一株降解金霉素的蜡样芽孢杆菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物降解技术领域，具体涉及一株降解金霉素的蜡样芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.金霉素(chlortetracycline，ctc)是一种广谱抗菌活性的四环素类抗生素，具有预防、控制和治疗动物疾病及促进动物生长的作用，已广泛应用于世界各地的畜禽养殖行业。畜禽对金霉素的吸收利用率低，导致约有70
‑
90％的金霉素以排泄物的方式进入环境。金霉素是一种持久性化合物，在自然环境中的降解十分缓慢，不同的水生环境、土壤和沉积物中都已检测到了较高浓度的金霉素残留物。此外金霉素的毒性是其它兽用抗生素如磺胺二甲嘧啶毒性的数百倍。环境中抗生素的不断积累会诱导抗生素抗性细菌(arb)和抗生素抗性基因(arc) 的产生，可能对公众健康和生态系统造成潜在威胁。
3.众所周知，微生物降解是一种成本低廉、安全高效且环境友好的方法，其在处理抗生素等有机污染物的过程中发挥着至关重要的作用。通过国内外研究发现，目前所筛选出的对金霉素具有降解能力的工程菌种较少。中国专利号： cn 102604841a和专利号：cn 108949639 a分别报道了哈茨木霉菌(hypocrealixii)lj245和鲍氏不动杆菌(acinetobacter baumannii)f3用于降解金霉素，两株不同的菌株均可以金霉素为唯一碳源作为能源生长，其菌剂能够应用于受金霉素污染环境的生物修复。具现有文献报道，微生物降解金霉素等抗生素形成的大部分降解产物均具有一定的毒性，目前对蜡状芽孢杆菌降解金霉素及降解产物毒性的研究，国内外尚无研究报道。通过筛选出一株降解金霉素的降解工程菌，并将其制成微生物菌剂并应用于实际受金霉素污染的环境中，着对于降低由金霉素污染所引起的环境破坏、生态失衡和减少抗菌性产生等风险具有重要的现实意义。


技术实现要素：

4.本发明目的在于提供一株降解金霉素蜡样芽孢杆菌。
5.本发明的另一目的在于提供所述金霉素蜡样芽孢杆菌的应用。
6.本发明通过如下技术方案实现：
7.一株降解金霉素的蜡样芽孢杆菌，其特征在于：其名称为蜡样芽孢杆菌 (bacillus cereus)lz01，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址为中国武汉大学，保藏时间为2021年8月30日，保藏编号为cctcc no：m 20211099。
8.所述蜡样芽孢杆菌lz01是从牛粪中，通过富集、驯化和分离纯化得到。
9.菌株lz01在lb琼脂平板上生长时，形成白色圆形菌落，显微镜下可见短杆状，为革兰氏阳性菌。
10.上述蜡样芽孢杆菌lz01的应用，其特征在于：用于对金霉素的降解。
11.进一步，上述金霉素降解是在30℃、ph为7，金霉素浓度为50mg/l环境下进行降解。
12.具体的，上述蜡样芽孢杆菌lz01应用于养殖废水中金霉素的降解。
13.蜡样芽孢杆菌lz01的应用，用于降解金霉素降解菌剂的制备。
14.本发明具有如下技术效果：
15.本发明中的蜡样芽孢杆菌lz01，具有优异的降解金霉素的功能，以金霉素作为唯一碳源进行生长，在温度为30℃、ph为7，金霉素浓度为50mg/l的无机盐基础培养基中培养48h，金霉素去除率达到92.44％
±
1.36，金霉素的降解产物具有低毒性。蜡样芽孢杆菌lz01降解含有金霉素的养殖废水2d，废水中的金霉素去除率较对照组高了51.39％
±
1.41，本发明蜡样芽孢杆菌lz01为降解金霉素提供了重要的微生物菌种资源，可以作为金霉素降解菌剂的制备原料。
附图说明
16.图1：诱变得到的蜡样芽孢杆菌lz01的扫描电镜图。
17.图2：诱变得到的蜡样芽孢杆菌lz01的系统发育树图。
18.图3：诱变得到的蜡样芽孢杆菌lz01对金霉素的去除率随时间变化柱状图和od
600
值随时间变化曲线图。
19.图4：诱变得到的蜡样芽孢杆菌lz01降解金霉素的降解产物对于大肠杆菌的抑菌直径变化柱状图。
具体实施方式
20.下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
21.实施例1
22.菌株的筛选及鉴定：
23.(1)菌株分离：
24.在无菌条件下取10g牛粪原料加入100ml无菌水中，在30℃、120r/min 下振荡45min，静置后去上清液，并按照梯度倍数稀释，采用稀释涂布平板法将稀释度10
‑6～10
‑8的上清液转接至lb平板，每个稀释度作3次重复，在30℃培养箱中培养。待菌群长出以后，在lb平板上反复划线分离，在显微镜下观察确定为纯的单菌落。
25.(1)菌株富集驯化：
26.将分离的菌落加入到含有20mg/l金霉素的100ml无机盐基础培养基中，并置于摇床培养箱中，在30℃、180r/min下暗培养7d，然后取10ml富集培养物再次接种到含有金霉素浓度40mg/l的100ml无机盐基础培养基中，并在相同条件下培养。重复以上操作步骤，并逐渐增加培养基中金霉素浓度，每次都逐渐增加20mg/l，直到金霉素的浓度为160mg/l。
27.(2)平板划线分离纯化：
28.富集驯化结束后，将富集培养物分别稀释到10
‑
1 10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6、 10
‑7、10
‑8、10
‑9、10
‑
10
浓度，形成不同梯度的稀释液，分别取0.1ml稀释液分别涂布于含有150mg/l金霉素浓度lb固体平板上，在30℃培养7d。培养结束后，从平板上挑取菌落形态和颜色不一样的单菌落，在lb琼脂平板上连续划线纯化培养，得到优化的原始菌株。
29.(3)菌株的形态学和分子生物学鉴定：
30.上述优化的原始菌株在lb琼脂平板上生长时，形成白色圆形菌落，显微镜下可见杆状，为革兰氏阳性菌。提取细菌总dna，用16sr rna通用引物进行 pcr扩增后，进行测序、同源性比对和进化树分析，原始菌株的鉴定结果为蜡样芽孢杆菌。
31.实施例2：原始菌株的诱变和筛选
32.采用常压室温等离子体诱变(artp)，诱变步骤如下：
33.(1)将上述菌落加入无菌水，配制成包子悬浊液，然后稀释成10
‑7/ml的浓度，取细胞悬液10ul均匀涂布于artp载片(已灭菌)表面，进行诱变处理，采用诱变工作气体为氦气，气流量10s/m，功率100w，距离为4mm下进行照射90s，进行诱变，然后将载片转移至含有1ml生理盐水的离心管中，振荡1min 后，放置振荡培养箱中振荡培养1h。
34.(2)得到诱变后的菌悬液，将诱变后的菌悬液稀释至10
‑7/ml的浓度后，取100μl稀释液在pda平板中涂布，置于培养箱中培养。取培养至对数期的菌液1ml于1.5ml的离心管中，12000rpm，离心1min，弃上清，菌体用生理盐水重悬2次得细胞悬液，稀释调节细胞数在10
‑6‑
10
‑8个/ml的梯度，每个梯度涂布 3个平行。
35.(3)取100ul的稀释菌悬液进行lb平板涂布后，静置培养3
‑
7d。将lb 平板上生长较快速的突变菌株点样至含有金霉素浓度50mg/l金霉素浓度lb固体平板上，在30℃培养7d。培养结束后，从平板上挑取菌落形态和颜色不一样的单菌落，在lb琼脂平板上连续划线纯化培养，得到诱变处理后的蜡样芽孢杆菌lz01。
36.实施例3
37.诱变处理得到的蜡样芽孢杆菌lz01对金霉素的降解：
38.在原始菌株对金霉素的降解过程中发现，ph对于降解效率的影响较大。将诱变处理前的原始菌株在接种至lb液体培养基中，在30℃、180rpm下活化培养，当原始菌株生长至对数生长期后，以离心收集菌体，然后洗涤、离心，按 0.2％(w/v)的接种量原始菌株添加到含50mg/l金霉素中，不进行ph调节(此时降解体系的ph为弱酸性)，其12
‑
48h时，对金霉素的去除率呈快速上升趋势，由31.75％上升至55.21％。
39.将诱变处理得到的蜡样芽孢杆菌lz01接种至lb液体培养基中，在30℃、 180rpm下活化培养，当诱变处理得到的蜡样芽孢杆菌lz01生长至对数生长期后，以8000rpm的速率离心15min收集菌体，然后用灭菌的质量浓度为0.85％的生理盐水洗涤、离心，重复三次。按0.2％(w/v)的接种量将蜡样芽孢杆菌lz01 添加到含50mg/l金霉素的无机盐基础培养基中，调节培养基的ph值为7。在 30℃摇床中避光培养，以12h为间隔测量od
600
和金霉素浓度，以此分别体现蜡样芽孢杆菌lz01的生长情况和对金霉素的降解效果，每种处理重复三次。对金霉素的降解去除率及od
600
的变化如表1所示，将诱变处理前的原始菌株在相同条件下对金霉素进行降解处理，作为对照。
40.表1：蜡样芽孢杆菌lz01对金霉素的降解及od
600
变化
[0041][0042]
由表1可知，诱变处理得到的蜡样芽孢杆菌lz01从0
‑
48h，od
600
值从1.02
ꢀ±
0.06迅速增加到1.66
±
0.12，细菌处于对数生长阶段，同时诱变得到的蜡样芽孢杆菌lz01在48h内对溶液中金霉素有明显的降解作用，其降解率从61.69％
±
1.54急剧上升至92.44％
±
1.36。在48
‑
108h期间，由于培养基中营养成分已被耗尽，蜡样芽孢杆菌lz01生长缓慢，od
600
从1.66
±
0.12下降至0.12
±
0.14，导致对金霉素的降解作用提升幅度也变化较小。因此，在实际降解过程中，降解时间采用48h是比较合适的。可见，正向突变的蜡样芽孢杆菌lz01在30℃、 ph为7等相同条件下对于ctc的去除率较诱变处理前的原始菌株提高了 30.52％。研究菌株对金霉素的最优降解环境条件过程中发现温度、ph和金霉素浓度对于菌株去除金霉素的能力有显著的影响。诱变前的原始菌株在35℃、ph 为7.5、金霉素浓度为57mg/l时达到最优降解效果(48h时去除率达到80.39％
±
0.74)，而诱变处理后的蜡样芽孢杆菌lz01在30℃、ph为7、金霉素浓度为 50mg/l时为达到最优降解效果，对于ctc的去除率达到了92.44％。
[0043]
实施例4
[0044]
金霉素的降解产物的抑菌性：
[0045]
本研究利用抑菌圈法测量了诱变处理得到的蜡样芽孢杆菌lz01对金霉素进行生物降解后，其降解产物的抑菌活性。大肠杆菌细胞在lb液体培养基中活化至稳定期，将大肠杆菌作为工具菌制备病原菌平板，待培养基凝固后将牛津杯至于琼脂表面，分别加入200μl不同金霉素降解阶段的样品和不含细菌的对照样品。平板置于37℃恒温培养箱中培养24h，测量抑菌圈直径，每组样品重复3次。
[0046]
表2：金霉素降解产物对于大肠杆菌的抑菌活性
[0047][0048]
由表2可知金霉素的生物降解产物较母体化合物展现了较低的抑菌活性。从抑菌圈的直径可以看出生物降解组的抑菌能力随着降解时间的延长而下降，抑菌圈直径从初始
的43.9mm
±
0.5减小至7.4mm
±
0.1。在没有加降解菌的对照组中，抑菌圈直径由最初的44.0mm
±
0.2减小至15.1mm
±
0.2。说明诱变处理得到的蜡样芽孢杆菌lz01降解金霉素的降解产物表现出低毒性。先前的研究表明金霉素在历经光降解后，产生降解产物的毒性高于抗生素本身。因此，蜡样芽孢杆菌lz01在降低环境中金霉素的生物活性方面同光降解等物理方法相比展现出更多的优势。
[0049]
实施例5
[0050]
诱变处理得到的蜡样芽孢杆菌lz01对养殖废水中的金霉素去除：
[0051]
将诱变处理得到的蜡样芽孢杆菌lz01在lb培养基对进行活化培养，然后按照0.2％(w/v)的接种量加入含有金霉素的养殖废水中，并以不接种微生物的原废水作为对照，分别置于30℃，180r/min的摇床中培养2d，测定废水中金霉素的残留量。经测定，接种诱变处理得到的蜡样芽孢杆菌lz01对金霉素去除率比对照提高了51.39％
±
1.41。
[0052]
本发明中所有实施例中用到的无机盐基础培养基组成为：nacl 1.0g/l, k2hpo
4 0.5g/l,kh2po
4 1.5g/l,mgso4·
7h2o 0.2g；lb培养基组成为:胰蛋白胨10.0g/l,酵母浸粉5.0g/l，nacl 5.0g/l。将所有培养基在121℃高压灭菌30 min。