XXIII型胶原蛋白测定的制作方法

xxiii型胶原蛋白测定
技术领域
1.本发明涉及靶向xxiii型胶原蛋白的单克隆抗体，以及使用所述抗体的免疫测定和试剂盒。


背景技术：

2.克罗恩病(cd)和溃疡性结肠炎(uc)是炎性肠病(ibd)的两种主要胃肠道疾病，具有相似的症状，例如炎症反应加剧和肠道结构损伤。cd可影响整个胃肠道，而uc主要局限于结肠黏膜[1]。ibd的病因尚不完全清楚，但据信其具有遗传基础和免疫系统对环境因素的异常反应[2]。
[0003]
健康肠道的上皮被单层肠上皮细胞覆盖，该单层肠上皮细胞形成抵抗细菌和包括抗原和毒素在内的其他外来物质的保护屏障，并且仅对膳食营养素具有选择性渗透性[3,4]。上皮对于维持肠道健康很重要。然而，在cd和uc中，肠道通透性受损，导致大量细菌从肠腔侵入肠道组织，并增加免疫细胞从血流流入组织[5,6]，导致ibd患者的慢性胃肠道炎症[7]。肠上皮细胞之间的紧密联系主要由连接复合物调节，该连接复合物由紧密连接、粘附连接和桥粒组成[6]。许多研究表明，一些连接蛋白在ibd发炎的肠道组织中显著下调[8
‑
11]，这可能是ibd肠道通透性丧失的主要原因。
[0004]
xxiii型胶原蛋白是ii型跨膜蛋白的成员，由jacqueline banyard等人于2003年首次在大鼠转移性肿瘤细胞中发现[12]。在人非小细胞肺癌细胞系和透明细胞肾细胞癌细胞系中，发现xxiii型胶原蛋白与细胞粘附和转移有关[13,14]。在此类细胞系中敲除xxiii型胶原蛋白导致细胞粘附分子表达改变和细胞粘附受损[13,14]，这表明xxiii型胶原蛋白可能是细胞粘附的调节剂。xxiii型胶原蛋白不仅在癌细胞中表达。在胚胎小鼠肠切片染色中，发现xxiii型胶原蛋白在肠的上皮表面表达，表明它可能在细胞相互作用中起重要作用[15]。
[0005]
xxiii型胶原蛋白由短的胞质域、跨膜域和长的胞外域组成[12]。胞外域有几个胶原蛋白域，并被短的非胶原蛋白域截断[12]。新合成的xxiii型胶原蛋白可以作为跨膜蛋白运输到细胞表面，或被弗林蛋白酶在细胞内裂解，使胞外域释放到细胞外基质(ecm)[16]。然而，裂解的功能尚不清楚。研究表明，xxiii型在一系列癌症中上调[17
‑
19]，可用作前列腺癌[18]、非小细胞肺癌[17]和透明细胞肾细胞癌的潜在生物标志物[14]。
[0006]
然而，xxiii型胶原蛋白在其他疾病中作为生物标志物的用途尚未确定。
[0007]
us 7,993,863 b(zetter等人)描述了胶原蛋白样基因(clg)产物，其在人前列腺癌和乳腺癌细胞系中表达，但在正常成人、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾或胰腺组织中不表达。还描述了具有序列ldqpcpvgpdglpvpgcwhk(表示为seq id no.14)的c端非胶原蛋白区。作者指出，该序列与跨膜胶原蛋白xmii和xxv具有高度同一性，因此得出结论，它可能是不好的表位。
[0008]
有证据表明，与非活动性疾病相比，活动性ibd患者的肠道通透性增加[20]。连接/粘附蛋白，如e
‑
钙粘蛋白、β
‑
连环蛋白，在ibd患者的活动性炎症组织中显著下调[8]。因此，
评估肠道通透性的方法可用于评估疾病负担[5]。然而，只有少数非侵入性生物标志物可用。粪便钙卫蛋白是主要由中性粒细胞表达的蛋白质，是ibd中最有希望的生物标志物。它与内窥镜疾病活动相关[21]，可以预测复发[22]并监测对治疗的反应[23]。但粪便钙卫蛋白仅测量肠道炎症，而不是直接测量组织损伤，因为钙卫蛋白是主要发现于中性粒细胞中的小的钙结合蛋白。密封蛋白
‑
3(claudin
‑
3)是一种紧密连接蛋白，可以在尿液中测量，并可能反映紧密连接的丢失[24]。关于这种生物标志物的信息有限，需要在人体中进一步研究。因此，对于ibd肠道通透性评估的非侵入性生物标志物仍然存在巨大需求。


技术实现要素：

[0009]
由于xxiii型胶原蛋白在肠上皮层中表达，因此在ibd的上皮损伤期间，它可能会从细胞表面裂解。此外，由于xxiii型胶原蛋白在细胞粘附中起重要作用，其水平可以被调节并有助于ibd中的细胞粘附变化，因此可以用作生物标志物。
[0010]
本发明人开发了一种单克隆抗体，其特异性识别xxiii型胶原蛋白的胞外域，特别是α链的c端；以及免疫测定，具体是检测生物流体样品中xxiii型胶原蛋白的胞外域的酶联免疫吸附测定(elisa)。本发明人已确定xxiii型胶原蛋白可用作细胞粘附变化的生物标志物并为患有炎性肠病如克罗恩病(cd)和溃疡性结肠炎(uc)的患者提供新的诊断信息。
[0011]
因此，在第一方面，本发明涉及一种单克隆抗体，其特异性识别并结合xxiii型胶原蛋白α1链(本文也称为靶肽)的c端，该c端具有氨基酸序列glpvpgcwhk(seq id no.1)(本文也称为靶序列)。
[0012]
优选地，单克隆抗体是针对具有c端氨基酸序列glpvpgcwhk(seq id no.1)的合成肽而产生的单克隆抗体。用于产生抗体的合成肽可以是在其n端与载体蛋白连接的合成肽。示例性载体蛋白包括诸如但不限于钥孔虫戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,klh)的蛋白质。合成肽可以通过任何合适的键与载体蛋白连接，该键可以包括在肽的n
‑
端的一个或多个额外氨基酸残基。单克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的合适技术产生，例如但不限于，免疫小鼠或其他哺乳动物，从免疫的哺乳动物中分离脾细胞并将其与杂交瘤细胞融合，然后培养得到的杂交瘤细胞以使得单克隆生长。
[0013]
在优选的实施方式中，单克隆抗体不特异性识别或结合具有c端氨基酸序列glpvpgcwhkx(seq id no.2)的肽，其中x代表任何氨基酸。因此，单克隆抗体优选不特异性识别或结合其中靶氨基酸序列在c端延伸一个或多个氨基酸的靶肽的延长变体。
[0014]
在优选的实施方式中，单克隆抗体不特异性识别或结合具有c端氨基酸序列glpvpgcwh(seq id no.3)的肽。因此，单克隆抗体优选不特异性识别或结合其中靶氨基酸序列在c端被截短一个或多个氨基酸的靶肽的缩短变体。
[0015]
在优选的实施方式中，单克隆抗体不特异性识别或结合具有c端氨基酸序列glpvqgcwnk(seq id no.4)的肽。因此，单克隆抗体优选不特异性识别或结合来自xiii型胶原蛋白的肽。
[0016]
在优选的实施方式中，单克隆抗体不特异性识别或结合具有c端氨基酸序列glpmpgcwqk(seq id no.5)的肽。因此，单克隆抗体优选不特异性识别或结合来自xxv型胶原蛋白的肽。
[0017]
单克隆抗体或其片段可优选包含一个或多个选自以下的互补决定区(cdr)：
[0018]
cdr
‑
h1：syams(seq id no.6)
[0019]
cdr
‑
h2：sistagrtyypdtvr(seq id no.7)
[0020]
cdr
‑
h3：pdydydgyin(seq id no.8)
[0021]
cdr
‑
l1：rssksllhsngvtyly(seq id no.9)
[0022]
cdr
‑
l2：qmsnlas(seq id no.10)和
[0023]
cdr
‑
l3：aqnlelplt(seq id no.11)。
[0024]
优选地，抗体或其片段包含以上列出的cdr序列中的至少2、3、4、5或6个。
[0025]
优选地，单克隆抗体或其片段具有包含以下cdr序列的轻链可变区：
[0026]
cdr
‑
l1：rssksllhsngvtyly(seq id no.9)
[0027]
cdr
‑
l2：qmsnlas(seq id no.10)和
[0028]
cdr
‑
l3：aqnlelplt(seq id no.11)。
[0029]
优选地，单克隆抗体或其片段具有：在cdr之间包含框架序列的轻链，其中所述框架序列与以下轻链序列中的cdr之间的框架序列基本相同或基本相似(其中cdr以粗体加下划线显示，框架序列以斜体显示)：
[0030][0031]
优选地，单克隆抗体或其片段具有包含以下cdr序列的重链可变区：
[0032]
cdr
‑
h1：syams(seq id no.6)
[0033]
cdr
‑
h2：sistagrtyypdtvr(seq id no.7)
[0034]
cdr
‑
h3：pdydydgyin(seq id no.8)。
[0035]
优选地，单克隆抗体或其片段具有：在cdr之间包含框架序列的重链，其中所述框架序列与以下轻链序列中的cdr之间的框架序列基本相同或基本相似(其中cdr以粗体加下划线显示，框架序列以斜体显示)：
[0036][0037]
如本文所用，如果一种抗体的cdr之间的框架氨基酸序列与另一抗体的cdr之间的框架氨基酸序列具有至少70％、80％、90％或至少95％相似性或同一性，则它们基本相同或基本相似。相似或相同的氨基酸可以是连续的或不连续的。
[0038]
框架序列可包含一种或多种氨基酸取代、插入和/或缺失。氨基酸取代可以是保守的，这意味着取代的氨基酸具有与原始氨基酸相似的化学性质。技术人员会理解哪些氨基酸具有相似的化学性质。例如，以下组的氨基酸具有相似的化学性质，例如大小、电荷和极性：第1组ala、ser、thr、pro、gly；第2组asp、asn、glu、gln；第3组his、arg、lys；第4组met、leu、lle、val、cys；第5组phe、thy、trp。
[0039]
可以使用诸如clustal程序的程序来比较氨基酸序列。该程序通过在任一序列中适当插入空格来比较氨基酸序列并找到最佳比对。可以计算氨基酸同一性或相似性(同一性加上氨基酸类型的保守性)以获得最佳比对。像blastx这样的程序将使伸长最长的一段相似序列对齐并为拟合分配一个值。因此，可以进行比较，其中存在几个相似区域，每个区域都有不同的分数。本发明考虑了两种类型的分析。优选地在框架序列的整个长度上计算
同一性或相似性。
[0040]
在某些优选的实施方式中，单克隆抗体或其片段可包含轻链可变区序列：
[0041][0042]
和/或重链可变区序列：
[0043][0044]
(cdr为粗体加下划线；框架序列为斜体)。
[0045]
在第二方面，本发明涉及一种用于检测人生物流体样品中xxiii型胶原蛋白的免疫测定方法，所述方法包括使人生物流体样品与根据本发明的第一方面的单克隆抗体接触，并检测单克隆抗体与样品中的肽之间的结合。
[0046]
优选地，检测是定量的。因此，该方法可以包括检测和确定单克隆抗体和样品中的肽之间的结合量。
[0047]
优选地，免疫测定是竞争性免疫测定。
[0048]
优选地，免疫测定是酶联免疫吸附测定(elisa)。优选地，elisa是竞争性elisa。
[0049]
人生物流体样品可以是例如血液、血清、血浆或尿液。优选地，样品是血清或血浆。
[0050]
人生物流体样品可以是来自具有指示炎性肠病的医学体征或症状的人患者的样品。优选地，生物流体样品是来自具有指示克罗恩病(cd)或溃疡性结肠炎(uc)的医学体征或症状的人患者的样品。优选地，生物流体样品是来自具有指示活动性炎性肠病(例如活动性克罗恩病(cd)或活动性溃疡性结肠炎(uc))的医学体征或症状的人患者的样品。
[0051]
该方法可以是用于诊断和/或监测和/或评估患者的炎性肠病的可能性的免疫测定方法，该方法包括使从所述患者获得的生物流体样品与单克隆抗体接触，检测和确定单克隆抗体和样品中的肽之间的结合量，以及将所述结合量与以下值相关联：与正常健康受试者相关的值和/或与已知疾病严重程度相关的值和/或在先前时间点从所述患者获得的值。优选地，炎性肠病是克罗恩病或溃疡性结肠炎。优选地，炎性肠病是活动性炎性肠病，例如活动性克罗恩病(cd)或活动性溃疡性结肠炎(uc)。
[0052]
在第三方面，本发明涉及一种测定试剂盒，该测定试剂盒包含根据本发明的第一方面的单克隆抗体和以下中的至少一种：
[0053]
‑
链霉亲和素包被的孔板；
[0054]
‑
具有c端氨基酸序列glpvpgcwhk(seq id no.1)的n端生物素化肽；和
[0055]
‑
具有c端氨基酸序列glpvpgcwhk(seq id no.1)的校准肽。
[0056]
该试剂盒可用于诊断或预测炎性肠病的风险，优选与根据本发明的第二方面的方法结合使用。
[0057]
优选地，炎性肠病是克罗恩病或溃疡性结肠炎。炎性肠病优选为活动性炎性肠病，例如活动性克罗恩病或活动性溃疡性结肠炎。
[0058]
定义
[0059]
如本文所用，术语“肽”和“多肽”同义使用。
[0060]
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指完整抗体及其保留完整抗体的结合特异性的片段，例如fab片段、fv片段或本领域技术人员已知的其他此类片段。保留相同结合特异性的抗体可以含有相同的互补决定区(cdr)。可以使用本领域已知的方法例如rabat等人[28]描述的方法来确定抗体的cdr。
[0061]
可以从b细胞克隆产生抗体，如实施例中所述。抗体的同种型可以通过对人igm、igg或iga同种型或人igg1、igg2、igg3或igg4亚类具有特异性的elisa进行确定。可以使用其他合适的方法来鉴定同种型。
[0062]
产生的抗体的氨基酸序列可以使用标准技术确定。例如，可以将rna从细胞中分离出来，并用于通过逆转录产生cdna。然后使用扩增抗体的重链和轻链的引物对cdna进行pcr。例如，对所有vh(可变重链)序列的前导区序列具有特异性的引物可以与先前已确定的结合到位于同种型的恒定区中的序列的引物一起使用。轻链可以使用与κ链或λ链的3'末端结合的引物以及与vκ或vλ前导区序列退火的引物一起扩增。可以生成全长重链和轻链并对该全长重链和轻链测序。
[0063]
如本文所用，术语“c端”是指多肽的末端，即在多肽c端的末端，并且不应被解释为在其一般方向上的含义。同样，术语“n
‑
端”是指多肽的末端，即在多肽n端的末端，并且不应被解释为在其一般方向上的含义。
[0064]
如本文所用，术语“竞争性免疫测定”是指这样一种免疫测定，其中存在于样品中的靶肽(如果有的话)与已知量的靶肽(靶肽例如是结合到固定基底或被标记的)竞争结合抗体，这是本领域技术人员已知的技术。
[0065]
如本文所用，术语“elisa”(酶联免疫吸附测定)是指这样一种免疫测定，其中使用与酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)连接的抗体检测样品(如果有的话)中存在的靶肽。然后通过与产生可测量产物的底物一起温育来评估酶的活性。从而可以检测和/或定量样品中靶肽的存在和/或量。elisa是本领域技术人员已知的技术。
[0066]
如本文所用，术语“结合量”是指对单克隆抗体与靶肽之间的结合的量化，所述量化通过将生物流体样品中的靶肽的测量值与校准曲线进行比较来确定，其中校准曲线是使用已知浓度的靶肽的标准样品产生。在本文公开的在生物流体中测量具有c端氨基酸序列glpvpgcwhk(seq id no.1)的靶肽的特定测定中，校准曲线是使用已知浓度的校准肽的标准样品产生的，该校准肽具有c端氨基酸序列glpvpgcwhk(seq id no.1，并且可以特别由氨基酸序列glpvpgcwhk(seq id no.1)组成)。将生物流体样品中测得的值与校准曲线进行比较，以确定样品中靶肽的实际数量。
[0067]
如本文所用，术语“pro
‑
c23”是指具有c端氨基酸序列glpvpgcwhk(seq id no.1)的xxiii型胶原蛋白胞外域。
附图说明
[0068]
图1：pro
‑
c23抗体10f6特异性。a)xiii、xxiii和xxv型胶原蛋白的c端的序列比对。该抗体识别xxiii型胶原蛋白的531至540位残基。b)pro
‑
c23抗体对不同肽的特异性。在pro
‑
c23测定中测试了对选择肽(glpvpgcwhk(seq id no.1))、延长肽(glpvpgcwhka(seq id no.16))、截短肽(glpvpgcwh)、来自xiii型胶原蛋白的肽(glpvqgcwnk(seq id no.4))和来自xxv型胶原蛋白的肽(glpmpgcwqk(seq id no.5))的反应性。c)使用10f6作为一抗进
行的重组xxiii型胶原蛋白的蛋白质印迹结果。
[0069]
图2：三种血浆和血清中pro
‑
c23水平的相关性(n＝16)
[0070]
图3：大鼠dss模型中的pro
‑
c23水平。a)对照大鼠(n＝8)和dai≥5的dss大鼠(n＝8)中的pro
‑
c23血清水平。b)pro
‑
c23的血清水平在诱导结肠炎时增加，并在肠道炎症逆转时回到基线。数据表示为中值
±
95％置信区间。*星号(*)代表统计学差异。*p<0.05。
[0071]
图4：人队列1中的pro
‑
c23水平。数据表示为中值
±
95％置信区间。*星号(*)代表统计学差异。*p<0.05。
[0072]
图5：人队列2(cd)和3(uc)中的pro
‑
c23水平。数据表示为中值
±
95％置信区间。*星号(*)代表统计学差异。*(p<0.05)**(p<0.01，)***(p<0.001)
具体实施方式
[0073]
实施例
[0074]
在以下实施例中描述和公开了各种实施方式，提出这些实施例是为了帮助理解本公开，并且这些实施例不应被解释为以任何方式限制如在随后的权利要求书中所限定的本发明的范围。提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供如何制作和使用所述实施方式的完整公开和描述，并且不旨在限制本公开的范围，也不旨在表示以下实验是全部或唯一进行的实验。已努力确保所用数值(例如量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数为重量份数，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，压力为大气压或接近大气压。
[0075]
方法
[0076]
pro
‑
c23的抗体开发
[0077]
xxiii型胶原蛋白α1链的最后10个氨基酸(
531
'glvpgcwhk'
540
，(seq id no.1)genscript，usa)用作免疫原性肽以产生特异性单克隆抗体。4
‑
6周龄的balb/c小鼠用100μg的stimmune佐剂(thermo fisher，usa)乳化的免疫原(klh
‑
cgg
‑
glpvpgcwhk(seq id no.1))进行皮下免疫。以2周的间隔进行连续免疫。选择具有最高抗血清效价和最佳肽反应性的小鼠进行融合。将小鼠脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合。将融合细胞在96孔板中培养(raised)并在co2培养箱中温育。选择对选择肽具有特异性但是对延长肽(glpvpgcwhka(seq id no.16))、截短肽(glpvpgcwh)、去选择肽(xiii型胶原蛋白glpvqgcwnk(seq id no.4)，xxv型胶原蛋白glpmpgcwqk(seq id no.5))(genscript，usa)没有交叉反应性的细胞系并进行亚克隆。最后，使用igg柱(ge health，usa)纯化抗体。
[0078]
对产生的抗体进行测序并确定cdr。
[0079]
链的序列如下：
[0080]
cdr为粗体加下划线
[0081]
恒定区为斜体：
[0082]
重链：氨基酸序列(454aa)
[0083][0084]
轻链：氨基酸序列(219aa)
[0085][0086]
pro
‑
c23测定和技术评估
[0087]
用于测定开发的elisa板是用来自roche(目录号：11940279)的链霉亲和素包被的。使用来自美谷分子(molecular devices)，spectramax m，(ca，usa)的elisa读板器分析所有elisa板。根据制造商(innovabioscience，babraham，cambridge，uk)的说明，使用lightning link hrp标记试剂盒用辣根过氧化物酶(hrp)标记所选择的单克隆抗体。将96孔链霉亲和素板用生物素
‑
glpvpgcwhk(seq id no.1)(genscript，usa)包被，并在20℃下温育30分钟。将20μl标准肽或样品添加到适当的孔中，然后添加100μlhrp缀合的单克隆抗体10f6，并在4℃下孵育20小时。最后，添加100μl四甲基联苯胺(tmb)(kem
‑
en
‑
tec，目录号4380h)并将板在20℃下避光温育15分钟。所有上述温育步骤都包括以300rpm的速度振荡。在每个温育步骤之后，将板洗涤五次。通过添加100μl终止溶液(1％h2so4)终止tmb反应，并在450nm处测量，以650nm作为参比。
[0088]
检测下限(llod)由21个零样本(即缓冲液)确定，并计算为平均值 3x标准偏差。检测上限(ulod)被确定为标准a的10次测量的平均值
‑
3xsd。测定内和测定间变化是10个qc样品独立地重复运行10次的平均变化。在4个血清样品和4个血浆样品中确定稀释回收率，并计算为稀释样品从100％样品中回收的百分比。在来自16个个体的血清和匹配的血浆肝素、血浆柠檬酸盐、血浆edta中确定血清和血浆之间的相关性(innovative research，usa)。
[0089]
使用重组人xxiii型胶原蛋白进行蛋白质印迹
[0090]
将重组人xxiii型胶原蛋白(r&d system，4165
‑
cl)在含有80mm dtt的样品缓冲液中稀释，并在10％sds
‑
page凝胶上跑胶，然后转移到硝酸纤维素膜上。然后通过在含有5％脱脂奶粉的tbs
‑
t中于室温下孵育1小时来封闭硝酸纤维素膜用于非特异性结合。然后与稀释在tbs
‑
t牛奶中的1μg/ml10f6或商业xxiii型胶原蛋白抗体(r&d system，mab4165)一起孵育过夜。然后将膜在tbs
‑
t中洗涤3次，然后在过氧化物酶缀合的二抗中孵育。最后，将膜在tbs
‑
t中洗涤3次，然后使用ecl系统(ge healthcare，目录号rpn2109)观察结果。
[0091]
dss大鼠模型
[0092]
将12周龄的雄性sd(sprague
‑
dawley)大鼠分为2组：6％dss组(12只大鼠)和对照
组(9只大鼠)。dss组通过在饮用水中加入6％的dss诱导急性结肠炎续5天。第5天后，从饮用水中去除dss。在第6天处死6％dss组中的一半大鼠以及3只对照大鼠，移出结肠。使剩余的大鼠从dss诱导的结肠炎中恢复，直到第16天处死。在基线、第6、7和16天采集血样。每天对疾病活动指数(dai)进行评分以评估结肠炎的进展。它基于以下参数：体重减轻、大便稠度和粪便中的血液或直肠出血。将dss大鼠的体重减轻评分与年龄匹配的对照组的平均体重进行比较：得分0＝体重减轻0
‑
4％；得分1＝体重减轻5
‑
10.9％；得分2＝体重减轻11
‑
15.9％；得分3＝体重减轻16
‑
20％。大便稠度：得分0＝正常且形态良好；得分1＝尾根部可见软而粘的粪便；得分2＝非常柔软且不成形；得分4＝腹泻和水样便。粪便带血或直肠出血：得分0＝大便颜色正常；得分2＝粪便带红色；得分4＝血便或直肠出血。每个参数的得分导致每日总dai得分为0分至12分。5分或更高的总得分被认为是高疾病活动性。
[0093]
ibd队列
[0094]
测量了三个不同的队列以评估pro
‑
c23测定的生物学相关性。在获得知情同意和当地伦理委员会的批准后收集血清样品。在队列1中，cd和uc患者的血清得自商业供应商reprocell(usa)，而健康供体的血清得自valley biomedical(usa)(表1)。在队列2和队列3中，分别获得了cd和uc患者的血清(表2)。对于任何一个队列，健康供体、cd和uc患者的患者人群统计数据(性别和年龄)之间没有显著的统计学差异。
[0095]
表1队列1的患者人群统计数据
[0096][0097]
使用克鲁斯卡尔
‑
沃利斯(kruskal
‑
wallis)检验进行年龄和性别的比较。低于0.05的p值被认为是显著的。缩写：cd：克罗恩病，uc：溃疡性结肠炎。
[0098]
表2队列2和队列3的患者人群统计数据
[0099][0100]
使用曼
‑
惠特尼(mann
‑
whitney)u检验或fisher精确检验进行年龄和性别的比较。低于0.05的p值被认为是显著的。缩写：cd：克罗恩病。
[0101]
统计数据
[0102]
使用medcalc第14版和graphpad prism第7版进行统计学分析。生物标志物水平表示为中值
±
95％置信区间。dss大鼠和对照之间pro
‑
c23的差异通过非配对t检验确定。在人队列中，使用克鲁斯卡尔
‑
沃利斯(kruskal
‑
wallis)检验进行年龄和性别的比较。通过曼
‑
惠特尼(mann
‑
whitney)t检验确定患者和健康对照之间pro
‑
c23的差异。通过具有95％置信区间(ci)的受试者工作特征(roc)曲线下面积(auc)来研究生物标志物的诊断功效。根据roc曲线确定合适的临界值的灵敏度和特异性。显著性阈值设定为p<0.05。
[0103]
结果
[0104]
pro
‑
c23测定的表征
[0105]
与xxiii型胶原蛋白一样，xiii型和xxv型胶原蛋白也是跨膜胶原蛋白，它们的c端
具有高度相似的序列(图1a)。为了充分研究抗体的特异性，合成了一系列肽并包括在抑制测试中。所选择的抗体10f6特异性识别xxiii型胶原蛋白c端的最后10个氨基酸
531
'glpvpgcwhk'
540
(seq id no.1)，但不识别延长肽glpvpgcwhka(seq id no.16)，截短肽glpvpgcwh(seq id no.3)，xiii型胶原蛋白c端肽glpvqgcwnk(seq id no.4)或xxv型胶原蛋白c端肽glpmpgcwqk(seq id no.5)(图1b)。重组xxiii型胶原蛋白胞外域(4165
‑
cl，r&d system)的蛋白质印迹显示，所选择的抗体10f6识别约60kd的xxiii型胶原蛋白胞外域，同时还显示了参考商业抗体(mab4165，r&d system)(图1c)。
[0106]
pro
‑
c23竞争性elisa提供了从0.38ng/ml(llod)到18.73ng/ml(ulod)的测量范围。测定间和测定内变异性分别为8.1％和3.5％。人血清中的稀释回收率和加标回收率(spiking recovery)见表3。人血清与三种血浆值之间的相关性较高(图2，p<0.0001)，表明pro
‑
c23水平与血液制备方法无关。
[0107]
表3 pro
‑
c23测定的技术性能
[0108]
检测范围(llod
‑
ulod)0.38ng/ml
‑
18.73ng/ml测定内变异性3.5％测定间变异性8.1％血清中稀释回收率100
±
20％内血清中加标回收率75.8％干扰无hama、生物素、内脂和血红蛋白干扰
[0109]
dss大鼠模型中的pro
‑
c23生物标志物
[0110]
为了研究pro
‑
c23片段的生物学相关性，使用了dss诱导的结肠炎大鼠模型。测量了血清样品中的pro
‑
c23生物标志物。与对照相比，在第6天和第7天具有高疾病活动指数(dai≥5)的dss大鼠具有显著更高的pro
‑
c23血清水平(p>0.05，图3a)。pro
‑
c23的血清水平在诱导结肠炎时增加，并在肠道炎症逆转时返回基线(图3b)。
[0111]
人ibd队列中的pro
‑
c23生物标志物
[0112]
测量来自三个独立的人队列的血清中的pro
‑
c23。在队列1中，在10名cd和10名uc患者以及10名年龄匹配的健康供体中对pro
‑
c23进行量化。结果显示，与健康供体相比，cd和uc患者的pro
‑
c23水平显著更高(p<0.05，图4)。没有提供这些患者的疾病活动性的信息。在队列2和3中，包括44名cd患者和29名uc患者，以及29名年龄匹配的健康供体。与健康供体相比，活动性cd患者和活动性uc患者的pro
‑
c23水平升高(cd：p<0.05，uc：p<0.001，图5)。
[0113]
讨论
[0114]
据推测，在上皮损伤期间，xxiii型胶原蛋白可以从细胞表面被裂解。此外，xxiii型胶原蛋白的丢失可能促使ibd的上皮粘附变化，因此用作ibd的生物标志物。因此，开发了测量xxiii型胶原蛋白的胞外域的pro
‑
c23elisa。
[0115]
该抗体仅识别xxiii型胶原蛋白的c端序列，与显示相似序列的xiii型和xxv型胶原蛋白的c端无交叉反应。该数据清楚地证实了抗体的特异性。此后，将该抗体应用于竞争性elisa并针对人血清和血浆测量进行优化。数据表明，可以通过竞争性elisa检测循环中xxiii型的胞外域，该竞争性elisa与血液制备方法无关。
[0116]
为了在体内研究中进一步验证生物标志物，在dss诱导的结肠炎大鼠模型中测量了pro
‑
c23生物标志物。dss可引起肠上皮细胞损伤。这些动物表现出类似ibd的症状，例如
腹泻、直肠出血和体重减轻[25,26]。一项研究还表明，dss可以诱导紧密连接蛋白表达的改变[27]。因此，dss大鼠模型可能是验证pro
‑
c23生物标志物的合适动物模型。发现xxiii型胶原蛋白在患有活动性疾病的大鼠中升高，并且与疾病活动性的相关性较弱。这一发现表明在与dss大鼠的疾病活动性相关的循环中发现了xxiii型胶原蛋白的胞外域。
[0117]
为了进一步验证pro
‑
c23生物标志物，在两个人队列中对其进行了测量。pro
‑
c23在患有活动性疾病的人cd患者(队列2)和uc患者(队列3)中升高。这些数据提示，在活动性肠道损伤中，xxiii型胶原蛋白的胞外域的释放得到加强，这与动物模型中的结果一致。
[0118]
xxiii型胶原蛋白已被认为是前列腺癌复发[18]、非小细胞肺癌[17]和透明细胞肾细胞癌[14]的潜在生物标志物。它在那些癌组织中，尤其是在转移组织中，显示出显著更高的表达。据信，xxiii型胶原蛋白促进细胞
‑
细胞粘附和细胞
‑
基质粘附[13]。肺癌和透明细胞肾细胞系中的xxiii型胶原蛋白沉默显示，粘附蛋白表达改变、细胞粘附和迁移能力降低[13,14]。然而，xxiii型胶原蛋白也存在于其他组织中，在其他疾病中的用能和用途尚不清楚。据发明人所知，这是首次研究表明xxiii型胶原蛋白水平在ibd中受到调节。结果表明，xxiii型胶原蛋白也可能在肠道细胞粘附中起重要作用，并有助于ibd的病理学。
[0119]
结论
[0120]
数据表明，上皮细胞pro
‑
c23的生物标志物可用作cd患者的疾病活动性的非侵入性替代物，从而有助于监测患者。与非活动性疾病相比，患有活动性疾病的cd和uc患者的血清中测量到更高水平的pro
‑
c23。
[0121]
在本说明书中承认的所有先前教导在此通过引用并入。对本文中任何先前出版的文件的承认不应被视为承认或表示其教导是澳大利亚或其他地方在本文发布之日的公知常识。
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