组，得到整合质粒p
‑
zyan02
‑
lppl
‑
t，该整合质粒包含溶血磷脂酶变体表达盒，该表达盒包含了黑曲霉糖化酶启动子序列，南极假丝酵母来源的溶血磷脂酶变体序列以及黑曲霉糖化酶终止子序列，经测序确认序列。
32.溶血磷脂酶变体表达盒的转化整合
33.本实施例出发菌株为zyan05，是由常规菌株经敲除糖化酶基因、真菌淀粉酶基因和酸性淀粉酶基因后获得的。黑曲霉中上述基因敲除/敲入方法可参考专利c n 103937766a或cn 104962594a实施例中公开的技术方法实现。即参照delmas(appl environ microbiol.2014,80(11):3484
‑
7)等人描述的方法。具体地，利用环状dna载体，包含有上述5’及3’同源序列，选择标记，以及大肠杆菌复制序列。将环状载体转入到黑曲霉中，通过选择获得重组菌株。
34.采用原生质体转化法将p
‑
zyan02
‑
lppl
‑
t质粒导入黑曲霉菌株zyan05，具体操作步骤如下：原生质体的制备：在营养丰富的tz液体培养基(牛肉膏粉0.8％；酵母浸膏0.2％；蛋白胨0.5％；nacl 0.2％；蔗糖3％；ph5.8)中培养黑曲霉菌丝体。通过mira
‑
cloth(lppl
‑
tiochem公司)从培养液中过滤菌丝体并用0.7m nacl(ph5.8)洗涤，菌丝体滤干后转移至含纤维素酶1％(sigma)、蜗牛酶1％(sigma)和溶壁酶(sigma)0.2％的酶解液(ph5.8)中，30℃，65rpm酶解3h。然后将含有原生质体的酶解液置于冰上并用四层擦镜纸过滤，得到的滤液经3000rpm，4℃温和离心10min后，弃上清；附着在管壁上的原生质体用stc溶液(1m dsorbitol、50mm cacl2、10mm tris，ph7.5)洗涤一次，最后把原生质体重悬于适量的stc溶液中。
35.将环状p
‑
zyan02
‑
lppl
‑
t质粒10μl(浓度为：100ng/μl)加入到100μl原生质体悬浮液中混匀后室温放置25min；然后分3次共加入900μl peg溶液，混匀后室温放置25min；3000rpm，常温离心10min，弃上清，原生质体附着于管壁上，将其重悬于1ml stc溶液中。把该悬浮液与预先降温至45℃左右的培养基(乙酰胺0.3％、蔗糖20％、琼脂0.7％)混合并铺平板；待平板凝固后放入34℃培养箱中培养；24h后在平板上再铺一层含300ng/μl潮霉素(hygromycin)的固体培养基(琼脂1％，其余成分同上)，继续将平板置于34℃培养箱中培养4
‑
5天后，长出上层培养基的转化子称为整合转化子。随机挑取几个整合转化子分别传代于含300ng/μl潮霉素(hygromycin)的固体培养基上，34℃恒温培养3天后，收集菌丝体用液氮冷冻后研磨粉碎，然后用真菌基因组提取试剂盒(杭州博日科技有限公司)提取整合转化子基因组dna，最后对整合转化子基因组dna进行pcr鉴定。pcr产物经测序后确认整合到糖化
酶基因座。阳性转化子经pcr产物测序后确认后得到重组表达菌株。
36.重组表达菌种液体发酵生产溶血磷脂酶变体
37.斜面培养：将所述黑曲霉重组表达菌株取一接种环菌苔接种于pda固体斜面，35℃下恒温培养60h；摇瓶培养：将斜面培养得到的菌株取一接种环菌苔接入种子培养基中，在初始ph5.5、35℃、摇床转速200rpm条件下培养110h左右。所述斜面培养基如下：蔗糖20g，nano3 2g，mgso4 0.5g，kcl 0.5g，feso4 0.01g，k2hpo4 1g，琼脂20g，将上述各组分溶于1000ml水中，调节ph至5.5,121℃灭菌20min，备用。所述摇瓶种子培养基如下：麦芽汁200ml，豆饼粉5g，调节ph至5.5,121℃灭菌20min，备用。
38.下表是250ml摇瓶2批次的发酵情况，以及于原始溶血磷脂酶发酵情况的对比。
39.表1：溶血磷脂酶原始序列及溶血磷脂酶变体序列在相同宿主及相同培养条件下的发酵产酶活情况对比
[0040][0041]
根据所述内容，本发明提供的溶血磷脂酶变体基因比溶血磷脂酶原始基因，分子比酶活提高了21.12％，发酵上清液的酶活提高了20.7％(图1)
[0042]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。