SVCV的宿主细胞膜结合蛋白的捕获方法和捕获试剂与流程

svcv的宿主细胞膜结合蛋白的捕获方法和捕获试剂
技术领域
1.本技术属于生物捕获技术领域，尤其涉及一种svcv的宿主细胞膜结合蛋白的捕获方法和捕获试剂。


背景技术：

2.鲤春病毒血症(spring viraemia of carp，svc)是鲤科鱼类的一种高度传染性的流行病，该病的病原是鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus，svcv)，我国将其列为一类动物疫病，就其传染性而言，可以称为“水生动物中的禽流感”。svcv的宿主范围广，能感染鲤科四大家鱼，非鲤科鱼如欧鲶也能被感染，鲤鱼是其中主要的和最易感的宿主(oie，2009)。svcv能否感染宿主主要与两个因素有关：1.svcv与宿主靶器官细胞的识别和侵入；2.宿主对svcv的免疫。上述差异的原因在动物机体水平层面两种因素都存在，但是在细胞水平层面则与病毒同靶器官细胞表面受体的特异性结合紧密相关。
3.细胞受体是能特异性与病毒结合、介导病毒内化并促进病毒侵入的细胞膜组分，它决定着病毒宿主范围和对组织及细胞的亲嗜性。水生动物的传染病水平传播时，媒介是其生活的水源，由于水环境的共用性，同一水源的各种水生动物必然接触传染源，病毒能否感染环境中的水生动物，首先决定于病毒对宿主细胞的亲嗜性。因此，病毒受体的研究是了解疫病传播途径很重要的一个环节，相比陆生动物病毒，对svcv研究的科学意义尤其突出。目前，国内外没有关于svcv感染鲤科鱼类所识别的细胞表面受体的文献报道。解析svcv的细胞受体，能够解答svcv跨种间感染的差异和细胞对svcv病毒4种基因型毒株敏感性不同的原因等科学问题，在理论上推动深入研究svcv感染宿主的机理，在实践中对svc发病的风险评估及防控研究具有重要的指导意义。
4.病毒的细胞受体研究方法主要有：
①
病毒覆盖蛋白结合法(virus overlay protein
‑
binding assay，vopba)；
②
免疫共沉淀法(coimmunoprecipitation，co
‑
ip)；
③
gst亲和层析和gst pull
‑
down方法；
④
表面等离子体共振(surface plasmon resonance，spr)；
⑤
酵母双杂交技术；
⑥
噬菌体表面展示技术等方法，研究受体的方法大体上就是研究蛋白质相互作用的方法。各种方法均有优缺点，例如通过vopba方法通常只能了解病毒受体的分子量大小，不能提供有关受体蛋白的其他线索，实际上还是不能明确病毒受体到底是什么；免疫共沉淀的优点是可以直接检测细胞提取物，蛋白质接近天然状态和构象，但是不能保证沉淀的蛋白复合物是否为直接相互作用的两种蛋白，并且敏感性较差；表面等离子体共振可以捕获受体分子并测定结合的动力学参数，但是无法鉴别相互作用物质，存在假阳性的情况；酵母双杂交技术和噬菌体表面展示技术的优点是灵敏度高，缺点是基于多肽的相互作用，不能完全代表病毒与蛋白质之间的相互作用，容易出现假阳性和假阴性现象。
5.目前，未见svcv与其宿主相互作用分子基础的研究。


技术实现要素：

6.本技术的目的在于提供一种svcv的宿主细胞膜结合蛋白的捕获方法和捕获试剂，
旨在如何捕获svcv与其宿主细胞相互作用的细胞膜结合蛋白的技术问题。
7.为实现上述申请目的，本技术采用的技术方案如下：
8.第一方面，本技术提供一种svcv的宿主细胞膜结合蛋白的捕获方法，包括如下步骤：
9.将sulfo
‑
sbed分子标记在第一鲤春病毒血症病毒上，加入第一宿主细胞进行第一孵育处理，然后进行紫外光交联反应，切割所述sulfo
‑
sbed分子中的二硫键，利用第一链霉亲和素树脂纯化得到第一捕获蛋白；
10.将lc
‑
spdp分子结合在第二鲤春病毒血症病毒上，然后与化学结构如下所示的saba分子交联，加入第二宿主细胞进行第二孵育处理，切割二硫键，利用第二链霉亲和素树脂纯化得到第二捕获蛋白；
11.将所述第一捕获蛋白和所述第二捕获蛋白通过生物信息学分析，确定捕获到的宿主细胞膜结合蛋白；
[0012][0013]
其中，n1为1～8的整数，n2为1～8的整数。
[0014]
本技术的捕获方法，通过sulfo
‑
sbed分子和saba分子分别标记鲤春病毒血症病毒，然后分别与宿主细胞孵育，再分别采用紫外光激活光交联反应和化学交联形成稳定的共价结合，以捕获svcv结合蛋白，通过链霉亲和素树脂纯化捕获蛋白后进行生物信息学分析，确定捕获到的宿主细胞膜结合蛋白；该捕获方法可以实现在活细胞上研究svcv病毒的宿主细胞膜结合蛋白的有效捕获，在svcv病毒受体研究中具有很好的应用价值。
[0015]
第二方面，本技术提供一种svcv的宿主细胞膜结合蛋白的捕获试剂，所述捕获试剂包括：分别独立包装的sulfo
‑
sbed分子、saba分子和lc
‑
spdp分子；所述sulfo
‑
sbed分子用于标记鲤春病毒血症病毒，所述saba分子用于标记鲤春病毒血症病毒，所述saba分子的化学结构如下所示，所述lc
‑
spdp在所述saba分子和鲤春病毒血症病毒之间起连接作用；
[0016][0017]
其中，n1为1～8的整数，n2为1～8的整数。
[0018]
本技术的捕获试剂包括独立包装的sulfo
‑
sbed分子、saba分子和lc
‑
spdp分子；该捕获试剂可以用于有效捕获svcv的宿主细胞膜结合蛋白，在svcv病毒受体研究中具有很好的应用价值。
附图说明
[0019]
为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020]
图1是本技术实施例提供的saba分子标记svcv的流程示意图；
[0021]
图2是本技术实施例提供的捕获蛋白unigene12835跨膜分析图；
[0022]
图3是本技术实施例提供的捕获蛋白unigene13423跨膜分析图；
[0023]
图4是本技术实施例提供的捕获蛋白unigene19308跨膜分析图；
[0024]
图5是本技术实施例提供的捕获蛋白unigene7122跨膜分析图；
[0025]
图6是本技术实施例提供的捕获蛋白cl1989.contig1跨膜分析图；
[0026]
图7是本技术实施例提供的捕获蛋白cl3290.contig2跨膜分析图；
[0027]
图8是本技术实施例提供的捕获蛋白cl3871.contig1跨膜分析图；
[0028]
图9是本技术实施例提供的捕获蛋白cl51.contig3跨膜分析图。
具体实施方式
[0029]
为了使本技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
[0030]
应理解，在本技术的各实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本技术实施例的实施过程构成任何限定。在本技术实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本技术。在本技术实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
[0031]
本技术实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本技术实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本技术实施例说明书公开的范围之内。本技术实施例说明书中所述的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
[0032]
术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本技术实施例范围的情况下，第一xx也可以被称为第二xx，类似地，第二xx也可以被称为第一xx。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
[0033]
本技术实施例第一方面提供一种svcv的宿主细胞膜结合蛋白的捕获方法，包括如下步骤：
[0034]
s01：将sulfo
‑
sbed分子标记在第一鲤春病毒血症病毒上，加入第一宿主细胞进行第一孵育处理，然后进行紫外光交联反应，切割sulfo
‑
sbed分子中的二硫键，利用第一链霉亲和素树脂纯化得到第一捕获蛋白；
[0035]
s02：将lc
‑
spdp分子结合在第二鲤春病毒血症病毒上，然后与化学结构如下所示
的saba分子交联，加入第二宿主细胞进行第二孵育处理，切割二硫键，利用第二链霉亲和素树脂纯化得到第二捕获蛋白；
[0036]
s03：将第一捕获蛋白和第二捕获蛋白通过生物信息学分析，确定捕获到的宿主细胞膜结合蛋白；
[0037][0038]
其中，n1为1～8的整数，n2为1～8的整数。
[0039]
本技术实施例的捕获方法，通过sulfo
‑
sbed分子和saba分子分别标记鲤春病毒血症病毒，然后分别与宿主细胞孵育，再分别采用紫外光激活光交联反应和醛反应氨氧基团化学交联形成稳定的共价结合，以捕获svcv结合蛋白，通过链霉亲和素树脂纯化捕获蛋白后进行生物信息学分析，确定捕获到的宿主细胞膜结合蛋白；该捕获方法可以实现在活细胞上研究svcv病毒的宿主细胞膜结合蛋白的有效捕获，在svcv病毒受体研究中具有很好的应用价值。
[0040]
具体地，本技术利用上述两种交联分子捕获到的svcv结合蛋白进行生物信息学分析，获得8种svcv相互作用的宿主细胞膜结合蛋白，其中sulfo
‑
sbed方法捕获到5种，saba方法捕获到6种，通过两者结合分析，可以有效捕获活细胞上svcv病毒的宿主细胞膜结合蛋白。
[0041]
上述步骤中，第一宿主细胞和第二宿主细胞均为svcv病毒宿主细胞，具体可以是鲤鱼上皮瘤细胞。进一步地，第一孵育处理的条件包括：温度0～4℃，时间1～1.5h；具体地，可以在避光摇床上转动孵育；第二孵育处理的条件包括：温度0～4℃，时间1～1.5h。该条件下可以更好地将结合宿主细胞膜蛋白。进一步地，第二孵育处理后，还加入终浓度为8～12mmol/l的苯二胺。
[0042]
上述步骤s01中，sulfo
‑
sbed含有的三个功能基团分别为：
①
sulfo
‑
nhs活性酯基团：用于结合标记诱饵蛋白或者病毒，nhs活性酯基团与诱饵蛋白的伯胺基团反应；
②
叠氮基团：主要靶向亲核试剂，如
‑
nh2、
‑
sh、
‑
oh，但它们不存在时，将与任何邻近的分子反应，若已标记的诱饵蛋白或者病毒已经与受体结合，光催化后叠氮基团便可与邻近的受体蛋白反应，达到捕获受体的目的；
③
生物素基团：可将生物素化的蛋白利用链霉亲和素树脂，达到纯化生物素化蛋白的目的。另外，sulfo
‑
sbed分子存在二硫键，感染捕获受体后，可通过加入二硫苏糖醇(dtt)或者巯基乙醇切割二硫键，达到将诱饵蛋白与靶向蛋白分开的目的。
[0043]
进一步地，紫外光交联反应的条件包括：紫外光波长300～304nm，时间为4～6min。本技术实施例采用sulfo
‑
sbed biotin label transfer reagent(thermo,no.33033)试剂盒推荐光交联条件(紫外交联仪，照射波长365nm，在5cm距离处光交联15min)进行svcv作用蛋白捕获，发现空白对照组也有较多蛋白被结合，该条件下虽然实验组鉴定到1212个蛋白，但是对照组鉴定到的蛋白数目也高达1165个。随后调整紫外光波长，缩短照射时间，降低交
联反应温度，结果如表1所示，在紫外光波长302nm，距离5cm，光交联5min的条件下，大幅降低了对照组的结合蛋白，最后实验组鉴定到578个蛋白，对照组鉴定到159个蛋白，表明大幅减少非特异性结合。
[0044]
表1
[0045][0046]
上述步骤s02中，saba分子基于化学交联分子交联，saba分子化学结构中，n1为1～8的整数，n2为1～8的整数，具体地，n1＝1～5，n2＝1～5；更进一步地，本技术中n1和n2均为3。如图1所示，saba分子包含一个巯基基团(sh
‑
，图1中字母s所示)，醛反应氨氧基团(aldehyde
‑
reactive aminooxy group，图1中字母a所示)，以及生物素基团(biotin，图1中字母b所示)。首先采用商业化试剂含活性酯(nhs)基团的lc
‑
spdp与svcv反应共价结合于svcv上，然后再将saba的巯基与spdp共价结合，从而将带有醛反应氨氧基团和生物素基团的交联分子结合到svcv上形成saba
‑
svcv。epc活细胞经过偏高碘酸钠处理后，具有糖基化的细胞膜蛋白的糖链其游离羟基被氧化为醛基，加入saba
‑
svcv后，svcv与相互作用蛋白靠近、结合，saba醛反应氨氧基团与醛基共价结合，从而实现svcv相互作用蛋白的化学捕获。
[0047]
步骤s01中，设置有sulfo
‑
sbed分子未标记的第一阴性对照组，步骤s02中，设置有lc
‑
spdp分子未标记的第二阴性对照组。
[0048]
本技术实施例可以通过将svcv宿主细胞的转录组测序得到的cds预测序列库作为质谱分析比对数据库，对捕获蛋白进行鉴定分析，通过质谱鉴定，使用sulfo
‑
sbed捕获到的第一捕获蛋白共578个，第一阴性对照组共159个；使用saba捕获到的第二捕获蛋白共415个，第二阴性对照组共287个。分别将实验组与阴性对照组所捕获的蛋白进行比较，找出实验组有质谱鉴定到的而阴性对照组中没有鉴定到的蛋白，然后进行生物信息分析。具体地，本技术的捕获方法还包括：将第一捕获蛋白与sulfo
‑
sbed分子未标记的第一阴性对照组对比，得到第一捕获蛋白中未在第一阴性对照组中出现的蛋白，将第二捕获蛋白与lc
‑
spdp分子未标记的第二阴性对照组比对，得到第二捕获蛋白中未在第二阴性对照组中出现的蛋白，然后再进行生物信息学分析。
[0049]
进一步地，生物信息学分析的步骤包括：采用跨膜区分析工具tmhmm在基于马尔可夫模型预测跨膜螺旋的程序上，对第一捕获蛋白中未在第一阴性对照组中出现的蛋白和第二捕获蛋白中未在第二阴性对照组中出现的蛋白进行预测。
[0050]
本技术实施例第二方面一种svcv的宿主细胞膜结合蛋白的捕获试剂，包括：分别独立包装的sulfo
‑
sbed分子、saba分子和lc
‑
spdp分子；sulfo
‑
sbed分子用于标记鲤春病毒血症病毒，saba分子用于标记鲤春病毒血症病毒，saba分子的化学结构如下所示，lc
‑
spdp在saba分子和鲤春病毒血症病毒之间起连接作用；
[0051][0052]
其中，n1为1～8的整数，n2为1～8的整数。
[0053]
该捕获试剂可以用于有效捕获svcv的宿主细胞膜结合蛋白，在svcv病毒受体研究中具有很好的应用价值。该捕获试剂可以基于上述捕获方法进行捕获svcv的宿主细胞膜结合蛋白。
[0054]
进一步地，saba分子化学结构中，n1为1～8的整数，n2为1～8的整数，具体地，n1＝1～5，n2＝1～5；更进一步地，n1和n2均为3。
[0055]
本技术实施例的捕获试剂还可以包括：链霉亲和素树脂，对苯二胺，切割二硫键试剂。
[0056]
下面结合具体实施例进行说明。
[0057]
本实验中的主要材料及试剂
[0058]
(1)主要生物材料：鲤鱼上皮瘤细胞(epithelioma papulosum cyprinid，epc)，鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus,svcv)。
[0059]
(2)主要相互作用蛋白捕获试剂：streptavidin agarose resin、centrifuge columns、zeba
tm spin desalting columns、sulfo
‑
sbed biotin label transfer reagent(33033)购自thermo公司；saba类似物(saba)由深圳佳肽生物科技有限公司合成；lc
‑
spdp(succinimidyl 6
‑
[3
′‑
(2
‑
pyridyldithio)
‑
propionamido]hexanoate)购自thermo公司；对苯二胺(p
‑
phenylenediamine)、cellytictm mem protein extraction kit、protease inhibitor cocktail购自sigma公司。
[0060]
sulfo
‑
sbed分子结构：
[0061]
saba分子结构：
[0062]
lc
‑
spdp结构：
[0063]
(3)细胞生物学及分子生物学实验材料：dl
‑
500dnamarker、dl
‑
2000dnamarker均购自宝生物工程(大连)有限公司。extaq酶、反转录试剂盒primescript
tm rt
‑
pcr kit、荧光定量pcr试剂盒premix extaq
tm
(probe qpcr)、tbgreen
tm premix ex taq
tm
ii(tli rnaseh plus)、dna片段纯化试剂盒mini best dna fragment purification kit ver.4.0购于takara公司。培养基dmem购自gbico公司(美国)。快速质粒小提试剂盒(dp105)购自天根生化科技(北京)有限公司。改良型bradford蛋白浓度测定试剂盒、抗生素penicillin
‑
streptomycin37.5:1等购于生工生物工程(上海)股份有限公司。焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,depc)处理水、40％聚丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(sds)、四甲基二乙胺(temed)、过硫酸铵(aps)、浓盐酸氨苄青霉素、nacl、蛋白胨、细菌培养用酵母提取物、琼脂粉、琼脂糖、甲基绿、溴酚蓝、甘油、koh、β
‑
alanine、tris、甘氨酸等购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0064]
实施例
[0065]
epc的转录组分析获得epc转录组序列
[0066]
(1)epc细胞培养。
[0067]
(2)epc总rna提取：使用takara公司的rnaiso plus试剂盒进行epc的总rna提取。
[0068]
(3)转录组测序：将所提取的epc总rna送交深圳华大基因科技服务有限公司进行转录组测序与分析，获得epc转录组序列数据库，用于epc膜蛋白质谱鉴定搜索比对所需序列数据库。
[0069]
使用sulfo
‑
sbed捕获svcv结合蛋白
[0070]
1.使用sulfo
‑
sbed标记svcv病毒粒子
[0071]
(1)蔗糖密度梯度离心纯化病毒，在除糖后用0.1mol/l nahco3溶液重悬。取纯化的svcv对epc细胞进行攻毒，验证病毒有活性后再进行标记；
[0072]
(2)取1管1mg的sulfo
‑
sbed粉末加入22μl dmso进行溶解；
[0073]
(3)取11μl溶解好的sulfo
‑
sbed溶液到0.5ml的病毒液中；
[0074]
(4)冰上孵育两个小时；
[0075]
(5)使用直径30kda的透析袋，以0.1mol/l nahco3溶液为透析液，对标记后的病毒液进行透析，以除去游离的sulfo
‑
sbed。
[0076]
2.光交联捕获svcv相互作用蛋白
[0077]
(1)前一天传代epc至90mm培养皿中，使细胞贴壁时覆盖培养平面的90％左右。第二天弃掉培养基，用无fbs培养基清洗细胞1
‑
2次，加入10ml无fbs培养基至培养孔中。
[0078]
(2)往贴壁细胞中加入30ul生物素化svcv
‑
sbed(拷贝数为：1.57
×
107copies/ul)，对照组中加入30ul svcv，各设置两个重复，室温(温度不要超过26℃)避光，摇床上缓慢转动孵育30min。
[0079]
(3)弃掉培养基，加入10ml无fbs培养基，轻轻晃一下，弃掉培养基，重复洗3次。
[0080]
(4)光交联条件：使用紫外交联仪波长设为302nm，在5cm距离处，样品置于冰上光交联5min。
[0081]
(5)加入终浓度为100mmol/l的dtt进行室温避光孵育15min(期间避光)，切割二硫键。
[0082]
(6)弃掉培养基，用10ml pbs重悬细胞(红光灯下操作)，转移至50ml离心管，800rpm离心3min，弃上清，重复洗3次。
[0083]
(7)临用前往细胞裂解液中加入蛋白酶抑制剂混合液，用1ml含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液重悬细胞沉淀，轻轻吹打均匀，置于冰上裂解30min。8000rpm，4℃离心30min，取上清，即为epc细胞总蛋白。
[0084]
3.分离及鉴定生物素化的蛋白
[0085]
(1)平衡链霉亲和素树脂后，加入总蛋白样品旋转孵育1小时，用含0.5％sds的pbs洗涤5次，接着用含2mol/l尿素的50mmol/l nh4hco3洗5次，最后用50mmol/l nh4hco3洗10次。
[0086]
(2)再用1ml浓度为8mol/l的盐酸胍(ph＝1.5)孵育30min后洗脱，收集盐酸胍洗脱样；
[0087]
(3)分别用500μl 50mmol/l nh4hco3继续冲洗树脂2次，收集1ml nh4hco3洗涤组分；
[0088]
(4)往洗涤后的树脂中每组加入300μl胰酶工作液(溶于50mmol/l nh4hco3，浓度为6.7ng/μl，总量2μg)，37℃摇床100rpm摇动孵育16h。然后10,000g离心3min，取上清；
[0089]
(5)同时，将步骤(3)收集的盐酸胍洗脱样及步骤(4)收集的nh4hco3洗涤组分合并(共2ml样品)，5mmol/l nh4hco3为透析液，用直径500d的透析袋进行透析；
[0090]
(6)透析后的样品进行真空冷冻干燥浓缩后，加入200μl ddh2o，此时缓冲液变为50mmol/l nh4hco3，加入2μl 1μg/μl的质谱级胰酶，37℃100rpm摇床孵育16h；
[0091]
(7)真空浓缩仪旋干酶切样品，送至深圳大学生命与海洋科学学院质谱平台进行lc
‑
ms分析。
[0092]
使用saba标记svcv捕获svcv受体
[0093]
1.试剂准备
[0094]
100mmol/l lc
‑
spdp：称取4.26mg lc
‑
spdp粉末，溶于100μl dmso中，配制成母液；另外用dmso将母液稀释成10mmol/l的工作液。
[0095]
10mmol/l gly：称取0.015g gly，溶于20ml pbs缓冲液中。
[0096]
200mol/l edta：称取0.0584g edta，加入pbs，再慢慢滴加naoh使edta完全溶解，再用hcl调节ph至7.4，最后用pbs定容至1ml。
[0097]
1mmol/l naio4：称取0.21389g naio4，溶于100ml pbs(ph＝6.5)中。
[0098]
1mol/l对苯二胺：称取0.5407g对苯二胺，溶于5ml dmso中。1mol/l dtt：称取0.0154g dtt粉末，溶于100μl ddh2o中。
[0099]
1m碘乙酰胺：称取0.185g碘乙酰胺，溶于1ml ddh2o中。
[0100]
含0.5％sds的pbs：称取2.5g sds，溶于500ml pbs(ph＝7.4)中。
[0101]
50mol/l nh4hco3：称取1.977g nh4hco3，溶于500ml ddh2o中。
[0102]
含2mol/l尿素的50mmol/l nh4hco3：分别称取60.06g尿素，1.977g nh4hco3，溶于500ml ddh2o中。
[0103]
细胞裂解液：pbs(ph＝7.4)，0.1％sds，1％np
‑
40，按适当比例加入蛋白酶抑制剂混合物和pmsf。
[0104]
2.使用saba标记纯化的svcv病毒粒子
[0105]
(1)蔗糖密度梯度离心纯化病毒，在除糖后用pbs(ph＝7.4)重悬svcv。取纯化的svcv对epc细胞进行攻毒，验证病毒有活性后再进行标记。
[0106]
(2)按10nmol lc
‑
spdp对应50μg纯化的svcv的比例，往纯化的病毒中加入lc
‑
spdp，混匀，在室温下孵育30min，svcv囊膜糖蛋白上的胺基与lc
‑
spdp一端的活性酯基团nhs作用而连接，lc
‑
spdp另一端带有巯基。
[0107]
(3)加入10nmol的甘氨酸，室温孵育30min，以淬灭过量的nhs基团；再补充edta，终浓度为1mmol/l。
[0108]
(4)用pbs溶解saba粉末，按照10nmol lc
‑
spdp对应30μg asb的比例，往lc
‑
spdp标记的svcv中加入saba，4℃孵育过夜，lc
‑
spdp上的巯基与saba上的巯基相互作用形成二硫键，从而使svcv标记上saba。
[0109]
(5)saba标记的svcv(svcv
‑
saba)用pbs透析(30kd透析袋)，直接用于后续实验或者暂存
‑
4℃。
[0110]
(6)以没有标记的svcv为阴性对照，将标记后的svcv过链霉亲和素树脂，将过柱前、流出样、洗脱样脱盐的样品进行taqman探针法qpcr检测这些样品的拷贝数，检测是否标记成功。
[0111]
3.标记svcv与epc孵育捕获受体
[0112]
(1)当epc细胞在培养瓶中的铺覆率为70
‑
80％时，直接用电动移液枪将细胞冲下来并收集到50ml的离心管中，每个样品需要6～8个75cm2培养瓶的细胞量。
[0113]
(2)800rpm离心3min，弃上清，加入冷的pbs(ph＝6.5)重悬洗涤细胞。800rpm离心3min，弃上清，加入10mmol/l冷的偏高碘酸钠(ph＝6.5)，在脱色摇床上缓慢(最慢速)摇，避光，4℃孵育20min。800rpm离心3min，弃上清，加入冷的pbs(ph＝7.4)重悬洗涤细胞。800rpm离心3min，弃上清，加入冷的pbs(ph＝8.0)重悬洗涤细胞。800rpm离心3min，弃上清，加入6
‑
10ml冷的pbs(ph＝8.0)重悬细胞，再加入已标记的svcv，在脱色摇床上摇床4℃孵育60min。
[0114]
(3)加入对苯二胺使之终浓度为10mmol/l，4℃孵育20
‑
30min。
[0115]
(4)用冷的pbs(ph＝7.4)重悬洗涤细胞两次，最后将细胞沉淀直接用于后续实验或者保存在
‑
80℃。
[0116]
4.分离及鉴定生物素化的蛋白
[0117]
(1)用细胞裂解液重悬细胞沉淀，冰上孵育30min进行裂解。
[0118]
(2)加入dtt使之终浓度为10mmol/l，20℃30min还原蛋白；再加碘乙酰胺使之终浓度为37.5mmol/l，20℃避光30min进行烷基化；最后再加入dtt(使终浓度为10mmol/l)淬灭反应。
[0119]
(3)将样品与链霉亲和素树脂旋转孵育1h。
[0120]
(4)用含0.5％sds的pbs(ph＝7.4)洗涤树脂5次。
[0121]
(5)用含2mol/l尿素的50mmol/l的碳酸氢铵溶液洗涤树脂5次。
[0122]
(6)用50mmol/l的碳酸氢铵溶液洗涤树脂10次。
[0123]
(7)往树脂转移至1.5ml ep管中，进行树脂加胰蛋白酶酶切，真空浓缩仪旋干酶切样品，深圳大学生命与海洋科学学院质谱平台进行lc
‑
ms分析。
[0124]
生物信息学方法分析捕获蛋白
[0125]
1.质谱鉴定比对分析
[0126]
对epc进行转录组测序得到的nr注释数据作为质谱分析比对数据库，分析所捕获蛋白的类型。将实验组与阴性对照组所捕获的蛋白进行比较，找出实验组鉴定到而对照组没有鉴定到的蛋白，下一步再深入分析其蛋白类型，判断其为病毒受体的可能性。
[0127]
2.蛋白的跨膜预测
[0128]
细胞表面的膜受体一般含有跨膜区，因而鉴定所捕获蛋白是否为病毒受体蛋白，可先分析预测这些蛋白的是否存在跨膜区。在线跨膜区分析(tmhmm)工具(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？tmhmm
‑
2.0)在基于马尔可夫模型预测跨膜螺旋的程序上，对蛋白的跨膜区及膜内外区进行整体的预测，囊括了跨膜区疏水性、电荷偏倚、螺旋长度和膜蛋白拓扑学限制等性质，采用在线tmhmm工具进行预测，倘若为跨膜蛋白则为受体可能性更大。
[0129]
实验结果与分析
[0130]
svcv相互作用蛋白捕获结果
[0131]
将转录组测序得到的cds预测序列库作为质谱分析比对数据库，对捕获蛋白进行鉴定分析，通过质谱鉴定，使用sulfo
‑
sbed捕获到的蛋白共578个，阴性对照组共159个；使用saba捕获到的蛋白共415个，阴性对照组共287个。分别将两种方法的实验组与阴性对照组所捕获的蛋白进行比较，找出实验组有质谱鉴定到的而阴性对照组中没有鉴定到的蛋白，然后使用工具tmhmm对这些蛋白逐个进行跨膜分析，从中找出具有跨膜区的蛋白，列为后续分析研究对象。sulfo
‑
sbed捕获蛋白中鉴定到的而对照组未捕获到的跨膜蛋白有33种，saba捕获蛋白中鉴定到的而对照组未捕获到的跨膜蛋白有23种。通过比较发现，有6种在两种方法中均有捕获，分别为有unigene7122、unigene19308、unigene13423、unigene12835、unigene2461、unigene1353。
[0132]
捕获蛋白的类型分析
[0133]
对于两种交联分子捕获分析到的跨膜蛋白作进一步的蛋白功能分析，将这些蛋白的序列在ncbi上进行blast，通过分析发现这些蛋白中有些与定位在线粒体或核糖体等细胞器膜上的蛋白高度同源，所以判断这类蛋白分布在胞内的可能性较大，因而可以将这部分蛋白先排除。除此之外，还有部分蛋白与细胞膜蛋白同源，推测这些蛋白可能是svcv入侵epc的受体。通过以上分析方法，本研究从捕获到的膜蛋白中分析获得8种svcv相互作用的epc细胞膜蛋白，如表2所示，其中sulfo
‑
sbed方法捕获到5种，saba方法捕获到6种，两种方法共同捕获到的蛋白有4种，获得的8种svcv相互作用蛋白与细胞膜蛋白高度同源，是值得进一步研究的svcv潜在受体。
[0134]
表2
[0135][0136]
这8种svcv相互作用epc细胞膜蛋白具体信息如下：
[0137]
(1)unigene12835，预测为cell
‑
surface antigen heavy chain
‑
like，即细胞表面重链糖蛋白，是抗原识别及结合有关的细胞膜蛋白，很有可能跟病毒的识别有关。l型氨基酸转运体1(l
‑
type amino acid transporter，lat1)是l
‑
型氨基酸转运蛋白家族的一个成员，主要介导分子质量较大的中性氨基酸的跨膜转运，它的功能发挥依赖4f2细胞表面抗原重链糖蛋白(4f2 cell surface antigen heavy chain，4f2hc，也叫cd98)。其通过二硫键与4f2hc共价连接形成lat1
‑
4f2hc复合体。
[0138]
序列信息：>gene.35304::unigene12835_epc_rna_1；跨膜分析见图2。
[0139]
msnepevdmkdvelneveqekqpfregearnnyaispvsekngvvkvkipdeetkftglskeelmkvagtpgwvkvrwallilfwlgwlgmlagaiaiiihaprckplpemnwwnygplyqigdmnsftsdlqglagkvqaldelkvkglvigpihvssadkpedlnlteiskeagdaaqfkeviqaahkrgiyvvldltpnykgeepwfdnnavsslelepamrhwlaegvdgflfygvekvstaapslwgnvedlfrnqtesdgktkkvligvteksspddiaavlnktgvdllltgalrsrsalevahsvarlystynqtqlawnvggriaghlasivglakvklsqlllltlpgtpvfnygdeigledesnknpamvwdfnstvtpvkildnmksfqtffktvsdkrskerslqhgeylplfsstfamayvrrwdqnerylialnwhsnetvtlqlnhaeipkeatvvlstdvgdankvcnlaqlevkpeqgimlkfpyts*。
[0140]
(2)unigene13423，预测为niemann
‑
pick c1 protein
‑
like，与尼曼
‑
匹克c1蛋白(niemann
‑
pick c1，npc1)密切相关，npc1可引起niemann
‑
pick疾病。npc1编码niemann
‑
pick c1样蛋白，存在于胃肠道上皮细胞和肝细胞中。尼曼
‑
匹克c1型类似蛋白1(niemann
‑
pick type c1 like 1,npc1l1)是npc1的同源物，为多跨膜蛋白，与肠内吸收胆固醇密切相关，是肠道固醇的转运者，被作为降胆固醇药物ezetimibe的分子靶点。npc1l1和npc1是密切相关的蛋白，都参与胆固醇的运输。
[0141]
序列信息：>gene.35790::unigene13423_epc_rna_1；跨膜分析见图3。
[0142]
mtlpggkqifcllwaiillsqwvhgqhciwygecgnstlegkklncnytgppkplpdeglellqelcpglvyednkvccdtqqlttlksniqiplqylsrcpacffnfmtlfceltcsprqsqfvnatqfsadpqlnktnvlkvsyyisqtfanamydacsdvqapssnikalsllcgtdasectpqkwikymfdikngqvpfaiepvfsdvptmsmtpmnngtfnctqslddgsgpcscqdcskacgptpvpppvlppwtilgldamtlimwcsyiaflfiffgvvlgawcyrrr
mvtseygpildsnqaysvnsdgtdfvdeatccetlgerfenmlrvvfsswgslcvrqpltvilasmvlvsicsaglsymrittnpvelwsspssrarqekdyfdqhfgpffrteqliittswnnsgyfipqsgapihfspmldisllhqvldlqteitnltaeykgetvtlqdicvsplapyndnctilsvlnyyqnshevldhvnkdefeiyfnyqthflycvssptalddtsllhdpcmgtyggpvfpwlvlggyednaynnatalvitfpvnnylndteklgkalawekvfidfvknysnpnltisfssersiedeidresnsdvttivisyvimfvyislalghinscrsllvdskislgiagilivlssvtcslgifsyigipltlivievipflvlavgvdnifiivqtyqrdermpeeelhhqigrilgdvapsmflssfsetvafflgalstmpavrtfslfaglavfidfllqiscfvsllgldiqrqeanrtdilccvklsdgpqeksegclfrffkkiyapfilkdwvrplvvavfvgmlsfsiavvnkveigleqtlsmpddsymldyfrnlseylhtgppvyfvvedghdyktsegqnavcggvgcnndslvqqiyaasllknytkisnvpsswlddyfdwvkpqssccryynatgafcnasvvdkscvhcrpmttsgkqrpngtefmhflpmflsdnpnikcgkgghaaystavalkengtdvgatyfmsyhtilktsadyidamkmvreltdnitqtitphdksyrvfpysifyvfyeqyltivhdtafnlgvsllaifvvstvllgfelwsavlvsltiamilvnmfgvmwlwsislnavslvnlvmscgisvefcshivrafsvstrssrveraeealahmgssvfsgitltkfggililalsksqifqifyfrvflaivllgathgliflpvllsyagpsvnkakamaarnrvvgsererliy。
[0143]
(3)unigene19308，预测为lysosome membrane protein 2
‑
like，虽然注释及序列blast预测是溶酶体膜蛋白2样分子，但该蛋白序列与细胞膜表面分子cd36家族同源，而cd36属于清道夫受体b类家族。cd36是受体识别的重要结构，在先天免疫中发挥重要的作用。
[0144]
序列信息：>gene.39906::unigene19308_epc_rna_1；跨膜分析见图4。
[0145]
mrlraccvystglicillliagiamvlsevfqkllnnrikeqiilengteafsvwqnppppvymqfyffnvtnpaevlngdkpsvieigpytyreyrpkedvkfmdngtrveavnpktyvfepdmsrgseddivrtvnipavtvmfkdsflrrlifdlmvskgvgvfetfrvgdllwgyedrllkdlktfkpevedhfglfykkngtddgdyvfftgrqnyldfarinewngqsalnwwssvdcnmingtdgasfhpiitkteklyifssdlcrslyalyesdvsvhgvpgfrfvppsevfanltvnpdnagfcvptgnclgsgllnvsvckegapiimssphfyqaddkfvqdvlgmnpkkeehetvidinpltglllrgakrvqvnvyvhqipgfsqtgkiqtlvfpvmylnesvvideesakklkvvvteadvivnipfivisvgillgvifivlmcrqqlpqssaaerqpllss*。
[0146]
(4)unigene7122，预测为aminopeptidase n
‑
like，已知氨肽酶n(aminopeptidase n
‑
like，apn)是一类糖蛋白受体。已知人类apn是一株冠状病毒(hcov)229e的受体，猪的apn也是猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)的功能性受体和猪三角鼻病毒(transmissible gastroenteritis virus)的受体。预测为apn的unigene7122可能是svcv的受体，值得进一步研究其功能。
[0147]
序列信息：>gene.31602::unigene7122_epc_rna_1；跨膜分析见图5。
[0148]
mgkgyyiskhmataamvlaaialvtiialsvvynreksknaakfsnattspvpptpktsnepwdkyrlpdtlspqyynvtlwprlvmnangtyiftgdsgvmftcvkttdlilihsnklnltlfkghhaklmgvsgvtapaikttwfqtetqylviqlggklkpgksywlytefrgelsdnldgfyrseymedgekkiiaitqmqatyarkafpcfdepgmkavfhitlihdlgttalsnsqemktenvkidgtvvtrtvfeptkrmstylvaflvsdftyiraegnkgvlvriwarkkaigdgqgdyalsitqpileffekyyntsyplsksdqialpdfesgamenwglvtyretallydsetsangnkqriatvvshelahmwfgnlvtlkwwndlwlnegfasyveylgadhaeptwnikdqiilydlqrafavdsltsshplsrkeeevntpseisemfstisyskgaavlkmlsefltepvfakglsnylnqfafgstvysdlwdhlqkavdqtpgvklpysvheimnrwilqmgypvvtidtrtgnvsqkhfllekdavvdrksefnyewfvpikwmkrdqvqdqlwllqksa
ihkpmkvsrgewvlanlhvsgyfrvnydlgnwerllsqlesnhqvipvvnraqilddafnlarasiinitlalrttkylihereyipweaalrnlnyffqlfgrsevygalqaylkkqvkllfehfgtissnwttvpsghtdqftqiialslacstgvegcreltkswfkrwmqnphvnaihpnlrstvycdaiaaggaeewnfgwqmfqkatvaaeavklraalactkvpwllnryleytmnpekirkqdaastigyiasniigqplawdffrenyfyffkvygtgsftfsrligdvtnrfctpfelsqlkqfkkdnaetgfgsgtqalqqaiekttakitwlaenkepvlqwftsese*。
[0149]
(5)cl1989.contig1，预测为neural cell adhesion molecule 1precursor，与神经细胞粘附分子1同源，而且经过blast发现其含有ig superfamily domain，而免疫球蛋白超家族是一类非常常见的病毒受体，因此该蛋白可能是svcv的受体，值得进一步研究。
[0150]
序列信息：>cl1989.contig1_epc_rna_1；跨膜分析见图6。
[0151]
mlqirdliwtllffgyaaalqvditpaqgeisvgeskfflcevvgdakeidwfapngeklvpgrpdisvsksdessstltiynanidhagmykcvaksgdkesqgtvivkifqkltfqnapspqefnegddadiicdvisspppsiiwkykktriqpetdvrfkvlnnnhlqirsikktdegdytcegrimargeidlrvikvivnvlpsirtrytelnatadinqavtlacyadgypeptvtwargnivlesnekyslnedgseltikdvnkldegdyqciarnkageksdevalsvfvqpkitflenqtaseleeqitltceatgdptpniiwsfgrrvfteneqsldgnvivrsdarvssltlkyvkftdagqylctarnsigqdiqsmylevryapkiqgpvavytwegnpanltcqalahpdasiswfrdgqmlpnanttnvkiyntptvsflevtpvsqndfgdynctatnvigtesmdfiliqadvpsapsiervepysstamvefdepksdggvpilkykaewriagqdwtdreydvedglnvitivglkpettyevkisaingkgegessapenfktqpvqgepnppkleakplstgnemkvywikqddggspikhylvryrakhrqewkpeirlpksseymvlrglewnteyevyvvaenqrgrsdpgilsfrtlpeptaipetsaglgtgaivgilivvfilllfgvdvtcyflnkcgllmciavnfcgksgpsakgkdieegkaaftkdeskepivevrteeentpnhgggptepnettpltdpdgklivddkskvpetevkktpaevktvpneapqtngneska。
[0152]
(6)cl3290.contig2，预测为erythrocyte band 7integral membrane protein isoform x2，为整合膜蛋白。整合膜蛋白镶嵌在于生物磷脂双分子层中，其最主要的种类为转运蛋白和通道蛋白，判断cl3290.contig2可能与svcv的转运有关，值得进一步探究其蛋白功能。
[0153]
序列信息：>gene.17897::cl3290.contig2_epc_rna_1；跨膜分析见图7。
[0154]
mensretaamrekerrdrqidrwcytvddtpalentdsdiglcgwilvifsilltlltlplsiwmcikivkeyeraiifrlgrilrggakgpglffilpctdsfinvdmrtitfdippqevltkdsvtvsvdgvvyyrvqnatlavanitnadaatrllaqttlrnvlgtknlaeilsdreeiahsmqstlddatddwgikverveikdvklpqqlqramaaeaeasrearakviaaegemnasralkeaslviaespsalqlrylqtlntiaaeknstiifplpidmmqsflkh。
[0155]
(7)cl3871.contig1，预测为source of immunodominant mhc
‑
associated peptides，是主要组织相容性复合体(major histocompatibility comple，mhc)相关蛋白，是跟免疫有关的细胞膜蛋白，值得进一步研究其功能。
[0156]
序列信息：>cl3871.contig1_epc_rna_1；跨膜分析见图8。
[0157]
maehhtasdckhkassnsggsvsgngrpnspagcsggglsggltqpagwqsllsftilflawlagfssrlfavirfesiihefdpwfnyrsthhlttngfyeflnwfderawyplgrivggtvypglmvtaglihyilnllhvtvhirdvcvflapvfsgltaistflltrelwnqgagllaacfiaivpgyisrsvagsfdnegiaifalqftyylwvksvktgsvfwaigcclsyfymvsawggyvfiinliplhvfvlllmqrfsrrlyiaystfyivglvlsmqipfvgfqpirtsehmaaagvfallqayaflqylkdrltrqefqtlfflgvsmaagvvfltviyltytgyiapwsgrfyslwdtg
yakihipiiasvsehqpttwvsfffdlhilvctfpaglwfciknindervfvalyaisavyfagvmvrlmltltpvvcmlsaiafssvfehylgddmkrenppaedssdeddkrnqgnlydkagkvrkhvseqdrpeeglgpniksivtmlmlmllmmfavhctwvtsnaysspsvvlasynhdgsrnilddfreayywlrqntdeharvmswwdygyqiagmanrttlvdnntwnnshialvgkamssnesaayeimksldvdyvliifggvigysgddinkflwmvriaegehpkdiresdyftpqgefrvdkagsptllnclmykmsyyrfgemqldfrtppgfdrtrnaeignkdirlkhleeaftsehwlvriyrvkkqenrqaldhklrniaakqkytskktakrkrgyiknklvlkkgkklnkksv。
[0158]
(8)cl51.contig3，预测为transferrin receptor protein 1
‑
like，转铁蛋白受体是一种ii型跨膜糖蛋白，转铁蛋白和转铁蛋白受体共同配合，调控铁在细胞内的转运。转铁受体蛋白具有免疫调节功能，值得进一步研究。
[0159]
序列信息：>cl51.contig3_epc_rna_1；跨膜分析见图9。
[0160]
mdqarttiskifngeprsytrfnltqnmegdnshvemklssdmddeveangggesihqhnrpyypsklnqrspktvcgivtailflfiigyligylsnrstdkneiksdcpvysettlekeqpvysldwsdlrallkkklttgniesnlkefssvshqagssgdemlankvmgkfrtlgmnpwtdehfvkvqdrgtsnkvlfrgnsvgttegylaysavatvegaalyahygraedfsrlqemnvdvngkvvliragllsfaekvanaaslnasavliypdpdnnkinentalfghvhlgtgdpytpgfpsfnhtqfppaessglplipaqtitikqateiisklrgrllpvgwspemfsdtkfgdegdnitvevnnvlvqkkihnvfgvikgyldpdrymvigaqrdawgpgfarstvgtsllvelaraitdmikndgfkpkrsivfaswsagefgsvgatewlegyltslnlktfsyisldevisgsdsfkasaspllydllestmkqvshttdatkslheqfagssweksvmepmglshsaypfqsfsgipslsfrftsgsvseypfgtyedtkqtldrytssstvklaktagevaglvtlrlvhdhllklnvakytnvirnyvsqirtkvesrqmvgrlpstltmqwllsaqgsydraasalvstirtsdlddmeqcriinnrimrvegsllspyvsprerpfrhiilgsgshtlaalvdhldairgnlqsadvdqfrnefafatwtiqgcanalagevwdmdnei。
[0161]
综上，本技术实施例成功建立了一种结合光交联和化学交联方法捕获svcv的宿主细胞epc细胞膜结合蛋白的方法，这个方法在病毒受体研究中具有重要的应用价值。
[0162]
以上所述仅为本技术的较佳实施例而已，并不用以限制本技术，凡在本技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。