子宫内膜癌早期筛查诊断用标志物、引物探针及试剂盒的制作方法

技术特征：
1.子宫内膜癌早期筛查诊断用标志物，其特征在于，选自目标基因cdo1、celf4、hand2和hs3st2中每个基因中以下任意至少一段甲基化区域：cdo1基因：chr5:115816884
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115817037、chr5:115816018
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115816152、chr5:115815760
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115815872；celf4基因：chr18:37566573
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37566662、chr18:37565524
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37565639、chr18:37565036
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37565173；hand2基因：chr4:173530858
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173530953、chr4:173530225
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173530335、chr4:173528847
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173528958；hs3st2基因：chr16:22813813
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22813928、chr16:22814029
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22814146、chr16:22814452
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22814557。2.根据权利要求1所述子宫内膜癌早期筛查诊断用标志物，其特征在于，选自目标基因cdo1、celf4、hand2和hs3st2中每个基因中以下甲基化区域：cdo1基因：chr5:115815760
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115815872；celf4基因：chr18:37565524
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37565639；hand2基因：chr4:173528847
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173528958；hs3st2基因：chr16:22813813
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22813928。3.子宫内膜癌早期筛查诊断用检测引物，其特征在于，用于对应检测权利要求1中所述标志物基因甲基化区域的甲基化状态，所述引物设计采用卡环式结构，引物核苷酸序列的5’端增加一段5
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10bp长度的且与3’端互补配对的序列，这段序列不含cg位点，3’端的末端最后两个碱基为cg，引物双链结合区域tm值应与pcr反应体系中退火温度保持一致。4.根据权利要求3所述的子宫内膜癌早期筛查诊断用检测引物，其特征在于，所述检测引物的核苷酸序列如下所示：cdo1基因中：chr5:115816884
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115817037对应检测引物为seq id no:1～2，chr5:115816018
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115816152对应检测引物为seq id no:4～5，chr5:115815760
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115815872对应检测引物为seq id no:7～8；celf4基因中：chr18:37566573
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37566662对应检测引物为seq id no:10～11，chr18:37565524
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37565639对应检测引物为seq id no:13～14，chr18:37565036
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37565173对应检测引物为seq id no:16～17；hand2基因中：chr4:173530858
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173530953对应检测引物为seq id no:19～20，chr4:173530225
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173530335对应检测引物为seq id no:22～23，chr4:173528847
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173528958对应检测引物为seq id no:25～26；hs3st2基因中：chr16:22813813
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22813928对应检测引物为seq id no:28～29，chr16:22814029
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22814146对应检测引物为seq id no:31～32，chr16:22814452
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22814557对应检测引物为seq id no:34～35。5.子宫内膜癌早期筛查诊断用检测探针，其特征在于，用于对应检测权利要求1中所述
标志物基因，检测探针的核苷酸序列设计采用卡环式结构，核苷酸序列的5’端增加一段3
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6bp长度的且与靠近3’端末端3
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4bp区域进行互补配对的序列，这段序列不含cg位点，探针双链结合区域tm值应高于pcr反应体系中退火温度2～15℃，探针的核苷酸序列与标志物基因序列的结合自由能高于探针自身形成的卡环结构；检测探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，且同一检测体系中不同的标志物基因检测探针标记不同的荧光基团。6.根据权利要求5所述的子宫内膜癌早期筛查诊断用检测探针，其特征在于，检测探针的核苷酸序列如下所示：cdo1基因检测探针：seq id no:9；celf4基因检测探针：seq id no:15；hand2基因检测探针：seq id no:27；hs3st2基因检测探针：seq id no:30。7.子宫内膜癌早期筛查诊断用检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求3或4所述的检测引物，以及权利要求5或6所述的检测探针。8.根据权利要求7所述的子宫内膜癌早期筛查诊断用检测试剂盒，其特征在于，还包括内参基因检测引物和探针，所述内参基因为gapdh，内参基因检测引物的核苷酸序列如seq id no:37～38所示，内参基因检测探针的核苷酸序列如seq id no:39所示，内参基因检测探针的核苷酸序列5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，同一检测体系中内参基因检测探针标记的荧光基团与标志物基因检测探针标记的荧光基团不同。9.根据权利要求7所述的子宫内膜癌早期筛查诊断用检测试剂盒，其特征在于，还包括pcr反应液，和样本甲基化前处理试剂；所述样本为宫颈脱落细胞，所述样本甲基化前处理试剂包括细胞基因组dna提取试剂和dna重亚硫酸盐转化试剂。10.根据权利要求9所述的子宫内膜癌早期筛查诊断用检测试剂盒，其特征在于，pcr反应液每一人份由浓度1u/μl的甲基化特性的taq dna聚合酶0.5～1μl、浓度10mm的dntps 2～5μl、浓度2～5mm的mg
2
2～6μl、10
×
dna聚合酶buffer 5μl和纯化水补足15μl组成。

技术总结
本发明公开了子宫内膜癌早期筛查诊断用标志物、引物探针及试剂盒，所述标志物为CDO1、CELF4、HAND2和HS3ST2四个基因中的部分甲基化区域，针对这些甲基化区域设计了检测引物和探针，均为卡环式结构。试剂盒则包括前述引物和探针。本发明对多甲基化区域进行筛选组合，确定最为合适的甲基化位置用于联合诊断，能够显著提高对早期子宫内膜癌检测的灵敏度以及特异性。试剂盒特别适用于以宫颈脱落细胞作为样本进行子宫内膜癌早期筛查诊断，即使DNA模板浓度低也能检测出来，具有取样无创、检测速度快、更高的灵敏度特异性等优点，能够确保结果的准确性，以帮助实现子宫内膜癌的早发现、早诊断、早治疗的目的。早治疗的目的。早治疗的目的。


技术研发人员：熊驷骏
受保护的技术使用者：北京起源聚禾生物科技有限公司
技术研发日：2021.10.21
技术公布日：2021/12/6