一种用于昂丹司琼和托烷司琼代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用与流程

1.本发明涉及一种用于昂丹司琼和托烷司琼代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。


背景技术：

2.术后恶心呕吐(postoperative nausea and vomiting，pony)在住院手术患者中的发生率为20％，高危ponv患者发生率达80％。同时ponv还可以诱发相关并发症，包括脱水、电解质混乱、切口裂开、出血、吸人性肺炎等。昂丹司琼、托烷司琼为高度选择性的5
‑
羟色胺受体拮抗剂，用于防治术后、化疗及放疗引起的恶心呕吐，然而其在部分患者中疗效不理想。
3.cyp2d6是昂丹司琼的主要药物代谢酶之一，是cyp酶家族重要的成员之一，虽然它只占肝脏酶总量的2％、9％，却参与20％、30％药物的代谢，包括抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药、镇痛药等。cyp2d6基因有9个外显子，8个内含子，共编码497种氨基酸。目前发现cyp2d6约有80个突变位点，基因突变可引起酶活性和数量的差异，从而导致药物代谢个体差异的产生。cyp2d6的代谢表型可分为超快代谢型(ums)、快代谢型(ems)、中等代谢型(ims)、慢代谢型(pms)。cyp2d6基因多态性会对药物的疗效产生影响，导致药物相互作用甚至毒副作用的产生。携带有cyp2d6代谢增强等位基因的患者，会更快速地代谢药物，使血药浓度下降过快而不能达到理想的治疗效果。携带有cyp2d6代谢能力减慢基因的患者，药物在体内的代谢速度减慢，从而使药物发生蓄积，发生毒性反应的概率变大。对于一些需要通过cyp2d6进行转化的前药，在缺乏cyp2d6基因的人群中会使药物的疗效降低。
4.研究发现止吐药药效与cyp2d6表型呈高度的相关性，如果是um型患者服用5
‑
ht3受体拮抗药，就会使药物血药浓度降低，影响昂丹司琼、托烷司琼等药物的疗效。因此，探讨cyp2d6的基因多态性，对指导临床合理用药和个体化用药具有重要的意义。临床药物基因组学实施联盟(cpic)发布了cyp2d6基因型与昂丹司琼和托烷司琼的应用指南，5羟色胺3(5
‑
ht3)受体拮抗剂主要用于预防放化疗相关以及术后恶心呕吐。cyp2d6多态性影响这些药物的代谢。针对cyp2d6基因型检测的临床应用提供相关信息进而指导5
‑
ht3受体拮抗剂
‑
昂丹司琼和托烷司琼的临床应用。
5.目前，对于基因多态性检测的方法主要有直接测序法、芯片法、高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性扩增法、taqman荧光探针法等。其中，测序法和芯片法，操作步骤繁琐，检测周期长，且扩增产物容易产生污染；高分辨率熔解曲线法步骤简单，特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法采用arms引物进行特异扩增，其引物设计难以最优化，检测条件要求严格。taqman荧光探针法其试验成本高，对于多个基因的扩增通量不高。因此，需要建立一种简单、快速有效、价格低廉的检测基因多态性的方法。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种用于昂丹司琼和托烷司琼代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用。
7.为实现上述发明目的之一，本发明采用的用于昂丹司琼和托烷司琼代谢标志物的检测试剂盒的技术方案如下：
8.本发明的快速反应试剂盒针对cyp2d6(c100t)、cyp2d6(g1846a)、cyp2d6*5三个基因的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：扩增反应液、cyp2d6(c100t)测序引物、cyp2d6(g1846a)测序引物、cyp2d6*5测序引物、阳性对照。
9.优选地，所述设计特异性引物，如下表所示：
[0010][0011][0012]
优选的，所述cyp2d6(c100t)的特异性引物组序列如序列表seq id no:1～seq id no:2所示；所述cyp2d6(g1846a)的特异性引物组序列如序列表seq id no:3～seq id no:4所示；cyp2d6*5的特异性引物组序列如序列表seq id no:5～seq id no:6所示。
[0013]
优选的，所述的cyp2d6(c100t)测序引物、cyp2d6(g1846a)测序引物、cyp2d6*5测序引物分别如序列表seq id no:7～seq id no:9所示。
[0014]
更优选的，所述的测序引物，为核酸类似物，其骨架为肽键而非磷酸二酯键，肽键骨架连有相应的碱基。该结构具有生物学性质稳定，无论蛋白酶还是核酸酶都不易将其降解。与dna结合较dna/dna的结合更为稳定。
[0015]
优选的，cyp2d6(c100t)测序引物对应的测序区域为cyp2d6(c100t)待检序列，如序列表seq id no:10所示；cyp2d6(g1846a)测序引物对应的测序区域为cyp2d6(g1846a)待检序列，如序列表seq id no:11所示。cyp2d6*5测序引物对应的测序区域为cyp2d6*5待检序列，如序列表seq id no:12所示。
[0016]
优选的，cyp2d6(c100t)、cyp2d6(g1846a)和cyp2d6*5共用一个分配指令如序列表seq id no:9所示。
[0017]
优选的，所述的扩增反应液，包括，cyp2d6(c100t)、cyp2d6(g1846a)、cyp2d6*5特异性扩增引物，还包括血液样品直接pcr预混液(2
×
)、海藻糖；
[0018]
更优选的，反应液各组分浓度分别为cyp2d6(c100t)前引物(0.2um)，cyp2d6(c100t)后引物(0.2um)，cyp2d6(g1846a)前引物(0.25um)，cyp2d6(g1846a)后引物(0.25um)，cyp2d6*5前引物(0.25um)，cyp2d6*5后引物(0.25um)pcr预混液(1
×
)，海藻糖(0.2％)。
[0019]
优选的，所述的pcr预混液为blood direct pcr master mix(2x)，含有耐血的hemotaq
tm dna聚合酶，对全血中血红素等各种pcr抑制剂表现出超强的抗性。
[0020]
优选的，为获得最高的检测灵敏度，20μl的pcr扩增体系中最大加入的血液量可以达到4μl，即20％体积。
[0021]
优选的，所述的阳性对照，包括浓度为20ng/ul cyp2d6*1*10的型基因组dna，对未知样本的型别判定提供参考，同时对反应液的有效性进行质控。
[0022]
优选的，所述的反应体积为20ul，反应条件为：预变性温度设为95℃，预变性时间设为5min，变性温度设为95℃，变性时间设为0s，退火延伸温度设为58℃，退火延伸时间设为0s，扩增35个循环。
[0023]
优选的，扩增所采用的pcr管密封薄膜，在pcr反应孔处具有与加热柱匹配的凹陷设计，其厚度为85μm，贴合度高，热传递快。更优选的，pcr管密封薄膜具穿透性，可用移液器枪头或探针穿透进行产物回收。
[0024]
本发明还公开了一种采用上述试剂盒的昂丹司琼、托烷司琼药效及不良反应预测相关的基因多态性检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0025]
a.将所述扩增反应液与4ul待测edta抗凝全血混合均匀进行pcr扩增；
[0026]
b.将含链霉亲和素标记微珠的结合液与扩增产物进行混合；
[0027]
c.加入洗涤缓冲液漂洗；
[0028]
d.变性液处理得到单链产物；
[0029]
e.加入洗涤缓冲液漂洗；
[0030]
f.向每个测序管中加入测序酶和测序底物；
[0031]
g.取一个8排管，自圆滑一端向平端依次加入datp、dttp、dgtp、dctp、cyp2d6(c100t)测序引物、cyp2d6(g1846a)测序引物、cyp2d6*5测序引物、ddatp、ddttp；将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部；
[0032]
h.焦磷酸测序；
[0033]
i.确定cyp2d6的基因型。
[0034]
本发明还公开了一种用于昂丹司琼、托烷司琼药效及不良反应预测试剂盒及方法的应用，所述检测试剂盒及检测方法对cyp2d6(c100t)、cyp2d6(g1846a)、cyp2d6*5进行检测，以从基因层面进行昂丹司琼、托烷司琼药效及不良反应预测。
[0035]
与现有技术相比，本发明的cyp2d6(c100t)、cyp2d6(g1846a)、cyp2d6*5的快速扩增方法主要从三方面进行了优化，一方面采用血液直扩的方式，免去核酸提取的步骤，只需将样品与其他pcr必须的组分加入反应管中混匀即可。另一方面通过将pcr仪加热模块设计
由加热底座和加热柱两部分组成，加热柱四周与底座相连中间与反应孔对应的，该加热模块在pcr扩增时伸入pcr反应管中，使反应液分散在加热柱和pcr管壁之间，从中间和四周同时变化温度，可以显著地提高热传递效率，降低了反应液各部分的温度变化差异，提高了反应液整体的温度一致性和变温速度，为pcr的快速扩增提供了另一关键要素。第三方面采用多重pcr扩增cyp2d6(c100t)、cyp2d6(g1846a)、cyp2d6*5三个位点，同时一次反应进行三个位点的焦磷酸测序。该测序首先加cyp2d6(c100t)测序引物与测序原料进行焦磷酸测序，最后一个碱基加入ddttp终止该测序反应；再加入cyp2d6(g1846a)测序引物和相应的dntp进行测序最后一个碱基加入ddatp终止该测序反应；再加入cyp2d6*5测序引物和相应的dntp进行测序。一次处理三个位点的测序，减少了操作的时间和提高了测序的通量。
[0036]
本发明以血液直扩、快速扩增和优化焦磷酸测序技术为组合对昂丹司琼、托烷司琼药效及不良反应预测相关的基因多态性进行检测，为昂丹司琼、托烷司琼临床使用给出基因角度的建议。
附图说明
[0037]
图1是本发明提供的pcr反应管的结构示意图；
[0038]
图2是本发明提供的引物设计原理图；
[0039]
图3是本发明提供的cyp2d6*1*10型测序结果示例图；
[0040]
图4是本发明提供的cyp2d6*1*4型测序结果示例图；
[0041]
图5是本发明提供的cyp2d6*1*5型测序结果示例图；
[0042]
图6是本发明提供的cyp2d6*10*10型测序结果示例图；
[0043]
图7是本发明提供的cyp2d6*1*1型测序结果示例图。
具体实施方式
[0044]
下面结合实施例对本发明提供的用于昂丹司琼和托烷司琼代谢标志物的检测试剂盒及其检测方法和应用作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0045]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
[0046]
实施例1、试剂盒的制备
[0047]
本发明的快速反应试剂盒针对cyp2d6(c100t)、cyp2d6(g1846a)、cyp2d6*5设计了特异性扩增引物和测序引物，用于扩增和焦磷酸测序检测。基于快速扩增技术设计引物是本发明的关键之一。基因多态性序列以genebank内的公开序列为准。
[0048]
(一)本实施例的引物序列如下：
[0049]
[0050][0051]
cyp2d6*5的拷贝数检测检测片段位于cyp2d6基因9号外显子，通过与cyp2d6、cyp2d8相同但与cyp2d7不同得序列，同时将cyp2d6与cyp2d8基因相关片段进行扩增，而后将pcr扩增产物用于焦磷酸测序。由于cyp2d8只存在着2个拷贝，因此可以将cyp2d8基因与cyp2d6基因所测序列中同一位置处不同碱基的峰高比值作比较。得到9号外显子的拷贝数。由于cyp2d6*5和9号外显子为缺失，cyp2d6*5不能进行扩增，不显示拷贝数。引物设计原理见图2所示。
[0052]
(二)本实施例的检测试剂盒包括如下组分：
[0053][0054]
(三)本实施例的检测试剂盒pcr反应液单人份配置体系如下：
[0055]
pcr反应液各组分浓度分别为：cyp2d6(c100t)前引物(0.2um)，cyp2d6(c100t)后引物(0.2um)，cyp2d6(g1846a)前引物(0.25um)，cyp2d6(g1846a)后引物(0.25um)，cyp2d6*5前引物(0.25um)，cyp2d6*5后引物(0.25um)，pcr预混液(1
×
)，海藻糖(0.2％)；其中easy
‑
load
tm blood direct pcr master mix(2x)购自上海钰博生物科技有限公司。
[0056]
[0057][0058]
配置完成后215ul/管进行分装。
[0059]
实施例2、焦磷酸检测
[0060]
本发明中采用的仪器如下：扩增仪、焦磷酸测序仪(武汉菲思特生物科技有限公司)。
[0061]
(1)试剂准备(试剂准备室)
[0062]
提前将试剂取出，并将pcr反应液涡旋振荡15秒，低速离心待用。确定反应数n，n＝待检样本数(n) 质控品数(1) 空白对照。建议每次pcr实验同时进行阳性对照、空白对照分析。然后将反应液按16μl/管分装至pcr反应管中。
[0063]
(2)加样检测(样本制备间)
[0064]
将edta抗凝全血、阳性对照和空白对照按4μl加样量加入到pcr反应管中，盖紧管盖，低速离心15秒将管壁上的液体全部甩至管底，然后立即进行pcr扩增反应。
[0065]
(3)pcr扩增(扩增间)
[0066]
采用pcr仪进行扩增，反应体系为20μl，扩增条件：
[0067][0068]
(4)焦磷酸测序
[0069]
1)在pcr反应管中加入结合液40μl和琼脂糖凝胶颗粒3ul，再向其中加入pcr产物10μl，置于台式振荡器上，1100rpm振荡10min，使微珠和pcr产物充分结合；
[0070]
2)7,000
×
g离心1min，弃上清；
[0071]
3)加入22ul稀释后的变性液工作液，静置5min，7,000
×
g离心1min，ep管收集得到单链产物；
[0072]
4)向ep管中加入150ul洗涤缓冲液，7,000
×
g离心1min；
[0073]
5)将ep管中的单链产物转移至测序管中，向每个测序管中加入3ul测序酶和3ul测
序底物；
[0074]
6)取一个8排管，自圆滑一端向平端依次加入datp、dttp、dgtp、dctp、cyp2d6(c100t)测序引物、cyp2d6(g1846a)测序引物、cyp2d6*5测序引物、ddatp、ddttp；将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部；扩增所采用的pcr管密封薄膜，在pcr反应孔处具有与加热柱匹配的凹陷设计，其厚度为85μm，贴合度高，热传递快。更优选的，pcr管密封薄膜具穿透性，可用移液器枪头或探针穿透进行产物回收。pcr反应管的结构示意图见图1所示；
[0075]
7)焦磷酸测序；检测结果如图3～7所示。
[0076]
(5)结果判读
[0077]
1)有效性判定：
[0078]
本试剂盒空白对照品的不通过，阳性对照品检出结果为cyp2d6*1/*10型。
[0079]
2)结果判定标准
[0080]
a.cyp2d6(c100t)的dna测序峰值图中，
[0081]
cc的频率≧90％，t的频率≦10％，即为cc型；
[0082]
40％≦c的频率≦60％，40％≦t的频率≦60％，即为ct型；
[0083]
t的频率≧90％，c的频率≦10％，即为tt型；
[0084]
b.cyp2d6(g1846a)的dna测序峰值图中，
[0085]
g的频率≧90％，a的频率≦10％，即为gg型；
[0086]
40％≦g的频率≦60％，40％≦a的频率≦60％，即为ag型；
[0087]
a的频率≧90％，g的频率≦10％，即为aa型
[0088]
c.cyp2d6*5的dna测序峰值图中，
[0089]
g的频率≧90％，a的频率≦10％，即为gg型；
[0090]
40％≦g的频率≦60％，40％≦a的频率≦60％，即为ag型；
[0091]
a的频率≧90％，g的频率≦10％，即为aa型
[0092]
(6)基因检测结果与代谢活性的相关性
[0093][0094]
[0095]
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
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