胶冻样类芽孢杆菌、制备的胞外多糖及其在微生物絮凝剂制备中的应用的制作方法

1.本发明属于微生物多糖的制备，特别是指一种胶冻样类芽孢杆菌、制备 的胞外多糖及其在微生物絮凝剂制备中的应用。


背景技术：

2.絮凝是一种成本低廉、操作简易的固液分离技术，在水质治理、发酵收 获、杂质去除等领域应用广泛。随着现代社会发展与人口增长，絮凝的重要 性愈发显现：目前各种未经处理或者处理不当的废水排放量远超自然环境的 承载能力，例如水资源总量丰富的长江流域，除了水体自净能力强的长江干 流和大型水库，多数湖泊、小型水库、平原水网普遍存在水质性缺水问题， 据估算，58％的用水会以污染水的形式返回天然水域，导致水质难以改善，而 絮凝技术既可以用于生态环境和景观的原位保护修复，也可以用于饮用水厂 和污水厂的水质处理，去除沙砾、腐殖质和部分病原菌,或者是处理甘蔗工 业、畜牧业等来源的废水；基于絮凝对有机物、微生物细胞的聚集效果，微 藻发酵、单克隆抗体生产等工业同样有对絮凝的需求，用于解决限制微生物 培养与发酵工业的一个关键瓶颈——从液体培养基中收获产物的高昂成本； 絮凝技术也可以用于植物小分子的提取工艺，可以除去多糖、蛋白质等大分 子杂质。
3.微生物絮凝剂是通过微生物发酵技术生产的具有絮凝活性的天然高分子 聚合物，其主要存在形式为以多糖、蛋白质和核酸为主要成分的胞外聚合物， 具有安全性、生物可降解性等特点。
4.相比普通无机高分子絮凝剂，如聚丙烯酰胺以及其衍生物，微生物絮凝 剂具有生物相容性，不会导致二次污染，如致癌和神经毒性。以多糖为主要 成分的微生物絮凝剂具有高分子量的结构特性和各种功能基团，能吸附无机 物和有机物并使之去稳定、聚集沉降而实现固液分离，表现出杰出的絮凝活 性、除色能力，还普遍无毒无害且具备可生物降解性，故微生物絮凝剂被期 望成为人工聚合物絮凝剂的替代品，是新型绿色絮凝剂开发的热点方向。但 微生物絮凝剂存在着产量低、用量大、絮凝效能不高的特点。研究表明，多 糖中糖醛酸含量越高、分子量越大，其絮凝活性越高。
5.申请人检索的背景技术包括：
6.公开号为cn102952834的专利文献中公开的利用胶质类芽孢杆菌生产微 生物多糖发酵液的方法，其中发酵周期为60h，采用蒽酮比色法测定发酵液中 的多糖含量可达7.5g/l。未对多糖的结构进行检测。
7.公开号为cn102628065的专利文献中公开了一种微生物絮凝剂的生产方 法和应用，利用白地霉种子发酵3
‑
5天得到发酵液，发酵周期长，未对多糖 的结构进行检测，50ml岩溶水中需加0.1g微生物絮凝剂，微生物絮凝剂添加 量大。
8.申请人未在现有技术中发现与本技术相同或相近似的文献报道。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供一种胶冻样类芽孢杆菌。
10.本发明的目的之二在于提供利用胶冻样类芽孢杆菌制备的胞外多糖。
11.本发明的目的之三在于提供一种胞外多糖的制备方法。
12.本发明的目的之四是提供胞外多糖在微生物絮凝剂制备中的应用。
13.本发明的整体技术构思是：
14.胶冻样类芽孢杆菌，该菌种的拉丁文名称为paenibacillus mucilaginosus，保藏编号为cgmcc no.23105。
15.本发明中的菌种已于2021年8月2日提交位于北京市朝阳区北辰西路1 号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该保藏单 位的简称为cgmcc，保藏编号为cgmcc no.23105。建议分类命名为胶冻样类 芽孢杆菌paenibacillus mucilaginosus。
16.本发明中的菌种是由申请人自河北省衡水市衡水湖湿地采样分离纯化后 得到，芽胞椭圆形，孢子囊微膨大，接近中央。菌落圆形，透明凸起，粘稠。
17.本发明中的菌种的细胞形态及理化特征如下：
18.[0019][0020]
利用胶冻样类芽孢杆菌制备的胞外多糖，多糖的化学组成为甘露糖：葡 萄糖：半乳糖：葡萄糖醛酸的摩尔比＝2:1:2:1，该多糖的结构式如下：
[0021][0022]
其结构通式如下：
[0023]
→
{3)
‑
α
‑
d
‑
manp
‑
(1
→
3)
‑4‑
suc
‑
β
‑
d
‑
manp
‑
(1
→
3)
‑
β
‑
d
‑
glcp
‑
(1
→
4)
‑
β
‑
d
‑
glcpa
‑
(1
→
4)[4，6
‑
pyr
‑
β
‑
d
‑
galp
‑
(1
→
3)]
‑
β
‑
d
‑
galp
‑
(1
→
}
n
→
[0024]
其中n＝104‑
106，suc:琥珀酸基团，pyr:丙酮酸基团。
[0025]
胞外多糖的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0026]
a、将拉丁文名称为paenibacillusmucilaginosus，保藏编号为cgmccno.23105的胶冻样类芽孢杆菌接入活化培养基进行活化；
[0027]
b、将步骤a中活化后的菌种接种到含有碳源、氮源及营养元素的发酵培养基中在搅拌条件下培养制成发酵液；
[0028]
c、从步骤b制备的发酵液中收集胞外多糖。
[0029]
胞外多糖在微生物絮凝剂制备中的应用。
[0030]
本发明的具体及技术构思还有：
[0031]
本发明的菌种的16srrna基因序列如seqno.1。
[0032]
为便于实现工业化生产，优选的技术实现手段是，所述的步骤b是将步骤a中活化后的菌种接入种子培养基经扩大培养后制成种子液，将种子液按体积比为4％～10％的接种量接入发酵培养基中培养制成发酵液。
[0033]
为便于实现更好的活化效果，更为优选的技术实现手段是，步骤a中的活化是将拉丁文名称为paenibacillusmucilaginosus，保藏编号为cgmccno.23105的胶冻样类芽孢杆菌接种到活化培养基，在温度为28℃～40℃的条件下活化24～48小时。
[0034]
为便于实现对于培养终点的控制，优选的技术实现手段是，所述的种子液的制备是波长550nm的条件下，od值≥1.0时种子液培养终止。
[0035]
由于发酵过程中随着时间增长发酵液粘度越来越高，为保证发酵过程中的溶氧水平，以利于菌体生长以及终产物的合成，优选的技术实现手段是，步骤b中的培养条件是温度28℃～40℃，搅拌转速为100～300转/分钟，培养时间16～50小时。
[0036]
为便于实现对于培养过程中发酵终点的控制，优选的技术实现手段是，所述的步骤b中当发酵液的黏度≥500cp时发酵终止。
[0037]
为便于实现对发酵液中胞外多糖的提取，优选的技术实现手段是，步骤c中采用体积百分比浓度为80％～95％的乙醇溶液沉降发酵液中的胞外多糖，所述的乙醇溶液与
发酵液的体积比为2
‑
4。
[0038]
为便于实现菌种生长及终产物的合成，优选的技术实现方式是，所述的 步骤a、b中所用的培养基包括如下成分：
[0039]
蔗糖20克/升～50克/升；硝酸钾1克/升～2.5克/升；磷酸二氢钠1克 /升～2克/升；氯化钙0.01克/升～1克/升；七水硫酸镁0.1克/升～1克/ 升；七水合硫酸亚铁0.01克/升～0.05克/升；一水合硫酸锰0.001克/升～ 0.01克/升；氯化锌0.001克/升～0.01克/升；ph＝6～8。
[0040]
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
[0041]
1、本发明提供了一种胶冻样类芽孢杆菌，该菌种可以合成具有絮凝能力 的胞外多糖。
[0042]
2、本发明中的胞外多糖制备方法简单易行，发酵周期短且条件温和。
[0043]
3、本发明中的胞外多糖具有糖醛酸含量高、分子量大的优点，经申请人 试验达到同等絮凝效果(＞98％)需要的剂量和聚丙烯酰胺基本一致，对高岭 土悬浊液都是1ppm，对煤粉是0.5ppm至1ppm之间。具有较好的絮凝活力， 有效解决了现有产品絮凝活力低，絮凝剂用量大等技术问题。
附图说明
[0044]
图1是本发明中菌株的平板菌落显微照片。
[0045]
图2是本发明中胞外多糖组分测定的红外色谱图。
[0046]
图3是本发明中胞外多糖组分测定的液相色谱图。
[0047]
图4是本发明中胞外多糖的
13
c核磁共振谱。
[0048]
图5是煤粉悬浊液在不同时间的测试展示图。
[0049]
图6是本发明中菌种的16s rrna序列表。
[0050][0051]
本发明中的菌种已于2021年8月2日提交位于北京市朝阳区北辰西路1 号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该保藏单 位的简称为cgmcc，保藏编号为cgmcc no.23105。建议分类命名为胶冻样类 芽孢杆菌paenibacillus mucilaginosus。
[0052]
为对本发明中的胞外多糖的结构及絮凝活力进行验证，申请人进行了如 下实验：
[0053]
1、多糖絮凝剂结构分析
[0054]
(1)红外光谱检测
[0055]
采用的红外扫描仪器型号为nicoletis10(赛默飞世尔科技公司)。将压 制好的溴化钾空白片放入红外扫描仪样品仓的样品架上，确认采集参比背景 光谱，然后将待测样品放入光谱仪内，对样品进行扫描。样品每次用量为2～ 5mg，结果如图2所示：
[0056]
红外光谱结果显示，3000～3700cm
‑1的宽吸收峰属于多糖分子中各种环境 的羟基基团；2931cm
‑1的峰来自c
‑
h的拉伸和弯曲振动；1100～1200cm
‑1的峰 属于c
‑
o
‑
c连接，即多糖中的糖苷键。
[0057]
(2)高效液相色谱检测
[0058]
将利用本发明中菌种制备的胞外多糖floccuronic acid用三氟乙酸完全 酸水
解、pmp衍生化、氯仿萃取及取水相过滤后进行高效液相分析。图3为单糖组分测定的液相色谱图。由图3可知，利用本发明中菌种制备的胞外多糖floccuronicacid是一种酸性杂多糖，由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸以摩尔比为2:1:2:1组成。
[0059]
(3)核磁检测
[0060]
将利用本发明中菌种制备的胞外多糖floccuronicacid用三氟乙酸部分酸水解，用d2o配置成80mg/ml，使用tmsp作为内标进行nmr分析。多糖的一维核磁碳谱见图4。13cnmr中，δ102
‑
106ppm之间有6个异头碳信号和一个尖锐的信号，表明floccuronicacid有6个异头碳和1个丙酮酸基团。13cnmr中化学位移179.26ppm归位于葡萄糖醛酸的羧基碳原子，178.66ppm归位于丙酮酸基团的羧基碳原子，183.91ppm和178.52ppm归位于琥珀酰基团，琥珀酰基团另外2个碳原子分别在34.76ppm和33.26ppm出峰。
[0061]
结合以上分析，可以确认胶冻样类芽孢杆菌(paenibacillusmucilaginosus)cgmccno.23105生产的胞外多糖floccuronicacid的结构式如下：
[0062][0063]
其中n＝104‑
106，suc:琥珀酸基团，pyr:丙酮酸基团。
[0064]
2、多糖絮凝剂的絮凝活力测试(浊度移除率)
[0065]
目前对于絮凝能力的测试通常以高岭土悬浊液或者煤粉悬浊液作为模拟废水，而应用最广泛的无机絮凝剂聚丙烯酰胺作为对照组。
[0066]
配制100ml的煤灰悬浮液(质量浓度为4g/l)，加入一定量的絮凝剂进行絮凝实验，以不加絮凝剂的煤灰悬浊液为空白。磁力搅拌(快搅3分钟，慢搅1分钟，静置5分钟)，拍照记录现象，如图6，并测量吸光度的变化。以去离子水为参比，吸取液面下2cm处的液体，在550nm处测定空白和絮凝体系的吸光度计算絮凝活力。絮凝活力计算公式为:
[0067]
絮凝活力＝(a0－a1)/a0×
100％
[0068]
其中a0为空白煤灰悬浊液的吸光度，a1为实验组煤灰悬浊液的吸光度。其结果为0.5ppm、1ppm和2ppm的利用本发明中菌种制备的胞外多糖floccuronicacid分别达到89.3％、93.7％和91.2％的絮凝活力，如图5。
[0069]
3、絮凝剂用量
[0070]
通过实验对比，本发明中制备的胞外多糖达到同等絮凝效果(＞98％)需要的剂量和聚丙烯酰胺基本一致，对高岭土悬浊液都是1ppm，对煤粉是0.5ppm至1ppm之间。
具体实施方式
[0071]
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书所做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
[0072]
实施例1
[0073]
本实施例中胞外多糖的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0074]
a、将拉丁文名称为paenibacillusmucilaginosus，保藏编号为cgmccno.23105的胶冻样类芽孢杆菌接入活化培养基进行活化；
[0075]
b、将步骤a中活化后的菌种接种到含有碳源、氮源及营养元素的发酵培养基中在搅拌条件下培养制成发酵液；
[0076]
c、从步骤b制备的发酵液中收集胞外多糖。
[0077]
胞外多糖在微生物絮凝剂制备中的应用。
[0078]
本实施例中的菌种的16srrna基因序列如seqno.1。
[0079]
所述的步骤b是将步骤a中活化后的菌种接入种子培养基经扩大培养后制成种子液，将种子液按体积比为4％的接种量接入发酵培养基中培养制成发酵液。
[0080]
步骤a中的活化是将拉丁文名称为paenibacillusmucilaginosus，保藏编号为cgmccno.23105的胶冻样类芽孢杆菌接种到活化培养基，在温度为28℃的条件下活化24小时。
[0081]
所述的种子液的制备是波长550nm的条件下，od值≥1.0时种子液培养终止。
[0082]
步骤b中的培养条件是温度28℃，搅拌转速为100转/分钟，培养时间16小时。
[0083]
所述的步骤b中当发酵液的黏度≥500cp时发酵终止。
[0084]
步骤c中采用体积百分比浓度为80％的乙醇溶液沉降发酵液中的胞外多糖，所述的乙醇溶液与发酵液的体积比为2。
[0085]
所述的步骤a、b中所用的培养基包括如下成分：
[0086]
蔗糖20克/升；硝酸钾1克/升；磷酸二氢钠1克/升；氯化钙0.01克/升；七水硫酸镁0.1克/升；七水合硫酸亚铁0.01克/升；一水合硫酸锰0.001克/升；氯化锌0.001克/升；ph＝6～8。
[0087]
实施例2
[0088]
本实施例与实施例1的区别在于：
[0089]
胞外多糖的制备方法中的步骤b是将步骤a中活化后的菌种接入种子培养基经扩大培养后制成种子液，将种子液按体积比为10％的接种量接入发酵培养基中培养制成发酵液。
[0090]
步骤a中的活化是将拉丁文名称为paenibacillusmucilaginosus，保藏编号为cgmccno.23105的胶冻样类芽孢杆菌接种到活化培养基，在温度为40℃的条件下活化48小时。
[0091]
步骤b中的培养条件是温度40℃，搅拌转速为300转/分钟，培养时间50小时。
[0092]
步骤c中采用体积百分比浓度为95％的乙醇溶液沉降发酵液中的胞外多糖，所述的乙醇溶液与发酵液的体积比为4。
[0093]
所述的步骤a、b中所用的培养基包括如下成分：
[0094]
蔗糖50克/升；硝酸钾2.5克/升；磷酸二氢钠2克/升；氯化钙1克/升； 七水硫酸镁1克/升；七水合硫酸亚铁0.05克/升；一水合硫酸锰0.01克/升； 氯化锌0.01克/升；ph＝6～8。
[0095]
其余内容与实施例1相同。
[0096]
实施例3
[0097]
本实施例与实施例1的区别在于：
[0098]
胞外多糖的制备方法中的步骤b是将步骤a中活化后的菌种接入种子培 养基经扩大培养后制成种子液，将种子液按体积比为7％的接种量接入发酵 培养基中培养制成发酵液。
[0099]
步骤a中的活化是将拉丁文名称为paenibacillus mucilaginosus，保 藏编号为cgmcc no.23105的胶冻样类芽孢杆菌接种到活化培养基，在温度 为34℃的条件下活化36小时。
[0100]
步骤b中的培养条件是温度34℃，搅拌转速为200转/分钟，培养时间 33小时。
[0101]
步骤c中采用体积百分比浓度为88％的乙醇溶液沉降发酵液中的胞外多 糖，所述的乙醇溶液与发酵液的体积比为3。
[0102]
所述的步骤a、b中所用的培养基包括如下成分：
[0103]
蔗糖35克/升；硝酸钾1.7克/升；磷酸二氢钠1.5克/升；氯化钙0.5 克/升；七水硫酸镁0.55克/升；七水合硫酸亚铁0.03克/升；一水合硫酸锰 0.005克/升；氯化锌0.005克/升；ph＝6～8。
[0104]
其余内容与实施例1相同。
[0105]
实施例4
[0106]
本实施例与实施例1的区别在于：
[0107]
胞外多糖的制备方法中的步骤b是将步骤a中活化后的菌种接入种子培 养基经扩大培养后制成种子液，将种子液按体积比为5％的接种量接入发酵 培养基中培养制成发酵液。
[0108]
步骤a中的活化是将拉丁文名称为paenibacillus mucilaginosus，保 藏编号为cgmcc no.23105的胶冻样类芽孢杆菌接种到活化培养基，在温度 为31℃的条件下活化30小时。
[0109]
步骤b中的培养条件是温度31℃，搅拌转速为150转/分钟，培养时间 25小时。
[0110]
步骤c中采用体积百分比浓度为80％～95％的乙醇溶液沉降发酵液中的 胞外多糖，所述的乙醇溶液与发酵液的体积比为2.5。
[0111]
所述的步骤a、b中所用的培养基包括如下成分：
[0112]
蔗糖25克/升；硝酸钾1.3克/升；磷酸二氢钠1.3克/升；氯化钙0.3 克/升；七水硫酸镁0.3克/升；七水合硫酸亚铁0.02克/升；一水合硫酸锰 0.003克/升；氯化锌0.003克/升；ph＝6～8。
[0113]
其余内容与实施例1相同。
[0114]
实施例5
[0115]
本实施例与实施例1的区别在于：
[0116]
胞外多糖的制备方法中的步骤b是将步骤a中活化后的菌种接入种子培 养基经扩
大培养后制成种子液，将种子液按体积比为9％的接种量接入发酵 培养基中培养制成发酵液。
[0117]
步骤a中的活化是将拉丁文名称为paenibacillus mucilaginosus，保 藏编号为cgmcc no.23105的胶冻样类芽孢杆菌接种到活化培养基，在温度 为38℃的条件下活化42小时。
[0118]
步骤b中的培养条件是温度38℃，搅拌转速为260转/分钟，培养时间 37小时。
[0119]
步骤c中采用体积百分比浓度为92％的乙醇溶液沉降发酵液中的胞外多 糖，所述的乙醇溶液与发酵液的体积比为3.5。
[0120]
所述的步骤a、b中所用的培养基包括如下成分：
[0121]
蔗糖40克/升；硝酸钾2.2克/升；磷酸二氢钠1.8克/升；氯化钙0.08 克/升；七水硫酸镁0.8克/升；七水合硫酸亚铁0.04克/升；一水合硫酸锰 0.008克/升；氯化锌0.008克/升；ph＝6～8。
[0122]
其余内容与实施例1相同。