针对伊马替尼的适体的制作方法

1.本发明的实施方案涉及与伊马替尼特异性结合的适体及其使用方法。例如，本发明的某些实施方案涉及使用本文所描述的适体检测样品中伊马替尼的存在、不存在或含量的方法。


背景技术：

2.伊马替尼是一种2
‑
苯基氨基嘧啶衍生物，是一种酪氨酸激酶抑制剂，具有抗abl、bcr
‑
abl、pdgfra和c
‑
kit的活性。伊马替尼与这些靶的atp结合位点紧密结合，抑制促进肿瘤发生的酶活性和下游信号通路。
3.伊马替尼是用于治疗癌症，特别是白血病或血液疾病的口服靶向疗法。例如，伊马替尼被用作为治疗慢性粒细胞白血病(cml)的一线疗法。药代动力学研究表明，由于伊马替尼的代谢变化、依从性差或药物之间的相互作用，伊马替尼的谷浓度具有相当大的变化性。由于伊马替尼的血浆水平与疗法反应相关，因此监测药物的治疗水平(并调整到所需的靶水平)将有助于提高疗效和减少毒性。
4.伊马替尼是一种低分子量药物(c
29
h
31
n7o，平均分子量为493.6027da)，无法利用不与药物代谢物交叉反应的特异性抗体开展免疫分析。例如，小分子对亲和试剂的靶向性很差。通常，小分子的官能团数量非常少，因此亲和试剂难以与这些底物特异性结合。此外，小分子可能存在毒性问题和/或缺乏免疫原性。尽管存在这些问题，但是，仍然需要开发试剂，所述试剂能够更简单、更容易适应分析平台、生产更可靠、不依赖于一对亲和配体并提供信号增益读出；同时能够与伊马替尼及其药理活性盐特异性结合，与密切相关的化合物或药物代谢物无交叉反应。
5.有人已经采用色谱法(例如液相色谱
‑
质谱联用或紫外分光光度法联用)对cml患者血清中的伊马替尼的水平进行评估(micova et al.clin chim acta.2010；411；1957
‑
62)。然而，这种检测方法成本高、耗时长，需要专业实验室、昂贵的设备、大量使用生物材料、溶剂和其他材料。
6.在伊马替尼的情况下，已经开发了几种基于抗体的测试，但这些测试都具有与小分子靶向免疫分析有关的相同局限性；它们依赖于一对抗体(很难分离，生产成本很高)和/或依赖于使用“信号损失”输出的竞争性分析形式。据了解，这种性质的竞争性分析容易产生高背景信号和缺乏灵敏性。
7.本发明一些实施方案的目的是开发出与基于抗体的测试相比生产更可靠、不依赖于一对亲和配体并且提供信号增益读出的检测试剂，至少部分缓解现有技术中识别的一些问题。
8.本发明某些实施方案的

技术实现要素：

9.本发明的涉及伊马替尼结合适体及其使用方法的开发。
10.本文所描述的适体被证明有效，并且提供了采用简单的信号增益分析形式测定样品中伊马替尼的存在、不存在或含量的简单方法。特别是，本文所描述的适体能够以高亲和
力与伊马替尼结合。本文所描述的适体能够检测生物流体中临床范围(即小于1μm)的活性伊马替尼。
11.因此，本发明的某些方面特别提供：
12.‑
能够与伊马替尼特异性结合的适体，其中所述适体包括以下项或由以下项组成：
13.(a)选自seq id no:3至24或27至30中的任一者的核酸序列；
14.(b)与seq id no:3至24或27至30中的任一者具有至少85％同一性的核酸序列；
15.(c)具有seq id no 3至24或27至30中的任一者的至少大约30个连续核苷酸的核酸序列；或
16.(d)具有序列的至少大约30个连续核苷酸的核酸序列，所述序列与seq id no 3至24或27至30中的任一者具有至少85％同一性；
17.‑
一种适体，其与本文所描述的适体竞争与伊马替尼结合；
18.‑
一种复合物，其包含本文所描述的任何适体和可检测的分子；
19.‑
一种生物传感器或测试条，其包含本文所描述的任何适体。
20.‑
用于检测样品中伊马替尼的存在、不存在或水平的装置，所述装置包括：
21.(i)载体；及
22.(ii)本文所描述的任何适体；
23.‑
本文所描述的任何适体、复合物、生物传感器、测试条和/或装置用于检测、富集、分离和/或隔离伊马替尼的用途。
24.‑
检测样品中伊马替尼的存在、不存在或含量的方法，所述方法包括：
25.(i)使样品与本文所描述的任何适体相互作用；和
26.(ii)检测伊马替尼的存在、不存在或含量。
27.‑
治疗或预防受试者癌症的方法，所述方法包括：
28.(i)向受试者施用初始剂量的伊马替尼；
29.(ii)按照本文所描述的任何方法检测受试者样品中伊马替尼的含量；和
30.(iii)(a)如果伊马替尼的水平低于下阈值水平，则增加向受试者施用的伊马替尼剂量；
31.(b)如果伊马替尼的水平高于上阈值水平，则减少向受试者施用的伊马替尼剂量。
32.‑
用于检测和/或定量伊马替尼的试剂盒，所述试剂盒包含本文所描述的任何适体。本发明某些实施方案的具体实施方式
附图说明
33.下面将参考附图更详细地描述本发明的某些实施方案，其中：
34.图1示出了针对伊马替尼的适体(a
‑
适体1(ima
‑
c5)b
‑
适体2(ima
‑
e8))的预测二级结构。二级结构采用mfold测定[zuker,m.(2003)mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.nucleic acid res.31(13),3406
‑
15]。固定寡核苷酸的结合位点以绿色突出显示。
[0035]
图2显示随着适体文库富集，连续几轮筛选回收的适体的荧光逐渐增加。第10轮后，分离出靶特异性多克隆群体。
[0036]
图3示出了用于监测适体与其靶结合、识别最佳适体克隆和用于动力学分析的“浸
读(dip and read)”生物膜层干涉法(bli)分析的模型数据。模型数据显示“适体固定”到传感器表面上，“清洗”过程中建立了新的基线，随后随着适体与靶结合并与传感器表面“分离”，信号减少。
[0037]
图4示出了采用bli分析监测的多克隆适体群体的结合。数据仅显示了图3所描述的“靶结合分离”，并且已经进行了背景减去和“翻转(flipped)”，以允许使用软件steady state analysis(稳态分析)算法。bli分析显示，与初始文库(蓝色)相比，所筛选的适体群体与选择靶伊马替尼的结合(红色)及与伊马替尼主要代谢物n
‑
去甲基伊马替尼的结合(绿色)情况有所改善。
[0038]
图5示出了用于“选中(hit picking)”最佳表现单克隆适体的bli分析数据。数据仅显示了图3所述的“靶结合分离”，并且已经进行了背景减去和“翻转”。结果表明，相对于其他筛选序列，鉴定了与伊马替尼结合得到改善的适体。与来自第10轮筛选的其他富集适体群体相比，两个适体对伊马替尼具有高亲和力。
[0039]
图6示出了测定适体特异性的比较结合研究。与初始文库和第10轮筛选的富集适体群体相比，适体1(ima
‑
c5)和适体2(ima
‑
c8)与伊马替尼(红色迹线)及伊马替尼主要代谢物(绿色迹线)的结合均得到改善。其他(结构上和功能上相关的)测试分子没有结合(蓝色和紫色迹线)。特异性研究采用图3所描述的bli分析进行。数据仅显示了图3所描述的“靶结合分离”，并且已经进行了背景减去和“翻转”。
[0040]
图7示出了适体ima c5以浓度依赖性方式与靶伊马替尼结合。伊马替尼的相互作用采用直接结合分析法，通过表面等离子体共振(spr)监测，其中将适体ima c5固定在biacore仪器的传感器芯片上。然后，适体与浓度梯度的伊马替尼相互作用。亲和力常数(k
d
值)采用biacore insight评估软件计算，其中采用1:1结合langmuir结合模型和局部ri参数。适体1对伊马替尼(pbs6中)的亲和力采用1.10x10
‑7m(110nm)计算。
[0041]
图8示出了适体1在类似elisa的分析形式中使用，与缓冲人血浆中的靶结合。通过基于微量滴定板的适体置换分析(荧光分析)，证明了最佳适体(适体1)的功能性。在不同浓度的人血浆中，所筛选的适体与其靶伊马替尼表现出强烈的浓度依赖性结合(导致信号增益响应)，与单独血浆的背景结合最小。在反映伊马替尼治疗范围的靶浓度下进行分析。
[0042]
图9示出了用于鉴定适体1最小有效片段的bli置换分析结合研究。对适体1的一组截短片段开展与靶伊马替尼(pbs6中，10μm)结合的测试。适体1的最小最佳片段在本文鉴定为seq id no：3(ima
‑
c5
‑
f6b，红色结合曲线)。最小片段鉴定研究采用图3所描述的bli分析进行。数据仅显示了图3所描述的“靶结合分离”，并且已经进行了背景减去和“翻转”。
[0043]
图10示出了适体片段ima c5
‑
f6b以浓度依赖性方式与靶伊马替尼结合。伊马替尼的相互作用采用直接结合分析法，通过表面等离子体共振(spr)监测，其中将适体片段ima c5
‑
f6b固定在biacore仪器的传感器芯片上。然后，适体与浓度梯度的伊马替尼相互作用。亲和力常数(k
d
值)采用biacore insight评估软件计算，其中采用1:1结合langmuir结合模型和局部ri参数。适体片段ima c5
‑
f6b对伊马替尼(pbs6中)的亲和力用7.21x10
‑8m(72.1nm)计算。
[0044]
图11示出了用于测定适体片段ima c5
‑
f6b特异性的基于bli的置换分析结合研究。结合曲线示出了适体与伊马替尼的结合(红色，10μm)、与代谢物n
‑
去甲基伊马替尼的结合(绿色，10μm)及与阴性靶伊立替康的结合(紫色，10μm)。特异性研究采用图3所描述的bli
分析进行。数据仅显示了图3所描述的“靶结合分离”，并且已经进行了背景减去和“翻转”。
[0045]
图12示出了适体ima c5
‑
f6b在类似elisa的分析形式中使用，与缓冲人血浆中的靶结合。通过基于微量滴定板的适体置换分析(荧光分析)，测试了ima c5
‑
f6b的功能性。在不同浓度的人血浆中，所筛选的适体与其靶伊马替尼表现出强烈的浓度依赖性结合(导致信号增益响应)，与单独血浆的背景结合最小。在反映这种药物治疗范围的靶浓度下进行分析。
[0046]
序列表
[0047]
seq id no:1示出了适体1(ima
‑
c5)的第一随机化区(r1)
[0048]
ccccgctatg
[0049]
seq id no:2示出了适体1(ima
‑
c5)的第二随机化区(r2)
[0050]
gttcggtgtgtttttaaagggtacagatcctgggcggggg
[0051]
seq id no:3示出了适体1(ima
‑
c5)的最佳最小有效核酸片段(f6b)
[0052]
ccccgctatgtgaggctcgatcgttcggtgtgtttttaaagggtacagatcc
[0053]
seq id no:4示出了与全长ima
‑
c5相比与伊马替尼结合改善的ima
‑
c5的核酸片段(f6a)
[0054]
ctatgtgaggctcgatcgttcggtgtgtttttaaagggtacagatcc
[0055]
seq id no:5示出了与全长ima
‑
c5相比与伊马替尼结合改善的ima
‑
c5的核酸片段(f6c)
[0056][0057]
seq id no:6示出了与全长ima
‑
c5相比与伊马替尼结合改善的ima
‑
c5的核酸片段(f6d)
[0058][0059]
seq id no:7示出了与全长ima
‑
c5相比与伊马替尼结合改善的ima
‑
c5的核酸片段(f6e)
[0060][0061]
seq id no:8示出了与全长ima
‑
c5相比与伊马替尼结合改善的ima
‑
c5的核酸片段(f7a)
[0062][0063]
seq id no:9示出了与全长ima
‑
c5相比与伊马替尼结合改善的ima
‑
c5的核酸片段(f7b)
[0064][0065]
seq id no:10示出了与全长ima
‑
c5相比与伊马替尼结合改善的ima
‑
c5的核酸片段(f7c)
[0066][0067]
seq id no:11示出了与全长ima
‑
c5相比与伊马替尼结合改善的ima
‑
c5的核酸片段(f7d)
[0068][0069]
seq id no:12示出了与全长ima
‑
c5相比与伊马替尼结合改善的ima
‑
c5的核酸片段(f7e)
[0070][0071]
seq id no:13示出了与全长ima
‑
c5相比与伊马替尼结合改善的ima
‑
c5的核酸片段(f14f)
[0072][0073]
seq id no:14示出了与全长ima
‑
c5相比与伊马替尼结合改善的ima
‑
c5的核酸片段(f14g)
[0074][0075]
seq id no:15示出了与全长ima
‑
c5相比与伊马替尼结合改善的ima
‑
c5的核酸片段(f14h)
[0076][0077]
seq id no:16示出了与全长ima
‑
c5相比与伊马替尼结合改善的ima
‑
c5的核酸片段(f14i)
[0078][0079]
seq id no:17示出了与全长ima
‑
c5相比与伊马替尼结合改善的ima
‑
c5的核酸片段(f14j)
[0080][0081]
seq id no:18示出了与全长ima
‑
c5相比与伊马替尼结合改善的ima
‑
c5的核酸片段(f14k)
[0082][0083]
seq id no:19示出了与全长ima
‑
c5相比与伊马替尼结合改善的ima
‑
c5的核酸片段(f14l)
[0084][0085]
seq id no:20示出了适体1(ima
‑
c5)的核酸片段(f6)
[0086][0087]
seq id no:21示出了适体1(ima
‑
c5)的核酸片段(f7)
[0088][0089]
seq id no:22示出了适体1(ima
‑
c5)的核酸片段(f8)
[0090][0091]
seq id no:23示出了适体1(ima
‑
c5)的核酸片段(f14)
[0092][0093]
seq id no:24示出了适体1(ima
‑
c5)的全核酸序列
[0094][0095]
seq id no:25示出了适体2(ima
‑
e8)的第一随机化区(r1)
[0096]
gtggactaga
[0097]
seq id no:26示出了适体2(ima
‑
e8)的第二随机化区(r2)
[0098][0099]
seq id no:27示出了适体2(ima
‑
e8)的核酸片段(f10)
[0100][0101]
seq id no:28示出了适体2(ima
‑
e8)的核酸片段(f11)
[0102][0103]
seq id no:29示出了适体2(ima
‑
e8)的核酸片段(f12)
[0104][0105]
seq id no:30示出了适体2(ima
‑
e8)的全核酸序列
[0106][0107]
seq id no:31示出了示例性固定区(i)
[0108]
tgaggctcgatc
[0109]
seq id no:32示出了示例性第一引物区(p1)
[0110]
atccacgctctttttctcc
[0111]
seq id no:33示出了示例性第二引物区(p2)
[0112]
gcattgagggtgacatagg
[0113]
seq id no:34示出了示例性固定序列
[0114]
gatcgagcctca
[0115]
seq id no:35示出了示例性反向第二引物区(p2)
[0116]
cctatgtcaccctcaatgc
[0117]
正如下文进一步解释的那样，任何带下划线的序列指的是第一(p1)和第二(p2)引物位点，任何斜体序列指的是适体的固定区(i)(即能够与至少一部分固定序列结合的适体核酸序列)。r1和r2分别指第一和第二随机化区。
具体实施方式
[0118]
下面对本发明某些实施方案的进一步特征进行说明。除非另有说明，否则本发明实施方案的实施将采用分子生物学、微生物学、重组dna技术和免疫学的常规技术，这些技术是本领域技术人员熟悉的。
[0119]
大多数通用分子生物学、微生物学、重组dna技术和免疫学技术都可以在sambrook et al,molecular cloning,a laboratory manual(2001)cold harbor
‑
laboratory press,cold spring harbor,n.y.或ausubel et al.,current protocols in molecular biology(1990)john wiley and sons,n.y.中找到。除非特别规定，本发明使用的所有词语(包括技术名词和科学术语)的意义与本发明所属领域技术人员通常理解的相同。例如，concise dictionary of biomedicine and molecular biology(《生物医学与分子生物学简明词典》)，juo,pei
‑
show,2nd ed.,2002,crc press；the dictionary of cell and molecular biology(《细胞与分子生物学词典》)，3rd ed.,academic press；以及牛津大学出版社为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的通用词典。
[0120]
单位、前缀和符号以国际单位制(si)公认的形式表示。数字范围包括定义范围的数字。除非另外说明，氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写，核酸序列以5'到3'的方向从左到右书写。
[0121]
在下文中，将通过具体实施方案的非限制性实施例对本发明进行更详细地说明。在实施例的实验中，采用无污染的标准试剂和缓冲液。
[0122]
伊马替尼
[0123]
本发明提供能够与伊马替尼特异性结合的适体。
[0124]
伊马替尼具有以下结构：
[0125][0126]
伊马替尼及其盐类(例如甲磺酸伊马替尼)被用于治疗癌症。例如，伊马替尼可用于治疗费城染色体阳性(ph )的慢性粒细胞白血病(cml)和急性淋巴细胞白血病(all)以及某些类型的胃肠道间质瘤(gist)、系统性肥大细胞增多症和骨髓增生异常综合征。
[0127]
通常，伊马替尼口服使用。常见的副作用包括呕吐、腹泻、肌肉疼痛、头痛和皮疹。严重的副作用包括体液滞留、胃肠道出血、骨髓抑制、肝脏问题和心力衰竭。
[0128]
优选的伊马替尼药理活性盐是甲磺酸伊马替尼，其具有以下结构：
[0129][0130]
本发明的适体与伊马替尼和/或其药理学活性盐特异性结合。在某些实施方案中，本发明的适体与甲磺酸伊马替尼特异性结合。
[0131]
在某些实施方案中，本发明的适体与伊马替尼的药理学活性代谢物特异性结合。伊马替尼的主要活性代谢物n
‑
去甲基伊马替尼具有以下结构：
[0132][0133]
n
‑
去甲基伊马替尼对bcr
‑
abl激酶的体外效力与伊马替尼相同，其在血浆中的水平通常是伊马替尼水平的10
‑
15％。在某些实施方案中，适体与n
‑
去甲基伊马替尼特异性结合。
[0134]
如本文所使用的，术语“伊马替尼”理解为包括伊马替尼和/或其任何药理学活性盐或代谢物，包括甲磺酸伊马替尼和/或n
‑
去甲基伊马替尼。
[0135]
适体与伊马替尼“特异性”结合，是指适体与伊马替尼优先或高亲和力结合，但与其他结构上相关的小分子(例如伊立替康)不结合或仅以低亲和力结合。
[0136]
在某些实施方案中，适体以小于大约1μm、小于大约500nm、小于大约400nm、小于大约300nm、小于大约200nm、小于大约100nm、小于大约90nm、小于大约80nm、小于大约70nm或更小的结合解离平衡常数(k
d
)与伊马替尼(和/或其盐)结合。适体的结合亲和力可采用本领域技术人员熟悉的任何方法测定，包括例如表面等离子体共振(spr)、生物膜层干涉法(bli)、置换分析和/或稳态分析。
[0137]
在某些实施方案中，不与伊马替尼特异性结合的适体是与伊马替尼非优先结合或低亲和力结合的适体。例如，仅以低亲和力与伊马替尼结合(或以低亲和力与其他结构上相关的小分子结合)的适体可以是k
d
大于大约1μm、大于大约2μm、大于大约3μm、大于大约4μm、大于大约5μm或更大的适体。
[0138]
适体
[0139]
本文所描述的适体是小的人工配体，包含dna、rna或其修饰，能够以高亲和力和特异性与伊马替尼特异性结合。
[0140]
如本文所使用的，“适体”、“核酸分子”或“寡核苷酸”可互换使用，指的是对靶分子(即伊马替尼)具有期望作用的非天然核酸分子。
[0141]
本发明的适体可以是dna适体。例如，适体可以由单链dna(ssdna)形成。或者，本发明的适体可以是rna适体。例如，适体可以由单链rna(ssrna)形成。本发明的适体可包含本文所描述的修饰核酸。
[0142]
在某些实施方案中，本发明的适体采用本领域熟悉的体外筛选原理制备，包括靶结合的迭代循环、靶结合序列的划分和优先扩增。
[0143]
在某些实施方案中，适体选自核酸分子文库，例如单链dna或rna核酸分子文库。通常，适体是从“通用适体筛选文库”中筛选的，该文库的设计使任何筛选的适体几乎不需要改变就可以转换成任何列出的分析形式。在某些实施方案中，“通用适体筛选文库”包括以下功能部分：第一引物区、至少一个固定区、至少一个随机化区和第二引物区。
[0144]
在某些实施方案中，适体文库的核苷酸序列具有以下结构(5’至3’方向)：
[0145]
p1
ꢀ–ꢀ
r1
ꢀ–ꢀ
i
ꢀ–ꢀ
r2
ꢀ–ꢀ
p2,
[0146]
其中p1是第一引物区，r1是第一随机化区，i是固定区，r2是另一随机化区，p2是另
一引物区，其中至少r1和/或r2或其一部分参与靶分子结合。
[0147]
一旦筛选好，适体可在使用前进一步修饰，例如去除靶结合不需要的一个或两个引物序列和/或部分随机化区或固定区。
[0148]
通常，本发明的适体包含固定区(即对接序列)。适体的固定区可在“固定寡核苷酸”的至少一部分上杂交。通常，固定区与固定寡核苷酸的至少一部分互补。通常，固定区的长度是大约10至大约20个核苷酸，例如，长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
[0149]
本文所使用的术语“杂交”是指在常规杂交条件下，优选在严格条件下，适体内的固定区和“固定寡核苷酸”内的互补序列之间形成基于watson
‑
crick碱基配对的相互作用，例如，如sambrook et al.,molecular cloning,a laboratory manual,3.ed.(2001)cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,ny所描述。
[0150]
本领域技术人员将理解的是，可以根据例如初始文库和/或适体筛选方案来筛选适体的固定区。各种组合随机文库可通过商业来源获得。在某些实施方案中，所述固定区包含seq id no：31和/或所述固定寡核苷酸包含seq id no:34。
[0151]
通常，本发明的适体包含第一引物区(例如在5’端)、第二引物区(例如在3’端)或两者。引物区可作为文库和筛选适体pcr扩增的引物结合位点。
[0152]
本领域技术人员将理解的是，可以根据例如初始文库和/或适体筛选方案来筛选不同的引物序列。例如，本发明的适体可包含seq id no:32和/或seq id no:33。
[0153]
第一引物区和/或第二引物区可包含如本文所描述的可检测标记。例如，第一和/或第二引物区可被荧光(例如fam)标记。在某些实施方案中，第一和/或第二引物区的引物被磷酸盐(po4)标记。
[0154]
本发明的适体可选自具有第一随机化区(r1)和/或第二随机化区(r2)的核酸分子文库。本发明的适体可包含r1和/或r2的至少一部分。在某些实施方案中，本发明的适体包含seq id no:1或seq id no:25的至少一部分(例如，至少8个或更多个连续核苷酸)和/或seq id no:2或seq id no:26的至少一部分(例如，至少8个或更多个连续核苷酸)。在某些实施方案中，本发明的适体包含seq id no：1或seq id no:25。在某些实施方案中，本发明的适体包含seq id no:2或seq id no:26的至少30个或更多个连续核苷酸。
[0155]
在某些实施方案中，本发明的适体包含选自seq id no：3至24或27至30中的任一者的核酸序列(例如，涉及“ima
‑
c5”和/或“ima
‑
e8”适体)，或由选自seq id no：3至24或27至30中的任一者的核酸序列(例如，涉及“ima
‑
c5”和/或“ima
‑
e8”适体)组成。
[0156]
在某些实施方案中，本发明的适体包含选自seq id no：3至24中的任一者的核酸序列(例如，涉及“ima
‑
c5”适体)，或由选自seq id no：3至24中的任一者的核酸序列(例如，涉及“ima
‑
c5”适体)组成。
[0157]
在某些实施方案中，本发明的适体包含seq id no:3至19中任一者，或由seq id no:3至19中任一者组成。这些序列涉及与全长ima
‑
c5相比与伊马替尼的结合得到改善的ima
‑
c5片段。在某些实施方案中，本发明的适体包含seq id no：3，或由seq id no：3组成。本文表明，这种最小有效片段是针对伊马替尼的最佳适体。
[0158]
在某些实施方案中，本发明的适体包含与seq id no:3至24或27至30中的任一者的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少
99％或更高的序列同一性的核酸序列，或由与seq id no:3至24或27至30中的任一者的核苷酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的核酸序列组成。
[0159]
在某些实施方案中，本发明的适体包含与seq id no:3至24中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的核酸序列，或由与seq id no:3至24中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的核酸序列组成。
[0160]
在某些实施方案中，本发明的适体包含与seq id no:3至19中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的核酸序列，或由与seq id no:3至19中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的核酸序列组成。
[0161]
在某些实施方案中，本发明的适体包含与seq id no:3具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的核酸序列或由与seq id no:3具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的核酸序列组成。
[0162]
如本文所使用的，“序列同一性”是指在比对序列并引入空位(gap)(如有必要的话)以实现最大百分序列同一性之后，候选序列中与所述序列中核苷酸相同的核苷酸百分数。用于确定核酸序列同一性百分数的比对可以通过本领域熟悉的各种方式实现，例如，使用公开可用的计算机软件，例如blast、blast
‑
2、align、clustalw或megalign(dnastar)软件。例如，％核酸序列同一性数值可以使用欧洲生物信息学研究所网站(http://www.ebi.ac.uk)上的序列比较计算机程序产生。
[0163]
在某些实施方案中，本发明的适体包含seq id no:24(全长ima
‑
c5)或seq id no:30(全长ima
‑
c8)的最小有效片段或由seq id no:24(全长ima
‑
c5)或seq id no:30(全长ima
‑
c8)的最小有效片段组成。在本文中，“最小有效片段”理解为能够以与全长适体相同或改进的亲和力与伊马替尼结合的全长适体的片段(例如部分)(例如，seq id no:24或30)。最小有效片段可与全长适体(例如seq id no:24或seq id no:30)竞争与伊马替尼的结合。
[0164]
在某些实施方案中，本发明的适体包含与seq id no：3至24或27至30中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的同一性的序列的至少大约30、35、40、45、50、51、52、53、54、55、60或更多个连续核苷酸的核酸序列，或由与seq id no：3至24或27至30中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的同一性的序列的至少大约30、35、40、45、50、51、52、53、54、55、60或更多个连续核苷酸的核酸序列组成。在本文中，术语“大约”通常是指参考核苷酸序列长度加上或减去所述参考长度的10％。
[0165]
在某些实施方案中，本发明的适体包含与seq id no：3至24中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的同一性的序列的至少大约30、35、40、45、50、51、52、53、54、55、60或更多个连续核苷酸的核酸序列，或由与seq id no：3至24中的任一者具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的同一性的序列的至少大约30、35、40、45、50、51、52、53、54、55、60或更多个连续核苷酸的核酸序列组成。
pharmacology and physiology(2006)33,533
‑
540)。
[0175]
一些修饰使适体能够对核酸裂解酶稳定。在适体的稳定化过程中，通常可以区分适体的后续修饰和选择已修饰的rna/dna。这种稳定化不影响修饰rna/dna适体的亲和力，但可防止适体在生物体或生物溶液中被rna酶/dna酶快速分解。在本发明中，如果适体在样品(例如生物培养基)中的半衰期大于1分钟，优选大于1小时，更优选大于1天，则适体被称为是稳定的。适体也可以采用报告分子修饰，除了检测标记适体外，报告分子还可以增加稳定性。
[0176]
适体的特征在于形成一种依赖于核酸序列的特定三维结构。适体的三维结构是由于watson和crick分子内碱基配对、hoogsteen碱基配对(四重)、摆动配对形成或其他非典型碱基相互作用而产生的。这种结构使适体(类似于抗原
‑
抗体结合)能够与靶结构准确结合。适体的核酸序列具有在规定条件下对规定靶结构具有特异性的三维结构。
[0177]
在某些实施方案中，适体包含如图1所示的二级结构。适体的二级结构分析采用最小自由能算法mfold执行(m zuker.mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.nucleic acids res.31(13),3406
‑
3415,2003)。在某些实施方案中，与seq id no:3至24或27至30中的任一者相比，本发明的适体可含有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸变异。例如，可以根据图1所示的二级结构来确定可以引入这种变异的位置。
[0178]
本发明还提供与如本文所描述的适体竞争与伊马替尼结合的适体。在某些实施方案中，本发明提供与seq id no：3至24或27至30中的任一者所述的适体竞争与伊马替尼结合的适体：seq id no：3至24或27至30。在某些实施方案中，竞争分析可用于鉴定竞争与伊马替尼结合的适体。在示例性竞争分析中，将固定的伊马替尼在包含结合伊马替尼的第一标记适体及与第一适体竞争结合伊马替尼的能力待测的第二未标记适体的溶液中培养。作为对照，固定的伊马替尼可在包含第一标记适体但不包含第二未标记适体的溶液中培养。在允许第一适体与伊马替尼结合的条件下培养后，可清除多余的未结合适体，并测定与固定伊马替尼结合的标记含量。如果测试样品中与固定伊马替尼结合的标记含量相对于对照样品显著减少，则表明第二适体与第一适体竞争与伊马替尼的结合。
[0179]
固定寡核苷酸
[0180]
在某些实施方案中，在没有任何固定寡核苷酸的情况下检测适体。例如，本发明的适体可采用本文所描述的连接序列固定到载体上。
[0181]
在某些实施方案中，本发明的适体包含固定区。适体的固定区可与适当设计的固定寡核苷酸的至少一部分杂交。
[0182]
在某些实施方案中，所述固定寡核苷酸包含核酸序列，所述核酸序列经配置以在其长度的至少一部分上与适体的固定区杂交。例如，固定寡核苷酸(或其一部分)可被配置为与适体的固定区(或其一部分)形成双链双螺旋结构。
[0183]
在某些实施方案中，固定寡核苷酸的长度是大约10个至大约20个核苷酸，例如长度是大约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核苷酸。通常，固定寡核苷酸与适体的固定区互补。在某些实施方案中，固定寡核苷酸是能够与多个适体中包括的固定区杂交的“通用”寡核苷酸。
[0184]
在某些实施方案中，固定寡核苷酸或适体包含具有适当功能单元的接头部分，以
and protocols,2006,didenko,ed.,humana press,totowa,nj,and marras et al.,2002,nucl.acids res.30,el22(通过引用而并入本文中)。
[0196]
在某些实施方案中，所述可检测标记是fam。在某些实施方案中，所述fam标记位于适体的第一或第二引物区。本领域技术人员将理解的是，所述标记可位于适体内的任何适当位置。本文也可以使用彼此接近时导致可检测信号增加的单元，例如由于荧光共振能量转移(“fret”)的结果；合适的配对包括但不限于例如荧光素和四甲基罗丹明；罗丹明6g和孔雀绿，及fitc和缩氨基硫脲等。
[0197]
在某些实施方案中，可检测标记选自荧光团、纳米颗粒、量子点、酶、放射性同位素、预定义序列部分、生物素、脱硫生物素、巯基(thiol group)、氨基、叠氮化物、氨基烯丙基、地高辛(digoxigenin)、抗体、催化剂、胶体金属颗粒，胶体非金属颗粒、有机聚合物、乳胶颗粒(latex particle)、纳米纤维、纳米管、树状聚合物(dendrimer)、蛋白质和脂质体。
[0198]
在某些实施方案中，可检测标记是荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(gfp)或本领域技术人员熟悉的任何其他荧光蛋白。
[0199]
在某些实施方案中，可检测标记是酶。例如，所述酶可选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、脲酶、β
‑
半乳糖苷酶或本领域技术人员熟悉的任何其他酶。
[0200]
在某些实施方案中，检测的性质将取决于所使用的可检测标记。例如，可通过其颜色(例如金纳米颗粒)来检测标记。颜色可由光学读取器或相机(例如带有成像软件的相机)定量检测。
[0201]
在某些实施方案中，所述可检测标记是荧光标记，例如量子点。在这些实施方案中，所述检测装置可包括经配置记录荧光强度的荧光板读取器、条带读取器或类似装置。
[0202]
在可检测标记是酶标记的实施方案中，检测装置可以例如是比色、化学发光和/或电化学装置(例如，采用电化学检测器)。通常，电化学传感是通过将氧化还原报告物(例如亚甲蓝或二茂铁)与适体的一端结合，并将传感器表面与另一端结合。通常，靶结合时适体构象发生变化，改变了报告物和传感器之间的距离，从而提供读数。
[0203]
在某些实施方案中，可检测标记可进一步包含酶，例如辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶(app)或类似物，以催化翻转底物而提供放大信号。
[0204]
在某些实施方案中，本发明提供包含本发明适体和可检测分子的复合物(例如缀合物)。通常，本发明的适体与可检测分子共价连接或物理连接。
[0205]
在某些实施方案中，可检测分子是可视的、光学的、光子的、电子的、声学的、光声的、质量的、电化学的、电光的、光谱的、酶的或其他物理的、化学的或生物化学的可检测标记。
[0206]
在某些实施方案中，可检测分子通过发光、uv/vis光谱、酶法、电化学或放射性检测。发光是指发射光。例如，光致发光、化学发光和生物发光用于检测标记。在光致发光或荧光中，通过吸收光子而激发。示例性荧光团包括但不限于双苯并咪唑、荧光素、吖啶橙、cy5、cy3或碘化丙啶(可共价连接到适体)、四甲基
‑6‑
羧基罗丹明(tamra)、德克萨斯红(tr)、罗丹明、alexa荧光染料(不同公司生产的不同波长的荧光染料等)。
[0207]
在某些实施方案中，可检测分子是胶体金属颗粒，例如金纳米颗粒、胶体非金属颗粒、量子点、有机聚合物、乳胶颗粒、纳米纤维(例如碳纳米纤维)、纳米管(例如碳纳米管)、树状聚合物、蛋白质或具有信号产生物质的脂质体。胶体颗粒可以用比色法检测。
[0208]
在某些实施方案中，可检测分子是酶。在某些实施方案中，酶可将底物转化成有色产物，如过氧化物酶、荧光素酶、β
‑
半乳糖苷酶或碱性磷酸酶。例如，无色底物x
‑
gal通过β
‑
半乳糖苷酶的活性转化为颜色可通过肉眼检测的蓝色产物。
[0209]
在某些实施方案中，可检测分子是放射性同位素。检测也可以通过标记适体的放射性同位素进行，所述放射性同位素包括但不限于3h、14c、32p、33p、35s或125i，更优选32p、33p或125i。在闪烁计数中，间接测定放射性标记适体
‑
靶复合物的放射性辐射。闪烁体物质被同位素的放射性发射激发。在闪烁材料转变回到基态的过程中，激发能以闪光的形式再次释放，并被光电倍增管放大和计数。
[0210]
在某些实施方案中，可检测分子选自地高辛和生物素。因此，适体也可以用被抗体或链霉亲和素结合的地高辛或生物素标记，而抗体或链霉亲和素可携带标记，例如酶缀合物。以前适体与酶的共价连接(结合)可以通过几种已知的方式实现。适体结合的检测也可以通过在ria(放射性免疫测定)中用放射性同位素标记(优选用125i)适体来实现，或通过在fia(荧光免疫测定)中采用荧光团，优选采用荧光素或fitc发射荧光来实现。
[0211]
装置
[0212]
根据本发明的装置可以以多种不同的形式提供。在某些实施方案中，本发明提供用于检测样品中伊马替尼的存在、不存在或水平的装置，所述装置包含本文所描述的适体。
[0213]
在某些实施方案中，所述装置包含本文所描述的载体。例如，在没有伊马替尼的情况下，所述适体可以直接或间接固定在载体上以进行固定。
[0214]
在某些实施方案中，所述装置包含本文所描述的固定寡核苷酸。
[0215]
在某些实施方案中，适体可以通过与固定寡核苷酸杂交的方式连接，而固定寡核苷酸直接或间接连接到载体上。或者，适体本身可以直接或间接(例如通过接头)与载体表面连接。在此实施方案中，固定寡核苷酸被配置为与适体的至少一部分杂交。在此实施方案中，可以测定固定寡核苷酸和适体之间相互作用的破坏，作为伊马替尼存在的间接测定。
[0216]
本发明的某些实施方案利用适体与伊马替尼结合时改变构象的能力。所述构象变化可能导致适体与固定寡核苷酸分离，从而根据是固定寡核苷酸或是适体与载体连接，释放出固定寡核苷酸或与伊马替尼复合的适体。如果不存在伊马替尼，则适体不会经历构象变化，因此仍然与固定寡核苷酸杂交。
[0217]
在某些实施方案中，所述装置包含与载体连接的接头分子，其中所述接头分子被配置为与适体杂交，并且进一步其中当适体与接头分子杂交时，固定寡核苷酸被配置为与适体杂交。
[0218]
适当地，接头分子与载体连接，其中所述接头分子被配置为与固定寡核苷酸杂交，并且进一步其中当固定寡核苷酸与接头分子杂交时，适体被配置为与固定寡核苷酸杂交。在某些实施方案中，所述接头分子是dna或rna分子或混合的dna/rna分子，其中任选所述接头分子包含一个或多个修饰核苷酸。
[0219]
在某些实施方案中，所述装置可以是生物传感器。生物传感器有许多不同的形式。在某些实施方案中，生物传感器包含适体和将适体与伊马替尼之间的结合事件转化为电学上可量化信号的传感器。生物传感器可以包含在容器或探针等中。
[0220]
此外，所述装置还可以包括其他元件，例如信号处理设备、输出电子设备、显示设备、数据处理设备、数据存储设备及与其他设备的接口。在某些实施方案中，使含有伊马替
尼的样品与生物传感器接触。然后，通过伊马替尼与适体特异性结合后适体特性的变化来鉴定伊马替尼。
[0221]
传感器的灵敏度可能会受所使用的传感器的影响。传感器将来自结合事件的信号(与样品中靶分子的浓度成比例)转换为电学上可量化的测量信号。由于适体和伊马替尼之间的分子相互作用，产生信号。利用本发明所述的生物传感器，可以获得定性、定量和/或半定量的分析信息。
[0222]
光学传感器中的测定可以基于光度学原理，由此例如检测颜色或发光强度变化。光学方法包括荧光、磷光、生物发光和化学发光、红外跃迁和光散射的测定。光学方法还包括测定伊马替尼与适体结合时的层厚变化。例如，层厚可以通过表面等离子体共振(spr)、反射干涉光谱法(rifs)、生物膜层干涉法(bli)或类似方法测定。
[0223]
此外，可以测定薄层上的干涉(spr或rlfs)和渐逝场的变化。声学传感器利用压电石英晶体的频率变化，所述压电石英晶体能检测到靶与适体结合时发生的高度敏感的质量变化。将使用的石英晶体置于振荡电场中，并测量晶体的谐振频率。对石英晶体表面的质量变化进行定量。
[0224]
在某些实施方案中，所述装置是bli(生物膜层干涉测量)装置或类似装置。bli是一种用于测量生物分子相互作用的无标记技术。它是一种光学分析技术，可分析从两个表面反射的白光干涉图的变化：生物传感器尖端上的固定配体层，及内部参考层。与生物传感器尖端结合的分子数量的任何变化都会导致可以实时测量的干涉图变化。只有与生物传感器结合或解离的分子才能改变干涉图并在bli传感器上生成响应曲线。未结合的分子、周围介质折射率的变化或流速的变化不会影响干涉图。置换选择原理允许根据适体的固定序列和固定寡核苷酸之间的双链体形成开发检测分析。靶
‑
依赖性构象变化可能导致适体从双链结构中释放出来。从适体的杂交双链体到置换阶段的这种转换可用于产生可记录的信号，即靶浓度依赖性信号。
[0225]
根据设计，采用所述测量装置可以获得关于待测靶的定性、定量和/或半定量分析信息。检测装置可以是例如便携式仪表。
[0226]
本发明还提供包含本文所描述的任何适体或复合物的测试条和/或侧流装置。侧流装置也可称为侧流试验、侧流测定(lateral flow assay)和侧流免疫测定。
[0227]
在某些实施方案中，侧流装置包括连接固定寡核苷酸的载体。所述固定寡核苷酸经配置与本文所描述的适体固定区的至少一部分杂交。可引入本文所描述的任何样品(例如，血液或血浆样品)。如果样品包含伊马替尼，则适体可与伊马替尼结合并出现构象变化，导致适体与固定寡核苷酸分离。
[0228]
在某些实施方案中，所述装置可适于在例如elisa(酶联免疫吸附测定)中使用。当采用适体代替抗体时，所开展的分析通常被称为“elona”(酶联寡核苷酸分析)、“elasa”(酶联适体吸附分析)、“elaa”(酶联适体分析)或类似叫法。由于适体可以与包括荧光团、猝灭分子和/或本文所描述的任何其他检测单元的多种报告分子结合，因此，在这些类似elisa的分析平台中加入适体可以提高灵敏度，允许检测更多的分析物；包括没有可用抗体和广泛输出的分析物。
[0229]
在某些实施方案中，所述装置可以包含容器。对伊马替尼具有特异性的适体可以通过与容器(例如容器的表面)中的固定寡核苷酸杂交而被固定。可以将可能含有伊马替尼
的样品添加到容器中。如果样品含有伊马替尼，这种靶可能与适体结合，导致构象变化，进而导致适体从固定寡核苷酸上置换。然后，可使用本文所描述的任何合适方法检测被置换的适体。
[0230]
伊马替尼的检测方法
[0231]
在某些实施方案中，本发明提供用于检测样品中伊马替尼的存在、不存在或含量的方法。
[0232]
在某些实施方案中，所述样品是合成样品(例如非生物样品)。例如，所述样品可以是包含(或怀疑包含)伊马替尼的药物组合物。在某些实施方案中，本发明提供用于在药物组合物制造期间定量伊马替尼含量的方法。
[0233]
在某些实施方案中，所述样品是生物样品。例如，所述样品可包括全血、白细胞、外周血单核细胞、血浆、血清、痰、呼气、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、滑液、关节抽吸物、细胞、细胞提取物、粪便、组织、组织活检或脑脊液。通常，所述样品是血液(例如血浆)样品。在某些实施方案中，所述样品例如通过混合、添加酶、缓冲液、盐溶液或标记物，或纯化进行预处理。
[0234]
在某些实施方案中，所述样品来自接受伊马替尼治疗的受试者。所述受试者可以是任何动物(例如猫、狗或马)。通常，所述受试者是人类。通常，所述受试者患有或怀疑患有癌症，例如白血病(如cml或all)、胃肠道间质瘤(gist)、系统性肥大细胞增多症或骨髓增生异常综合征。通常，白血病是费城染色体阳性(ph )。
[0235]
在用于检测样品中伊马替尼的存在、不存在或含量的方法中，使样品与本文所描述的适体相互作用(即接触)。例如，可以将样品和本文所描述的适体在足以使适体的至少一部分与样品中的伊马替尼结合的条件下培养。
[0236]
本领域技术人员将理解本文所描述的适体与伊马替尼之间发生结合所需的条件。在某些实施方案中，样品和适体可在温度大约20℃至大约37℃，优选22℃条件下培养。在某些实施方案中，可采用合适的缓冲液(例如pbs等)将样品和适体稀释至不同浓度(例如至少大约1％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％v/v或更高)。在某些实施方案中，样品和适体可在振动和/或混合的条件下培养。在某些实施方案中，将样品和适体培养至少1分钟、至少5分钟、至少15分钟、至少1小时或更长时间。
[0237]
在某些实施方案中，适体与伊马替尼的结合导致形成适体
‑
伊马替尼复合物。如本文所描述的，结合或结合事件可以例如通过视觉、光学、光子、电子、声学、光声、质量、电化学、电光、光谱、酶或化学、生物化学或物理方法检测。
[0238]
在某些实施方案中，如本文所描述，所述方法包括使样品与本发明的适体和固定寡核苷酸相互作用。如上所述，与伊马替尼的结合可能使适体的构象改变，导致其从固定寡核苷酸中置换。例如，当固定寡核苷酸与载体连接时，伊马替尼与适体的结合可能导致适体从载体上置换。
[0239]
在某些实施方案中，适体与固定寡核苷酸的结合在固定寡核苷酸固定到载体上之前进行。或者，固定寡核苷酸在核酸分子与固定寡核苷酸杂交之前连接到载体上。固定寡核苷酸和/或核酸分子可以连接到载体上。所述连接可以例如通过接头或其它连接单元直接或间接连接。
[0240]
适体和伊马替尼的结合可以采用任何合适的方法检测。如上文所述，例如，可以采
用生物传感器检测适体和伊马替尼的结合。在某些实施方案中，如本文所描述，适体和伊马替尼的结合采用spr、rlfs、bli、lfd或elona检测。
[0241]
有利的是，本发明的适体允许检测临床相关含量的伊马替尼。通常，本发明适体的伊马替尼检测限小于大约1μm，例如小于大约900nm、小于大约800nm、小于大约700nm、小于大约600nm或小于大约500nm。通常，本发明适体的伊马替尼检测范围是大约0.5μm至大约10μm，例如大约0.5μm至大约5μm伊马替尼。因此，适体能够以高特异性和亲和力与伊马替尼结合，并允许检测样品中临床范围的活性伊马替尼。
[0242]
癌症治疗期间监测伊马替尼
[0243]
在某些实施方案中，本发明提供了监测接受伊马替尼治疗的受试者的样品中伊马替尼水平的方法。因此，本发明提供了根据受试者的个人需要调整治疗方案的机会，从而允许更有效和个性化的治疗。
[0244]
在某些实施方案中，本发明提供了根据本文所描述的任何方法检测受试者样品中伊马替尼的含量，然后根据检测的伊马替尼的水平治疗或预防受试者的癌症。
[0245]
在某些实施方案中，所述方法包括在检测受试者样品中伊马替尼的含量之后向受试者施用一定剂量(例如初始剂量)的伊马替尼。
[0246]
在某些实施方案中，癌症是cml(通常为ph )、all(通常为ph )、gist、系统性肥大细胞增多症或骨髓增生异常综合征。通常，所述受试者是人。
[0247]
伊马替尼的初始剂量可以预测为治疗或预防有效量的伊马替尼。通常，口服给药伊马替尼的初始剂量。初始剂量可以根据各种参数来确定，尤其是待治疗的受试者的年龄、体重和状况以及所需的方案。医生将能够确定任何受试者所需的给药途径和剂量。
[0248]
在某些实施方案中，用每天约300mg至600mg伊马替尼的初始剂量治疗最近被诊断为患有ph cml或all的成人或儿童受试者。
[0249]
在某些实施方案中，用每天约400mg伊马替尼的初始剂量治疗患有复发性或难治性ph cml或all的成年受试者。
[0250]
在治疗或预防癌症的方法中，根据本文所描述的方法检测受试者样品中伊马替尼的水平。通常，所述样品是血液样品。通常，检测血样中伊马替尼的最低血浆浓度水平(cmin)(例如，给药下一剂量伊马替尼前，伊马替尼达到的最低浓度)。
[0251]
如果所测伊马替尼的水平低于下阈值水平，则增加向受试者施用的伊马替尼的剂量。在本文中，“下阈值水平”理解为是指被认为不可能在受试者中导致肿瘤响应的血浆中的任何伊马替尼的水平。例如，伊马替尼的下阈值水平可以是大约500ng/ml或更低、大约600ng/ml或更低、大约700ng/ml或更低、大约800ng/ml或更低、大约900ng/ml或更低或大约1000ng/ml或更低。
[0252]“增加剂量”被理解为比初始剂量更高的剂量，其作用是进一步将样品中伊马替尼的水平增加到下阈值水平之上(例如，大约1000ng/ml至大约3000ng/ml)。本领域技术人员例如根据伊马替尼的初始剂量和样品中伊马替尼的水平，将能够计算适当的增加剂量。
[0253]
如果所测伊马替尼的水平高于上阈值水平，则减少向受试者施用的伊马替尼的剂量。在本文中，“上阈值水平”理解为是指被认为可能在受试者中导致毒性的血浆中的任何伊马替尼水平。例如，伊马替尼的上阈值水平可以是大约3000ng/ml、大约3500ng/ml、大约4000ng/ml或更高。
[0254]“减少剂量”被理解为比初始剂量更低的剂量，其作用是进一步将样品中伊马替尼的水平减少到大约1000ng/ml至大约3000ng/ml。本领域技术人员将能够根据伊马替尼的初始剂量和样品中伊马替尼的水平，计算适当的减少剂量。
[0255]
在某些实施方案中，在向受试者施用伊马替尼初始剂量后1周、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或12个月内检测伊马替尼的水平。伊马替尼的水平可检测一次或多次，例如在伊马替尼治疗开始后定期检测。通常，在伊马替尼治疗的第一年内，在伊马替尼治疗的大约第3、6和/或12个月时检测伊马替尼的水平，以便监测伊马替尼的治疗水平(必要时调整到目标水平)。
[0256]
试剂盒
[0257]
本发明还提供用于检测和/或定量伊马替尼的试剂盒，其中所述试剂盒包含如本文所描述的一种或多种适体。通常，所述试剂盒还包含如本文所描述的可检测分子。
[0258]
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括本文所描述的任何方法的使用说明。
[0259]
在某些实施方案中，所述试剂盒还包括如本文所描述的固定序列、载体和/或接头。
[0260]
通常，所述试剂盒包括用于试剂盒预期反应或将要执行的方法的其它组分，例如用于富集、分离和/或隔离程序预期检测的组分。例如缓冲溶液、显色反应底物、染料或酶底物。在试剂盒中，适体可以以多种形式提供，例如预先固定在载体(例如固体载体)上、冷冻干燥或在液体介质中。
[0261]
本发明的试剂盒可用于执行本文所描述的任何方法。应当理解的是，试剂盒的各部分可以单独包装在小瓶中，或者组合包装在容器中或多容器单元中。通常，试剂盒的制造遵循本领域技术人员熟悉的标准程序。
[0262]
实施例
[0263]
在下文中，将通过特定实施方案的非限制性实施例对本发明进行更详细地说明。在实施例的实验中，采用无污染的标准试剂和缓冲液。
[0264]
实施例1
–
适体筛选
[0265]
采用置换筛选法进行单链dna适体的筛选。插入的荧光标记允许在方法的不同步骤后通过荧光测量对dna进行定量。
[0266]
在筛选过程中，将适体文库的ssdna寡聚体通过互补的固定寡核苷酸固定在磁珠上。在不同的洗涤步骤去除未结合和仅弱结合的ssdna分子后，在相同的条件下进行背景洗脱和随后的靶结合步骤。靶结合导致适体构象改变。构象改变导致适体与固定寡核苷酸分离，从而释放/置换与靶分子复合的适体。如果不存在靶分子，则适体分子不会发生构象变化，因此仍然与固定寡核苷酸杂交。
[0267]
直接比较背景步骤中非特异性洗脱物质的含量和由于靶结合而置换的适体的含量，可以跟踪筛选过程。如果与非特异性背景相比，靶结合材料呈指数富集，则适体筛选过程是成功的。富集的适体池可用作“多克隆适体”，也可以从池中分离出单个适体分子。
[0268]
通过引入反筛选步骤，提高了筛选过程的严格性。在这些步骤中，将固定文库采用非特异性的/“不需要的”靶分子固定，以去除与这些非特异性的/“不需要”的靶具有亲和力的ssdna分子。
[0269]
适体文库和寡核苷酸
[0270]
在筛选过程中，适体文库(由比利时idt制造)的ssdna寡核苷酸序列通过互补的固定寡核苷酸(seq id no:31)固定到磁珠上。
[0271]
适体文库的核苷酸序列具有以下结构(5’至3’方向)：
[0272]
p1
ꢀ–ꢀ
r1
ꢀ–ꢀ
i
ꢀ–ꢀ
r2
ꢀ–ꢀ
p2,
[0273]
其中p1是第一引物区，r1是第一随机化区，i是固定区，r2是另一随机化区，p2是另一引物区，其中至少r1和/或r2或其一部分参与靶分子结合。
[0274]
采用以下修饰引物通过pcr扩增寡聚体：具有以下序列的荧光素(fam)标记正向引物(p1)：5
’‑
/56fam/atccacgctctttttctcc
‑3’
和具有以下序列的po4‑
修饰反向引物(p2)：5’/5phos/cctatgtcaccctcaatgc
‑3’
。
[0275]
示例性生物素化固定寡核苷酸(i)具有以下结构：5'bio
‑
gtc
‑
hegl
‑
gatcgagcctca
‑
3'。所有寡核苷酸均由比利时idt公司化学合成。
[0276]
文库的第一随机化区(r1)是任何大约10个核酸的序列。文库的第二随机化区(r2)是任何大约40个核酸的序列。
[0277]
将适体文库固定到磁珠上
[0278]
固定寡核苷酸包含12个核苷酸的定义区，所述定义区与初始文库的ssdna核苷酸序列的固定区互补，从而使序列之间能够杂交。此外，固定寡核苷酸携带通过六乙二醇(hegl)残基结合的5’生物素，所述生物素负责将固定寡核苷酸与链霉亲和素修饰的磁珠偶联。
[0279]
为了进行固定，将3nmol初始文库和2nmol固定寡核苷酸在250μl结合缓冲液“bb”(20mm tris
‑
hcl ph 7.4、100mm nacl、2mm mgcl2、1mm cacl2、0.01％tween 20)中在95℃下加热5分钟开展预杂交。冷却至4℃后，根据制造商的说明，采用b&w(5mm tris
‑
hcl ph 7.5、0.5mm edta、1m nacl、0.01％tween 20)缓冲液，将预杂交文库
‑
固定寡核苷酸混合物采用109个m
‑
270链霉亲和素磁珠(英国thermo fisher scientific公司)培养并固定在所述磁珠上。
[0280]
从第2轮开始，将300pmol fam标记的适体文库和200pmol固定寡核苷酸序列在100μl结合缓冲液(bb)中使用与上述相同的方案进行杂交。根据制造商的说明，将预杂交的适体文库
‑
固定寡核苷酸混合物固定在108个m
‑
270链霉亲和素磁珠上。
[0281]
置换法体外筛选
[0282]
将荧光标记混入适体文库，可通过荧光板读取器分析，在过程的每个步骤后定量适体dna。采用bmg荧光板读取器(英国bmg fluostar optima公司)在以下测量条件下对荧光素(fam)标记的dna进行荧光测量：激发485nm/发射520nm。
[0283]
靶置换和回收的适体dna的定量基于利用fam标记的ssdna(寡核苷酸文库)的校准曲线进行计算，所述校正曲线的范围为0
‑
50pmol/ml，是为相关适体筛选缓冲液中的每个适体文库绘制的。
[0284]
将靶伊马替尼(英国sigma
‑
aldrich公司)在dmso中稀释至1mg/ml(1.7mm)储备溶液并于
‑
20℃储存。在使用前，采用筛选缓冲液pbs6(10mm na2hpo4/2mm kh2po4,ph 6.0,137mm nacl、2.7mm kcl、2mm mgcl2、1mm cacl2、0.01％tween 20)配制20μm的工作储备溶液。对伊马替尼靶向适体筛选中采用的缓冲液进行优化以提高筛选效率。
[0285]
进行了连续几轮的置换筛选过程，包括以下步骤；经过优化以减少与不需要的靶
的相互作用，去除弱结合序列或通过机械过程释放的序列；并提高伊马替尼的筛选效率：
[0286]
‑
根据上述方案将初始适体文库(或从上一轮制备的富集适体文库)与磁珠结合；
[0287]
‑
对固定适体文库含量进行定量(荧光测量)，第一轮筛选输入500pmol固定初始文库，然后每轮筛选输入80pmol固定适体文库；
[0288]
‑
在筛选缓冲液pbs6中，同时以1000rpm的转速振动(德国埃普多夫市thermomix comfort公司)，于28℃高温洗涤步骤中保持15分钟，去除弱结合的寡聚体；
[0289]
‑
在筛选缓冲液pbs6中，同时以1000rpm的转速振动，于22℃条件下背景洗脱45分钟；
[0290]
‑
第8、9和10轮筛选还包括在筛选缓冲液pbs6中，在22℃条件下保持45分钟，同时在1000rpm转速下振动，采用40％人血浆(英国bioivt公司humanpl32ncu2n)开展反筛选步骤；
[0291]
‑
在补充有靶分子(20μm伊马替尼)的筛选缓冲液pbs6中，同时以1000rpm的速度振动，在22℃下进行靶结合45分钟；
[0292]
‑
在每一轮筛选之后，将靶
‑
置换的适体与未置换的适体分离，回收，并采用非等量引物混合物(2μm fam标记的正向引物和0.1μm po4‑
修饰的反向引物)通过半不对称pcr直接扩增；
[0293]
‑
双链dna在30分钟内被去除。根据制造商的方案，在37℃下用lambda核酸外切酶(波兰eurx公司)处理，并使用axyprep mag pcr纯化试剂盒(美国axygen biosciences公司)纯化刚得到的ssdna，从而获得富集适体文库。经筛选和纯化后的适体文库用于后续轮数的置换筛选；
[0294]
‑
在每一轮中，在背景洗脱、反筛选或复杂基质(例如血浆)(如果适用的话)中回收的适体文库的含量及靶结合部分适体文库的含量通过荧光测量进行定量。每个样品中回收材料的含量用于跟踪靶结合适体的富集(相对于背景或反靶结合物)；
[0295]
‑
该程序总共进行10轮，以富集伊马替尼特异性适体。
[0296]
图2示出了高亲和力适体群体的鉴定。在第7轮后，观察到靶置换显著增加，之后包括采用人血浆开展反筛选。第10轮后，分离出靶特异性多克隆群体。
[0297]
生物传感器的构建及适体
‑
靶结合的评价
[0298]
在第10轮筛选后，通过生物膜层干涉法(bli)检测富集适体群体对靶分子伊马替尼的结合特异性。实验采用blitz或octet qk仪器(美国pall life sciences公司的fortebio)进行。
[0299]
为了将适体固定到生物传感器探针(美国pall life sciences公司fortebio链霉亲和素
‑
sa浸&读生物传感器)上，将1.5μm适体(或初始文库)和1μm固定寡核苷酸在缓冲液bb中通过加热至95℃进行预杂交10分钟，然后立即冷却至4℃保持5分钟，然后与等体积的2x b&w缓冲液(10mm tris
‑
hcl ph 7.5、1mm edta、2m nacl、0.02％tween 20)混合。然后，利用固定寡核苷酸上的生物素基团将杂交的寡核苷酸固定到链霉亲和素包被的表面上。将链霉亲和素包被的探针采用所述预杂交混合物培养5分钟。采用缓冲液pbs6进行三个洗涤步骤(30秒，120秒，30秒)，以除去松散固定的文库材料。然后将探针采用靶溶液(pbs6中，20μm伊马替尼或20μm代谢物n
‑
去甲基伊马替尼)培养5分钟。
[0300]
靶结合引起固定适体构象发生变化，导致适体置换，表现为信号降低(图3)。这种
“
浸读”bli测定用于监测适体
‑
靶的相互作用，识别性能最佳的适体克隆和用于比较动力学分析。
[0301]
fortebio系统的软件(fortebio数据分析8.0)允许“翻转”信号以进行比较动力学分析。采用这种方法，bli结合分析显示，与初始文库相比，所筛选的适体群体与选择靶伊马替尼的结合及与伊马替尼主要代谢物n
‑
去甲基伊马替尼的结合情况都有所改善(参见图4)。
[0302]
克隆
[0303]
在最后一轮筛选之后，将回收的适体文库采用未修饰的正向引物和反向引物通过pcr扩增。按照制造商的方案(英国thermo fisher scientic公司的clonejet pcr克隆试剂盒)将纯化的dsdna克隆到pjet1.2/平末端(blunt)克隆载体中，并用于转化大肠杆菌(neb 5
‑
α大肠杆菌c2987h细胞)的测序菌株，采用质粒特异性引物(英国thermo fisher scientic公司clonejet pcr克隆试剂盒pjet正向引物和pjet反向引物)通过“菌落pcr”对96个阳性转化体/克隆进行了分析。同时，使用适体特异性fam标记的正向引物和po4‑
修饰的反向引物，通过“适体pcr”从相同的转化体/克隆产生适体dna。
[0304]
单个适体的鉴定
[0305]
根据上述克隆方案，为单个dna克隆制备单链dna。然后使用上述bli测定分析每个克隆与靶的结合。两个克隆对靶伊马替尼表现出高亲和力(图5)。
[0306]
对适体1和适体2克隆的dna进行测序。使用ebi网络服务器(http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/)提供的网络工具clustalw对获得的序列数据进行分析和比对。采用最小自由能算法mfold进行适体的二级结构分析[zuker,m.(2003)mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.nucleic acid res.31(13),3406
‑
15](http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold)(图1)。
[0307]
适体特异性的测定
[0308]
根据上述方案，使用bli分析测定适体特异性。将靶伊马替尼、代谢物n
‑
去甲基伊马替尼、阴性靶1伊立替康、阴性靶2sn
‑
38以10μm(pbs6中)应用(图6)。
[0309]
从图6中可以清楚地看出，与初始文库和第10轮筛选的富集适体群体相比，适体1和适体2对选择靶及其主要代谢物的结合反应都得到改善。其他测试的(结构上和功能上相关)小分子靶并不与适体1或适体2结合。特异性研究采用bli置换分析进行(翻转数据，减去缓冲液)。
[0310]
适体
‑
伊马替尼表观结合亲和力的测定
[0311]
使用直接结合分析通过表面等离子体共振(spr)测定表观适体亲和力。根据制造商的建议，将s系列cap芯片(ge healthcare 28920234)在biacore t200(瑞典乌普萨拉市ge healthcare)中对接、水合和预处理。根据制造商的建议，使用1μm的浓度、5μl/min的流速和10分钟的接触时间，将仪器置入pbs6缓冲液中，并在芯片表面捕获5’生物素化适体。将全长适体1(ima c5)、最小片段(ima c5
‑
f6b)和随机对照分别捕获在fc2、fc3和fc4上。伊马替尼的动力学通过多循环动力学测定：30μl/min，两个空白对照，然后注入0.039、0.075、0.157、0.375、0.75、1.5、3、6μm伊马替尼，然后加入空白和0.75μm重复样，接触时间60秒，解离时间60秒。数据采用biacore insight评估软件分析，其中采用1:1结合langmuir结合模型和局部ri参数。适体1(ima c5)对伊马替尼(在pbs6中)的亲和力用1.10x10
‑7m计算(图7)。
[0312]“类elisa”适体置换测定(基于微量滴定板的荧光测定)和人血浆中适体选择性的评估
[0313]
为了将适体固定到链霉亲和素包被的mtp(pierce链霉亲和素包被，hbc，black 96
‑
孔板，包括superblock阻断缓冲液,美国thermo scientific公司)上，将0.75μm适体1和0.5μm固定寡核苷酸在缓冲液bb中通过加热混合物至95℃保持10分钟进行预杂交，然后立即冷却至4℃保持5分钟，然后与等体积的2x b&w缓冲液混合。将微量滴定板mtp 1采用所述预杂交混合物在室温下培养1h，同时在mtp摇床(德国ika werke gmbh&co.kg公司ika sch
ü
ttler mts 4)上以1000rpm振动。通过分别比较培养前和培养后的输入和输出荧光来测定固定效率。这样可以通过荧光测量计算负载适体的近似含量。适体负载板(mtp 1)用筛选缓冲液pbs6充分清洗以去除松散固定的dna，然后在室温下采用梯度靶伊马替尼(10μm、5μm、2.5μm、1.25μm、0.625μm、0μm)培养1小时(1000rpm转速mtp摇床)，梯度靶伊马替尼在4种浓度(缓冲液pbs6中0％、10％、20％和25％v/v基质)的缓冲人血清(英国bioivt公司humanpl32ncu2n)中配制。回收靶
‑
洗脱材料(来自mtp 1)，并通过荧光测量确定靶结合适体的含量。原始数据以“荧光”相对于“靶浓度”以及不同血浆浓度作图。
[0314]
在所有四种血浆浓度下，都可以观察到适体“ima c5”与靶伊马替尼的明显浓度依赖性结合，与相应浓度的单独缓冲血浆的背景结合最小(图8)。在反映这种治疗分子的治疗范围的伊马替尼浓度下进行测试。伊马替尼的检测限小于1μm，这种药物的临床范围具有明显的浓度依赖性反应。
[0315]
实例2
–
适体1的最小有效结合片段的鉴定
[0316]
为了鉴定适体1的最小功能片段，产生了一组片段(亲本适体的截短片段)(由比利时idt制造)。
[0317]
对亲本适体1的一组截短片段进行测试，测试其与靶伊马替尼(10μm，在pbs6中)的结合能力。特别是，采用bli置换结合研究来鉴定适体1的最小有效片段。测试适体1的一组截短片段与靶伊马替尼(10μm，在pbs6中)的结合能力。采用bli置换分析进行最小片段鉴定研究(翻转数据，减去缓冲液)。许多适体片段失去了结合能力，表明结合位点已被去除或受损。相对于亲本适体(ima c5)，其他片段显示出更好的结合。我们发现，这组片段中最小且性能最佳的适体片段是片段f6b(seq id no:3)。
[0318]
最小有效片段ima c5
‑
f6b的表观结合亲和力使用上述biacore仪器，采用直接结合方法的方案通过spr进行测试。适体片段ima c5
‑
f6b对伊马替尼(在pbs6中)的表观亲和力用7.21x10
‑8m计算(图10)。
[0319]
使用如上所述的bli置换分析确定适体特异性(图11)。使用几个相关靶确定靶诱导的置换，并证明了最小功能片段与伊马替尼和代谢物n
‑
去甲基伊马替尼结合，但不与阴性靶伊立替康结合。
[0320]
人血浆中适体选择性的评估通过如上所述的类elisa适体置换分析(基于微量滴定板的荧光分析)验证(图12)。结果表明，最小功能片段ima c5
‑
f6b能够在人血浆存在下与伊马替尼特异性结合，而与单独血浆的背景结合最小。在反映这种药物治疗范围的目标浓度下进行测试。
[0321]
读者应注意与此说明书同时提交、或在本说明书之前提交的与本技术有关的、可供公众查阅的所有论文和文件，通过引用，所有这些论文和文件都并入本文中。