一种用于枯草芽孢杆菌产抑菌物质的培养基及其优化方法与流程

1.本发明涉及生物发酵领域，更具体地涉及一种用于枯草芽孢杆菌产抑菌物质的培养基及其优化方法。


背景技术：

2.国际益生菌和益生元科学协会(isapp)将益生菌定义为当适量施用时，可以给宿主健康带来益处的活体微生物。常见的益生菌有芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌等。抑菌脂肽在益生菌中普遍存在，其成分通常涉及大型的多酶复合物，常见的抑菌脂肽有伊枯草菌素(iturins)、丰原素(fengycins)和表面活性素(surfactins)，将可以生产这些抑菌脂肽的益生菌作为生物防治剂应用于牲畜的饲料中，既可以维持和改善动物的生长和生产力，预防和控制肠道病原体，又可以降低抗生素滥用带来的生态和安全问题。
3.土壤中分离得到的枯草芽孢杆菌k12对溶藻弧菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌等常见致病菌表现出良好的抑制作用，同时也对真菌(比如白色念珠菌，根瘤菌，曲霉菌)生长表现出抑制作用。lc
‑
esi
‑
ms/ms鉴定分析，这三种抑菌活性成分是三族脂肽，分别为surfactins，itulins和fengycins。因此该菌株具有明显的抗菌活性和益生菌特性。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种用于枯草芽孢杆菌产抑菌物质的培养基及其优化方法，从而解决现有培养基培养的枯草芽孢杆菌抑菌脂肽活性较低的问题。
5.为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
6.根据本发明的第一方面，提供一种用于枯草芽孢杆菌产抑菌物质的培养基的优化方法，包括以下步骤：1)抑菌实验指示菌培养；2)通过对碳源种类、碳氮比、金属离子的浓度进行调整，配制不同发酵培养基；3)向所述发酵培养基中接入枯草芽孢杆菌，培养菌体获得发酵液；4)将发酵液离心后，收集上清液，制备无细胞的发酵液上清；5)通过测定所述发酵液上清的抑菌效果，分别筛选出最佳的碳源种类、碳氮比、金属离子的浓度，从而获得一种优化的用于枯草芽孢杆菌产抑菌物质的培养基。
7.所述步骤1)中采用金黄色葡萄球菌作为指示菌。
8.所述碳源种类包括：淀粉、葡萄糖、或淀粉与葡萄糖的混合物。
9.可选地，所述碳氮比在(3:1)～(1:3)之间调节。
10.所述金属离子包括fe
3
和mn
2
。
11.可选地，fe
3
在0～5mm之间调节。
12.可选地，mn
2
在0～0.025mm之间调节。
13.根据本发明的一个优选方案，该培养基的优化方法是以枯草芽孢杆菌k12发酵培养基为基础进行配方优化，该枯草芽孢杆菌k12发酵培养基的配方为：玉米浆干粉20g/l、葡萄糖10g/l、淀粉10g/l、酵母粉2g/l、(nh4)2so
4 2g/l、na2hpo
4 2g/l、k2hpo
4 2g/l、cacl
2 2g/
l、caco
3 1g/l、mgso
4 0.5g/l、kcl 0.5g/l、fecl
3 0.03g/l。
14.根据本发明的第二方面，提供一种用于枯草芽孢杆菌产抑菌物质的培养基，所述培养基的配方包括：30～60g/l葡萄糖、10～30g/l玉米浆干粉、1.8～2.0g/l酵母粉、1.8～2.0g/l(nh4)2so4、1.8～2.0g/l na2hpo4、1.8～2.0g/l k2hpo4、1.8～2.0g/l cacl2、0.9～1.0g/l caco3、0.4～0.5g/l mgso4、0.4～0.5g/l kcl、0～5.0mm fecl3、0～0.025mm mnso4。
15.优选地，所述培养基的配方包括：40～60g/l葡萄糖、20g/l玉米浆干粉、2.0g/l酵母粉、2.0g/l(nh4)2so4、2.0g/l na2hpo4、2.0g/l k2hpo4、2.0g/l cacl2、1.0g/l caco3、0.5g/l mgso4、0.5g/l kcl、1.0～5.0mm fecl3、0.005～0.025mm mnso4。
16.最优选地，所述培养基的配方包括：60g/l葡萄糖、20g/l玉米浆干粉、2.0g/l酵母粉、2.0g/l(nh4)2so4、2.0g/l na2hpo4、2.0g/l k2hpo4、2.0g/l cacl2、1.0g/l caco3、0.5g/l mgso4、0.5g/l kcl、1.0mm fecl3、0.005mm mnso4。
17.根据本发明提供的一种用于枯草芽孢杆菌产抑菌物质的培养基的优化方法，通过对发酵培养基的优化发现，碳源有利于菌体生长，最优选为60g/l葡萄糖，氮源根据碳源的比例添加，最优选为20g/l玉米浆干粉，金属离子主要包括fe
3
和mn
2
，其中最优选为1mm fecl3、0.005mm mnso4。
18.根据本发明提供的这样一种枯草芽孢杆菌产抑菌脂肽培养基的优化方法，该方法通过改善培养基组成既提高了菌体产量，同时使发酵液的抑菌效果得到大幅提高，最高甚至可相对原培养基发酵液的抑菌效果提高84.0％，最终获得一种最优化的枯草芽孢杆菌产抑菌脂肽的培养基。因此，本发明对于益生菌的工业发展具有重要的参考价值。
附图说明
19.图1为碳源种类对枯草芽孢杆菌k12生长的影响；
20.图2为碳源种类对抑菌效果的影响；
21.图3为碳氮比对枯草芽孢杆菌k12生长的影响；
22.图4为碳氮比对抑菌效果的影响；
23.图5为fe
3
对枯草芽孢杆菌k12生长的影响；
24.图6为fe
3
比对抑菌效果的影响；
25.图7为mn
2
对枯草芽孢杆菌k12生长的影响；
26.图8为mn
2
比对抑菌效果的影响。
具体实施方式
27.以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
28.实施例1：培养基
29.1.1lb培养基
30.蛋白胨10.0g/l、酵母粉5.0g/l、nacl 10.0g/l，ph 7.0；121℃灭菌20min。
31.1.2lb固体培养基
32.蛋白胨10.0g/l、酵母粉5.0g/l、nacl 10.0g/l、琼脂20g/l，用naoh调至ph 7.0，
121℃灭菌20min。
33.1.3枯草芽孢杆菌k12发酵培养基
34.玉米浆干粉20g/l、葡萄糖10g/l、淀粉10g/l、酵母粉2g/l、(nh4)2so
4 2g/l、na2hpo
4 2g/l、k2hpo
4 2g/l、cacl
2 2g/l、caco
3 1g/l、mgso
4 0.5g/l、kcl 0.5g/l、fecl
3 0.03g/l，用naoh调至ph 7.0，115℃灭菌20min。fecl3用量极少，先配置高浓度的母液，单独灭菌后再加入配好的培养基中。淀粉不溶于水，淀粉酶(淀粉酶/淀粉＝1：100)加入到淀粉液中，加热到80℃并不断搅拌10min，消化至澄清，再加入到培养基中。
35.实施例2：抑菌实验指示菌的培养
36.以金黄色葡萄球菌(市售)作为指示菌，培养方法如下，先将
‑
20℃保存的甘油管菌种接种到装有5ml，lb培养基的试管中活化，待其长到od
600
＝6时以1％的接种量接种到装有40ml，lb培养基250ml锥形瓶中，并在37℃下于摇床中培养6h备用。
37.实施例3：枯草芽孢杆菌k12发酵培养基的优化
38.3.1碳源对枯草芽孢杆菌k12菌株的影响
39.将枯草芽孢杆菌k12发酵培养基(见实施例1)中的碳源(淀粉10g/l 葡萄糖10g/l)分别替换为20g/l葡萄糖或20g/l淀粉，其它成分不做改变，并以原发酵培养基作为对照，将培养基的初始ph调至7.0，200rpm摇瓶将枯草芽孢杆菌(保藏于本实验室，参考文献：曹龙奎，吴泽柱，盛艳.枯草芽孢杆菌生长培养基的优化.中国食品学报，2009，9(6)：104
‑
109.)培养32h，在不同时间点取样，用稀释涂布平板法测定菌体浓度，用管碟法测定抑菌效果，筛选最佳碳源。应当理解的是，市售的枯草芽孢杆菌均适用于本发明。
40.从图1和图2可知，无论是哪种碳源，培养24h后菌体浓度和抑菌效果均达到最佳。此时，培养基中以20g/l葡萄糖作为主要碳源时，发酵液的菌体浓度最高，从2.1
×
109cfu/ml(原培养基)提高到3.0
×
109cfu/ml，菌体生长提升了42.9％，抑菌圈直径从21.3mm(原培养基)提高到26.5mm，抑菌效果提升了24.4％。
41.3.2碳氮比对枯草芽孢杆菌k12菌株的影响
42.为筛选最佳碳氮比，保持氮源玉米浆干粉浓度为20g/l不变，添加不同浓度的葡萄糖。比如，碳氮比为3:1时，玉米浆干粉浓度为20g/l，葡萄糖为60g/l。将培养基的初始ph调至7.0，200rpm摇瓶培养32h，在不同时间点取样，用稀释涂布平板法测定菌体浓度，用管碟法测定抑菌效果。
43.从图3和图4中可知，在碳氮比为3:1的培养基中生长24h时，枯草芽孢杆菌k12的抑菌效果和菌体浓度均达到最高。菌体浓度从3.0
×
109cfu/ml(3.1培养基)提高到3.4
×
109cfu/ml，菌体生长提升了13.3％，抑菌圈直径从26.5mm(3.1培养基)提高到32.0mm，抑菌效果提升了20.7％。
44.3.3无机离子对枯草芽孢杆菌k12菌株的影响
45.在综合碳源种类和碳氮比优选结果的基础上，在培养基中添加不同浓度的fecl3和mnso4，研究铁离子和锰离子对枯草芽孢杆菌k12菌体生长和抑菌效果的影响。
46.从图5和图6中可知，在铁离子浓度为1mm的培养基中生长24h时，其抑菌效果和菌体浓度均达到最高。菌体浓度从3.4
×
109cfu/ml(3.2培养基)提高到3.6
×
109cfu/ml，菌体生长提升了5.9％；抑菌圈直径相较于3.2中的培养基从32.0mm提高到37.4mm，抑菌效果提升了16.9％。
47.锰离子的影响从图7和8可知，在添加0.005mm的锰离子时其抑菌效果和菌体浓度均达到最大，而且在此添加浓度下对菌体的生长促进作用不显著，但对抑菌效果的促进作用明显，说明添加0.005mm的锰离子可以促进发酵液当中的抑菌物质的产生，抑菌圈直径从37.4mm进一步扩大到39.2mm，抑菌效果提升了4.8％。
48.针对枯草芽孢杆菌k12菌株的抑菌性能的提升进行了培养基优化，最终得到枯草芽孢杆菌k12的优化培养基配方为：60g/l葡萄糖、20g/l玉米浆干粉、2g/l酵母粉、2g/l(nh4)2so4、2g/l na2hpo4、2g/l k2hpo4、2g/l cacl2、1g/l caco3、0.5g/l mgso4、0.5g/l kcl、1mm fecl3、0.005mm mnso4。原培养基发酵液的抑菌圈直径为21.3mm，优化后可达39.2mm，抑菌效果提高84.0％。
49.实施例4：无细胞发酵液上清的制备
50.将活化的枯草芽孢杆菌菌液按1％(v/v)接种于发酵培养基中，在37℃摇床培养不同时间后使用高速冷冻离机(8000rpm，15min，4℃)离心，取上清液后再离心一次，使用0.22μm的滤膜过滤，将上清中的菌体全部去除，得到无细胞发酵液上清，测定各发酵液的ph，置于4℃保存备用。
51.实施例5：抑菌效果的测定方法
52.抑菌效果的测定采用管碟法。将各指示菌菌液培养到od600＝6.0备用。待营养琼脂培养基凝固后，吸取100μl指示菌悬液加入到冷却至60℃的装于250ml锥形瓶的30ml的固体培养基中充分摇匀并迅速倾倒于40ml的培养皿中，在超净工作台中冷却20min至完全凝固。在平整的固体培养基的表面放置若干牛津杯，静置5min，待其依靠自身重力下沉使其部分嵌入到培养基中。在牛津杯中加注200μl待测的无细胞发酵液上清，将培养皿置于各菌种的适宜温度的培养箱中培养12h，测定抑菌圈直径。每组均设定3组重复实验，用抑菌圈直径来评价各待测菌株的抑菌效果。
53.以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。