一株蓝莓灰霉病害的生防菌及其应用的制作方法

1.本发明属于植物病害的生物防治领域，具体涉及一株蓝莓灰霉病害的生防菌及其应用。


背景技术：

2.近年来，蓝莓凭借独特的口感和极高的营养、保健价值风靡全球水果市场，成为仅次于草莓的全球第二大浆果。我国蓝莓产业起步晚，但发展迅速，2020年我国蓝莓种植面积为6.64万公顷，产量达34.72万吨。
3.随着蓝莓种植面积的急剧增加和种植年限的增长，病害不断加重，逐渐成为制约蓝莓产业发展的因素。其中，蓝莓灰霉病在全国蓝莓产区相继发生，呈逐年加重态势，严重影响蓝莓果实的品质和产量，造成重大经济损失。
4.蓝莓灰霉病作为我国蓝莓生产上最重要的病害之一，其致病菌主要是灰葡萄孢菌 (botrytis cinerea)。该病原菌能够侵染蓝莓叶片、果柄和果实等部位，初期多从叶尖形成“v”形病斑，逐渐向叶内扩展，形成灰褐色病斑，后期病斑上着生灰色霉层，被感染的果实软化腐烂，风干后，果实干瘪、僵硬。
5.目前对蓝莓灰霉病的的主要防治手段还是以杀菌剂为主的化学农药，如腐霉利、甲基硫菌灵和啶酰菌胺等，但容易造成环境污染和病原菌抗药性水平上升。对于生产高品质高附加值的绿色乃至有机蓝莓产品来说，生物防治尤其是利用生防菌及其代谢产物防治病害，受到越来越多的关注和使用。但是目前尚无针对蓝莓灰霉病的生防菌的研究报道，市场上更没有相应的生防菌剂等产品。
6.解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)属于芽孢杆菌属的一种革兰氏阳性好氧菌，其是一种广泛存在于环境中的非致病性细菌，对人畜无毒害，其在代谢过程可产生多种丰富的抑菌活性物质，具有广泛的抑菌活性。
7.但是目前尚没有人研究和报道解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)对于蓝莓灰霉病是否具备防治作用。


技术实现要素：

8.发明目的：为解决现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一株蓝莓灰霉病生防菌菌株及其应用。本发明涉及的具有特异性抑制蓝莓灰霉病菌的解淀粉芽孢杆菌，该菌株生长速度快、营养简单、抗逆性强，其发酵液或发酵液滤液容易获得，具有应用潜力。
9.技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)，该菌株为解淀粉芽孢杆菌cnbg
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5，其于2020年06月02 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no. 20008，分类命名为淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
10.本发明内容还包括一种生防菌剂，所述生防菌剂含有所述的解淀粉芽孢杆菌 (bacillus amyloliquefaciens)。
11.其中，所述生防菌剂为解淀粉芽孢杆菌的发酵培养液或发酵液滤液。
12.本发明内容还包括所述的解淀粉芽孢杆菌或所述的生防菌在防治蓝莓灰霉病害中的应用。
13.其中，所述应用为将所述解淀粉芽孢杆菌进行发酵培养得到发酵液或其发酵液滤液，然后将发酵液或其发酵液滤液处理蓝莓果实表面，然后将蓝莓灰霉病菌孢子悬浮液喷雾接种蓝莓果实表面。
14.其中，所述解淀粉芽孢杆菌的发酵条件为：将菌株接种于nb液体培养基中，28～30℃、 160～220rpm振荡培养过夜，而后吸取菌液接种于nb液体培养基中，28～30℃、 160～220rpm振荡培养3～5d，获得发酵液。
15.其中，所述发酵液滤液是将发酵液进一步离心，得上清液，然后将上清液微孔滤膜过滤除杂得到发酵液滤液。
16.其中，所述蓝莓灰霉病菌孢子悬浮液中的蓝莓灰霉病菌孢子为0.5～1
×
106个/ml。
17.有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明菌株分离于蓝莓果实表面，能够附着蓝莓生长存活，有利于充分发挥菌株的优势。本发明属于生物防治，可避免环境污染和病原菌抗药性水平上升等问题。本发明解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株生长速度快，培养条件简单，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。本发明的生防菌对蓝莓灰霉病菌的抑制率为60.9％；其发酵液对蓝莓灰霉病害的防治效果为56.4％，发酵液滤液对蓝莓灰霉病害的防治效果为45.0％。
附图说明
18.图1为菌株cnbg
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5在nb培养基中的细菌形态图；
19.图2为菌株cnbg
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5在na培养基上的菌落形态图。
20.图3为菌株cnbg
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5的系统进化树。
21.图4为菌株cnbg
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5的生长曲线。
22.图5为菌株cnbg
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5对蓝莓灰霉病菌的生长抑制结果。
具体实施方式
23.下面将结合以大肠杆菌为宿主菌的实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
24.实施例1 cnbg
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5的分离、纯化及鉴定
25.取不同感病程度的蓝莓果实10～15个，分别用100ml无菌水在无菌条件清洗果实表面，清洗液混合后依次进行梯度稀释，吸取不同倍数的混合液100μl涂布于na培养基平板上，于30℃培养箱中培养，待长出菌落后，挑取单菌落在新的na平板上进行分区纯化，重复纯化直至单菌落出现。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对菌株进行形态学测定。
26.用灭菌的牙签挑取单菌落于nb培养基中，30℃、200rpm振荡培养过夜，然后用细菌基因组dna提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取细菌基因组dna，以 dna为模板，用引物27f和1492r分别进行16s rrna序列扩增。pcr扩增反应体系为50μl：25μl easytaq mix、2μl正向引物27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag
‑3’
)、 2μl反向引物1492r(5
’‑
ggttaccttgttacgactt
‑3’
)、1μl dna模板、1μl bsa、 19μl无菌水。扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s， 30个循环；72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳无误后，纯化送往公司测序。
27.nb培养基配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1l，ph7.2～7.5，121℃高温高压灭菌15min。na培养基配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉 15g，蒸馏水1l，ph7.2～7.5，121℃高温高压灭菌15min。
28.结果：
29.参见图1、2，获得的cnbg
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5菌株在nb液体培养基中30℃200rpm下培养 2天后，镜检下菌体细胞呈杆状，不成链，能运动；在na培养基平板上30℃培养2天后，菌落呈米黄色，不透明，圆形，扁平，边缘不整齐，有晕环，湿润有粘性。
30.对测序结果进行拼接处理，cnbg
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5 16s rdna近全长序列长为1412bp。将菌株的16s rrna基因序列在genbank数据库(ncbi)进行同源序列检索，结果显示，该菌株与解淀粉芽孢杆菌相似度达到了100％。同时，利用mega 7软件并采用最大可能性法(maximum likelihood methods)构建系统进化树，发现该菌株与多株解淀粉芽孢杆菌聚成一簇，可确定cnbg
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5很可能是解淀粉芽孢杆菌(图3)。将该菌株 cnbg
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5保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 cgmcc no.20008。
31.实施例2 cnbg
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5在nb培养基中96h内的生长曲线
32.cnbg
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5在na平板上划线培养2天后，挑取生长良好的单菌落接种于nb 液体培养基中活化，按5％接种量活化2代后，按5％接种量接入第4代nb液体培养基中，置于30℃下培养96h，从0h开始每隔0.5h测定菌液波长600nm处的od值(吸光值)，平行三次测定，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制生长曲线(图4)。
33.由图4可知，在0
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4h之间，cnbg
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5菌株处于对数生长阶段，快速增长至 od值为0.4左右；之后在4h
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9h cnbg
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5开始较快下降，在9h
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22h保持短期稳定，在22h
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49h开始呈缓慢增加趋势；在49h
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70h保持稳定，之后直到96h，菌株又呈缓慢增加趋势至od值接近0.6。说明本发明提供的菌株cnbg
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5生长速度快，稳定性好。
34.实施例3 cnbg
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5的固氮能力
35.cnbg
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5在na平板上划线培养2天后，挑取生长良好的单菌落接种在ashby 无氮固体培养基上，30℃恒温培养12d，持续观察平板上是否有菌落长出，并记录时间，以此来初步判断该菌株是否有自生固氮能力。
36.ashby无氮固体培养基配方：葡萄糖10g，磷酸二氢钾0.2g，七水硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，二水硫酸钙0.1g，碳酸钙5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。
37.经测试，直到9d后才能观察到cnbg
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5在ashby无氮固体平板上长出菌落，长势较弱，说明该菌株的自生固氮能力一般。
38.实施例4 cnbg
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5的解磷能力
39.(1)cnbg
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5的无机磷降解能力
40.cnbg
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5在na平板上划线培养2天后，挑取生长良好的单菌落接种于无机磷固体平板上，将平板置于30℃下恒温培养12d，观察菌落周围是否出现解磷圈。
41.无机磷固体培养基配方：葡萄糖10g，磷酸三钙5g，碳酸钙0.1g，硫酸镁0.5g，硫酸铵0.5g，硫酸钙0.1g，氯化高铁0.005g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。
42.经测试，菌株cnbg
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5在无机磷固体平板上生长较好，4d后能观察到微弱的解磷圈，说明该菌株具有较好的无机磷降解能力。
43.(2)cnbg
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5的有机磷降解能力
44.cnbg
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5在na平板上划线培养2天后，挑取生长良好的单菌落接种于有机磷固体平板上，将平板置于30℃下恒温培养12d，观察菌落周围是否出现解磷圈。
45.有机磷固体培养基配方：葡萄糖10g，卵磷脂5g，碳酸钙5g，硫酸镁0.5g，硫酸铵0.5g，硫酸钙0.1g，氯化高铁0.005g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。
46.经测试，直到12d也没能观察到菌株cnbg
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5在有机磷固体平板上长出菌落，说明该菌株没有有机磷降解能力。
47.实施例5 cnbg
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5对蓝莓灰霉病菌生长的抑制作用
48.采用平板对峙培养法，测定该菌株cnbg
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5对蓝莓灰霉病菌的抑制作用。cnbg
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5在na平板上划线培养2天后，挑取生长良好的单菌落接种于3ml nb 液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养过夜。于波长600nm下测定od值，根据比例浓缩重悬至od值为10备用。将蓝莓灰霉病菌活化，用无菌打孔器(5mm)打孔，用无菌接种针挑取病原菌琼脂块置于pda平板中央，吸取5μl上述制备好的菌液点在距离平板中心2.5cm处，以接种nb培养基作对照，25℃培养至病原菌长满整个平板，观察抑菌效果，计算抑菌率。
49.抑菌率(％)＝(rp
‑
rt)/rp
×
100％
50.其中，rp表示对照组菌丝生长半径，rt表示处理组菌丝生长半径(靠拮抗菌一侧)。
51.所述pda培养基具体配制方法：马铃薯浸粉3g，葡萄糖20g，琼脂15g，加入1000 ml去离子水，121℃高压蒸汽灭菌20min。
52.实验结果显示，如表1和图4，解淀粉芽孢杆菌cnbg
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5对蓝莓灰霉病菌有显著的抑制作用，抑制率为60.9％；但对草莓灰霉病菌抑制作用不明显，抑制率为29.5％。
53.表1 cnbg
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5对蓝莓/草莓灰霉病菌的抑制作用
[0054][0055]
实施例6 cnbg
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5发酵液及发酵液滤液对蓝莓灰霉病害的防治效果
[0056]
cnbg
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5在na平板上划线培养2天后，挑取生长良好的单菌落接种于2ml 的nb液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养过夜。而后吸取2ml菌液接种于200mlnb液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养3～5d至od
600
达到1.0，获得发酵液。取发酵液于50ml离心管中，12000rpm离心20min，得上清液，将上清液过滤(ψ＝0.22μm 的微孔滤膜)除杂得到发酵液
滤液，
‑
20℃保存备用。
[0057]
挑选大小一致的无病害的蓝莓果实，用2％次氯酸钠溶液浸泡2min，然后用去离子水多次冲洗以彻底除去次氯酸钠，自然条件下晾干置于塑料盒子中。用cnbg
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‑
5 发酵液饱和喷雾10ml一起处理16个蓝莓果实表面，将所有处理好的16个蓝莓果实放置于培养皿上，保鲜膜封口进行保湿，25℃培养。24h后将蓝莓灰霉病菌孢子悬浮液 (1
×
106个/ml)饱和喷雾(10ml)接种于16个蓝莓果实表面，继续25℃恒温培养。设置新鲜的nb液体培养基饱和喷雾处理蓝莓果实作为对照。按照以上同样的方法用 cnbg
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5发酵液滤液饱和喷雾10ml再一起处理另外的16个蓝莓果实表面后再接种蓝莓灰霉病菌孢子悬浮液(1
×
106个/ml)，同时设置新鲜的nb液体培养基饱和喷雾处理蓝莓果实作为对照。
[0058]
观察拍照并统计发病率、病情指数和防治效果。
[0059]
蓝莓灰霉病果实病害分级标准：
[0060]
0级，果实不发病，或无明显症状
[0061]
1级，果实表面仅出现单个坏死斑点；
[0062]
2级，果实表面出现一处明显坏死，呈凹陷状，部分果实表面可观察到菌丝；
[0063]
3级，果实表面出现较大面积或多处坏死，呈凹陷状，部分可观察到菌丝；
[0064]
4级，果实整体破裂，多处凹陷，部分果实表面覆盖菌丝。
[0065]
发病率＝接种发病数/总接种处理数
×
100％
[0066]
病情指数＝∑(各级病斑数
×
各级代表值)/(调查总数
×
最高病级代表值)
×
100
[0067]
防治效果＝(对照病情指数
‑
处理病情指数)/对照病情指数
×
100％
[0068]
菌株发酵液生物防治实验结果如下：
[0069]
表2 nb培养基及菌株发酵液处理后接种结果
[0070][0071]
结果显示，该菌株发酵液对蓝莓灰霉病害有显著的抑制作用(表3)，发病率降低了25％，防治效果为56.4％。
[0072]
表3 cnbg
‑
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5发酵液对蓝莓灰霉病害的抑制作用
[0073][0074]
菌株发酵液滤液生物防治实验结果如下：
[0075]
表4 nb培养基及菌株发酵液滤液处理后接种结果
[0076]
[0077]
结果显示，该菌株发酵液滤液对蓝莓灰霉病害有显著的抑制作用(表5)，发病率降低了12.5％，防治效果为45.0％。
[0078]
表5 cnbg
‑
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5发酵液滤液对蓝莓灰霉病害的抑制作用
[0079]