一种检测粘度的大斯托克位移荧光探针及其制备和应用的制作方法

1.本技术涉及小分子荧光探针领域，具体地，涉及一种检测粘度的大斯托克位移荧光探针及其制备和应用。


背景技术：

2.粘度在生物微环境中起着至关重要的作用。细胞不同区域的粘度差异很大，因此也影响着各个区域中活性分子的扩散，如信号传递、物质运输、生化物质之间的相互作用等。多项研究发现，细胞粘度水平异常往往与各种疾病有关，如癌症、心血管疾病、抑郁症、糖尿病和阿尔茨海默病。因此，急需开发有效的检测细胞中粘度变化的工具，这对促进疾病预防和开展临床诊断具有重要作用。
3.相对于其他检测方法，荧光探针由于其制备方法简单、灵敏度高、活细胞/活体可视化等优点，已被用细胞/活体中粘度值的检测。然而，目前已报道的粘度荧光探针大多存在斯托克斯位移小的缺陷，容易具有严重的自淬灭现象，其检测结果受到仪器激发光的干扰，造成较大的测量误差。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明提供一种检测粘度的大斯托克斯位移荧光探针。
5.一种检测粘度的大斯托克斯位移荧光探针，探针分子式为c
26
h
24
n2o，结构式如式(i)所示：
[0006][0007]
本技术还提供一种大斯托克斯位移荧光探针的制备方法，包括：
[0008]
将化合物(2)和化合物(3)混合，加入乙腈及哌啶，在氮气保护下将混合物加热得反应液；将反应液旋干并分离纯化，制备得到所述的大斯托克斯位移荧光探针；
[0009][0010]
合成路线如下：
[0011][0012]
可选的，所述化合物(2)、化合物(3)和哌啶的摩尔比为1：1～1.5：0.1。
[0013]
可选的，所述乙腈作为溶剂。
[0014]
可选的，氮气保护下将混合物加热的反应条件为：60℃～80℃反应10～14小时。
[0015]
可选的，所述分离纯化方法可如下：将反应液减压浓缩，利用硅胶柱层析法进行分离纯化，所用洗脱液为体积比为1：3的乙酸乙酯：石油醚，得到所述的荧光探针(i)。
[0016]
本技术化合物(2)为公开的化合物，其制备方法可参考文献(homma h,harada s,ito t,kanda a,et al.atypical dearomative spirocyclization ofβ
‑
naphthols with diazoacetamides using a silver catalyst[j].organic letters,2020,22:8132
‑
8138.)。
[0017]
本发明化合物(3)为公开的化合物，其制备方法可参考文献(wu y y,yu wt,hou t c,et al.a selective and sensitive fluorescent albumin probe for the determination of urinary albumin[j].chemical communications,2014,50:11507
‑
11480.)。
[0018]
本技术还提供一种所述的大斯托克斯位移荧光探针在制备粘度检测产品中的应用。
[0019]
可选的，所述粘度检测产品为粘度检测试剂或粘度检测试剂盒。
[0020]
可选的，所述粘度检测产品用于检测细胞中粘度或溶液中粘度。
[0021]
可选的，所述细胞为人肺癌细胞a549。
[0022]
本技术还提供一种所述的大斯托克斯位移荧光探针在制备荧光成像产品中的应用。
[0023]
可选的，所述荧光成像产品为荧光成像试剂或荧光成像试剂盒。
[0024]
本技术的荧光探针，可应用于定量检测溶液的粘度值，方法包括：
[0025]
将所述荧光探针加入待测溶液中，经混匀、超声、静置后，在激发波长为440nm，发射波长为628nm处采集溶液的荧光强度，根据标准曲线计算得到待测溶液的粘度值。
[0026]
可选的，可检测粘度的大斯托克斯位移荧光探针在待测溶液中的加入量以荧光探针的摩尔量与溶液中粘度比计为：0.005mm荧光探针：粘度1～109cp。在该配比条件下，以628nm处的荧光强度为纵坐标与溶液粘度为横坐标，做线性关系图可以发现，在粘度为1～109cp的范围内，两者具有良好的线性关系，线性方程：y＝29.65x 711.47(r2＝0.999)。
[0027]
可选的，标准曲线的制备如下：
[0028]
将0.005mm荧光探针分别与粘度在1～109cp内的溶液中，激发波长为440nm、发射波长为628nm下采集溶液的荧光强度，以荧光强度为纵坐标、溶液粘度为横坐标，绘制即得线性标准曲线。
[0029]
可选的，线性标准曲线的线性方程为：y＝29.65x 711.47(r2＝0.999)
[0030]
可选的，检测粘度时，溶液的ph值为7.4。
[0031]
本技术的荧光探针还可用于非诊断目的的细胞中粘度变化检测。在激发波长为488nm、发射接收波长范围为580～680nm可检测检测粘度变化。
[0032]
可选的，所述细胞为人肺癌细胞a549。
[0033]
相比于现有技术，本发明的有益效果体现在：本发明提供的荧光探针制备方法简单，具有大斯托克斯位移的性质，可避免仪器激发光的干扰，减少检测误差，并可用于检测溶液和细胞内粘度的变化。
附图说明
[0034]
图1为实施例1制备的荧光探针(i)的核磁氢谱。
[0035]
图2为实施例1制备的荧光探针(i)的核磁碳谱。
[0036]
图3为实施例1制备的探针(i)在不同溶剂中的紫外可见光吸收光谱图。
[0037]
图4为实施例1制备的探针(i)在不同溶剂中的荧光光谱图。
[0038]
图5为实施例1制备的探针(i)在激发波长为440nm、发射波长为628nm时，在不同溶剂中的荧光强度图。
[0039]
图6为实施例1制备的探针(i)在不同比例的甘油
‑
pbs溶液中的荧光光谱图。
[0040]
图7为实施例1制备的探针(i)在激发波长为440nm、发射波长为628nm时，荧光强度与溶液粘度的线性关系图。
[0041]
图8为实施例1制备的探针(i)在激发波长为440nm、发射波长为628nm时，在不同ph值下的荧光强度图。
[0042]
图9为实施例1制备的探针(i)的抗干扰荧光强度图。
[0043]
图10为实施例1制备的探针(i)在不同粘度细胞中的成像。
具体实施方式
[0044]
下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
[0045]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本技术的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本技术。
[0046]
实施例1：荧光探针(i)的制备
[0047]
将化合物(2)(0.5mmol)和化合物(3)(0.6mmol)置于圆底烧瓶中，随后加入5ml乙腈和哌啶(0.05mmol)，在氮气保护下将混合物加热12小时，反应温度为70℃。将反应液旋干并用硅胶柱层析分离纯化，展开剂为乙酸乙酯：石油醚为1:3(体积比)，制备得到大斯托克斯位移荧光探针(i)(0.11g，产率为57.9％)。
[0048]
合成路线：
[0049][0050]
该大斯托克斯位移荧光探针(i)的核磁氢谱如图1所示，核磁碳谱如图2所示。
[0051]1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ8.11
–
8.06(m,1h),7.90
–
7.79(m,3h),7.53
–
7.33(m,3h),7.22(dd,j＝8.9,2.6hz,1h),6.90(s,1h),6.12(ddt,j＝17.2,10.5,5.3hz,1h),5.47(dq,j＝17.2,1.7hz,1h),5.31(dq,j＝10.5,1.5hz,1h),4.71(dt,j＝5.4,1.6hz,2h),2.60(d,j＝13.6hz,4h),1.03(s,6h).
13
c nmr(101mhz,dmso
‑
d6)δ170.74,157.59,156.53,138.40,135.38,133.89,131.96,130.51,129.37,129.28,128.90,127.86,125.07,122.93,119.81,118.24,114.42,113.61,107.92,76.36,68.84,42.78,38.68,32.16,27.93.
[0052]
实施例2：荧光探针(i)在不同溶剂中的紫外可见光吸收强度和荧光强度的测试。
[0053]
准确称取一定量的荧光探针(i)，用二甲基亚砜配制成浓度为10mm的母液，移液枪吸取40μl加入到4ml不同待测溶剂(1
‑
13分别为：1,4
‑
二氧六环、四氢呋喃、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、丙酮、二甲基亚砜、n,n
‑
二甲基甲酰胺、乙腈、甲醇、水、乙醇和甘油)中，摇荡混匀后加入到比色皿中，分别用紫外
‑
可见光分光光度计和荧光分光光度计进行测试。
[0054]
由图3表明，荧光探针(i)在不同溶剂中的最佳吸收峰和吸收强度不同，其中在甘油中的最佳吸收峰位于440nm。由图4和图5发现，以440nm为激发波长进行荧光激发扫描，相比于其他低粘度溶剂，探针在高粘度溶剂甘油中的荧光强度(发射峰位于628nm)最高。以上数据证明了荧光探针(i)响应溶液粘度的能力，发射峰与激发峰差为188nm，具有大斯托克斯位移的性质。
[0055]
实施例3：荧光探针(i)在不同比例的甘油
‑
pbs溶液中的荧光光谱测试。
[0056]
准确称取一定量的荧光探针(i)，用二甲基亚砜配制成浓度为10mm的母液，移液枪吸取40μl加入到4ml不同比例(体积比)的甘油
‑
pbs溶剂(10％、20％、40％、50％、70％、80％和90％)中，摇荡混匀、超声后加入到比色皿中，用荧光分光光度计进行测试。
[0057]
如图6可知，随着甘油的比例提高，溶液的粘度不断提高，以440nm为激发波长扫描得到的荧光强度提高。由图7可知，以628nm处的荧光强度为纵坐标与溶液粘度为横坐标，做线性关系图可以发现，在粘度为1～109cp的范围内，两者具有良好的线性关系，线性方程：y＝29.65x 711.47(r2＝0.999)。因此，证明了探针(i)可通过628nm处的荧光强度变化定量检测溶液粘度。
[0058]
实施例4：荧光探针(i)在不同的ph溶液中的荧光光谱测试。
[0059]
准确称取一定量的荧光探针(i)，用二甲基亚砜配制成浓度为10mm的母液，移液枪吸取40μl加入到4ml pbs溶液中(ph＝3.5、4、4.5、5、5.5、6、7、7.4、8、8.5、9、10)中，摇荡混匀、超声后加入到比色皿中，用荧光分光光度计进行测试。
[0060]
如图8所示，随着ph的变化，探针的荧光强度变化较小，证明溶液的ph基本不影响探针对粘度的检测。
[0061]
实施例5：荧光探针(i)的抗干扰能力的测试。
[0062]
准确称取一定量的荧光探针(i)，用二甲基亚砜配制成浓度为10mm的母液，移液枪吸取40μl加入到4ml含有不同被分析物的pbs溶液中(1至20分别为gu
2
、ni
2
、k

、sr
2
、cd
2
、ba
2
、zn
2
、mg
2
、so
32
‑
、no
32
‑
、i
‑
、hs
‑
、hso3‑
、f
‑
、：cys、gsh、hcy、clo
‑
、h2o2、onoo
‑
、甘油)中，摇荡混匀、超声后加入到比色皿中，用荧光分光光度计进行测试。
[0063]
如图9所示，相比于甘油，其它被分析物的加入对探针的荧光强度影响很小，证明探针具有很好的抗干扰能力。
[0064]
实施例6：本发明中探针(i)在人肺癌细胞中的粘度成像分析。
[0065]
将a549(人肺癌细胞)接种到培养皿中，在二氧化碳培养箱中培养，待24小时后，将细胞分为两组：实验组，向培养皿中加入从试剂公司购买的制霉菌素，37℃下孵化半小时，用新鲜培养基洗涤两次，然后加入探针(i)孵化半小时，用pbs洗涤后在激光共聚焦显微镜下成像；对照组，不需要另外处理，直接加入探针(i)孵化半小时，用pbs洗涤后在激光共聚焦显微镜下成像。荧光通道：激发波长为488nm，发射接收波长范围为580～680nm。细胞共聚焦成像图见图10。
[0066]
结果表明，相比于对照组，a549细胞在制霉菌素孵育之后，其荧光强度增大，表明探针(i)可以定性检测a549细胞内粘度的变化。
[0067]
以上所述实施例仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本技术专利的保护范围应以所附权利要求为准。