通过基因置换和抗炎的针对杜氏肌营养不良的一步基因疗法的制作方法

通过基因置换和抗炎的针对杜氏肌营养不良的一步基因疗法
1.相关申请的交叉引用
2.本专利申请要求2019年02月02日提交的美国临时专利申请号62/800,484的权益，其通过引用并入本技术。
3.序列表
4.与本文同时提交的核苷酸/氨基酸序列表通过引用整体并入本文。


背景技术：

5.杜氏肌营养不良症(dmd)是一种由肌营养不良蛋白基因突变引起的致命的x连锁遗传疾病。其是最常见的遗传性肌肉病症。心力衰竭是dma患者过早死亡的主要原因。炎症是dmd在进行性肌肉变性中的次要病理机制，而nf
‑
kappab(nf
‑
κb)的抑制可减轻dmd小鼠的肌肉炎症、改善肌肉病理并改善肌肉生理功能(yang,2012和yin,2017)。
6.基于基因治疗的基因置换是dmd的潜在治疗方法(wang,2000)，但dmd尚无治愈的方法。由nf
‑
κb信号转导上调引起的慢性炎症对dmd的基因疗法造成挑战(mendell jr,2010 the nejm)。通用启动子如cmv启动子经常在肌肉基因治疗中引起不希望的毒性和免疫应答。因此，特定的肌肉靶向基因递送系统对于dmd临床试验的安全性很重要(wang,2008)。此外，鉴于充血性心力衰竭是dmd引起的主要并发症，用于dmd治疗的肌肉特异性表达迷你肌营养不良蛋白应导致在骨骼肌和心肌中迷你肌营养不良蛋白的强烈表达。
7.已经证明通过shrna技术减少nf
‑
κb可以改善mdx小鼠的这种病理过程(yang,2012)。其他初步结果还表明，当两种分别携带迷你肌营养不良蛋白和nf
‑
κb/p65
‑
shrna的重组腺相关病毒(aav)载体同时注射进入dmd小鼠模型中时，通过减少nf
‑
κb显著增加迷你肌营养不良蛋白的表达。然而，两种aav注射在很多应用中过于复杂而无法应用于临床。
8.因此，需要一种在骨骼肌和心肌中同时引入迷你肌营养不良蛋白基因和nf
‑
κb/p65
‑
shrna的更实用的载体。


技术实现要素：

9.在一个实施方式中，本发明提供了一种双重表达盒基因载体，其包含用于在心肌组织和骨骼肌组织中表达迷你肌营养不良蛋白基因和nf
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κb/p65
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shrna基因两者的表达盒，其是腺相关病毒(aav)载体，其中所述迷你肌营养不良蛋白基因与包含肌肉特异性第一启动子和经修饰的mcken(mck)增强子的构建体可操作地连接，并且其中所述nf
‑
κb/p65
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shrna基因是在第二启动子的控制下。还提供了包含此类基因载体的药物组合物和使用此类基因递送载体和药物组合物改善杜氏肌营养不良症(dmd)的方法。
10.不存在类似的技术。在dmd中上调的nf
‑
kb通路，不仅在下游发病机制中起关键作用(acharyya 2007j clin invest)，而且还显著影响肌营养不良蛋白基因置换的效率(jayandharan,2011pnas)。双重治疗基因疗法策略是创新的，应该比单一的迷你肌营养不良蛋白置换有更多获益。
附图说明
11.图1a描述了单一和双重表达盒aav构建体的示意图。图1b描述了在心脏组织中检测的肌营养不良蛋白的western印迹。图1c描述了在心脏和肝脏组织中肌营养不良蛋白的免疫荧光(if)染色。图1d描述了在来自使用双重表达盒aav和单一表达盒aav治疗全身性治疗的mdx/utrn
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/
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小鼠的心脏组织、骨骼肌组织(dia是膈肌，gas是腓肠肌，ta是胫骨前肌)和肝脏组织中迷你肌营养不良蛋白的if染色。迷你肌营养不良蛋白在单一homo和双重homo组的心脏、膈肌、gas和ta肌肉中均成功表达。此外，在肝脏组织中无迷你肌营养不良蛋白表达，表明其具有组织特异性。图1e是显示在不同类型组织中迷你肌营养不良蛋白阳性细胞比的图。在单一homo和双重homo组之间在心脏和dia组织中不存在差异。但是，双重homo组在gas和ta肌肉中具有高得多的迷你肌营养不良蛋白。(****平均值p<0.0001)
12.图2a描述了在腓肠肌中cd68、cd4、cd8和p
‑
p65的if染色。图2b描述了在心肌和腓肠肌中p
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p65的if染色。wt：野生型，双重同源：双重表达盒aav治疗的dko
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homo，单一homo：单一表达盒aav治疗的dko
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homo，ct
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homo：未经治疗的dko
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homo。放大倍数：200x。(*平均值p<0.05，**平均值p<0.01，***平均值p<0.001，****平均值p<0.0001)
13.图3a代表在实施例2中讨论的转基因和敲低小鼠的特征。图3b描述了在2月龄的gas肌肉中肌营养不良蛋白和p
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p65表达的western印迹。图3c描述了在相同月龄的gas肌肉中进行的肌营养不良蛋白和β
‑
肌聚糖的苏木精和伊红(h&e)染色，以及if染色。
14.图4a描述了在2月龄转基因和敲低小鼠的腓肠肌中migg、cd68、cd4和cd8的masson三色染色和if染色。图4b显示的统计分析表明，cd68、cd4和cd8在不同转基因和敲低小鼠的组之间显示出显着差异。*p<0.01，**p<0.001和***p<0.0001。图4c描述了在raav治疗的心肌和/或腓肠肌中cd8、cd4和cd68的if染色结果(在心脏组织中几乎无cd8阳性)。在下图中，y轴是每个视觉帧的阳性细胞数。单一homo具有比ct homo组更少的免疫细胞浸润，以及双重homo具有比单一homo组更少的免疫细胞浸润。(n＝3，*平均值p<0.05，**平均值p<0.01，***平均值p<0.001，****平均值p<0.0001)。图4d描述了aav治疗小鼠的总体健康状况，其中(1)表示wt，(2)表示双重homo，(3)表示单一homo和(4)表示ct homo。上图显示了在1月龄和2月龄的肌肉功能，频率为0至200hz。下图显示了在1月龄和2月龄不同组的体重(*平均值p<0.05，**平均值p<0.01，***平均值p<0.001，****平均值p<0.0001)。
15.图5a是表示本发明的实施方式的示意性载体图：载体paav
‑
m1p65ensynopti3978(seq id no:1)和paav
‑
m2p65ensynopti3978(seq id no:23)。图5b以图形方式显示了paav
‑
m1p65ensynopti3978和paav
‑
m2p65ensynopti3978载体内某些遗传元件的位置。
16.图6a是表示本发明的实施方式的示意性载体图：载体paav
‑
m1p65ensynopti3837(seq id no:25)和paav
‑
m2p65ensynopti3837(seq id no:26)。图6b以图形方式显示了paav
‑
m1p65ensynopti3837和paav
‑
m2p65ensynopti3837载体内某些遗传元件的位置。
具体实施方式
17.在一个实施方式中，本发明提供了一种双重表达盒基因载体，其包含用于在心肌组织和骨骼肌组织中表达迷你肌营养不良蛋白基因和nf
‑
κb/p65
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shrna基因两者的表达盒，其是腺相关病毒(aav)载体，其中所述迷你肌营养不良蛋白基因与包含肌肉特异性第一启动子和经修饰的mcken(mck)增强子的构建体可操作地连接，并且其中所述nf
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κb/p65
‑
shrna基因是在第二启动子的控制下。
18.aav载体可以源自任何适合用作基因治疗载体的aav菌株，如本领域普通技术人员公知的。纯粹举例来说，亲本aav毒株可以是aav1、aav2、aav6或aav9，但也可以使用其他毒株。
19.在本发明上下文中的示例性aav载体(或用于产生编码载体的质粒，本领域技术人员从中可以理解病毒序列)在本文中描述为aav
‑
m1p65ensynopti3978或aav
‑
m2p65ensynopti3978(包括用于产生此类载体的质粒)。在本发明上下文中使用的这些示例性aav的序列包含seq id no:1的序列，其是aav
‑
m1p65ensynopti3978；seq id no:23的序列，其是aav
‑
m2p65ensynopti3978；seq id no:25的序列，其是aav
‑
m1p65ensynopti3837；以及seq id no:26的序列，其是aav
‑
m2p65ensynopti3837。
20.aav
‑
m2p65ensynopti3978与aav
‑
m1p65ensynopti3978的不同之处在于，其包含序列agtccctgtctgcacctgtctcgagacaggtgcagacagggactttttttt(编码m2p65shrna，在bp 1701
‑
1751的seq id no:22代替存在于seq id no:1中的编码m1p65的序列(tgtgtccattgtctcactcctcgaggagtgagacaatggacacattttttt(seq id no:17))。
21.类似地，aav
‑
m2p65ensynopti3837与aav
‑
m1p65ensynopti3837的不同之处在于，其包含序列agtccctgtctgcacctgtctcgagacaggtgcagacagggactttttttt(编码m2p65shrna，在bp1701
‑
1751的seq id no:22代替存在于seq id no:25中的编码m1p65的序列(tgtgtccattgtctcactcctcgaggagtgagacaatggacacattttttt(seq id no:17)))。
22.如所指出的，用于本发明上下文中的aav包含用于在心肌和在骨骼肌中表达迷你肌营养不良蛋白基因的表达盒。优选地，迷你肌营养不良蛋白基因是人密码子优化的。例如，人优化的迷你肌营养不良蛋白基因，其包含5个棒状结构域(rod)(1、2、22、23、24)和3个铰链结构域(hinge)(1、3、4)，以及cr结构域，其可以用于治疗dmd动物模型和用于人临床试验以及最终用于治疗cdm。参见，例如，kornegay jn等，molecular therapy.2010,18(8):1501
‑
1508,pmid:20517298(其全部内容通过引用并入本文)。一个此类人优化的迷你肌营养不良蛋白(也称为微型肌营养不良蛋白)的序列是opti
‑
dysδ3978(包含3978个碱基对)并且如序列id no:2所示：
23.atggtgtggtgggaggaagtggaggactgctacgagagagaggacgtgcagaagaaaaccttcaccaagtgggtgaacgcccagttcagcaagttcggcaagcagcacatcgagaacctgttcagcgacctgcaggatggcaggagactgctggacctgctggagggcctgaccggccagaagctgcccaaggagaagggcagcaccagagtgcacgccctgaacaacgtgaacaaggccctgagagtgctgcagaacaacaacgtggacctggtgaacatcggcagcaccgacatcgtggacggcaaccacaagctgaccctgggcctgatctggaacatcatcctgcactggcaggtgaagaacgtgatgaagaacatcatggccggcctgcagcagaccaacagcgagaagatcctgctgagctgggtgaggcagagcaccagaaactacccccaggtgaacgtgatcaacttcaccacctcctggagcgacggcctggccctgaacgccctgatccacagccacagacccgacctgttcgactggaacagcgtggtgtgtcagcagagcgccacccagagactggagcacgccttcaacatcgccagataccagctgggcatcgagaagctgctggaccccgaggacgtggacaccacctaccccgacaagaaaagcatcctcatgtacattaccagcctgttccaggtgctgccccagcaggtgtccatcgaggccatccaggaagtggaaatgctgcccaggccccccaaagtgaccaaggaggagcacttccagctgcaccaccagatgcactacagccagcagatcacagtgagcctggcccagggctatgagagaaccagcagccccaagcccagattcaagagctacgcctacacccaggccgcctacgtgaccacctccgaccccaccagaagccccttccccagccagcacctggaggcccccgagga
caagagcttcggcagcagcctgatggagagcgaagtgaacctggacagataccagaccgccctggaggaagtgctgtcctggctgctgagcgccgaggacaccctgcaggcccagggcgagatcagcaacgacgtggaagtggtgaaggaccagttccacacccacgagggctacatgatggatctgaccgcccaccagggcagagtgggcaatatcctgcagctgggcagcaagctgatcggcaccggcaagctgagcgaggacgaggagaccgaagtgcaggagcagatgaacctgctgaacagcagatgggagtgcctgagagtggccagcatggagaagcagagcaacctgcacagagtgctgatggacctgcagaaccagaagctgaaggagctgaacgactggctgaccaagaccgaggagcggaccagaaagatggaggaggagcccctgggccccgacctggaggacctgaagagacaggtgcagcagcacaaagtgctgcaggaggacctggagcaggagcaggtgcgcgtgaacagcctgacccacatggtggtggtcgtggacgagagcagcggcgaccacgccacagccgccctggaagagcagctgaaagtgctgggcgacagatgggccaatatttgtaggtggaccgaggacagatgggtgctgctgcaggaccagcccgacctggcccctggcctgaccaccatcggcgccagccccacccagaccgtgaccctggtgacccagcccgtggtgacaaaggagaccgccatcagcaagctggagatgcccagctccctgatgctggaagtgcccacccaccgcctgctccagcagttccccctggacctggagaagttcctggcctggctgaccgaggccgaaaccaccgccaatgtgctccaggacgccactagaaaggagaggctgctggaggacagcaagggcgtgaaagagctgatgaagcagtggcaggatctgcagggcgaaatcgaggcccacaccgacgtgtaccacaacctggacgagaacagccagaagattctgaggagcctggagggcagcgacgacgccgtcctgctccagaggaggctggacaacatgaacttcaagtggagcgagctgcggaagaagagcctgaacatccggagccacctggaagccagcagcgaccagtggaagagactgcacctgagcctgcaggagctgctggtgtggctgcagctgaaggacgacgagctgagcagacaggcccccatcggcggcgacttccccgccgtgcagaagcagaacgacgtgcaccgggccttcaagagggagctgaaaaccaaggaacccgtgatcatgagcaccctggagacagtgcggatcttcctgaccgagcagcccctggagggactggagaagctgtaccaggagcccagagagctgccccccgaggagagagcccagaacgtgaccaggctgctgagaaagcaggccgaggaagtgaataccgagtgggagaagctgaatctgcacagcgccgactggcagagaaagatcgacgagaccctggagagactccaggaactgcaggaagccaccgacgagctggacctgaagctgagacaggccgaagtgatcaagggcagctggcagcctgtgggcgatctgctgatcgactccctgcaggatcacctggagaaagtgaaggccctgcggggcgagatcgcccccctgaaggagaatgtgagccacgtgaacgacctggccagacagctgaccaccctgggcatccagctgagcccctacaacctgagcacactggaggatctgaacacccggtggaaactgctgcaggtggccgtggaggatagagtgaggcagctgcacgaagcccacagagacttcggccctgcctcccagcacttcctgagcaccagcgtgcagggcccctgggagagagccatctcccccaacaaagtgccctactacatcaaccacgagacccagaccacctgctgggaccaccctaagatgaccgagctgtatcagagcctggccgacctgaacaatgtgcggttcagcgcctacagaaccgccatgaagctgcggagactgcagaaggccctgtgcctggatctgctgagcctgagcgccgcctgcgacgccctggaccagcacaacctgaagcagaatgaccagcccatggacatcctgcagatcatcaactgcctgaccacaatctacgaccggctggaacaggagcacaacaacctggtgaatgtgcccctgtgcgtggacatgtgcctgaattggctgctgaacgtgtacgacaccggcaggaccggcagaatccgcgtgctgagcttcaagaccggcatcatcagcctgtgcaaggcccacctggaggataagtaccgctacctgttcaagcaggtggccagcagcaccggcttctgcgatcagaggagactgggcctgctgctgcacgatagcatccagatccctaggcagctgggcgaagtggccagctttggcggcagcaacatcgagccctctgtgaggagctgcttccagttcgccaacaacaagcccgagatcgaggccgccctgttcctggactggatgaggctggagcctcagagcatggtgtggctgcctgtgctgcacagagtggccgccgccgagaccgccaagcaccaggccaagtgcaatatctgcaaggagtgccccatcatcggcttccggtacaggagcctgaagcacttcaactacgacatctgccagagctgctttttcagcggcagagtggccaagggccacaaaatgcactaccccatggtggagtactgcacccccaccacctccggcgaggatgtgagagacttcgccaaagtgctgaagaataagttccggaccaagcggtactttgccaagcaccccaggatgggctacctgcccgtgca
gaccgtgctggaaggcgacaacatggagacctga。该序列作为碱基对2365
‑
6342包含在seq id no:1和seq id no:23内。
24.在seq id no:2内，可以鉴定人优化的迷你肌营养不良蛋白的以下结构域。在针对人优化的迷你肌营养不良蛋白基因的编码序列内的其核苷酸位置如在图5b中所示：
25.人肌营养不良蛋白的n末端(756个碱基对)；seq id no:3：
26.atggtgtggtgggaggaagtggaggactgctacgagagagaggacgtgcagaagaaaaccttcaccaagtgggtgaacgcccagttcagcaagttcggcaagcagcacatcgagaacctgttcagcgacctgcaggatggcaggagactgctggacctgctggagggcctgaccggccagaagctgcccaaggagaagggcagcaccagagtgcacgccctgaacaacgtgaacaaggccctgagagtgctgcagaacaacaacgtggacctggtgaacatcggcagcaccgacatcgtggacggcaaccacaagctgaccctgggcctgatctggaacatcatcctgcactggcaggtgaagaacgtgatgaagaacatcatggccggcctgcagcagaccaacagcgagaagatcctgctgagctgggtgaggcagagcaccagaaactacccccaggtgaacgtgatcaacttcaccacctcctggagcgacggcctggccctgaacgccctgatccacagccacagacccgacctgttcgactggaacagcgtggtgtgtcagcagagcgccacccagagactggagcacgccttcaacatcgccagataccagctgggcatcgagaagctgctggaccccgaggacgtggacaccacctaccccgacaagaaaagcatcctcatgtacattaccagcctgttccaggtgctgccccagcaggtgtccatcgaggccatccaggaagtggaa；
27.铰链结构域1(225个碱基对)；seq id no:4：
28.atgctgcccaggccccccaaagtgaccaaggaggagcacttccagctgcaccaccagatgcactacagccagcagatcacagtgagcctggcccagggctatgagagaaccagcagccccaagcccagattcaagagctacgcctacacccaggccgcctacgtgaccacctccgaccccaccagaagccccttccccagccagcacctggaggcccccgaggac；
29.棒状结构域1(333个碱基对)；seq id no:5：
30.agcgaagtgaacctggacagataccagaccgccctggaggaagtgctgtcctggctgctgagcgccgaggacaccctgcaggcccagggcgagatcagcaacgacgtggaagtggtgaaggaccagttccacacccacgagggctacatgatggatctgaccgcccaccagggcagagtgggcaatatcctgcagctgggcagcaagctgatcggcaccggcaagctgagcgaggacgaggagaccgaagtgcaggagcagatgaacctgctgaacagcagatgggagtgcctgagagtggccagcatggagaagcagagcaacctgcacaga；
31.棒状结构域2(327个碱基对)；seq id no:6：
32.gtgctgatggacctgcagaaccagaagctgaaggagctgaacgactggctgaccaagaccgaggagcggaccagaaagatggaggaggagcccctgggccccgacctggaggacctgaagagacaggtgcagcagcacaaagtgctgcaggaggacctggagcaggagcaggtgcgcgtgaacagcctgacccacatggtggtggtcgtggacgagagcagcggcgaccacgccacagccgccctggaagagcagctgaaagtgctgggcgacagatgggccaatatttgtaggtggaccgaggacagatgggtgctgctgcaggac；
33.铰链结构域3(141个碱基对)；seq id no:7：
34.cagcccgacctggcccctggcctgaccaccatcggcgccagccccacccagaccgtgaccctggtgacccagcccgtggtgacaaaggagaccgccatcagcaagctggagatgcccagctccctgatgctggaagtgccc；
35.棒状结构域22(348个碱基对)；seq id no:8：
36.acccaccgcctgctccagcagttccccctggacctggagaagttcctggcctggctgaccgaggccgaaaccaccgccaatgtgctccaggacgccactagaaaggagaggctgctggaggacagcaagggcgtgaaagagctg
atgaagcagtggcaggatctgcagggcgaaatcgaggcccacaccgacgtgtaccacaacctggacgagaacagccagaagattctgaggagcctggagggcagcgacgacgccgtcctgctccagaggaggctggacaacatgaacttcaagtggagcgagctgcggaagaagagcctgaacatccggagccacctggaagcc；
37.棒状结构域23(387个碱基对)；seq id no:9：
38.agcagcgaccagtggaagagactgcacctgagcctgcaggagctgctggtgtggctgcagctgaaggacgacgagctgagcagacaggcccccatcggcggcgacttccccgccgtgcagaagcagaacgacgtgcaccgggccttcaagagggagctgaaaaccaaggaacccgtgatcatgagcaccctggagacagtgcggatcttcctgaccgagcagcccctggagggactggagaagctgtaccaggagcccagagagctgccccccgaggagagagcccagaacgtgaccaggctgctgagaaagcaggccgaggaagtgaataccgagtgggagaagctgaatctgcacagcgccgactggcagagaaagatcgacgag；
39.棒状结构域24(327个碱基对)；seq id no:10：
40.accctggagagactccaggaactgcaggaagccaccgacgagctggacctgaagctgagacaggccgaagtgatcaagggcagctggcagcctgtgggcgatctgctgatcgactccctgcaggatcacctggagaaagtgaaggccctgcggggcgagatcgcccccctgaaggagaatgtgagccacgtgaacgacctggccagacagctgaccaccctgggcatccagctgagcccctacaacctgagcacactggaggatctgaacacccggtggaaactgctgcaggtggccgtggaggatagagtgaggcagctgcacgaa；
41.铰链结构域4(216个碱基对)；seq id no:11：
42.gcccacagagacttcggccctgcctcccagcacttcctgagcaccagcgtgcagggcccctgggagagagccatctcccccaacaaagtgccctactacatcaaccacgagacccagaccacctgctgggaccaccctaagatgaccgagctgtatcagagcctggccgacctgaacaatgtgcggttcagcgcctacagaaccgccatgaagctg；
43.富含半胱氨酸(cr)的结构域(888个碱基对)；seq id no:12：
44.cggagactgcagaaggccctgtgcctggatctgctgagcctgagcgccgcctgcgacgccctggaccagcacaacctgaagcagaatgaccagcccatggacatcctgcagatcatcaactgcctgaccacaatctacgaccggctggaacaggagcacaacaacctggtgaatgtgcccctgtgcgtggacatgtgcctgaattggctgctgaacgtgtacgacaccggcaggaccggcagaatccgcgtgctgagcttcaagaccggcatcatcagcctgtgcaaggcccacctggaggataagtaccgctacctgttcaagcaggtggccagcagcaccggcttctgcgatcagaggagactgggcctgctgctgcacgatagcatccagatccctaggcagctgggcgaagtggccagctttggcggcagcaacatcgagccctctgtgaggagctgcttccagttcgccaacaacaagcccgagatcgaggccgccctgttcctggactggatgaggctggagcctcagagcatggtgtggctgcctgtgctgcacagagtggccgccgccgagaccgccaagcaccaggccaagtgcaatatctgcaaggagtgccccatcatcggcttccggtacaggagcctgaagcacttcaactacgacatctgccagagctgctttttcagcggcagagtggccaagggccacaaaatgcactaccccatggtggagtactgcacccccaccacctccggcgaggatgtgagagacttcgccaaagtgctgaagaataagttccggaccaagcggtactttgccaagcaccccaggatgggctacctgcccgtgcagaccgtgctggaaggcgacaacatggagacc；and
45.终止密码子(3个碱基对)；seq id no:13:tga
46.因此，在本发明上下文中使用的适宜的人优化的迷你肌营养不良蛋白基因可以包含、基本上由或由seq id no:2组成，并且可以包含由选自以下的序列表示的结构域：由seq id no:3
‑
13的任一个组成的序列，尽管一个或多个此类结构域可以包含、基本上包含或由此类序列组成。当然，显然人类优化的迷你肌营养不良蛋白基因可以包含seq id no:2
‑
13的功能性变体。在此上下文中，功能性变体表示可以使用给定序列的变体，只要编码的基因
产物保留参考编码分子的功能即可。因此，在本发明的上下文中，来自任何seq id no:2
‑
13的序列变体可以用于编码适宜的人优化的迷你肌营养不良蛋白。此类变体可以与本文所示的示例性序列不同，通过保留与seq id no:2
‑
13的一个或多个的约75％至约99％，如与seq id no:2
‑
13的一个或多个的至少约75％，如至少约80％、或至少约90％、至少约95％或至少约99％的序列同一性。
47.在本发明中使用的具有更小尺寸的其他迷你肌营养不良蛋白(微型肌营养不良蛋白)包含迷你肌营养不良蛋白基因(人或犬科动物)，其包含n末端、5个棒状结构域(rod 1、2、22、23、24)、2个铰链结构域(铰链1和4)和富含半胱氨酸的结构域，如hδdys3849和hoptiδdys3837。hoptiδdys3837与hδdys3849的不同之处在于(i)hoptiδdys3837是密码子优化的和(ii)全外显子79的12个碱基已被去除。基本的功能性结构域是相同的。hoptiδdys3837(也称为opti
‑
dysδ3837)的序列(其包含3837个碱基对)如seq id no:27中所示。该序列包含在seq id no:25和26内，作为碱基对2365
‑
6201(图6b)。示例性迷你肌营养不良蛋白参见wang等，pnas usa,97(25):13714
‑
13719(2000),pmid 11095710；wang等，gene therapy,15(15):1099
‑
1106(2008),pmid 18432277；wang等，gene therapy,15(22):1489
‑
1499(2008),pmid 18563184；romesh等，journal of muscle research and cellmotility,27(1):53
‑
67(2006),pmid 16496225；和koppanati等，gene therapy,17(11):1355
‑
1362(2010),pmid 20535217，其均通过引用并入本文。
48.因此，在本发明上下文中使用的适宜的人优化的迷你肌营养不良蛋白基因可以包含、基本上由或由seq id no:27组成，并且可以包含由选自以下的序列表示的结构域：由seq id no:3
‑
6和8
‑
13的任一个组成的序列，尽管一个或多个此类结构域可以包含、基本上包含或由此类序列组成。当然，显然人优化的迷你肌营养不良蛋白基因可以包含seq id no:3
‑
6、8
‑
13和27的功能性变体。此类变体可以与本文所示的示例性序列不同，通过保留与seq id no:3
‑
6、8
‑
13和27的一个或多个的约75％至约99％，如与seq id no:3
‑
6、8
‑
13和27的一个或多个的至少约75％，如至少约80％、或至少约90％、至少约95％或至少约99％的序列同一性。
49.如上所述，在本发明上下文中使用的aav内，用于在心肌和在骨骼肌中表达迷你肌营养不良蛋白基因的表达盒包含肌肉特异性第一启动子和经修饰的mck启动子增强子。在该表达盒内，迷你肌营养不良蛋白基因可操作地连接至肌肉特异性第一启动子和经修饰的mck启动子增强子，以使得迷你肌营养不良蛋白的表达在肌肉特异性第一启动子和经修饰的mck启动子增强子的控制下。
50.为了在本发明的上下文中使用，经修饰的肌肉mck启动子增强子，其允许肌肉特异性表达。优选地，经修饰的肌肉mck启动增强子是mck启动子的截短修饰，鉴于aav基因组的大小限制这是有用的。对于提供的一种修饰的肌肉mck启动子增强子，除了肌肉特异性顺式元件以外，针对在不同肌肉中的组织特异性，可以将mef
‑
2、右e盒(mef1)和富含a/t的元件保留在增强子区域中，包括两个右e
‑
盒和一个s5修饰区。参见bing wang等，gene ther.,2008,15:1489
‑
1499.pmid:18563184(其全部内容通过引用并入本文)。一个优选的经修饰的肌肉mck启动子增强子的序列(包含216个碱基对)如seq id no:1(图5b)、seq id no:23(图5b)、seq id no:25(图6b)和seq id no:26(图6b)的核苷酸1757
‑
1972所示，并且由序列id no:14：
51.ccactacgggtctaggctgcccatgtaaggaggcaaggcctggggacacccgagatgcctggttataattaaccccaacacctgctgcccccccccccccaacacctgctgcctgagcctgagcggttaccccaccccggtgcctgggtcttaggctctgtacaccatggaggagaagctcgctctaaaaataaccctgtccctggtggatcccct表示。
52.因此，在本发明上下文中使用的适宜的经修饰的肌肉mck启动子增强子可以包含、基本上由或由seq id no:14组成。当然，显然经修饰的肌肉mck启动子可以包含seq id no:14的功能性变体。在此上下文中，功能性变体表示可以采用给定序列的变体，只要该变体保留参考序列的功能即可。因此，在本发明的上下文中，来自seq id no:14的序列变体可用作经修饰的肌肉mck启动子增强子。此类变体可以与本文所示的示例性序列不同，通过保留与seq id no:14的约75％至约99％，如与seq id no:14的至少约75％，如至少约80％、或至少约90％、至少约95％或至少约99％的序列同一性。
53.为了在本发明的上下文中使用，肌肉特异性第一启动子允许肌肉特异性表达。一个优选的经修饰的肌肉特异性第一启动子是合成的启动子(syn)，除了肌肉特异性顺式元件以外，其还包含mef
‑
2和右e盒。参见bing wang等，gene ther.,2008,15:1489
‑
1499.pmid:18563184(其全部内容通过引用并入本文)。一个优选的肌肉特异性第一启动子的序列(包含317个碱基对)如seq id no:1(图5b)、seq id no:23(图5b)、seq id no:25(图6b)和seq id no:26(图6b)的核苷酸1973
‑
2289所示，并由序列id no:15：
54.gcatgcggccgtccgccctcggcaccattcctcacgacaccgaaatatggcgacgggtgaggaatggtggggagttatttttagagcggtgaggaatggtgggcaggcagcaggtgttgggggagttatttttagagcggggagttatttttagagcggtgaggaatggtggacaccgaaatatggcgacgggtgaggaatggtgccgtcgccatatttgggtgtcccgtccgccctcggccggggccgcattcctgggggccgggcggtgctcccgcccgcctcgataaaaggctccggggccggcggcggcccac表示。
55.因此，在本发明上下文中使用的适宜的肌肉特异性第一启动子可以包含、基本上由或由seq id no:15组成。当然，显然肌肉特异性第一启动子可以包含seq id no:15的功能性变体。在此上下文中，功能性变体表示可以采用给定序列的变体，只要该变体保留参考序列的功能即可。因此，在本发明的上下文中，来自seq id no:15的序列变体可用作肌肉特异性第一启动子。此类变体可以与本文所示的示例性序列不同，通过保留与seq id no:15的约75％至约99％，如与seq id no:15的至少约75％，如至少约80％、或至少约90％、至少约95％或至少约99％的序列同一性。
56.用于在心肌和在骨骼肌中迷你肌营养不良蛋白基因表达的表达盒还可以包含用于增强迷你肌营养不良蛋白基因表达的其他所需的元件。例如，在seq id no:1中所示的示例性aav序列包含kozak共有序列(gccacc(seq id no:16))，其作为用于迷你肌营养不良蛋白基因翻译的增强子。参见，bing wang等，journal of orthopaedic research,2009,27:4,421
‑
42,.pmid:18973234(其全部内容通过引用并入本文)。
57.如上所述，用于本发明上下文中的aav包含其中nf
‑
κb/p65
‑
shrna基因可操作地连接至第二启动子的表达盒。小鼠nf
‑
кb/p65
‑
shrna表达盒特异性沉默nf
‑
кb/p65的亚基65。参见qing yang等，gene ther.2012,19:1196
‑
1204,pubmedpmid:22278411(其全部内容通过引用并入本文)。不受理论的束缚，据信nf
‑
кb/p65的亚基65的特异性沉默降低炎症，其能够导致迷你肌营养不良蛋白基因更强大的表达。小鼠特异性nf
‑
кb/p65
‑
shrna包含51个碱基对，并且包含在seq id no:1(图5b)和seq id no:25(图6b)的核苷酸1701
‑
1751处。其序
和3’反向末端重复序列(itr)有助于将基因组包装到载体包装中。参见，xiao等，j.virol.1998；72(3):2224
‑
32.pubmedpmid:9499080(其全部内容通过引用并入本文)。此类3’和5’itr的序列是本领域普通技术人员公知的，但是例如包括：
64.ttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct(seq id no:19
–5’
itr和)
65.aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaa(seq id no:20
–3’
itr)。
66.此外，包含poly(a)信号序列可以增强载体的基因表达。参见，bing wang等，proc.natl.acad.sci.usa.,2000,97(25):13714
‑
13719,pmid:11095710(其全部内容通过引用并入本文)。polya序列是本领域普通技术人员众所周知的，但一个适宜poly(a)的非限制性实例是tcgaggcctaataaagagctcagatgcatcgatcagagtgtgttggttttttgtgtgaga(seq id no:21)。在图5b和6b中描述了seq id no:1、23、25和26内这些序列的位置。包括在内的其他有用的遗传元件包括赋予抗生素抗性的基因，如氨苄青霉素，其通常在病毒包装细胞的培养过程中用于选择受感染的细胞以增加病毒滴度。
67.在本发明的上下文中，作为双重表达盒基因载体使用的aav可以通过本领域普通技术人员公知的标准分子和细胞技术产生，所述双重表达盒基因载体包含用于在心肌组织和骨骼肌组织中表达迷你肌营养不良蛋白基因和nf
‑
κb/p65
‑
shrna基因两者的表达盒。例如，可以通过标准分子技术工程化的包含所述双重表达盒和其他aav序列的质粒。然后，可以使用质粒来产生病毒载体，例如，通过将其转染到适宜的包装细胞系中(如hek293细胞或hek 293t细胞，但可以使用其他细胞系)。可以从群体中选择转化体，例如通过将培养物暴露于针对其aav载体基因组赋予抗性的化合物(例如，氨苄青霉素)。一旦细胞产生了aav包装，就可以对其进行纯化(例如，使用cscl梯度或通过本领域普通技术人员公知的其他方法)。随后，可以将其储存(例如，冻存)或配制以供使用。
68.在一个实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的基因载体(本文所述的aav)和药学上可接受的载剂，所述基因载体包含用于在心肌组织和骨骼肌组织中表达迷你肌营养不良蛋白基因和nf
‑
κb/p65
‑
shrna基因两者的表达盒。药学上可接受的载剂可以包括本领域普通技术人员公知的任何载剂。组合物的载剂可以是针对载体的任何适宜载剂。载剂通常将是液体并配制用于注射，但是也可以是固体，或者液体和固体组分的组合。理想的载剂是药学上可接受(例如，生理学或药学上可接受)的载剂(例如，赋形剂或稀释剂)。药学上可接受的载剂是众所周知和容易获得的。载剂的选择将至少部分地由用于给予组合物的特定载剂和特定方法决定。
69.该组合物还可包含任何其他适宜的组分，特别是用于增强组合物和/或其最终用途的稳定性。因此，本发明的组合物有多种适宜的制剂。以下制剂和方法仅仅是示例性的，绝对不是限制性的。
70.适用于胃肠外施用的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液或其他组织等渗的溶质，以及水性和非水性无菌混悬剂，其可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。制剂可以存在于单位
剂量或多剂量密封容器中，如安瓿和小瓶，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，只需在使用前立即添加无菌液体赋形剂，例如注射用水。
71.此外，组合物可以包含另外的治疗剂或生物活性剂。例如，可以存在用于治疗特定适应症的治疗因素。控制炎症的因素，如布洛芬或类固醇，可以是组合物的一部分，以减少与体内施用载体和生理不适相关的肿胀和炎症。免疫系统抑制剂可以与组合方法一起施用以减少对载体本身或与病症相关的任何免疫应答。或者，组合物中可包含免疫增强剂以上调身体对疾病的天然防御。可以存在抗生素(即，杀微生物剂和杀真菌剂)，以降低与基因转移程序和其他病症相关的感染风险。
72.在一个实施方式中，本发明还提供了一种用于改善杜氏肌营养不良症(dmd)的方法，所述方法包括将如本文所述的基因载体(aav)或药物组合物以可改善dmd的量和位置施用给患有dmd或有发生dmd风险的患者或受试者。在这种情况下，患者或受试者通常是人(例如，患有并接受dmd治疗的患者或临床试验的受试者)。然而，该方法还可以应用于非人动物的基因表达评估或dmd动物模型的评估。此类非人动物通常是实验室研究中常用的动物(例如，小鼠、大鼠、狗、非人灵长类等)。
73.在实施该方法时，基因载体或药物组合物通常通过胃肠外(例如，腹腔内、静脉内、肌内等)注射施用。然而，其他递送途径可能适合并被治疗医师或临床试验方案采用。
74.在执行本发明的方法中递送的病毒颗粒的量可以由医师或实验室研究人员确定并且可以取决于受试者的体型或受试者或患者的物种。然而，应该递送足够的基因载体(aav)以感染心脏和骨骼肌，以导致双重表达盒从本发明的基因载体表达。对于实验室研究，如在以下实施例中所报告的，腹腔注射10
11
个aav基因组，尽管比这少一点可能就足够了。然而，对于人类患者或受试者，更高数量的aav基因组可能是必需的或所需的。例如，在实施本发明方法时，可以使用至少108个aav基因组、或至少109个aav基因组、或至少10
10
个aav基因组、或至少10
11
个aav基因组、或至少10
12
个aav基因组、或至少10
13
个aav基因组、或至少10
14
个aav基因组(或至少“约”此类数量的aav基因组)。尽管施用于患者或受试者的aav基因组的上限可能部分取决于药物组合物的配制浓度，但是施用高达10
20
个aav基因组、或高达10
19
个aav基因组、或高达10
18
个aav基因组、或高达10
17
个aav基因组、或高达10
16
个aav基因组、或高达10
20
个aav基因组(或高达“约”此类数量的aav基因组)可能是适宜的。可以使用更多或更少数量的aav基因组；剂量最终由医师、实验室研究人员或临床试验方案决定。通常的剂量是2x10
10
‑
1x10
11
个病毒基因组/kg(患者身体)(参见，ds,mol.ther.2018,26:2337
‑
2356，表4，其全部内容通过引用并入本文)。
75.以下实施例进一步说明本发明，但当然不应被解释为以任何方式限制其范围。
76.实施例
77.在下述实施例中，产生了一个此类双重表达盒aav载体，其具有驱动人密码子优化的迷你肌营养不良蛋白基因的经修饰的mck增强子(mcken)和肌肉特异性合成启动子(syn)(wang,2008 gene therapy，和kornegay,2010 molecular therapy)。如通过在心肌中的高水平表达所证实的，这保证了在严重dmd小鼠模型的全身肌肉中迷你肌营养不良蛋白基因的有效和特异性表达，所述小鼠模型是肌营养不良蛋白/抗肌萎缩蛋白相关蛋白双重敲除(dys
‑
/
‑
:utro
‑
/
‑
,dko
‑
homo)小鼠。这种双重治疗方法还导致慢性炎症的有效抑制，特别是在这种严重dmd模型的骨骼肌中。
78.接下来，通过tg.dko
‑
het(dys
‑
/
‑
:utro /
‑
).p65 /
‑
小鼠的杂交，获得了tg.dko
‑
homo.p65 / 和tg.dko
‑
homo.p65 /
‑
小鼠两者。还观察到，在严重dmd小鼠模型中，nf
‑
κb的p65亚基(p65 /
‑
)的遗传消融与转基因人迷你肌营养不良蛋白基因的协同治疗效果是有益的，且没有毒性。
79.总之，具有双重表达盒的新型aav载体包含用于肌肉特异性肌营养不良蛋白基因表达的紧凑启动子和用于抗炎的nf
‑
κb的特异性shrna，其可以提高dmd基因疗法的治疗有效性和安全性。
80.实施例1
81.该实施例证明了通过设计驱动人密码子优化的迷你肌营养不良蛋白基因的经修饰的mck增强子(mcken)和肌肉特异性合成启动子(syn)优化双重表达盒aav载体(wang,2008 and kornegay,2010)。这确保在严重dmd小鼠模型的全身肌肉中，特别是在心肌中，迷你肌营养不良蛋白基因的有效和特异性表达。这种双重治疗方法还导致慢性炎症的有效抑制，特别是在骨骼肌中。
82.方法
83.在本研究中，iacuc方案被批准用于所有小鼠品系。野生型(wt,c57/bl10)小鼠购自jackson laboratory。肌营养不良蛋白/抗肌萎缩蛋白相关蛋白双重敲除(dys
‑
/
‑
:utro
‑
/
‑
,dko
‑
homo)小鼠来自通过杂合子肌营养不良蛋白/抗肌萎缩蛋白相关蛋白双重敲除小鼠(dys
‑
/
‑
:utro /
‑
)杂交的内部群体。如图1a所示，迷你肌营养不良蛋白aav载体的单一表达盒的产生，即将由计算机密码子优化的迷你肌营养不良蛋白基因(包括n末端、5个棒状结构域(1、2、22、23、24)、3个铰链结构域(1、3、4)和cr末端)克隆进入单一aav载体，并由mck修饰的增强子调控的肌肉合成启动子驱动。基于已发表的功能性小鼠nf
‑
κb/p65 mrna序列(yang,2012)，设计了两种形式(m1和m2)的由u6启动子驱动的小鼠p65/shrna，并分别克隆至单一表达盒paav(ss)
‑
mcken
‑
syn
‑
hoptidys3978(kornegay,2010)。通过cscl梯度超速离心纯化质粒。一种这样的质粒paav
‑
m1p65ensynopti3978示意性地描述在图5a和5b中，并且其序列如seq id no:1中所示。
84.根据yang,2012，通过共转染在293细胞中包装aav9载体，并通过两次cscl梯度超速离心纯化。向5日龄的dko
‑
homo幼崽进行使用50μl(1x10
11
个病毒基因组颗粒)病毒的单次腹腔内注射，并在8周龄时分析心肌和骨骼肌以及肝脏组织的冰冻切片。将切片用于使用针对人肌营养不良蛋白(棒状结构域1&2)、磷酸化的nf
‑
κb/p65(#8242,cell signaling)、cd4(bd550280,bd biosciences)、cd8(ab22378,abcam)、cd68(#9936,cell signaling)、coliv(ab6586,abcam)抗体的免疫荧光(if)染色。还使用dapi对细胞核染色(蓝色)。图像是在200x放大倍数下拍摄。
85.结果
86.如图1b所示，通过western印迹测定检测心肌，观察到在wt小鼠中全长肌营养不良蛋白(450kda)以及在使用单一或双重表达盒载体治疗的dko
‑
homo小鼠中迷你肌营养不良蛋白(150kda)的有效表达。肌营养不良蛋白的if染色也证实了在心脏和骨骼肌组织(膈肌、腓肠肌和胫前肌)中肌肉靶向基因递送的特异性，如在肝组织中未表达肌营养不良蛋白所证实的(图1c和图1d)。在使用单一或双重表达盒载体治疗的小鼠之间在心脏和膈肌组织中肌营养不良蛋白阳性细胞比例没有差异(图1e)。但是，使用双重表达盒载体治疗的小鼠在
腓肠肌和胫骨前肌中具有高得多的迷你肌营养不良蛋白表达(图1e)。
87.结果表明，双重表达盒aav载体治疗的骨骼肌炎症减少，这表明单一aav载体将抗肌营养不良蛋白基因置换与抗炎组合可以实现协同效应。
88.通过p
‑
p65对腓肠肌(gas)进行if染色，以确定活性nf
‑
κb、cd4和cd8的水平以评价免疫细胞浸润，以及cd68以检测炎性巨噬细胞。如在图2a中所示，与使用单一表达盒aav治疗相比，使用双重表达盒aav治疗的gas肌肉通过减少nf
‑
κb显示出较少的炎症标志物，如cd4、cd8和cd68。wt gas在肌肉中未显示出炎症。然而，未治疗的dko
‑
homo的gas具有显著的炎症。图2b显示了在心肌和gas中p
‑
p65的if染色。在心脏组织中，在所有组中几乎无阳性细胞。但是，在gas肌肉中，与单一
‑
homo和未治疗homo小鼠(ct
‑
homo)组相比，双重
‑
homo组显示出低的多的p
‑
p65。
89.这些结果表明，与单一表达盒aav治疗或无治疗相比，在通过双重表达盒aav治疗的骨骼肌中观察到活性nf
‑
κb(p
‑
p65)的显著降低。与在mdx/utrn
‑
/
‑
小鼠的骨骼肌中不同的是，无论是使用双重表达盒aav治疗还是单一表达盒aav治疗或无治疗的小鼠中，在心肌组织中活性nf
‑
κb(p
‑
p65)无显著差异。
90.讨论
91.考察了通过单一aav载体将肌肉靶向基因置换与nf
‑
κb抑制组合的全身性作用，确保了在全身肌肉中计算机密码子优化的人迷你肌营养不良蛋白的充分表达和炎症降低。这些结果表明，具有双重表达盒的新型aav载体可以增强在临床试验或其他方面中dmd基因疗法的治疗效率和安全性，所述双重表达盒包含用于肌肉特异性肌营养不良基因表达的紧凑启动子和用于抗炎的nf
‑
κb的特异性shrna。
92.实施例2
93.本实施例表明，在严重dmd小鼠模型(dys
‑
/
‑
:utro
‑
/
‑
,dko
‑
homo)中nf
‑
κb(p65 /
‑
)的p65亚基的基因消融与转基因人迷你肌营养不良蛋白基因的协同治疗作用可能是有益的。
94.方法
95.在本研究中，iacuc方案被批准用于所有小鼠品系。野生型(wt,c57/bl10)和mdx(dys
‑
/
‑
)小鼠购自jackson laboratory。mdx.p65 /
‑
和人迷你肌营养不良蛋白(dysδ3990).mdx(tg.mdx)小鼠(yin,2017和wang,2000)来自内部群体。tg.dko
‑
het(dys
‑
/
‑
:utro /
‑
).p65 /
‑
小鼠杂交，获得了tg.dko
‑
homo.p65 / 和tg.dko
‑
homo.p65 /
‑
小鼠两者(图3a)。
96.使用2月龄小鼠的腓肠肌(gas)制备冰冻切片。将切片用于苏木素和伊红(h&e)以及masson三色染色。还使用针对人肌营养不良蛋白(棒状结构域1&2)、β
‑
肌聚糖(ncl
‑
a
‑
sarc,leica)、磷酸化的nf
‑
κb/p65(#8242,cell signaling)、cd68(#9936,cell signaling)、cd4(bd550280,bd biosciences)、cd8(ab22378,abcam)、coliv(ab6586,abcam)和小鼠igg(migg)(c2181,sigma)抗体对切片进行免疫荧光(if)染色。使用dapi对细胞核染色。在200x放大倍数采集图像。通过western印迹分析检测蛋白表达，使用针对gapdh的抗体作为内参。使用graphipad prism 7软件进行统计学分析。所有结果均以平均值
±
sd表示(每组n≥4)。当p值<0.05时，认为差异具有统计学显著性。
97.结果
98.如图3b中所示，检测到在wt中全长肌营养不良蛋白(450kda)或在tg小鼠中迷你肌营养不良蛋白(150kda)的高水平表达。在p65敲除背景下(tg.dko
‑
homo.p65 / vs tg.dko
‑
homo.p65 /
‑
；dko
‑
homo.p65 / vs dko
‑
homo.p65 /
‑
)发现磷酸化nf
‑
κb(65kda)的显著降低。在图3c中，在迷你肌营养不良蛋白转基因dmd小鼠中还发现了高水平的肌营养不良蛋白或肌营养不良蛋白相关蛋白(β
‑
肌聚糖)，以及在h&e染色中肌细胞形态的改善。
99.此外，将migg、cd68、cd4和cd8的masson三色染色和if染色应用于分析肌肉纤维化、坏死和炎症。在图4a中的结果表明在p65敲减背景下(特别是tg.dko
‑
homo.p65 /
‑
vs tg.dko
‑
homo.p65 / )细胞形态改善，以及纤维化、坏死和炎症减少，表明nf
‑
κb/p65亚基的基因消融能够降低炎症水平。
100.如图4b中所示，对在2月龄时gas肌肉(tg.dko
‑
homo.p65 / vs tg.dko
‑
homo.p65 /
‑
；dko
‑
homo.p65 / vs dko
‑
homo.p65 /
‑
)中cd68,cd4and cd8的if染色的统计学分析表明，从每组共计200个细胞计算得出，p65亚基的基因减少能够显著降低免疫细胞的纤维化、坏死和浸润水平。在wt小鼠中未观察到炎症，且与mdx小鼠相比未治疗的dko
‑
homo gas肌肉显示出更高的炎症水平(图4a和4b)，这与此前观察到的结果一致(mu,2015)。
101.如图4c中所示，与在mdx/utrn
‑
/
‑
小鼠中的骨骼肌不同的是，无论小鼠使用双重表达盒aav或单一表达盒aav治疗或未治疗，在心肌中cd68 巨噬细胞无显著性差异。。而相反的是，与单一表达盒aav相比，在使用双重表达盒aav治疗的骨骼肌中观察到cd4 和cd8 免疫细胞和cd68 巨噬细胞的显著减少。
102.图4d显示了通过双重表达盒aav和单一表达盒aav治疗的全身治疗mdx/utrn
‑
/
‑
小鼠总体健康状况和肌肉功能的比较。当在1月龄和2月龄时使用0至200hz频率对肌肉功能检测时，在1月龄时在200hz下这两个治疗组均显示出显著改善，但是双重表达盒aav和单一表达盒aav治疗相比无差异。然而，在晚龄(如2个月)时在200hz下与单一表达盒aav相比双重表达盒aav治疗显示出协同作用。
103.此外，在双重表达盒aav治疗组观察到早期出现(在1月龄)体重改善，并且在2月龄时观察到通过双重表达盒aav和单一表达盒aav治疗的mdx/utrn
‑
/
‑
小鼠的体重改善。
104.讨论
105.该实施例表明，在严重dmd小鼠模型中转基因和nf
‑
κb/p65敲低的基因置换和抗炎作用的有效性。这些结果揭示了在dko
‑
homo小鼠背景下迷你肌营养不良蛋白表达与nf
‑
kb/p65敲除一起能够改善肌肉形态，减少纤维化、化合物和炎症。这些结果意味着nf
‑
κb的基因减少可能会增强其在大型动物和临床试验中迷你肌营养不良蛋白基因疗法的有效性，强调了可以将其用于通过肌营养不良蛋白基因置换与抗炎组合对dmd患者的基因疗法。
106.在此引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，都以相同的程度通过引用并入本文，就好像每个参考文献被单独地和具体地指示为通过引用并入并在此整体阐述一样。其中包括但不限于以下参考文献：
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122.在描述本发明的上下文中(尤其是在以下权利要求的上下文中)，术语“一个(a)”和“一种(an)”和“所述(the)”和“至少一个”以及类似指代的使用应被解释为涵盖以下两个方面：单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。使用术语“至少一个”后跟一个或多个项目的列表(例如，“a和b中的至少一个”)应被解释为表示从所列项目(a或b)中选择的一个项目或者两个或多个所列项目(a和b)的任何组合，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，否则术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(containing)”应被解释为开放式术语(即，意为“包括但不限于”)。除非本文另有说明，否则本文中对值范围的引用仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且将每个单独值并入说明书中，就好像其在本文中单独引用一样。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法都可以任何合适的顺序进行。除非另有声明，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明而不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
123.本文描述了本发明的优选实施方式，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。通过阅读上述描述，那些优选实施方式的变化对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的。发明人期望技术人员适当地采用这种变化，并且发明人打算以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括在适用法律允许的情况下所附权利要求中记载的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素的所有可能变化形式的任何组合。