用于产生包含治疗剂或显像剂的细胞外囊泡的流体系统及相关方法与流程

1.本发明一般涉及细胞外囊泡的生产和至少一种治疗剂或显像剂的加载。更具体地，本发明涉及用于将治疗剂或显像剂加载到生产细胞的细胞外囊泡中的系统和，涉及用于加载治疗剂或显像剂以及用于回收此类囊泡和由此系统产生的囊泡的方法，所述细胞外囊泡可以作为例如用于递送治疗剂或显像剂的载体、作为细胞治疗的替代和在再生医学方面而令人感兴趣。


背景技术：

2.已知细胞在它们的环境中，例如，在体内，在生物体的生物流体中释放细胞外囊泡。细胞外囊泡已被确定为以个性化或靶向方式将药物递送到人体中的有效手段。它们首先具有天然的生物相容性和免疫耐受性。它们还可以内化治疗诊断纳米颗粒，从而可以对身体的某些部位进行成像并递送具有治疗功能的活性成分。细胞外囊泡还具有细胞间通讯功能：例如，它们允许在不同细胞之间运输脂质、膜和细胞质蛋白和/或细胞质的核苷酸，例如mrna、microrna或长链非编码rna。
3.特别地，细胞外囊泡的使用可以解决细胞的治疗用途中已知的问题，例如细胞复制、分化、血管闭塞、排斥风险以及储存和冷冻困难。因此，工业上需要以足以用于治疗用途的量生产功能化(即加载有感兴趣的化合物)的细胞囊泡，特别是作为细胞疗法的替代或补充。细胞外囊泡(ev)的独特性质及其生物耐受性现在被认为是递送生物活性大分子的优势，同时保护在体液中循环的酶。
4.治疗用途的两个主要挑战是(i)产生足够临床使用的量的ev和(ii)加载感兴趣的生物活性化合物的效率。
5.至今，描述了两种主要类型的加载技术，(i)亲代细胞的生物修饰，或(ii)在生产后通过物理方式加载ev。关于亲代细胞的加载，已经描述了自发加载或通过转染的技术。例如，细胞被设计为在ev上过表达的lamp2b蛋白的细胞外部分上表达rvg肽(alvrez
‑
erviti等人,2011)。然而，这种通过编码融合到感兴趣的肽的lamp2b的质粒来转染母细胞的策略需要时间，带来挑战，并且会难以遵守良好处理实践(良好生产规范或gmp)的可扩展流程。同时，电穿孔法是可用于在生产后加载ev的方法。该方法用于在ev中加载各种化合物，如sirna(shtam等人,2013)、dna(lamihhane等人,2015)和阿霉素(tian等人,2014)。然而，由于sirna聚集体的形成，sirna加载被发现是无效的。国际申请wo 2004/083379还描述了将外源性剂加载到细胞外囊泡中的方法，该方法包括施加电荷。另一种获得功能化ev(即加载有感兴趣的化合物的囊泡)的方法包括破坏ev以使其功能化(haney等人,2015)。这种方法易于实施，但不能保留囊状结构，这会导致膜和蛋白的不对称性丢失，其中膜蛋白重排不良。smyth等人公开了通过点击化学加载ev的方法。该方法包括用特定的官能团加载ev的膜蛋白，以便将这些蛋白质与感兴趣的化合物结合。然而，这种方法不能对囊泡的腔进行加载。
6.因此，有必要提供获得功能化细胞外囊泡(ev)的方法，其中囊泡的拓扑结构和原有性质被保留，并且使得能够对囊泡的腔加载。该方法还需要用各种化合物，以任何类型的样品体积，来加载ev。最后，这种方法也需要加载ev用于与符合良好生产规范(gmp)相容的临床使用，或通过减少步骤数易于实施，并允许获得大量加载的和包含大量物质的ev，等等。


技术实现要素：

7.本发明的一个目的是提供一种解决方案，该解决方案用于将治疗剂和/或显像剂加载到生产细胞的细胞外囊泡的膜或腔中，从而在符合gmp标准的条件下，比使用已知方法更快速和更有效地使大量细胞外囊泡功能化。本发明的另一个目的是提出用于增加囊泡中的治疗剂和/或显像剂的加载系统的产率，即加载有治疗剂和/或显像剂的囊泡的数量与非加载囊泡的数量的比率的解决方案。本发明的另一个目的是提出以连续方式或分批加载、生产和回收加载有治疗剂和/或显像剂的细胞外囊泡的解决方案。最后，本发明的另一个目的是简化用于加载和生产加载有治疗剂和/或显像剂的囊泡的流体系统的结构并降低其制造成本。
8.因此，本发明提出了用于将治疗剂和/或显像剂加载到由流体系统产生的细胞外囊泡的解决方案。
9.特别地，本发明的一个目的是用于将治疗剂和/或显像剂加载到生产细胞的细胞外囊泡(ev)的膜或腔中的流体系统，其包括至少一个容器、容器所包含的液体培养基、生产细胞、适合用于生产细胞生长的液体培养基搅拌器，其特征在于它还包括用于控制搅拌器速度的装置，搅拌器和容器的尺寸适合在容器中产生液体培养基的湍流，从而对生产细胞施加剪切应力，以便将治疗剂和/或显像剂加载到由流体系统同时产生的细胞外囊泡(ev)的膜或腔中。
10.应当理解，使用这样的系统，可以在符合gmp标准的系统中生产大量加载有治疗剂和/或显像剂的囊泡。它还包括这样的系统，其用于加载和功能化细胞外囊泡比已知系统更简单且制造成本更低，流的柯尔莫哥洛夫(kolmogorov)长度小于100μm。
11.本发明有利地通过以下特征完成，单独地或以其任何技术上可能的组合进行：
12.‑
流的柯尔莫哥洛夫长度小于或等于100μm，优选小于或等于70μm；更优选小于或等于60μm；
13.‑
流体系统包括出口和连接到出口的连接器，所述连接器能够包括液体培养基和细胞外囊泡；
14.‑
流体系统包括微载体，贴壁生产细胞附着到所述微载体上；
15.‑
搅拌器优选为旋转式搅拌器，其转速或速度、形状、尺寸与容器的形状和尺寸相适应，以在容器中产生液体培养基的湍流；
16.‑
微载体为微球，所述微球直径为100μm至300μm；
17.‑
流体系统包括细胞外囊泡的分离器，其与容器流体连通以便能够将贫细胞外囊泡(ev)的液体培养基重新引入容器中。流体系统可包括分离器上游的关闭装置，用于关闭或打开连接器，从而获得用于连续或不连续回收囊泡的系统。
18.本发明的另一个目的是将治疗剂和/或显像剂加载到生产细胞的细胞外囊泡(ev)
的膜或腔中的方法，其包括：
19.·
用于控制搅拌器速度的装置，驱动容器中液体培养基的湍流，对生产细胞施加剪切应力，以便将治疗剂和/或显像剂加载到细胞外囊泡(ev)的膜或腔中，容器中流的柯尔莫哥洛夫长度小于100μm，优选小于或等于70μm，更优选小于或等于60μm，容器包括出口、包含治疗剂和/或显像剂的液体培养基、生产细胞，和
20.·
在容器出口处收集包含细胞外囊泡(ev)的液体培养基。
21.该方法有利地通过以下特征来完成，单独地或以其任何技术上可能的组合进行：
22.‑
搅拌液体培养基超过二十分钟；
23.‑
控制搅拌器以驱动液体培养基的流动恒定、间歇、强度增加或减少，流的柯尔莫哥洛夫长度小于100μm，优选小于或等于70μm，更优选小于或等于60μm；
24.‑
分离器，其使得可以时在容器出口处收集的一部分液体培养基贫细胞外囊泡，并且将此贫细胞外囊泡的液体的重新引入到容器中的部分液体培养基中；
25.‑
收集后进行超速离心或切向过滤的步骤以分离液体培养基中的囊泡、生产细胞和治疗剂和/或显像剂；
26.‑
容器出口处的细胞外囊泡(ev)包括加载有治疗剂和/或显像剂的细胞外囊泡或未加载的细胞外囊泡的混合物；
27.‑
流动允许同时加载治疗剂和在容器中产生细胞外囊泡(ev)。
28.根据本发明的方法加载细胞外囊泡也可以独立于它们的生产进行。因此，本发明的一个目的是通过直接使用先前产生的细胞外囊泡的悬浮液来加载至少一种治疗剂和/或显像剂的方法。因此，本发明的一个目的是用于加载到细胞外囊泡(ev)的膜或腔中的方法，其包括：
29.‑
在液体培养基(5)中提供细胞外囊泡，
30.‑
控制搅拌器的速度，使容器中产生液体培养基的湍流，从而对囊泡施加剪切应力，以便将治疗剂和/或显像剂加载到细胞外囊泡的膜或腔中，流的柯尔莫哥洛夫长度小于100μm，液体培养基包含治疗剂和/或显像剂。
31.本发明的另一个目的是将至少一种治疗剂和/或显像剂加载到生产细胞的膜或细胞质中的方法，其包括：
32.·
控制搅拌器的速度，使容器中产生液体培养基的湍流，从而对生产细胞施加剪切应力，以便将治疗剂和/或显像剂加载到生产细胞的膜或细胞质中，容器中流的柯尔莫哥洛夫长度小于或等于100μm，优选小于或等于70μm，更优选小于或等于60μm，容器包括出口，包含治疗剂和/或显像剂的液体培养基、生产细胞，和
33.·
在容器出口处收集包含细胞外囊泡的液体培养基。
34.这种加载生产细胞的方法有利地通过以下特征来完成，单独地或以其任何技术上可能的组合进行：
35.‑
搅拌液体培养基超过20分钟；
36.‑
控制搅拌器以驱动液体培养基的流动恒定、间歇、强度增加或减少，流的柯尔莫哥洛夫长度小于100μm，优选小于或等于70μm，更优选小于或等于60μm。
37.如实验所证明的，本发明的系统或方法能够以与被动加载/产生的囊泡和/或细胞相比特别高(测得的增加从39％到592％不等)的浓度获得由至少一种治疗剂和/或显像剂
加载的囊泡和/或生产细胞。因此，所述生产细胞和细胞外囊泡是特别令人感兴趣的，并且因此构成本发明的一个目的。本发明的囊泡作为至少一种治疗剂和/或显像剂的载体特别令人感兴趣。这些用途也构成本发明的一个目的。
38.更具体地，如与替莫泊芬相关的数据所示，与脂质体制剂相比，根据本发明的方法加载的囊泡具有改善的药效学和治疗特性。因此，本发明的一个特定目的是，对于根据本发明在其任一实施方案中的方法、根据该方法获得的细胞外囊泡、生产细胞，其中所述治疗剂选自替莫泊芬、两性霉素b、柔红霉素、伊立替康、长春新碱和阿糖胞苷。
39.定义
40.术语“细胞外囊泡”通常指由生产细胞内源性释放的囊泡，其直径为30nm至5000nm。细胞外囊泡特别地指外排体和/或微囊泡和/或细胞凋亡体。本领域已知细胞外囊泡含有来自生产细胞的膜和/或细胞质标记物。这些标记物使得可以识别和表征这些囊泡，并对它们的功能负责。如实验部分所示，例如，根据本发明的囊泡比脂质体更有效，并且能够改善它们负载的分子的药代动力学/药效学(pk/pd)。
41.术语“生产细胞”通常表示不粘附在培养基上的细胞，或粘附在培养基上并且可以分裂和繁殖的贴壁细胞。根据本发明的另一方面，术语“生产细胞”是指人类、动物或植物来源的细胞，或者源自能够分泌细胞外囊泡的细菌或其他微生物。在贴壁细胞的情况下，它们本身可以粘附到悬浮在液体培养基中的微载体上。根据本发明的另一方面，术语“生产细胞”是指细胞聚集体。术语“细胞聚集体”是指多个彼此牢固粘附的生产细胞的集合。搅拌器产生的温和混合物使粘附的生产细胞在液体培养基中保持悬浮。
42.术语“微载体”和“微支持体”表示允许粘附在其表面或内部的生产细胞生长的球形基质，其尺寸为50μm至500μm，优选为100μm至300μm。微载体通常是珠子，其选择的密度基本上接近于生产细胞的液体培养基的密度。因此，温和的混合物允许珠子在液体培养基中保持悬浮。
43.术语“治疗剂”或“显像剂”通常指任何可以被加载、插入到细胞外囊泡中的感兴趣的试剂。这些试剂可以是治疗剂、显像剂、用于治疗目的、成像目的的纳米颗粒等。如实验数据所示，本发明能够允许改进多种尺寸的治疗剂或显像剂的加载，例如小分子、聚合物、蛋白质等，而与生产细胞的类型无关。因此，由于通过根据本发明的方法掺入并因此可被本发明的细胞外囊泡负载的治疗剂的可能的多样性，并且还由于可用的生产细胞的广泛多样性，根据本发明的囊泡可用于任何一种疗法；例如，并且以非限制性的方式，它可以是感染性疾病、炎性疾病、免疫性疾病、代谢性疾病、癌症疾病、遗传疾病、退行性疾病或继发于手术或创伤疾病的疗法。特别优选低生物利用度的分子的载体化。类似地，可将多种显像剂和/或示踪剂加载到根据本发明的细胞外囊泡中，例如但不限于，荧光剂、发光剂、放射性同位素、具有磁性、等离子体、声学或不透射线性质的造影剂。它也可以是与这些试剂偶联的蛋白质或其他生物或合成分子，包括靶向试剂，以便改变囊泡的生物分布。
44.术语“搅拌器”通常表示用于搅拌液体的装置。这可以是至少部分地与一部分液体接触并且使得可以使该液体运动的机械部件。例如，旋转式搅拌器就是这种情况。本领域技术人员知道，通过改变旋转式搅拌器的形状特征，或者通过单独或结合使用其他类型的动作，可以使用多种变化，以诱导液体运动的方式来产生液体运动和混合。因此，“摇动
‑
闪蒸”反应器使用摇动动作来引起液体及其混合物的运动；“气
‑
升”反应器利用向液体中注入气
泡来产生液体的运动及其混合物。存在其他反应器配置，其任选地利用使用柔性外壳来容纳液体，与柔性外壳的变形相关联以产生液体运动和混合物。同样地，可以通过反应器相对于重力倾斜的周期性变化来获得混合运动，从而在液体中产生波浪，并促进流动和混合。最后，反应器中存在的静态结构，例如挡板，或形成液体运动的部分屏障的结构，如静态混合器中所用的，自然也可以使用。
45.术语“搅拌器”应在一个非常大的方向上理解，即任何方式或任何方式的组合，用于在液体培养基中产生流的组合、培养基混合物和产生湍流。
附图说明
46.其他特征和优点将从以下描述中变得明显，这些描述纯粹是说明性的而非限制性的，并且必须结合附图阅读，其中：
47.图1示意性说明流体系统，其用于将治疗剂和/或显像剂从悬浮的生产细胞加载到细胞外囊泡的膜或腔中；
48.图2示意性说明流体系统，其用于将治疗剂和/或显像剂从贴壁的生产细胞加载到细胞外囊泡的膜或腔中，并且包含微载体；
49.图3a、3b分别说明nta获得的ev的尺寸分布和通过cryo
‑
tem获得的形态学分析；
50.图4说明加载有mthpc的囊泡的荧光分析。
51.图5说明携带ht29肿瘤的小鼠中静脉注射(0.3mg/kg感兴趣的药剂)后根据所选组织中的荧光强度随着时间发生的变化，来研究的市售mthpc(a和b)脂质体制剂和含有mthpc(c和d)的囊泡的生物分布。
52.图6说明携带ht29肿瘤的小鼠静脉注射(0.3mg/kg感兴趣的药剂)后根据所选组织中的荧光强度随着时间发生的变化，来研究根据本发明的用mthpc(a和b)加载的囊泡的生物分布。
53.图7说明在携带ht29肿瘤的小鼠中静脉注射mthpc或mthpc
‑
ev(0.3mg/kg mthpc)的脂质体制剂后表达的mthpc的血浆浓度随着时间发生的变化。
54.图8说明用游离mthpc治疗后ht29肿瘤生长迟缓的kaplan
‑
meier图；用激光激活药物(光动力疗法)的mthpc脂质体制剂(mthpc脂质体)和mthpc囊泡，与未用激光激活的相同组(对照，虚线)对比。
55.图9说明柯尔莫哥洛夫长度对huvec的阿霉素加载量(阿霉素的细胞浓度)的影响。
56.图10说明柯尔莫哥洛夫长度对huvec细胞外囊泡的阿霉素加载量的影响(阿霉素浓度为106个囊泡)。
57.图11说明以nta(灰色条)或荧光素酶的任意发光单位测量，柯尔莫哥洛夫长度对所形成的huvec的细胞外囊泡的数量的影响。对于48μm的l
k
，无论是否存在加载物(fitc葡聚糖70kda)，都可获得相当数量的囊泡。
58.图12说明柯尔莫哥洛夫长度对fitc
‑
葡聚糖70kda加载的huvec细胞外囊泡的影响，其通过囊泡中包含的fitc荧光(任意单位)来测量。
59.图13说明柯尔莫哥洛夫长度对fitc葡聚糖70kda(图13a)或fitc葡聚糖10kda(图13b)对由huvec细胞形成的不同尺寸的囊泡的加载的影响，其通过囊泡中包含的fitc(任意单位)的荧光来测量。黑条，l
k
＝245μm下的加载，白条，在l
k
＝48μm下的加载。
具体实施方式
60.理论要素
61.柯尔莫哥洛夫长度(或柯尔莫哥洛夫尺寸或涡流长度)是流体的黏度使其能够耗散该流体的流动动能的长度。实际上，柯尔莫哥洛夫长度相当于湍流中最小涡流的大小。该长度l
k
根据柯尔莫哥洛夫的出版物(柯尔莫哥洛夫,a.n.,1941,january,the local structure of turbulence in incompressible viscous fluid for very large reynolds numbers,in dokl.akad.nauk,sssr,vol.30,no.4,pp.301
‑
305)计算，并由以下公式(i)描述：
62.l
k
＝v
3/4·
ε
‑
1/4
ꢀꢀꢀ
(i)
63.其中，ν是流动的液体培养基的运动黏度，ε是每单位质量流体中能量耗散的平均速率(或流体中的能量注入速率)。
64.zhou等人(zhou,g.,kresta,s.m.,1996,impact of tank geometry on the maximum turbulence energy dissipation rate for impellers,aiche journal,42(9),2476
‑
2490)描述平均值ε与容器几何结构之间的关系，其中通过桨叶式搅拌器搅拌液体培养基。此关系由以下公式(ii)给出：
[0065][0066]
其中，n
p
为搅拌器在液体培养基种的功率的值(或牛顿数)，d为搅拌器的直径(单位：米)，n为转速(单位：每秒转数)，v为液体培养基体积(单位：立方米)。该关系用于计算与用于实施本发明的容器和搅拌器的几何形状相对应的平均值ε。功率的值n
p
通过公式(iii)以已知方式给出：
[0067][0068]
其中，p为搅拌器提供的功率，ρ为液体培养基的密度。公式(iii)可以按照nienow等人(nienow,a.w.,&miles,d.,1971,impeller power numbers in closed vessels,industrial&engineering chemistry process design and development,10(1),41
‑
43)或zhou等人(zhou,g.,kresta,s.m.,1996,impact of tank geometry on the maximum turbulence energy dissipation rate for impellers,aiche journal,42(9),2476
‑
2490)中描述的，随着液体培养基流的雷诺数来调整。也可以通过以下公式(iv)计算系统的雷诺数：
[0069][0070]
或者，本领域技术人员可以使用其常识和其它计算模式，基于每单位体积的平均能量耗散率来计算柯尔莫哥洛夫长度。在任何状态下，上述计算只是本领域技术人员已知的其他方法中计算柯尔莫哥洛夫长度的方法之一，并且是在不限制本发明范围的情况下说明本发明的一个实施方案。一般来说，对于选定的容器和搅拌器，本领域技术人员将知道应用由搅拌器的提供者提供的n
p
，从而确定如何获得期望的l
k
。
[0071]
流体系统的一般结构
[0072]
图1和2示意性地说明用于加载细胞外囊泡(ev)的流体系统(1)。用于加载细胞外
囊泡(ev)的流体系统(1)旨在产生在容器(4)中加载的大量细胞外囊泡(ev)。然而，本发明不限于此实施方案，并且可以包括并联或串联流体连通的一系列容器(4)。
[0073]
容器(4)包含液体培养基(5)。容器(4)可以特别是罐、法兰，例如由玻璃或塑料制成，或任何其他适于容纳液体培养基(5)的容器。容器(4)的体积是使得能够大量产生细胞外囊泡(ev)的因素之一：该体积可以为50ml至500l，优选100ml至100l，更优选300ml至40l。在图1所示的实施方案的非限制性实例中，图1或图2中示意性地示出的容器(4)的体积为1l，其允许所产生的囊泡的连续分离，液体培养基(5)可由第一泵(16)经由连接器(13)从容器(4)中取出，以便将液体培养基(5)运输至收集器(19)。另一个泵(16’)可以通过另一个连接器将包含在收集器(19)中的液体培养基(5)供给到分离器(15)的入口(10)。分离器(15)的第一出口(11)通过连接器与容器(4)连接，从而将贫细胞外囊泡(ev)的液体培养基5重新引入至容器(4)。分离器(15)的第二出口(12)通过连接器与收集器(19)连接，从而使包含在收集器(19)中的液体培养基(5)富集细胞外囊泡(ev)。或者，分离器(15)的入口(10)可以直接(或者通过第一泵(16))连接到容器(4)的出口(9)。分离器(15)的第一出口(11)连接到容器(4)，分离器(15)的第二出口(12)连接到收集器(19)。几个分离器也可以串联布置以改变细胞外囊泡ev在液体培养基5中的分离程度，和/或并联布置以使每个分离器15中液体培养基5与到第一泵16的流速相适应。可在出口(9)处布置过滤器(18)，从而在从容器(4)中取出细胞外囊泡ev时过滤生产细胞(6)和细胞碎片。
[0074]
容器(4)通常包括一个或多于一个气体入口和一个或多于一个气体出口，由此其中可流动适合于细胞培养的包含一定浓度的空气、n2、o2和co2的气氛，例如包含5％的co2的气氛。该气氛可来自合适的气体喷射器/混合器或co2控制气氛烘箱。泵(17)用于控制容器(4)中的这种气流。容器(4)还包括出口(9)，其能够包括液体培养基(5)和细胞外囊泡(ev)。该出口可补充有分离和/或过滤悬浮细胞的装置，使得悬浮在容器(4)外的细胞不可回收。该出口(9)使得能够从容器(4)中取出产生的细胞外囊泡(ev)。容器(4)还可包括至少一个适于将液体培养基(5)引入容器(4)的入口(8)。
[0075]
液体培养基(5)通常可以是盐水溶液，例如等渗溶液。液体培养基5优选是添加了能够培养感兴趣的细胞的化合物的液体培养基，或补充有先前由细胞外囊泡或无血清培养基纯化的血清或血小板裂解物的培养基，使得流体系统1产生的细胞外囊泡(ev)能够不被源自血清的蛋白质或其他囊泡污染。可以使用无血清dmem液体培养基(5)。液体培养基(5)的最大体积部分地由容器(4)决定。最大体积也可以为50ml至500l，优选为100ml至100l，更优选为300ml至40l。容器(4)所包含的液体培养基(5)的最小体积部分取决于可以搅拌液体培养基(5)的搅拌器(7)的选择。
[0076]
根据一个特定实施方案，流体系统(1)可以包括悬浮在液体培养基(5)中的微载体(3)。当生产细胞(6)是贴壁细胞时，微载体特别有利。微载体(3)可以是微珠(14)，例如葡聚糖，每个微珠(14)能够覆盖有一层胶原蛋白或细胞培养所需的其他材料。其他材料可用于制造微载体(3)，例如玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、胶原蛋白和/或褐藻胶。一般来说，所有适合于细胞培养的微载体(3)都适合于产生细胞外囊泡(ev)。微载体(3)的密度可以例如略大于液体培养基(5)的密度。葡聚糖中微珠(14)的密度为例如1.04。该密度允许通过轻微搅拌液体培养基(5)使微珠(14)悬浮在液体培养基(5)中，每个微载体(3)在液体培养基(5)中的阻力取决于微载体(3)的密度。微载体(3)的最大尺寸可以为50μm至500μm，优选100μm至
300μm，并且优选130μm至210μm。
[0077]
微载体(3)可以是，例如，cytodex 1型(注册商标)的微珠(14)。由这些微珠(14)形成的粉末可以在使用前再水化和灭菌。再水化可以用于pbs中，然后转移到不含血清的培养基(例如dmem)中，其中微珠在使用前保持在4℃。
[0078]
流体系统(1)还包括生产细胞(6)。根据一个实施方案，生产细胞(6)可以是微载体(3)上的贴壁细胞，或者在另一实施方案中为悬浮细胞。细胞外囊泡ev由流体系统(1)从这些生产细胞(6)(贴壁或悬浮的)加载并产生。
[0079]
可以在加载和生产由流体系统(1)加载的细胞外囊泡(ev)之前，在适合的细胞培养基中的微载体(3)的表面上或在适合于悬浮细胞的细胞培养基中悬浮培养生产细胞(6)。因此，在生产细胞(6)的培养和细胞外囊泡(ev)的加载之间不需要细胞转移，从而避免污染并简化整个过程。根据一个实施方案，大部分生产细胞(6)粘附到微载体(3)的表面，即使一小部分生产细胞(6)可以被剥离，例如通过搅拌液体培养基(5)被剥离。然后其他生产细胞悬浮在液体培养基(5)中或沉降在容器(4)底部。根据本发明的一个具体实施方案，至少50％的生产细胞(6)粘附于微载体(3)的表面，优选至少60％的生产细胞(6)粘附于微载体(3)的表面，优选至少70％的生产细胞(6)粘附于微载体(3)的表面，优选至少80％的生产细胞(6)粘附于微载体(3)的表面，优选至少85％的生产细胞(6)粘附于微载体(3)的表面，优选至少90％的生产细胞(6)粘附于微载体(3)的表面，优选至少95％的生产细胞(6)粘附于微载体(3)的表面，优选至少96％的生产细胞(6)粘附于微载体(3)的表面，优选至少97％的生产细胞(6)粘附于微载体(3)的表面，优选至少98％的生产细胞(6)粘附于微载体(3)的表面，优选至少99％的生产细胞(6)粘附于微载体(3)的表面，优选100％的生产细胞(6)粘附于微载体(3)的表面。因此，小于50％的生产细胞(6)是悬浮的，优选小于40％的生产细胞(6)是悬浮的，优选小于30％的生产细胞(6)是悬浮的，优选小于20％的生产细胞(6)是悬浮的，优选小于15％的生产细胞(6)是悬浮的，优选小于10％的生产细胞(6)是悬浮的，优选小于5％的生产细胞(6)是悬浮的，优选小于4％的生产细胞(6)是悬浮的，优选小于3％的生产细胞(6)是悬浮的，优选小于2％的生产细胞(6)是悬浮的，优选小于1％的生产细胞(6)是悬浮的，优选生产细胞(6)是不悬浮的。优选地，流体系统(1)适于产生温和的搅拌，从而可以使容器(4)内的液体培养基(5)中的生产细胞(6)均质化。通常，可以使用任何类型的生产细胞(6)，包括非贴壁的生产细胞。然后将悬浮的生产细胞悬浮在液体培养基(5)中或沉降在容器(4)底部。
[0080]
容器(4)还包括用于搅拌液体培养基(5)的搅拌器(7)。搅拌器(7)可以是叶片，例如叶轮，其叶片至少部分地浸入液体培养基(5)中，并通过磁力或机械力的传输移动。搅拌器(7)也可以是流速足以搅动容器所包含的液体培养基(5)的液体培养基(5)的输注系统，或者是旋转壁系统(例如，置于辊上)。或者，搅拌器(7)可以是带瓶子的辊类型或带瓶子的瓶子、erlenmees的轨道式搅拌器、带或不带挡板(摇动闪蒸)、肘杆式搅拌器(波浪)、带气动搅拌(气升)的生物反应器或旋转叶片搅拌器，例如船用螺旋桨式搅拌器、拉什顿涡轮、搅拌锚、屏障搅拌器、螺旋带式搅拌器。优选的旋转式搅拌器是立式叶片涡轮机。最后，容器(4)中可存在静态结构，例如挡板，或形成液体运动的部分屏障的结构，例如在静态混合器中使用的结构，自然也可使用。搅拌器(7)和容器(4)的尺寸适于控制容器(4)中液体培养基(5)的湍流。本领域技术人员根据常识知道如何根据容器(4)的尺寸、搅拌器(7)的几何形状和
搅拌强度的变化，计算适合每种类型搅拌器(7)的柯尔莫哥洛夫长度l
k
。术语“湍流”是指雷诺数re大于2000的流。例如，雷诺数可通过公式(iv)计算。优选地，液体培养基(5)的流的雷诺数大于7000，优选为10000，优选为12000。
[0081]
根据本发明用于控制湍流的其它搅拌器(7)是本领域技术人员公知的搅拌器，并且能够安装到根据本发明的系统中。
[0082]
本发明示例性实施方案中使用的搅拌器(7)包括叶片，例如布置在容器4中并由磁力传输系统移动的叶轮。液体培养基(5)中叶片的速度引起液体培养基(5)的流动。搅拌器适于控制从容器(4)的尺寸来看是湍流的流动。在图1或图2中所示的搅拌器(7)的情况下，几个参数使得能够计算代表液体培养基(5)湍流的值,特别是液体培养基(5)的运动黏度v，容器(4)的尺寸和特别是包含在容器(4)中的液体培养基(5)的体积v，与叶片浸没部分相对应的功率n
p
、搅拌器的和特别是叶轮的直径d，叶轮的旋转速度n。因此，用户可以计算代表流的湍流的值随这些参数的变化，特别是柯尔莫哥洛夫长度l
k
，如等式(i)、(ii)和(iii)所给出的。特别地，搅拌器(7)适于控制长度l
k
小于100μm、优选小于或等于80μm的流。更优选地，搅拌器7适于控制其中长度l
k
小于或等于70μm且非常优选小于或等于60μm的流。以一个特别优选的方式，流的l
k
小于或等于55μm，也优选小于或等于50μm。
[0083]
在流体系统(1)的一个示例性实施方案中，搅拌器(7)的旋转速度能够被控制在100rpm(每分钟旋转数)，叶片例如叶轮的直径为10.8cm，并且容器(4)所容纳的液体培养基的体积为400ml。通过式(iii)测得的叶片在液体培养基5的功率n
p
基本上等于3.2。通过公式(ii)计算的每单位质量耗散的能量ε等于5.44.10
‑1·
j
·
kg
‑1。由公式(i)计算的柯尔莫哥洛夫长度l
k
因此等于41.8μm。
[0084]
准备微载体和生产细胞
[0085]
容器(4)可以是一次性的，或者是在任何引入液体培养基(5)、微载体(3)、生产细胞(6)和治疗剂或显像剂之前灭菌。在微载体(3)是微珠(14)时，其也被灭菌。微珠(14)在容器(4)中的生产细胞(6)的包含血清的培养基中培养。这种培养可以使培养基充氧，并在微珠(14)表面至少部分覆盖蛋白质层，促进生产细胞(6)粘附到微珠(14)表面。
[0086]
生产细胞(6)在被引入流体系统(1)之前，是通过包含胰蛋白酶的培养基悬浮的。然后可以将它们以300g离心5分钟以在管底部浓缩，以便用dmem培养基代替包含胰蛋白酶的培养基。然后将生产细胞(6)引入包含培养基和微珠(14)的容器(4)中，其量基本上相当于每个微珠(14)5至20个生产细胞(6)。然后将生产细胞(6)和微珠(14)搅动然后沉降，从而使微珠(14)和生产细胞(6)接触，促进生产细胞(6)粘附到微珠(14)表面。搅拌可以周期性地继续，从而提高生产细胞(6)粘附到微珠(14)表面的均质性，例如每45分钟一次，持续5至24小时。然后在培养基的低速搅拌下进行生产细胞的培养(例如，以20rpm的速度旋转叶片，如叶轮)，以及定期更换培养基(例如每天更换5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％的培养基)。
[0087]
加载治疗剂或显像剂
[0088]
用于细胞外囊泡(ev)的加载和生产的流体系统(1)旨在在容器(4)中大量生产细胞外囊泡(ev)。然而，本发明不限于此实施方案，并且还允许在根据本发明产生的细胞外囊泡(ev)中存在大量治疗剂和/或显像剂。因此，生产细胞(6)和治疗剂或显像剂同时悬浮于液体培养基(5)并在容器(4)中混合。或者，生产细胞(6)可以按顺序添加到液体培养基(5)
中，即，在所述液体培养基(5)中添加治疗剂和/或显像剂之前或之后。一般而言，可使用任何类型的治疗剂和/或显像剂，其中治疗剂可以特别是用于治疗传染病、炎性疾病、代谢性疾病、退行性疾病、创伤性疾病、术后疾病、遗传疾病、恶性肿瘤、罕见疾病、脉管系统疾病、淋巴系统疾病、运动系统疾病、消化系统疾病、神经系统疾病、生殖系统疾病、排泄系统疾病的分子或颗粒，和/或核试剂、磁试剂、光试剂、声试剂(分子或颗粒)。容器(4)还包括如上所述的搅拌器(7)，用于搅拌包括悬浮的生产细胞(6)和治疗剂或显像剂的液体培养基(5)。优选地，流体系统(1)适于产生足够温和的搅拌，以使培养基均匀化，而不会损害生产细胞，但足以在容器(4)的内部的液体培养基(5)施加剪切应力，以便有效地将治疗剂和/或显像剂加载到生产细胞(6)和细胞外囊泡中。
[0089]
根据另一个目的，本发明还涉及由生产细胞(6)离体产生细胞外囊泡的方法，包括：
[0090]
·
控制搅拌器(7)的速度，从而使容器(4)中产生液体培养基(5)的湍流，以对生产细胞(6)施加剪切应力，以便在细胞外囊泡(ev)的腔中进行治疗剂和/或显像剂的加载和生产，在容器(4)中流的柯尔莫哥洛夫长度小于100μm，容器包括出口(9)、包含生产细胞(6)的液体培养基5，和
[0091]
·
收集包括细胞外囊泡(ev)的液体培养基(5)，例如在容器(4)的出口(9)处收集。也可以通过将容器中所含的全部液体(5)转移到另一个容器中来进行收集。任选地，一方面离心的速度适于分离细胞外囊泡，另一方面施用生产细胞和/或粘附在微载体上的生产细胞。
[0092]
在一个特定实施方案中，流的柯尔莫哥洛夫长度小于或等于80μm，或甚至小于或等于70μ，且优选小于或等于60μm。在一个特别优选的模式中，所述柯尔莫哥洛夫长度小于或等于55μm。在一个优选的实施方案中，所述柯尔莫哥洛夫长度小于或等于50μm。
[0093]
根据本发明的一个目的，根据本发明的方法包括加载治疗剂和/或显像剂的步骤。当然，这一步也可以在产生细胞外囊泡之前进行。在该特定实施方案中，因此在实施用于产生细胞外囊泡的方法之前，将感兴趣的治疗剂和/或显像剂加载在产生囊泡的细胞的膜和/或细胞质中。通过本领域的已知方法例如被动加载进行加载，或以优选方式根据用于将至少一种治疗剂和/或显像剂加载到生产细胞(6)的膜或细胞质中的方法来进行加载，该方法包括：
[0094]
‑
控制搅拌器(7)的速度，导致在容器(4)中产生液体培养基(5)的湍流，以对生产细胞(6)施加剪切应力，以便将治疗剂和/或显像剂加载到生产细胞(6)的膜或细胞质中，在容器(4)中，流的柯尔莫哥洛夫长度小于或等于100μm，容器包括出口(9)、包含治疗和/或显像剂的液体培养基(5)、生产细胞(6)，和
[0095]
‑
在容器(4)的出口(9)处收集包含细胞外囊泡(ev)的液体培养基(5)，和
[0096]
‑
任选地，收集加载的生产细胞。
[0097]
根据一个特定实施方案，流的柯尔莫哥洛夫长度小于或等于80μm，或甚至小于或等于70μm，和优选小于或等于60μm。根据一个更特定的特征，l
k
小于或等于55μm。根据另一特定特征，l
k
小于或等于50μm。
[0098]
或者，在另一实施方案中，加载步骤可在产生细胞外囊泡的步骤之后执行。在期望获得第一次生产的未加载的囊泡，随后获得第二次生产的加载有所述治疗剂和/或显像剂
的细胞外囊泡的情况下，该实施方案有意义的，并且这是在放置连续地收集液体培养基(5)的流体系统的情况下。在该实施方案中，一旦囊泡以独立于其产生的方式产生，则通过控制搅拌器(7)的速度导致容器(4)中产生液体培养基(5)的湍流以使囊泡经受剪切应力而进行囊泡的加载，其中含有细胞外囊泡，以便实现将液体培养基(5)中也含有的治疗剂和/或显像剂加载到细胞外囊泡(ev)的腔和膜中，在容器(4)中流的柯尔莫哥洛夫长度小于100μm。根据一个具体特征，流的柯尔莫哥洛夫长度小于或等于80μm，或甚至小于或等于70μm，优选小于或等于60μm。根据一个特别优选的特征，l
k
小于或等于55μm。根据一个更优选的特征，l
k
小于或等于50μm。
[0099]
出人意料的是，如实验部分所证明的，允许生产细胞(6)产生细胞外囊泡的流也允许并同时在生产细胞(6)中加载治疗剂或显像剂，并因此在容器(4)中产生所述加载有治疗剂和/或显像剂的细胞外囊泡(ev)。因此，或者，在另一个实施方案中，加载所述治疗剂和/或显像剂的步骤与产生细胞外囊泡的步骤同时进行。因此，本发明的一个目的也是将至少一种治疗剂和/或显像剂加载到生产细胞(6)的膜和/或细胞质中和/或所述细胞的细胞外囊泡的膜或腔中的方法，其包括：
[0100]
‑
控制搅拌器(7)的速度，使容器(4)中液体培养基(5)产生湍流，以在生产细胞(6)以及细胞外囊泡上施加剪切应力，以便在生产细胞(6)的膜或细胞质中以及所述细胞囊泡的腔和/或膜中加载治疗剂和/或显像剂，在容器(4)中流的柯尔莫哥洛夫长度小于或等于100μm，所述容器包括出口(9)、包含治疗剂和/或显像剂的液体培养基(5)、生产细胞(6)，和
[0101]
‑
在容器(4)的出口(9)处收集包含细胞外囊泡(ev)的液体培养基(5)。
[0102]
根据一个特定实施方案，流的柯尔莫哥洛夫长度小于或等于80μm，或甚至小于或等于70μm且优选小于或等于60μm。根据一个甚至更具体的特征，l
k
小于或等于55μm。根据另一个同样具体的特征，l
k
小于或等于50μm。
[0103]
优选地，容器(4)的出口(9)处的细胞外囊泡(ev)包含加载有治疗剂和/或显像剂的细胞外囊泡与未加载治疗剂和/或显像剂的细胞外囊泡的混合物。
[0104]
产生加载有治疗剂或显像剂的细胞外囊泡ev的实例
[0105]
细胞外囊泡(ev)在例如不含血清的含有生产细胞(6)的液体培养基(5)的容器(4)中产生。所使用的用于培养生产细胞(6)的培养基在生产前包含血清和治疗剂和/或显像剂，容器(4)用不含血清的dmem液体培养基5洗涤三到四次，每次洗涤相当于例如约400ml的体积。液体培养基(5)的搅拌随后由搅拌器(7)控制，从而在容器(4)中引起湍流。优选地，调整搅拌从而控制液体培养基(5)的流动，其中柯尔莫哥洛夫长度l
k
小于100μm且优选小于或等于60μm。控制液体培养基(5)的搅拌至少20分钟，优选大于1小时，更优选大于2小时。根据一个具体方面，搅拌持续两小时。加载的细胞外囊泡(ev)的加载和产生可以在生产过程中进行测量。为此，可以暂时中断搅拌。允许生产细胞6在容器(4)底部沉降和/或离心，然后获得含有细胞外囊泡(ev)的液体培养基样品5。样品在2000g下离心10分钟，从而去除细胞碎片。上清液通过单独跟踪颗粒的方法(或nta，纳米颗粒跟踪分析的英文首字母缩写)进行分析，从而计数细胞外囊泡(ev)的数量，并由此推断样品的细胞外囊泡(ev)浓度。可以证实，搅拌开始时细胞外囊泡(ev)的浓度接近于零或可忽略不计。
[0106]
产生的细胞外囊泡(ev)也可以用透射电镜观察和/或计数。为此，将一滴2.7μl的包含细胞外囊泡ev的溶液沉积在适合冷冻显微镜的网格上，然后浸入液体乙烷中，导致所
述液滴近乎瞬时冻结，避免形成冰晶。将支持细胞外囊泡(ev)的网格引入显微镜，并在
‑
170℃左右的温度下观察细胞外囊泡(ev)。
[0107]
细胞外囊泡的分离
[0108]
在容器4中加载和产生的细胞外囊泡(ev)能够从容器(4)中通过容器(4)的出口(9)提取，悬浮在液体培养基(5)中。过滤器(18)可布置在出口(9)处，从而在从容器(4)提取细胞外囊泡ev时过滤生产细胞6和细胞碎片。连接器(13)流体连通到出口(9)，从而允许运输包含产生的细胞外囊泡(ev)的液体培养基(5)。
[0109]
流体系统(1)还可以包括细胞外囊泡(ev)的分离器(15)。分离器(15)包括分离器的入口(10)，其中可以直接或间接进给来自容器(4)的包含细胞外囊泡(ev)的液体培养基(5)。分离器(15)还可以包括分离器的第一出口(11)，通过该出口液体培养基(5)能够以小于分离器(15)的入口(10)处的或甚至基本上为零的细胞外囊泡ev浓度离开分离器(15)。分离器(15)还可以包括分离器(15)的第二出口(12)，液体培养基(5)能够通过该第二出口(12)以高于分离器(15)的入口(10)处的细胞外囊泡(ev)浓度离开分离器(15)。
[0110]
通常，细胞外囊泡ev的分离器(15)可以与容器(4)流体连通，从而能够将贫囊泡ev的液体培养基(5)重新引入容器(4)中，例如通过容器(4)的入口(8)重新引入。因此，加载的细胞外囊泡(ev)的产生和/或提取可以连续进行，容器(4)中的液体培养基(5)的体积基本恒定。根据一个替代实施方案，流体系统不包括细胞外囊泡(ev)的分离器(15)，或者流体系统包括细胞外囊泡(ev)的分离器(15)，其可以流体连通到容器(4)，或例如通过用于关闭所述分离器(15)的装置不流体连通到容器(4)。因此，加载的细胞外囊泡(ev)的产生和/或提取可以根据布置在分离器(15)上游的关闭装置的打开或关闭以不连续或连续方式进行。
[0111]
在图1或图2描述的流体系统(1)的示例性实施方案中，液体培养基(5)可从容器4通过第一泵(16)经由连接器(13)提取，从而将液体培养基(5)运输至收集器(19)。另一个泵(16')使得可以将包含在收集器(19)中的液体培养基(5)通过另一个连接器供给到分离器(15)的入口(10)。分离器(15)的第一出口(11)通过连接器与容器(4)连接，从而将贫细胞外囊泡(ev)的液体培养基(5)重新引入容器(4)。分离器(15)的第二出口(12)通过连接器与收集器(19)相连，从而使收集器(19)中包含的液体培养基(5)富集细胞外囊泡(ev)。或者，分离器(15)的入口(10)可以直接(或通过第一泵(16))连接到容器(4)的出口(9)。分离器(15)的第一出口(11)与容器(4)相连，分离器(15)的第二出口(12)与收集器19相连。多个分离器也可以串联排列以改变液体培养基(5)中细胞囊泡(ev)的分离程度，和/或并联以调整每个分离器(15)中的液体培养基5的流速以适应第一泵(16)的流速。
[0112]
搅拌对细胞外囊泡ev的加载的影响
[0113]
图3(a)说明通过nta(纳米颗粒追踪分析，ns300，malvern)和(b)通过cryo
‑
tem(冷冻透射电子显微镜)的形态分析获得的ev的尺寸分布。通过nta和冷冻tem(图3)对来自huvec的湍流触发的ev的尺寸分布的分析，显示囊泡的形式和多分散ev的尺寸范围(c)。结果表明，在柯尔莫哥洛夫长度为35μm下获得的ev具有常规尺寸范围(100nm至400nm)。ev的平均尺寸分别为236nm和200nm。在分离的ev中部分存在的mthpc(间四(羟基苯基)二氢卟酚，inn:temoporfin，法语为t
é
moporfine)用荧光光谱法证明，该分子具有发射峰为650nm的特征(随后激发至400nm至410nm)(图4)。
[0114]
mthpc的定量是在搅拌下通过用100μm mthpc孵育的生产细胞产生的ev样品进行
的。加载实验在100μm和35μm的柯尔莫哥洛夫长度下进行，以便确定在生产细胞和随后释放的ev中湍流对感兴趣的试剂的内化的影响。为了建立与同等量的ev的比较，根据下表1的实验方案，在100μm的加载步骤之后，进行洗涤，在柯尔莫哥洛夫长度为35μm时囊泡形成。
[0115]
表1:用mthpc加载huvec囊泡的方案
[0116][0117]
由于在柯尔莫哥洛夫长度为100μm和35μm时加载细胞而获得的纯化ev样品(ev)分别含有浓度为1.3mm和7.8mm的mthpc，这意味着ev中mthpc的加载量增加了5倍。此外，当比较在35μm时和在100μm时获得的ev量时，10倍的增加证明柯尔莫哥洛夫长度的作用和重要性，一方面，其触发和增加ev的释放，并且另一方面，也增加它们加载感兴趣的分子的加载量。
[0118]
利用不同的l
k
使用huvec(atcc，图9和10)和小鼠间充质干细胞(csm)(c3ht1/2，atcc)进行了相同实验。简而言之，将细胞在含有10％胎牛血清(svf)和1％青霉素
‑
链霉素(penstrep,gibbco)的dmem中在37℃(5％的co2)培养。它们在100ml微载体旋转瓶(bellco)中以13300个细胞/cm2接种在12克珠子/升的cytodex 1微载体(ge healthcare)上，然后在34rpm的搅拌下以6克珠子/升培养直到汇合。在加载阿霉素之前，将包含汇合细胞的微载体用dmem洗涤3次以便去除任何痕量血清。在无血清dmem中平衡后，加入最终浓度为5mm的阿霉素。根据下表2的方案在37℃(5％co2)下进行加载和囊泡形成。
[0119]
表2：对huvec或csm小鼠囊泡加载阿霉素的方案
[0120][0121]
在培养结束时，在37℃(5％co2)下，将细胞通过胰蛋白酶与珠子脱离10分钟，与珠子通过70μm细胞筛进行分离，然后在pbs中洗涤以去除游离阿霉素。在第一步以2000g离心10分钟后，通过超速离心(beckman optics max xp，150000g离心1小时30分钟)分离和浓缩囊泡。用nc200细胞计数仪(chemometec)测定细胞浓度，用nta法计算囊泡的浓度和尺寸分布。使用macsplex试剂盒(miltenyi biotec)通过流式细胞术分析存在于囊泡或其膜中的标记物。然后对囊泡和细胞进行化学裂解(triton 0.3％)，然后用荧光分光光度计
(hitachi f7000)进行分析。使用485nm的激发波长和560nm的发射波长对阿霉素进行定量。
[0122]
图9一方面证实l
k
在huvec加载中的重要性：使用55μm的l
k
比使用283μm的l
k
时huvec细胞的加载量大2.4倍( 140％)；另一方面，在囊泡的加载中(图10)：当使用55μm的l
k
时，观察到囊泡的阿霉素浓度相对于l
k
为283μm时，即相当于被动加载细胞或囊泡时，浓度增加了39％(图10)。
[0123]
对于鼠csm获得了类似结果(未示出)，特别是当使用55μm的l
k
时，相对于l
k
为283μm的被动加载，囊泡的阿霉素浓度增加485％。细胞的加载量也增加592％。
[0124]
关于产生的囊泡的特性，nta数据显示加载条件(被动和l
k
＝55μm)之间的尺寸分布相似，对于huvec囊泡分别为106.9nm和109.7nm，对应于细胞外囊泡的常规尺寸(未示出)。流式细胞仪分析表明，根据两种条件获得的囊泡具有细胞外囊泡的常规标记物，包括cd9、cd63和cd81(未显示)。因此，l
k
小于40μm时的囊泡形成对囊泡的常规标记物的存在没有影响；因此，可以期待至少与被动产生的囊泡一样高的载体化功能。
[0125]
结果显示l
k
在囊泡的产生和加载中对所使用的不同类型细胞的影响。mthpc和阿霉素是小的治疗剂(分别为680.7kda和543.5kda)。例如，发明人确定的条件比不搅拌或例如在283μm的极低搅拌下的被动加载条件更有效。还测试了l
k
的变化对产生较大试剂的细胞外囊泡的影响(图11、12、13)。使用10kda和70kda的葡聚糖
‑
fitc探针。可将它们认为是显像剂的模型，也可认为是具有更大分子量的治疗剂的模型，例如聚合物、分子量约为13kda的sirna(whitehead等人，2009)或分子量接近70kda的“小的”治疗性蛋白质(strohl，2015)。类似的结果仅在70kda或10kda的葡聚糖
‑
fitc探针上获得。
[0126]
简而言之，在37℃(5％co2)下，将经过基因改造以表达hsp70蛋白结合荧光素酶(hsp70是细胞外囊泡的标记物，thery等人，2018)的hela(atcc)细胞，用含有10％胎牛血清(svf)和1％青霉素
‑
链霉素的dmem培养基(penstrep，gibbco)培养。将这些细胞通过100ml旋转瓶(bellco)以6700个细胞/cm2接种到6克珠子/升的cytodex 1微载体(ge healthcare)上，然后在34rpm搅拌下以3克珠子/升培养直至汇合。在加载之前，将包含汇合细胞的微载体用无血清dmem洗涤3次以去除痕量血清，然后用10kda或70kda的fitc
‑
葡聚糖探针(分别参考fd10s和90718，sigma)以1.43mm在245μm或48μm的l
k
下孵育2小时(表3)。
[0127]
表3：用与fitc耦合的10kda或70kda葡聚糖生产和加载hela细胞囊泡的方案。
[0128][0129]
在第一次离心去除细胞碎片(2000g 10分钟)和超速离心(beckman optics max xp，110000g 1小时)后，用nc200细胞计数器(chemometec)测定细胞浓度，通过nta(ns300，malvern)计算囊泡的浓度和尺寸分布。通过酶标仪(ensworst，perkinelmer)分析囊泡的发光信号。然后对囊泡和细胞进行化学裂解(triton 0.3％)，并在荧光分光光度计(hitachi f7000)上利用fitc在495nm处的激发波长和在520nm处的发射波长确定fitc的量。还使用抗cd63 pe和抗cd81 apc(biolegend)抗体在流式细胞成像仪
中分析获得的细胞外囊泡。总共分析了100000项。然后根据其相对粒度或内部复杂性(“侧向散射”)将fitc标记的阳性项分类为相应的凋亡小体(ab)、大囊泡(lev)和小囊泡(sev)。
[0130]
评估了使用70kda的fitc
‑
葡聚糖探针在245μm和48μm的l
k
下获得的囊泡的发光信号(荧光素酶)和荧光信号(fitc)。发光信号表示由hela细胞产生的囊泡数量，它对应于与hsp70蛋白相连的荧光素酶，hsp70蛋白是囊泡的胞质标记物，并且由母细胞产生。fitc的荧光反映了内化到囊泡中的fitc
‑
葡聚糖的量，从而反映了fitc
‑
葡聚糖在囊泡中的加载量。
[0131]
关于使用70kda的fitc
‑
葡聚糖生产囊泡(图11)，观察到使用48μm的l
k
的囊泡产量相对于在245μm的l
k
下加载的细胞，无论是在nta还是发光信号(发现其与nta中计数的囊泡数量成正比)中都增加了2倍。对照条件在l
k
为48μm但不存在70kda的fitc
‑
葡聚糖探针的情况下制备。在不存在70kda加载的情况下，观察到囊泡数量的增加相同。此外，对表明存在70kda的fitc
‑
葡聚糖探针的荧光信号的分析表明，在囊泡数量相同的情况下，荧光信号增加27％(图12)，从而表明相对于l
k
＝245μm的条件，囊泡在l
k
＝48μm时的加载量更大。
[0132]
无论细胞产生的细胞外囊泡(小囊泡、大囊泡、凋亡小体)的大小如何，都观察到加载效率的增加。不同类型的囊泡及其标记物通过流式细胞术(未显示)成像来变得可视化，其显示荧光标记物cd81和cd63的存在，并可以确认nta数据很好地与细胞外囊泡而非细胞碎片聚集体对应。流式细胞分析(通过绘制侧向散射强度和fitc标记强度)指示其被fitc
‑
葡聚糖探针加载(图13a和图13b)。当使用小于100mm的l
k
时，细胞外囊泡的加载增加的量化结果在如下表4所示：
[0133]
表4
[0134][0135]
一般而言，对于用抗cd 63pe和抗cd 81apc抗体的标记的流式细胞术分析显示，用任一抗体标记的胞外囊泡数量大致相同(未显示)。因此，就常规的细胞外囊泡标记物的存在而言，细胞外囊泡产生量的增加不会损害囊泡的质量。
[0136]
这些结果表明，根据本发明选择柯尔莫哥洛夫(l
k
)的长度可以增加hela细胞囊泡产物的产量，加载物对产量没有影响，而且l
k
对囊泡加载有显著影响。因此，可以针对各种尺寸的加载物，产生更多更好的囊泡，而与细胞类型(原代培养细胞或永生化细胞、干细胞、内皮细胞、上皮细胞、人类或动物细胞)无关。
[0137]
从这组结果中可以看出，选择小于100μm的合适的柯尔莫哥洛夫长度可以显著优化细胞外囊泡的生产和加载，而与期望的加载物的尺寸和细胞类型无关。因此，根据本发明产生的细胞外囊泡比根据目前已知的方法例如被动加载(没有或在非常低的搅拌下)产生
的细胞外囊泡具有更高浓度的显像剂和/或治疗剂。此外，根据本发明的方法不包括通过例如电穿孔方法施加电位差而在细胞上施加电应力。
[0138]
图5和图6说明mthpc(图5)和mthpc
‑
ev(图6)的脂质体制剂作为在携带ht29肿瘤的小鼠中静脉注射(0.3mg/kg感兴趣的试剂)后选定组织中随时间变化的荧光强度的函数的生物分布。在小鼠肿瘤模型中研究了在35μm的柯尔莫哥洛夫长度下mthpc
‑
ev的形成。通过利用药物的成像特性，将静脉内施用后的生物分布与mthpc的脂质体制剂(脂质体制剂mthpc)进行比较。生物分布数据(图5和图6)表明，mthpc
‑
ev(注射后6小时至15小时)比mthpc的脂质体制剂(注射后的24小时至48小时)更快达到肿瘤中的最大浓度。mthpc
‑
ev的肺吸收高于mthpc的脂质体制剂。观察到mthpc
‑
ev和mthpc的脂质体制剂在肝脏中的吸收同样很高。
[0139]
图7说明在携带ht29肿瘤的小鼠中静脉注射mthpc或mthpc
‑
ev(0.3mg/kg mthpc)的脂质体制剂后，mthpc的血浆浓度随时间的变化。药代动力学研究表明，在注射mthpc脂质体制剂后，在注射后30分钟达到峰值后，循环的mthpc减少(图7)。相反，mthpc的血液浓度出人意料在注射后6小时升高到峰值。在mthpc和mthpc脂质体制剂注射后6小时和24小时，mthpc的血浆浓度分别降低至约0.2ng/ml。
[0140]
图8说明用游离mthpc处理后，ht29肿瘤生长迟缓的kaplan
‑
meier图；将具有激光激活药物的mthpc和mthpc
‑
evs的脂质体制剂(光动力疗法(pdt)，三维疗法)与没有激光激活的相同组(对照，虚线)进行比较。发明人比较了在治疗后90天mthpc
‑
ev、mthpc的脂质体制剂和游离mthpc在肿瘤生长方面的治疗效果。kaplan
‑
meier图显示，在没有激光诱导的药物激活的情况下，mthpc
‑
ev、mthpc的脂质体制剂和游离mthpc具有相同的治疗效果。然而，相对于激光激活的mthpc的脂质体制剂和游离mthpc，mthpc
‑
ev进行光动力疗法随后进行激光激活可提高治疗效果。结果显示，0％的对照组或用mthpc脂质体制剂进行光动力疗法治疗的组的肿瘤，以及20％的用mthpc光动力疗法治疗的肿瘤，增长了10倍，而在第90天通过mthpc
‑
ev的pdt治疗的组的这一值为33％(图8)。
[0141]
因此，与脂质体相比，根据本发明的方法获得的加载活性试剂的囊泡可以构成从药效学性质和所进行治疗的有效性的角度来看非常有利的替代方案。脂质体已知是各种生物分子例如酶、激素、反义寡核苷酸、核酶、蛋白质或dna肽、癌症分子的载体(farjadian等人，2018)。因此，在不存在mthpc的情况下，通过根据本发明方法加载的囊泡可有利地负载这些分子。事实上，脂质制剂中的活性试剂是卫生当局授权出售的对象，例如：
[0142]
‑
两性霉素b(允许用于治疗真菌感染)，
[0143]
‑
柔红霉素(允许用于治疗广泛或内脏的卡波西肉瘤)，
[0144]
‑
伊立替康(允许用于治疗腺癌)，
[0145]
‑
长春新碱(允许用于治疗phi阴性急性淋巴母细胞白血病或淋巴母细胞淋巴瘤)，
[0146]
‑
阿糖胞苷(允许用于治疗淋巴瘤性脑膜炎)。
[0147]
因此，本发明的一个特定目的是如本技术在其任一实施方案中所述的用于生产加载有这些分子之一的细胞外囊泡的方法。通过所述方法有利地加载这些试剂的囊泡或细胞也构成本发明的目的。具体目的是根据本发明的加载方法、根据该方法加载的细胞外囊泡
turbulence energy dissipation rate for impellers,aiche journal,42(9),2476
‑
2490