抗FGF19抗体的制作方法

抗fgf19抗体
技术领域
1.本技术公开了结合成纤维细胞生长因子19(fgf19)，特别是结合包含fgf19的n
‑
末端的抗体表位的大多数残基的抗体及其抗原结合片段。本技术还提供所述抗体的组合物和用途，以及通过施用所述抗fgf
‑
19抗体治疗由异常fgf19
‑
fgfr4信号传导引起或与之相关的疾病或病症，例如癌症的方法。


背景技术：

2.成纤维细胞生长因子(fgf)是在从线虫到人的生物体的发育中具有多种功能的蛋白质家族。在多种正常的发育和生理学过程中，已经发现了fgf
‑
fgfr(fgf受体)信号传导的关键性，其调节异常可能在肿瘤发育和进展中扮演重要角色(turner n,grose r.nature reviews cancer,2010,10(2):116,https://www.nature.com/articles/nrc2780)。
3.在人类中，成纤维细胞生长因子19(fgf19)是一种胆汁酸诱导并由回肠衍生的肽类生长因子，其功能为通过结合肝细胞表达的fgf受体4(fgfr4)和β
‑
klotho(klb)来调节胆汁酸代谢以阻遏编码胆固醇
‑7‑
α
‑
羟化酶1(cyp7a1)的基因的转录，cyp7a1是一种胆汁酸生物合成的关键酶(m.h.xie等，cytokine 11,729
‑
735(1999)；j.a.holt等，genes&development 17,1581
‑
1591(2003)；h.kurosu等，the journal of biological chemistry 282,26687
‑
26695(2007)；和b.c.lin等，the journal of biological chemistry 282,27277
‑
27284(2007))。在其胆汁酸调节功能之外，临床观察结果已经证明，与邻近的非肿瘤组织相比，fgf19及其同族(cognate)受体fgfr4二者在肿瘤中均有高表达(e.t.sawey等，cancer cell 19,347
‑
358(2011)；k.wang等，hepatology 58,706
‑
717(2013)；s.m.ahn等，hepatology 60,1972
‑
1982(2014)；k.schulze等，nat genet 47,505
‑
511(2015)；m.h.xie等，(1999)；l.r.desnoyers等，oncogene 27,85
‑
97(2008)；和y.li等，oncotarget,(2016))。
4.fgf19被提议为肝细胞瘤(hcc)形成中的一种驱动基因，hcc是最常见的肝癌类型，占全部肝癌病例的大约90％(j.m.llovet等，nat rev dis primers2,16018(2016))。肝癌在全球是最常见的确诊癌症中的第六位，在世界范围内是最常见的与癌症相关的死亡原因的第三位(f.bray et al.,ca cancer j clin68,394
‑
424(2018))。几项临床研究已经鉴定出hcc以高度集中的成纤维细胞生长因子(fgf)19的扩增为特征(e.t.sawey等，cancer cell 19,347
‑
358(2011)；k.wang等，hepatology 58,706
‑
717(2013)；s.m.ahn等，hepatology60,1972
‑
1982(2014)；and k.schulze等，nat genet 47,505
‑
511(2015))。发现fgf19和/或fgfr4的高表达促进了肿瘤进展并且可能还可以预测hcc患者的不良预后(s.miura等，bmc cancer12,56(2012)；and j.hyeon,s.ahn,j.j.lee,d.h.song,c.k.park,digestive diseases and sciences 58,1916
‑
1922(2013))。在转基因小鼠中，fgf19的过表达引起了肝细胞发育不良、瘤形成，和最终的hcc(k.nicholes等，am j pathol 160,2295
‑
2307(2002))，这在fgfr4敲除小鼠中得到消除(d.m.french等，plos one 7,e36713(2012))，因此在原理上确认了异常fgf19/fgfr4信号传导的致瘤活性，为开发靶向fgf19/
fgfr4通路的拮抗性药剂作为潜在癌症治疗提供了理论基础。然而，正在开发用于hcc治疗的几种选择性fgfr4抑制剂在临床前动物模型或早期人类临床试验中造成了增加的胆汁酸合成和肝脏毒性(m.hagel等，cancerdiscov 5,424
‑
437(2015)；r.kim等，european journal of cancer 69,s41(2016)；s.l.chan等，cancer research 77,ct106
‑
ct106(2017)；j.j.joshi等，cancer research 77,6999
‑
7013(2017)；和b.ruggeri等，cancer research 77,1234
‑
1234(2017))。针对开发直接靶向fgf19作为治疗靶标用于治疗hcc的药物进行了努力，并且得到了中和抗fgf19抗体(wo2007136893a2，genentech公司)。这种抗fgf19抗体(1a6)的治疗使过表达fgf19的转基因小鼠免于形成hcc，并且这项治疗还在小鼠中抑制了hcc异种移植物的生长(e.t.sawey等，2011,supra；and l.r.desnoyers et al.,2008,supra)。然而，不幸的是，在一项毒理学研究中，向食蟹猴施用人源化1a6抗体增加了cyp7a1的肝脏转录并且提高了胆汁酸合成，因此显著改变了胆汁酸代谢并引起了严重的剂量相关的副作用，如降低的体重、严重的腹泻和低食物消耗(r.pai等，toxicological sciences:an official journal of the society of toxicology126,446
‑
456(2012))。考虑到fgf19在调节胆汁酸代谢中的角色，靶向fgf19的抗体可能折损了其在这方面的正常生理学功能并导致无法接受的副作用。鉴于这些事实，通过抗体靶向fgf19的临床治疗将需要解决这些副作用。
5.本发明通过提供特异性靶向fgf19的n
‑
末端的抗fgf19抗体满足了该需求，其显示出作为抗hcc疗法的强力功效，同时并不负面应影响fgf19的正常胆汁酸调节功能。
6.所有参考文献，包括学术公开、专利申请公开和专利公开，均以其整体并入本文用于全部目的。


技术实现要素：

7.本发明部分基于对fgf19上新的结合区域的发现，具体来说位于fgf19的n
‑
末端处，以及对抗fgf19抗体的鉴定，所述抗体显示出对hcc的强力抗肿瘤活性并且还具有理想的安全性，其通过特异性结合至fgf19的n
‑
末端处的所述结合区域而不影响由fgf19介导的对胆汁酸合成的调节。因此，本发明提供位于fgf19的n
‑
末端的、具有治疗潜力的新靶点，并且还提供特异性结合所述靶点的抗体，用于与异常fgf19/fgfr4信号传导相关的和/或由异常fgf19/fgfr4信号传导导致的病理性状况的诊断、预防、治疗和/或预后，特别是与异常fgf19/fgfr4信号传导相关的和/或由异常fgf19/fgfr4信号传导导致的癌症，包括但不限于hcc。还提供包含编码所述抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的核酸分子、表达载体和宿主细胞。本发明还提供与fgf19/fgfr4信号传导通路调节相关的药物组合物、方法、试剂盒、制品以及医药用途(medical use)。
8.在第一方面，本发明提供一种结合人成纤维细胞生长因子19(fgf19)的分离的抗体或其抗原结合片段，并且所述结合依赖于fgf19的n
‑
末端。在一个实施方案中，本发明的所述抗体或抗原结合片段结合位于seq id no:1的第38
‑
45位的氨基酸残基的表位。更具体地，所述表位包含人fgf19(seq id no:1)的如下残基中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个：w38、d40、p41、i42、r43、l44、r45。在进一步的实施方案中，本技术的抗体或抗原结合片段结合由seq id no:1的第38
‑
45位的氨基酸残基和人fgf19(seq id no:1)的如下残基至少中的至少一个组成的表位：e81、p167、l169。在进一
步的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有以下性质中的至少一种：(i)以约1x10
‑9m至约1x10
‑
12
m的k
d
值结合人fgf19，如由表面等离子共振(例如，biacore)或类似技术所测定的；(ii)与食蟹猴fgf19交叉反应；(iii)阻断人fgf19与人fgfr4和/或人fgfr4
‑
klb复合物的结合；(iv)抑制fgf19
‑
诱导的细胞增殖；(v)不影响或最小化地影响fgf19抑制的cyp7a1表达；和(vi)不损害或略微(marginally)损害fgf19介导的胆汁酸稳态。
9.在第一方面的另一实施方案中，本技术的所述抗fgf19抗体或其抗原结合片段包含：含有seq id no:3、4、5、13或19的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的重链可变(vh)结构域互补决定区(cdr)中的至少一个、两个或三个。在另一个实施方案中，本技术的所述抗fgf19抗体或其抗原结合片段包含：含有seq id no:6、7、8或14的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的轻链可变(vl)结构域互补决定区(cdr)中的至少一个、两个或三个。在另一个实施方案中，本发明的抗fgf19抗体或其抗原结合片段包含：含有seq id no:3、4、5、13或19的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的重链可变(vh)结构域cdr中的至少一个、两个或三个，和含有seq id no:6、7、8或14的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的轻链可变(vl)结构域cdr中的至少一个、两个或三个。在进一步的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有以下性质中的至少一种：(i)如通过表面等离子体共振(例如，biacore)或类似技术测定，以约1x10
‑9m至约1x10
‑
12
m的k
d
值结合人fgf19；(ii)与食蟹猴fgf19发生交叉反应；(iii)阻断人fgf19与人fgfr4和/或人fgfr4
‑
klb复合物的结合；(iv)抑制fgf19诱导的细胞增殖；(v)不影响或最小化地影响fgf19抑制的cyp7a1表达；和(vi)不损害或略微损害fgf19介导的胆汁酸稳态。
10.在一个实施方案中，本发明的抗fgf19抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变(vh)结构域，其包含具有seq id no:3的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的hcdr1(重链互补决定区1)，具有seq id no:4的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的hcdr2，和具有seq id no:5、seq id no:13、seq id no:14的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的hcdr3；和/或(b)轻链可变(vl)结构域，其包含具有seq id no:6的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的lcdr1(轻链互补决定区1)，具有seq id no:7的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的lcdr2，和具有seq id no:8、seq id no:14的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的lcdr3。
11.在一个实施方案中，本发明的抗fgf19抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变(vh)结构域，其包含具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr1，具有seq id no:4的氨基酸序列的hcdr2，和具有seq id no:5、seq id no:13或seq id no:19的氨基酸序列的hcdr3；和/或(b)轻链可变(vl)结构域，其包含具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr1，具有seq id no:7的氨基酸序列的lcdr2，和具有seq id no:8或seq id no:14的氨基酸序列的lcdr3。
12.在一个实施方案中，本发明的抗fgf19抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变(vh)结构域，其包含具有seq id no:3的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的hcdr1，具有seq id no:4的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的hcdr2，和具有seq id no:5的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的hcdr3；和/或(b)轻链可变(vl)结构域，其包含具有seq id no:6的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的lcdr1，具有seq id no:7的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的lcdr2，和具有seq id no:8的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的lcdr3。在
更具体的实施方案中，本发明的抗fgf19抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变(vh)结构域，其包含具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr1，具有seq id no:4的氨基酸序列的hcdr2，和具有seq id no:5的氨基酸序列的hcdr3；和/或(b)轻链可变(vl)结构域，其包含具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr1，具有seq id no:7的氨基酸序列的lcdr2，和具有seq id no:8的氨基酸序列的lcdr3。
13.在一个实施方案中，本发明的抗fgf19抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变(vh)结构域，其包含具有seq id no:3的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的hcdr1，具有seq id no:4的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的hcdr2，和具有seq id no:13的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的hcdr3；和/或(b)轻链可变(vl)结构域，其包含具有seq id no:6的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的lcdr1，具有seq id no:7的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的lcdr2，和具有seq id no:14的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的lcdr3。在更具体的实施方案中，本发明的抗fgf19抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变(vh)结构域，其包含具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr1，具有seq id no:4的氨基酸序列的hcdr2，和具有seq id no:13的氨基酸序列的hcdr3；和/或(b)轻链可变(vl)结构域，其包含具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr1，具有seq id no:7的氨基酸序列的lcdr2，和具有seq id no:14的氨基酸序列的lcdr3。
14.在一个实施方案中，本发明的抗fgf19抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变(vh)结构域，其包含具有seq id no:3的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的hcdr1，具有seq id no:4的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的hcdr2，和具有seq id no:19的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的hcdr3；和/或(b)轻链可变(vl)结构域，其包含具有seq id no:6的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的lcdr1，具有seq id no:7的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的lcdr2，和具有seq id no:14的氨基酸序列或其包含一个或多个保守取代的变体的lcdr3。在更具体的实施方案中，本发明的抗fgf19抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变(vh)结构域，其包含具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr1，具有seq id no:4的氨基酸序列的hcdr2，和具有seq id no:19的氨基酸序列的hcdr3；和/或(b)轻链可变(vl)结构域，其包含具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr1，具有seq id no:7的氨基酸序列的lcdr2，和具有seq id no:14的氨基酸序列的lcdr3。
15.在一个优选的实施方案中，本发明的抗fgf19抗体或其抗原结合片段包含与seq id no:9、15或20的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域；和/或与seq id no:10、16或21的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域。一个优选的实施方案中，本发明的抗fgf19抗体或其抗原结合片段包含具有seq id no:9、15或20的氨基酸序列的重链可变结构域；和/或具有seq id no:10、16或21的氨基酸序列的轻链可变结构域。
16.在一个优选的实施方案中，本技术的抗fgf19抗体或其抗原结合片段包含：(a)与seq id no:9的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和/或与seq id no:10的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；(b)与seq id no:15的氨基酸序列具有至少95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和/或与seq id no:16的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域；或(c)与seq id no:20的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域，和/或与seq id no:21的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域。在一个优选的实施方案中，本技术的抗fgf19抗体或其抗原结合片段包含(a)包含seq id no:9的氨基酸序列的重链可变结构域，和/或包含seq id no:10的氨基酸序列的轻链可变结构域；(b)包含seq id no:15的氨基酸序列的重链可变结构域，和/或包含seq id no:16的氨基酸序列的轻链可变结构域；或(c)包含seq id no:20的氨基酸序列的重链可变结构域，和/或包含seq id no:21的氨基酸序列的轻链可变结构域。
17.在一个优选的实施方案中，本发明的抗fgf19抗体或其抗原结合片段包含：与seq id no:11、17或22的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链；和/或与seq id no:12、18或23的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链。在一个优选的实施方案中，本发明的抗fgf19抗体或其抗原结合片段包含：具有seq id no:11、17或22的氨基酸序列的重链；和/或具有seq id no:12、18或23的氨基酸序列的轻链。
18.在一个优选的实施方案中，本发明的抗fgf19抗体或其抗原结合片段包含：(a)与seq id no:11的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和/或与seq id no:12的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；(b)与seq id no:17的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和/或与seq id no:18的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链；或(c)与seq id no:22的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链，和/或与seq id no:23的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链。在一个优选的实施方案中，本发明的抗fgf19抗体或其抗原结合片段包含：(a)具有seq id no:11的氨基酸序列的重链，和/或具有seq id no:12的氨基酸序列的轻链；(b)具有seq id no:17的氨基酸序列的重链，和/或具有seq id no:18的氨基酸序列的轻链；或(c)具有seq id no:22的氨基酸序列的重链，和/或具有seq id no:23的氨基酸序列的轻链。
19.在一个实施方案中，本技术提供抗fgf19抗体或其抗原结合片段，其与如下抗体竞争结合人fgf19，所述抗体包含：重链可变(vh)结构域，其包含具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr1，具有seq id no:4的氨基酸序列的hcdr2，和具有seq id no:5的氨基酸序列的hcdr3；以及轻链可变(vl)结构域，其包含具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr1，具有seq id no:7的氨基酸序列的lcdr2，和具有seq id no:8的氨基酸序列的lcdr3。在更具体的实施方案中，本发明提供抗fgf19抗体或其抗原结合片段，其与如下抗体竞争结合人fgf19，所述抗体包含：具有seq id no:9的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含seq id no:10的氨基酸序列的轻链可变结构域。更优选地，所述抗体或其抗原结合片段具有以下性质中的至少一种：(i)如通过表面等离子体共振(例如，biacore)或类似技术测定，以约1x10
‑9m至约1x10
‑
12
m的k
d
值结合人fgf19；(ii)与食蟹猴fgf19发生交叉反应；(iii)阻断人fgf19与人fgfr4和/或人fgfr4
‑
klb复合物的结合；(iv)抑制fgf19诱导的细胞增殖；(v)不影响或最小
化地影响fgf19抑制的cyp7a1表达；和(vi)不损害或略微损害fgf19介导的胆汁酸稳态。
20.在一个实施方案中，本技术提供抗fgf19抗体或其抗原结合片段，其与如下抗体竞争结合人fgf19，所述抗体包含：重链可变(vh)结构域，其包含具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr1，具有seq id no:4的氨基酸序列的hcdr2，和具有seq id no:13的氨基酸序列的hcdr3；以及轻链可变(vl)结构域，其包含具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr1，具有seq id no:7的氨基酸序列的lcdr2，和具有seq id no:14的氨基酸序列的lcdr3。在更具体的实施方案中，本发明提供抗fgf19抗体或其抗原结合片段，其与如下抗体竞争结合人fgf19，所述抗体包含：具有seq id no:15的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含seq id no:16的氨基酸序列的轻链可变结构域。更优选地，所述抗体或其抗原结合片段具有以下性质中的至少一种：(i)如通过表面等离子体共振(例如，biacore)或类似技术测定，以约1x10
‑9m至约1x10
‑
12
m的k
d
值结合人fgf19；(ii)与食蟹猴fgf19发生交叉反应；(iii)阻断人fgf19与人fgfr4和/或人fgfr4
‑
klb复合物的结合；(iv)抑制fgf19诱导的细胞增殖；(v)不影响或最小化地影响fgf19抑制的cyp7a1表达；和(vi)不损害或略微损害fgf19介导的胆汁酸稳态。
21.在一个实施方案中，本技术提供抗fgf19抗体或其抗原结合片段，其与如下抗体竞争结合人fgf19，所述抗体包含：重链可变(vh)结构域，其包含具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr1，具有seq id no:4的氨基酸序列的hcdr2，和具有seq id no:19的氨基酸序列的hcdr3；以及轻链可变(vl)结构域，其包含具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr1，具有seq id no:7的氨基酸序列的lcdr2，和具有seq id no:14的氨基酸序列的lcdr3。在更具体的实施方案中，本发明提供抗fgf19抗体或其抗原结合片段，其与如下抗体竞争结合人fgf19，所述抗体包含：具有seq id no:20的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含seq id no:21的氨基酸序列的轻链可变结构域。更优选地，所述抗体或其抗原结合片段具有以下性质中的至少一种：(i)如通过表面等离子体共振(例如，biacore)或类似技术测定，以约1x10
‑9m至约1x10
‑
12
m的k
d
值结合人fgf19；(ii)与食蟹猴fgf19发生交叉反应；(iii)阻断人fgf19与人fgfr4和/或人fgfr4
‑
klb复合物的结合；(iv)抑制fgf19诱导的细胞增殖；(v)不影响或最小化地影响fgf19抑制的cyp7a1表达；和(vi)不损害或略微损害fgf19介导的胆汁酸稳态。
22.在一个实施方案中，本技术提供抗fgf19抗体或其抗原结合片段，其与如下抗体结合人fgf19上的相同表位，所述抗体包含：重链可变(vh)结构域，其包含具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr1，具有seq id no:4的氨基酸序列的hcdr2，和具有seq id no:5的氨基酸序列的hcdr3；以及轻链可变(vl)结构域，其包含具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr1，具有seq id no:7的氨基酸序列的lcdr2，和具有seq id no:8的氨基酸序列的lcdr3。在更具体的实施方案中，本技术提供抗fgf19抗体或其抗原结合片段，其与如下抗体结合人fgf19上的相同表位，所述抗体包含：包含seq id no:9的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含seq id no:10的氨基酸序列的轻链可变结构域。更优选地，所述抗体或其抗原结合片段具有以下性质中的至少一种：(i)如通过表面等离子体共振(例如，biacore)或类似技术测定，以约1x10
‑9m至约1x10
‑
12
m的k
d
值结合人fgf19；(ii)与食蟹猴fgf19发生交叉反应；(iii)阻断人fgf19与人fgfr4和/或人fgfr4
‑
klb复合物的结合；(iv)抑制fgf19诱导的细胞增殖；(v)不影响或最小化地影响fgf19抑制的cyp7a1表达；和(vi)不损害或略微损害fgf19介导的胆汁酸稳态。
23.在一个实施方案中，本技术提供抗fgf19抗体或其抗原结合片段，其与如下抗体结
合人fgf19上的相同表位，所述抗体包含：重链可变(vh)结构域，其包含具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr1，具有seq id no:4的氨基酸序列的hcdr2，和具有seq id no:13的氨基酸序列的hcdr3；以及轻链可变(vl)结构域，其包含具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr1，具有seq id no:7的氨基酸序列的lcdr2，和具有seq id no:14的氨基酸序列的lcdr3。在更具体的实施方案中，本技术提供抗fgf19抗体或其抗原结合片段，其与如下抗体结合人fgf19上的相同表位，所述抗体包含：包含seq id no:15的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含seq id no:16的氨基酸序列的轻链可变结构域。更优选地，所述抗体或其抗原结合片段具有以下性质中的至少一种：(i)如通过表面等离子体共振(例如，biacore)或类似技术测定，以约1x10
‑9m至约1x10
‑
12
m的k
d
值结合人fgf19；(ii)与食蟹猴fgf19发生交叉反应；(iii)阻断人fgf19与人fgfr4和/或人fgfr4
‑
klb复合物的结合；(iv)抑制fgf19诱导的细胞增殖；(v)不影响或最小化地影响fgf19抑制的cyp7a1表达；和(vi)不损害或略微损害fgf19介导的胆汁酸稳态。
24.在一个实施方案中，本技术提供抗fgf19抗体或其抗原结合片段，其与如下抗体结合人fgf19上的相同表位，所述抗体包含：重链可变(vh)结构域，其包含具有seq id no:3的氨基酸序列的hcdr1，具有seq id no:4的氨基酸序列的hcdr2，和具有seq id no:19的氨基酸序列的hcdr3；以及轻链可变(vl)结构域，其包含具有seq id no:6的氨基酸序列的lcdr1，具有seq id no:7的氨基酸序列的lcdr2，和具有seq id no:14的氨基酸序列的lcdr3。在更具体的实施方案中，本技术提供抗fgf19抗体或其抗原结合片段，其与如下抗体结合人fgf19上的相同表位，所述抗体包含：包含seq id no:20的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含seq id no:21的氨基酸序列的轻链可变结构域。更优选地，所述抗体或其抗原结合片段具有以下性质中的至少一种：(i)如通过表面等离子体共振(例如，biacore)或类似技术测定，以约1x10
‑9m至约1x10
‑
12
m的k
d
值结合人fgf19；(ii)与食蟹猴fgf19发生交叉反应；(iii)阻断人fgf19与人fgfr4和/或人fgfr4
‑
klb复合物的结合；(iv)抑制fgf19诱导的细胞增殖；(v)不影响或最小化地影响fgf19抑制的cyp7a1表达；和(vi)不损害或略微损害fgf19介导的胆汁酸稳态。
25.在一个实施方案中，所述抗fgf19抗体是人抗体。在一个实施方案中，所述抗fgf19抗体是人单克隆抗体(mab)。
26.在一个实施方案中，所述抗fgf19抗体是fab、f(ab’)2、fv或单链fv(scfv)。
27.在一个实施方案中，所述抗fgf19抗体包含亚类iggl、igg2、igg3、igg4或其变体的重链恒定区，以及κ或λ或其变体类型的轻链恒定区。
28.在一个实施方案中，所述抗fgf19抗体是分离的抗体。在一个实施方案中，所述抗fgf19抗体是重组抗体。
29.在一个优选的实施方案中，本技术第一方面的当前抗体或抗原结合片段用于治疗由异常fgf19
‑
fgfr4信号传导引起或与之相关的疾病或病症，包括向有需要的受试者施用。在一个具体的实施方案中，所述疾病或病症是由异常fgf19
‑
fgfr4信号传导引起或与之相关的癌症。在更具体的实施方案中，所述癌症是肝细胞癌(hcc)。
30.在第二方面，本公开提供一种组合物，例如一种药物组合物，其包含本技术第一方面的抗fgf19抗体或抗原结合片段，以及药学上可接受的赋形剂。在优选的实施方案中，所述药物组合物包含治疗有效量的所述抗fgf19抗体或抗原结合片段。
established hbv infections.elife 6,(2017))。通过随后使用全长fgf19和n末端缺失变体fgf19
δnt
进行的elisa筛选，鉴定了与fgf19以高于fgf19
δnt
的亲和力结合的抗体。与浅灰色或白色阴影的孔相比，深灰色阴影的孔表示更高的亲和力。将一种鉴定出的抗体31a3的重链和轻链二者的cdr3区的蛋白质序列及其亲和力改进抗体g1a8并排显示，不同的氨基酸标有下划线。
39.图3a
‑
b g1a8改进的结合亲和力和更高的n末端依赖性。(a)使用spr对抗fgf19抗体31a3或g1a8与fgf19的结合进行动力学分析。fgf19为从100nm起的两倍系列稀释。(b)31a3和g1a8二者与fgf19的结合均依赖于fgf19的n末端，这由使用fgf19或fgf19
δnt
作为靶标时不同的结合谱显示。通过elisa分析了所述抗体对fgf19和fgf19
δnt
的结合活性。
40.图4a
‑
c g1a8的表征。(a)g1a8和31a3显示了对fgf19诱导的细胞增殖的抑制。将hep3b与20ng/ml fgf19和100nm抗fgf19抗体或同种型对照抗体一起培养。(b)g1a8抑制了fgf19和fgfr4之间的相互作用。将抗体g1a8和同种型对照抗体与100nm fgfr4
‑
fc和20μg/ml肝素混合。通过elisa分析了fgfr4与fgf19的结合抑制。(c)g1a8未损害由fgf19下调的小鼠肝脏cyp7a1基因表达。c57bl/6小鼠在腹膜内注射指定治疗前禁食。通过qpcr分析了肝脏cyp7a1基因表达水平。每组由3只雄性和3只雌性小鼠组成。fgf19，0.1mg/kg；g1a8，fgf19的5倍摩尔过量。
41.图5a
‑
e g1a8在人肝细胞癌异种移植小鼠模型中的抗肿瘤活性。(a
‑
c)g1a8在肿瘤发展的早期抑制了肿瘤生长。将稳定表达萤光素酶的hep3b
‑
萤光素酶皮下(s.c.)注射到nod scid小鼠中。将小鼠分成具有等同平均肿瘤生物发光强度的组(n＝6/组)并接受了200μg g1a8或同种型对照抗体的治疗。通过卡尺(a)和生物发光(b和c)测量了肿瘤生长。(d
‑
e)g1a8在肿瘤发展的晚期抑制了肿瘤生长。将hep3b(s.c.)荷瘤nsg小鼠分成具有等同平均肿瘤体积的组(n＝6/组)并接受了200μg g1a8或同种型对照抗体的治疗。通过卡尺测量了肿瘤生长(d)，并通过kaplan
‑
meier生存分析分析了存活(e)。施用抗体治疗的日期用箭头标记。
42.图6a
‑
l g1a8在食蟹猴中的安全性评估。(a)说明g1a8给药和动物采样的时间线的示意图。将四只食蟹猴分成两组，接受静脉内(i.v.)施用的对照盐水(灰色)或g1a8
‑
higg1(黑色)。每组由一只雄性(三角形)猴和一只雌性(圆形)猴组成。(b)食蟹猴的体重。(c
‑
f)食蟹猴的血液生化。在不同时间点测量食蟹猴的血清tba(c)、tbil(d)、alt(e)和ast(f)。静脉施用g1a8或对照盐水的日期用箭头标记。短横虚线和点线分别表示雄性和雌性食蟹猴生化参数的正常参考区间。(g
‑
h)与胆汁酸代谢相关的基因的表达。在研究结束时收获食蟹猴的组织样本。通过qpcr分析了肝脏(g)、回肠(h)和肾脏(i)中所选基因的表达。(j
‑
k)g1a8的药代动力学特征。在第1天施用10mg/kg g1a8后(j)或在第16天施用30mg/kg g1a8后(k)测量了g1a8的血清浓度。(l)g1a8与食蟹猴fgf19结合的动力学分析。食蟹猴fgf19为自100nm起的两倍系列稀释。
43.图7a
‑
f fgf19
‑
g1a8复合物的结构分析。(a)正交视图中fgf19
‑
g1a8的带状示意图。fgf19显示为黑色，g1a8的可变重链(vh)和轻链(vl)显示为灰色。fgf19的n末端和c末端进行了标记。为清楚起见，去掉了g1a8fab的恒定区。(b)fgf19
‑
g1a8复合物的表面视图。该结构显示出明显完美的形状互补性。(c)g1a8
‑
fgf19界面的详细视图。虚线代表氢键。(d)使用spr分析了g1a8与50nm的野生型fgf19和fgf19丙氨酸突变体的结合活性。
44.图8a
‑
c hs29的活性。(a)使用spr进行了抗fgf19抗体g1a8和hs29与fgf19丙氨酸突变体之间的结合分析。fgf19丙氨酸突变体以50nm进行测试。(b)hs29与fgf19的结合的动力学分析。fgf19是从100nm起的两倍系列稀释。(c)hs29对fgf19诱导的细胞增殖的抑制。将hep3b与20ng/ml fgf19和100nm抗fgf19抗体或同种型对照抗体一起培养。
45.图9a
‑
d在患者来源的异种移植物(pdx)模型中对hs29的抗肿瘤活性的评估。将携带表达fgf19的pdx li6677(a)或不表达fgf19的pdx li6646(b)的balb/c裸小鼠分成具有等同平均肿瘤体积的组(n＝5/组)并接受了10mg/kg hs29腹膜内注射，或不治疗作为对照。(c)pdx模型中的fgf19mrna表达。在研究结束时收获肿瘤样品并通过qpcr分析了fgf19的表达。每个数据点代表一个小鼠肿瘤样本，并且将hep3b培养细胞系的fgf19mrna表达水平用作参考。虚线表示该测定的可靠检测限。(d)在研究期间测量了携带pdx的小鼠的体重。
46.发明详述
47.定义
48.除非在本文件的其他位置有具体定义，否则本文使用的所有其他技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义。
49.如用于本文，包括所附的权利要求时，单数形式的词语例如“一个”、“一种”和“所述/该”包括其对应的复数所指物，除非上下文另有明确规定。
50.除非上下文另有明确规定，否则术语“或”用于表示术语“和/或”并且可以与术语“和/或”互换使用。
51.在本公开的上下文中，除非另有说明，否则词语“包含”及其变型例如“包括”和“含有”应被理解为暗示包括所陈述的要素，例如氨基酸序列、核苷酸序列、性质、步骤或它们的组，但不排除任何其他元素，例如氨基酸序列、核苷酸序列、性质和步骤。当在本文中使用时，术语“包含”或其任何变型可以被术语“含有”、“包括”或有时被“具有”或其等同的变型替代。在某些实施方案中，词语“包含”还包括“由
……
组成”的情形。
52.如用于本文，术语“fgf19”是指回肠衍生的激素成纤维细胞生长因子19，其是fgfr4(成纤维细胞生长因子受体4)的高亲和力配体。如上所述，fgf19通过fgfr4/klotho
‑
β受体复合物抑制肝脏中cyp7a1的转录，由此在胆汁酸合成等的调节中发挥重要作用。在本技术的上下文中，除非特别指明，否则fgf19指人fgf19。小鼠中人fgf19的直系同源物是fgf15。fgf19(例如人fgf19)的氨基酸序列和编码它的核苷酸序列是本领域已知的。fgf具有由12条反向平行的β链形成的同源核心区，其两侧是不同的(divergent)n末端和c末端(a.benken和m.mohammadi，nature reviews.drug discovery8,235
‑
253(2009))。各种fgf的n末端和c末端之间的主要序列变化解释了它们不同的生物学活性(n.itoh和dm ornitz,j biochem 149,121
‑
130(2011)；r.goetz和m.mohammadi,nat rev mol cell biol 14,166
‑
180(2013)))。
53.抗体及其抗原结合片段
54.除非另有说明，否则本文所用的术语“抗体”涵盖最广义的抗体以及抗体片段，只要它识别并结合人fgf19即可。具体地，本技术的抗体结合人fgf19的n
‑
末端，具体而言是具有seq id no:1的氨基酸序列的fgf19的氨基酸残基38
‑
45。本技术的抗体一般指单特异性抗体。但是本技术还考虑了具有异源特异性(异特异性(heterospecific))或多特异性抗体的抗体。抗体通过特异性结合位点与特异性抗原决定簇或表位结合。“抗体片段”指全长抗
体的一部分，通常包含抗原的结合区或可变区。抗体片段的实例可包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
55.抗体最常见的基本结构是四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每对具有一条称为“轻链”(约25kda)的较小的链和一条称为“重链”(约50
‑
70kda)的较大的链。在每条链的氨基末端，其包括一个主要负责抗原识别的大约100至110个或更多个氨基酸的可变结构域。重链的羧基末端部分可以定义主要负责效应子功能的恒定区。通常，人抗体的轻链分为κ和λ轻链。此外，人抗体的重链通常分类为α、δ、ε、γ或μ，并将抗体的同种型分别定义为iga、igd、ige、igg和igm及其亚类，例如igg1、igg2、igg3和igg4。每个轻链/重链(vl/vh)对的可变区/结构域形成抗体结合位点。因此，完整抗体通常具有两个结合位点。
56.术语“高变域”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变域包含来自“互补决定区(cdr)”(即轻链可变域中的lcdr1、lcdr2和lcdr3以及重链可变域中的hcdr1、hcdr2和hcdr3)的氨基酸残基。通常，重链和轻链二者的可变域都包含三个高变域，即cdr，它们位于相对保守的“框架区”或“fr”之间。cdr通常通过框架区排列对齐，从而能够与特定表位结合。一般而言，从n末端到c末端，轻链和重链可变域均包含fr
‑
1(或fr1)、cdr
‑
1(或cdr1)、fr
‑
2(fr2)、cdr
‑
2(cdr2)、fr
‑
3(或fr3)、cdr
‑
3(cdr3)和fr
‑
4(或fr4)。使用kabat编号系统用于抗体的氨基酸残基，除非另有说明(kabat等，sequence of proteins of immunological interest,5
th ed.,public health service,national institute of health,bethesda,md(1991))。
57.除非另有说明，否则“抗体片段”、“靶结合片段”和“抗原结合片段”在本技术的上下文中可以互换，并且意指保留了特异性结合由全长抗体结合的抗原(fgf19，或特别是fgf19的n末端)的能力的抗体片段，例如保留了一个或多个cdr区的片段。抗原结合片段的实例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2和fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如单链fv(scfv)；由抗体片段形成的纳米抗体和多特异性抗体。
[0058]“特异性结合”或“与
……
特异性结合”意指与其他蛋白质相比，抗体表现出对特定靶标的优先结合，但这种特异性不需要是绝对的结合特异性。如果抗体的结合可测定样品中靶蛋白的存在，例如不会产生不希望的结果，例如假阳性，则认为抗体对其预期靶标具有“特异性”。相较于与非靶蛋白的亲和力，本发明的抗体或其抗原结合片段将以至少2倍高，优选至少10倍高，更优选至少20倍高，且最优选至少100倍高的亲和力结合靶蛋白。作为替代或在此基础上，本发明的抗体或其抗原结合片段将具有对其靶蛋白的结合亲和力，如由低于1x10
‑8m、低于1x10
‑9m(1nm)，低于1x10
‑
10
m，低于1x10
‑
11
m，或甚至低于1x10
‑
12m
(1pm)的k
d
值所代表。如果本技术的抗体与包含给定氨基酸序列(例如成熟人fgf19的氨基酸序列或人fgf19的n末端残基38
‑
45)的多肽结合但不与缺乏该序列的蛋白质结合，则称其为特异性结合包含所述给定氨基酸序列的多肽。
[0059]
如本文所用，术语“人抗体”意指仅包含人免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。如果在小鼠、小鼠细胞或源自小鼠细胞的杂交瘤中产生，人抗体可能含有鼠的糖链。类似地，“小鼠抗体”或“大鼠抗体”分别意指仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗体。
[0060]
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mab”或“mab”是指基本上同质的抗体群体，这意味着群体中包含的抗体分子在氨基酸序列上是相同的，除了可能以少量存在的有可能天然发生的突变外。“单克隆”表示抗体从基本上同质的抗体群体中获得的特征，而不应解释
为需要通过任何特定方法产生抗体。单克隆抗体(mab)可以通过本领域已知的常规方法获得。参见，例如kohler g等人，nature 1975 256:495
‑
497；美国专利号4,376,110；ausubel fm等人，current protocols in molecular biology 1992；harlow e等人，antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory1988；和colligan je等人，current protocols in immunology 1993。
[0061]
在一个实施方案中，与人fgf19特异性结合的本发明的抗体还显示出与人fgf19的食蟹猴直系同源物的交叉反应性。如本文所用，术语“交叉反应性”是指抗体与源自其他物种的同源或直系同源蛋白反应的能力。可以使用本领域已知的任何方法测定抗体的交叉反应性。例如，其可以通过表面等离子体共振(例如biacore)或类似技术(例如kinexa或octet)测量结合亲和力来测定。
[0062]
在一些实施方案中，本技术的抗体或抗原结合片段不影响或最小限度地影响fgf19抑制的cyp7a1表达。换句话说，当施用所述抗体或抗原结合片段时，cyp7a1表达受到fgf19的同等抑制。更具体地，在存在fgf19的情况下，施用所述抗体或抗原结合片段后，cyp7a1表达水平的变化或具体来说增加不超过5％、10％、15％或20％。
[0063]
在一些实施方案中，本技术的抗体或抗原结合片段不损害或略微损害fgf19维持的胆汁酸稳态。可以通过监测相关组织中涉及胆汁酸代谢的一种或多种基因的转录或表达水平来测定稳定的胆汁酸稳态。例如，所述基因可以是编码胆汁酸转运蛋白的基因。要测量的特定基因可以是肝脏、肾脏和/或回肠中的asbt、ibabp、cyp7a1、ntcp、oatp2、bsep、ostα、ostβ、mrp2、mrp3和/或mrp4。在fgf19存在下，在施用所述抗体或抗原结合片段后，肝脏、肾脏和/或回肠中asbt、ibabp、cyp7a1、ntcp、oatp2、bsep、ostα、ostβ、mrp2、mrp3和/或mrp4中的一种或多种表达水平的变化是有限的，例如不超过5％、10％、15％或20％。
[0064]
可以对本技术的抗体实施纯化工艺以去除不需要的物质，从而产生纯化的抗体。纯化抗体的常规方法包括但不限于本领域公知的柱层析法。
[0065]
本发明的抗体或抗原结合片段可以是分离的抗体。术语“分离的”是指所述抗体或抗原结合片段至少部分不含来自产生它们的细胞、细胞培养物、生长培养基、表达系统的其他生物材料或非生物材料。所述材料可以包括核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物、缓冲液、盐或其他材料，例如细胞碎片和生长培养基。
[0066]
本技术还涵盖包含一个或多个保守取代的抗体或其抗原结合片段，只要该抗体或抗原结合片段结合fgf19并具有本文所述的抗体的至少一种特性。氨基酸的“保守取代”是本领域众所周知的，并且通常指将一个氨基酸残基改变为具有结构或功能上相似的侧链的另一个氨基酸残基。例如，下表中提供了示例性的保守取代列表。
[0067]
原始氨基酸残基保守取代alagly；serarglys；hisasngln；hisaspgln；asncysser；alaglnasnglnasp；gln
glyalahisasn；glnileleu；valleuile；vallysarg；hismetleu；ile；tyrphetyr；met；leuproalaserthrthrsertrptyr；phetyrtrp；phevalile；leu
[0068]
本技术还提供包含编码本技术的抗体或其片段的核苷酸序列的分离的核酸序列。“分离的核酸”或“分离的多核苷酸”指从在自然界中该分离的多核苷酸存在于其中的多核苷酸的全部或部分移出的dna或rna，或连接到它在自然界中不与之相连的多核苷酸的dna或rna。“包含”特定核苷酸序列的分离的核酸分子除特定序列外，还可包括可操作地连接的调控序列，其控制所述核酸序列的编码区的表达。由于密码子简并性，本领域技术人员可以理解特定的氨基酸序列可以由不同的核苷酸序列编码。
[0069]
治疗用途
[0070]
本公开提供一种用于预防、治疗由异常fgf19
‑
fgfr4信号传导引起或与之相关的疾病或病症或预防其复发的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本技术第一方面的抗体或抗原结合片段，或本技术第二方面的药物组合物。在一个具体的实施方案中，所述疾病或病症是由异常fgf19
‑
fgfr4信号传导引起或与之相关的癌症。在更具体的实施方案中，所述癌症是肝细胞癌(hcc)。
[0071]
如本文所用的术语“施用”、“给予”、“治疗”和“处理”，当应用于受试者，例如动物，包括人，或细胞、组织、器官或生物流体时，意指使外源药物、治疗剂、诊断剂或组合物与该受试者、细胞、组织、器官或生物流体接触。细胞的处理包括使试剂与细胞接触，以及使试剂与流体接触，其中所述流体与细胞接触。术语“施用”和“治疗”还包括体外和离体治疗例如细胞，例如通过试剂、诊断剂、结合化合物或通过另一种细胞进行。
[0072]
如本文所用，术语“治疗有效量”是指当向受试者施用以治疗疾病，或疾病或病症的至少一种临床症状时，足以实现对所述疾病、病症或症状的该种治疗的抗体的量。“治疗有效量”可随抗体、疾病、病症和/或疾病或病症的症状，疾病、病症和/或疾病或病症的症状的严重程度，待治疗的受试者的年龄，和/或待治疗的受试者的体重而变化。在任何给定情况下的合适量对于本领域技术人员来说是显而易见的或者可以通过常规实验确定。在联合疗法的情况下，“治疗有效量”是指用于有效治疗疾病、病症或状况的联合对象的总量。
[0073]
在本技术的上下文中，“受试者”指动物，优选哺乳动物，例如灵长类动物，优选高等灵长类动物，例如人类。
[0074]
术语“癌症”或“肿瘤”在本文中意指或描述哺乳动物中的生理状况，其通常以不受
调节的细胞生长为特征。在一个优选的实施方案中，癌症与异常的fgf19
‑
fgfr4信号传导有关。本技术的抗体或抗原结合片段可预期本技术的抗fgf19抗体可用于治疗例如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌和胃癌。
实施例
[0075]
材料和方法
[0076]
实施例中使用了以下材料和方法。
[0077]
细胞系
[0078]
人肝癌细胞系hep3b是北京大学医学部dr.fengming lu实验室的馈赠。将hep3b细胞培养在补充有10％胎牛血清(gibco,dmem,c11965500bt)的dmem培养基中。细胞在37℃、5％co2气氛的加湿培养箱中培养。
[0079]
通过慢病毒转导并用嘌呤霉素选择生成了表达萤火虫萤光素酶报告基因的hep3b
‑
luc23稳定细胞系。
[0080]
将freestyle 293
‑
f细胞系在freestyle
tm
293表达培养基(细胞系和培养基均来自thermal fisher scientific)中，在37℃和8％co2气氛中的加湿定轨摇床平台中培养。
[0081]
蛋白质的表达和纯化
[0082]
对于人fgf19(seq id no:1)及其变体，包括n末端缺失变体fgf19
δnt
(具有对应于seq id no:1的残基arg43
‑
lys216的氨基酸序列)和fgf19丙氨酸取代突变体，将蛋白质的编码序列克隆到带有c末端his
‑
avi标签的哺乳动物细胞表达载体中，然后将它们单独瞬时转染或与编码大肠杆菌bira生物素
‑
蛋白质连接酶的蛋白质序列的表达载体以1:1的比例瞬时共转染到freestyle293
‑
f cell(thermal fisher scientific)中。在转染后3
‑
5天，收集细胞上清液并使用ni
‑
nta亲和层析(qiagen)纯化蛋白质或生物素化的蛋白质。
[0083]
对于全长人igg1抗体的生产，将vh和vl的编码序列分别克隆到人igg1重链(hc)哺乳动物细胞表达载体和轻链(lc)哺乳动物细胞表达载体中。将freestyle 293
‑
f细胞用两种表达质粒(hc和lc质粒)以1:1的比例瞬时共转染。在转染后3
‑
5天，收集细胞培养物上清液用于人igg1抗体的纯化，所述纯化使用蛋白a珠(ge healthcare life sciences)进行。
[0084]
针对fgf19筛选抗体文库
[0085]
由fgf19 n末端的残基arg23至ile42和之后的5个氨基酸(sgsgk)组成并在其c末端带有生物素修饰的fgf19 n
‑
末端肽(seq id no:24)由scilight
‑
peptide(中国北京)合成，纯度大于95％。将n末端fgf19肽或生物素化全长fgf19蛋白捕获在链霉亲和素偶联的磁性m
‑
280(thermal fisher scientific)上作为目标蛋白，然后与5x10
12
噬菌体
‑
scfv(可变域的单链片段)颗粒一起温育，所述噬菌体
‑
scfv颗粒制备自93名健康供体的外周血单核细胞构建的人类非免疫抗体噬菌体展示文库(大小：1.0x10
10
)。进行了两轮筛选。对于第二轮选择，使用了减少量的目标蛋白并应用了大量洗涤步骤。使用常规的碱性三乙醇胺溶液洗脱与靶蛋白展现特异性结合的噬菌体。
[0086]
随后，挑取单个克隆并拯救以在细菌培养物上清液中产生噬菌体
‑
scfv；在酶联免疫吸附试验(elisa)中，通过比较与全长fgf19和fgf19 n末端缺失版本(fgf19
δnt
)的结合，筛选这些与fgf19 n末端的特异性结合。选择与fgf19以高于fgf19
δnt
的亲和力结合的克隆作为与fgf19的n末端具有特异性结合的候选者，并对这些克隆的重(vh)和轻(vl)链可变区
的基因进行测序。比对所选克隆的相应氨基酸序列以消除重复克隆，并由此鉴定独特的抗体用于进一步表征。
[0087]
31a3抗体子文库构建和针对亲和力改进的选择
[0088]
为了通过cdr3定向随机化提高抗体31a3的亲和力，通过nnk简并密码子构建了一个对31a3的hcdr3和lcdr3进行随机诱变的子文库。构建的抗体子文库大小为1.23x108。抗体子文库的选择和筛选与上文针对fgf19的抗体文库筛选类似地进行。为了从磁珠获得高亲和力的命中，使用了与31a3higg1的竞争性洗脱。随后，挑取单个克隆并拯救以在细菌培养物上清液中产生噬菌体
‑
scfv以筛选与fgf19的结合。仅保留与31a3相比具有更高结合亲和力的命中。
[0089]
elisa测定
[0090]
将磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的2μg/ml neutravidin(sigma aldrich)以每孔100μl包被到96孔u型培养板(nunc，maxisorptm)上，并在4℃下温育过夜。然后通过在30℃下孵育0.5
‑
1小时，将2μg/ml的生物素化fgf19或fgf19变体以每孔100μl的捕获到培养板上。将fgf19或fgf19变体也直接以每孔100μl包被到96孔u型培养板上，并在4℃下温育过夜。对于基于higg1抗体的elisa，在含有2％脱脂奶的pbs中以每孔100μl加入三倍系列稀释的抗体。对于竞争elisa，测试的抗体以三倍系列稀释，并与竞争者fgfr4
‑
hfc混合。然后使用hrp偶联的山羊抗hfc抗体(thermo fisher scientific)检测结合的抗体。
[0091]
通过表面等离子体共振分析(spr)测定进行的结合动力学分析
[0092]
本技术的抗fgf19人igg1抗体的动力学分析使用biacore t200系统(ge healthcare life sciences)在25℃下进行。使用胺偶联试剂盒(ge healthcare life sciences)将抗hfc抗体(ge healthcare life sciences)固定在cm5传感芯片上。将本技术的抗fgf19人igg1抗体捕获到传感芯片上作为配体，随后将分析物fgf19(自100nm起的2倍系列稀释)或fgf19丙氨酸突变体(50nm)注射到每个流动池。注射缓冲液(含0.5
‰
tween20和0.3mm edta的hbs)作为阴性对照。将3m mgcl2用作每个结合和解离循环之间的再生缓冲液。结合率(ka)、解离率(kd)和亲和力常数(k
d
)使用biacoret200评估软件计算。
[0093]
细胞增殖测定
[0094]
在补充有1％胎牛血清的dmem中，用不同浓度的fgf19或fgf19变体处理人hcc细胞系hep3b，以诱导过度的细胞增殖。为了评估抗fgf19抗体对fgf19诱导的细胞增殖的抑制活性，将15μg/ml(100nm)higg1抗体添加到细胞培养基中。72小时后，根据制造商的产品说明，使用cell counting kit
‑
8(dojindo molecular technologies)测量了细胞增殖。
[0095]
肝脏中的cyp7a1表达
[0096]5‑
6周龄的c57bl/6小鼠禁食过夜，然后腹膜内(i.p.)注射2μg(1)fgf19、(2)fgf19变体或(3)fgf19连同60μg抗fgf19抗体。腹膜内注射后3小时对小鼠实施安乐死并收获肝脏。对于cyp7a1 mrna表达水平的后续分析，使用trizol试剂(thermo fisher scientific)提取肝脏的总rna，并使用prime script rt
‑
pcr试剂盒(takara)通过逆转录生成互补dna(cdna)。cyp7a1 mrna表达水平(相对于gapdh)通过qpcr使用abi fast 7500实时仪器(applied biosystems)进行评估。
[0097]
动物实验
[0098]
将nod scid和nsg小鼠用于评估抗fgf19抗体的抗肿瘤活性。在6
‑
8周龄的小鼠右
胁皮下注射5
×
106个hep3b细胞(每只小鼠100μl)。根据等同的平均肿瘤生物发光强度或肿瘤体积，将小鼠分为三组(每组n＝6)，并每周两次接受腹膜内(i.p.)注射200μg g1a8或对照igg。腹膜内注射15mg/kg d
‑
萤光素(perkinelmer)后，使用ivis lumina iii体内成像系统(perkinelmer)测量了荷瘤小鼠的体内肿瘤生物发光强度。肿瘤体积使用电子卡尺测量并使用公式3.14
×
l
×
w2/6计算，其中l和w分别是最大和最小测量直径。所有动物协议均按照中国实验动物饲养和护理国家指南进行，并在nibs的iacuc批准后按照机构规定执行。评估抗体在balb/c裸小鼠中患者来源异种移植物中的抗肿瘤功效的研究在crown bioscience inc.在获批的iacuc方案下进行。
[0099]
本技术的抗体，特别是g1a8的安全性评估在joinn laboratories(beijing),inc.进行。为体重约3kg的3
‑
4岁健康未经治疗的食蟹猴静脉内注射30mg/kg体重量的g1a8抗体或作为对照的生理盐水，在第16天时，以30mg/kg体重的量。评估了临床观察、体重、体温、血液化学和解剖病理学。在不同时间点(第
‑
1天、第8天、第15天、第23天和第30天)收集血样用于g1a8的药代动力学分析。在研究结束时收集肝脏、回肠和肾脏样本，用于对与胆汁酸代谢相关的基因进行rna分析。
[0100]
fgf19
‑
g1a8复合物的结晶和结构测定
[0101]
将fgf19和g1a8
‑
fab在freestyle 293
‑
f细胞中分别表达，并通过ni
‑
nta流动色谱法(qiagen)单独纯化。为了获得fgf19
‑
g1a8复合物，将fgf19和g1a8
‑
fab以1:1的摩尔比混合，在4℃下温育过夜，并通过superdex s20010/300柱(ge healthcare)使用含有10mm tris
‑
hcl ph 8.0和500mm nacl的缓冲液进一步纯化。然后将纯化的fgf19
‑
g1a8复合物浓缩至18mg/ml并使用悬滴蒸气扩散方法在20℃下结晶，所述方法将1μl蛋白质与1μl含有0.2m一水合硫酸锂、0.1m bis
‑
tris ph 6.9、26％w/v聚乙二醇3350的储存液混合进行。在7天内出现了四边形晶体。将晶体在液氮中快速冷冻。
[0102]
x射线衍射数据在shanghai synchrotron radiation facility(ssrf)beamline bl17u上收集。数据在hkl2000和xds中处理。晶体属于p212121空间群，并且每个不对称单元包含两个fgf19
‑
g1a8复合物副本。结构通过分子置换在phenix中使用phaser确定，使用以下结构作为搜索模型：fgf19(pdb id：2p23)和抗类固醇fab 5f2结构(pdb id:3kdm)。该模型在coot中迭代构建并在phenix中完善。
[0103]
统计学分析
[0104]
所有分析均使用graphpad prism 6.00版进行。普通单向anova或非配对student’s t检验用于组间比较。使用双向anova和turkey’s多重比较检验来评估连续变量。kaplan
‑
meier生存分析和对数秩检验用于生存分析。
[0105]
实施例1.鉴定位于fgf19 n末端的结合靶点
[0106]
本发明人进行了多项分析以研究全长fgf19与其n末端缺失版本之间是否存在功能差异。
[0107]
发现了与全长fgf19相比，fgf19
δnt
变体(fgf19
δnt
具有对应于seq id no:1的残基arg43
‑
lys216的氨基酸序列)对fgfr4具有显著更弱的结合亲和力，并在体外试验中展现出显著降低的诱导肿瘤细胞增殖的活性(图1a和b)。
[0108]
此外，测试了全长fgf19和所述n末端缺失变体fgf19
δnt
的胆汁酸调节功能。在此项测试中使用了小鼠模型，因为发现外源性fgf19可以通过结合与人fgfr4享有90％氨基酸同
一性的鼠受体fgfr4来发挥其胆汁酸调节功能，以抑制cyp7a1的鼠肝脏转录(m.zhou等人，2014，同上；r.goetz等人，molecular and cellular biology 27,3417
‑
3428(2007))。在腹膜内注射fgf19或fgf19
δnt
后，评估了这些小鼠中的肝脏cyp7a1基因表达水平。在通过抑制肝脏cyp7a1基因表达水平的胆汁酸调节功能方面，全长和n末端缺失变体fgf19
δnt
之间没有观察到统计学上显著的差异(图1c)。根据这些结果，可以合理地预期，靶向fgf19的n末端的治疗剂能够潜在抑制其致瘤活性，而不会对其胆汁酸调节生理功能产生有害影响。
[0109]
实施例2.生成特异性靶向人fgf19的n末端的抗体
[0110]
设计了以下两种不同的选择策略用于鉴定特异性靶向fgf19的n末端的抗体，所述策略使用seq id no:1或seq id no:24作为结合靶标(图2)。抗体筛选通过使用fgf19 n末端肽(seq id no：24)或全长fgf19(seq id no：1)作为结合靶标进行，并且筛选了大型非免疫人抗体噬菌体展示文库(d.li等人，elife 6,2017，同上)。选择对fgf19的n末端片段和全长fgf19均显示出结合亲和力的抗体用于下一步筛选。
[0111]
在接下来使用elisa测定的筛选步骤中，将全长fgf19和n端缺失变体fgf19
δnt
均用作结合靶标，以鉴定能够与全长fgf19结合但不结合或弱结合fgf19
δnt
的抗体。在许多已鉴定的抗体中，选择了一种命名为31a3的抗体，其显示出相对高的结合亲和力并特异性识别fgf19的n末端用于进一步分析(图2和3)。
[0112]
实施例3.体外评估31a3对fgf19致瘤活性的抑制作用
[0113]
进行了抗增殖测定以评估31a3在体外抑制fgf19的致瘤活性的能力。为了评估31a3是否能够抑制由fgf19特异性诱导的hcc细胞增殖，在外源性fgf19存在下用31a3处理了hcc细胞系hep3b。如图4a所示，31a3抑制了fgf19诱导的hep3b细胞增殖。
[0114]
实施例4.创建具有改进的结合亲和力的31a3衍生突变体
[0115]
为了提高31a3对fgf19的n末端的亲和力，在31a3的hcdr3和lcdr3区域内进行了定点丙氨酸扫描诱变，其表明四个氨基酸残基，即hcdr3中的v96和w97以及lcdr3中的y91和t95可以作为通过用其他氨基酸取代来提高结合亲和力的潜在候选。本发明人随后构建了抗体噬菌体展示文库，该文库包含在其hcdr3和lcdr3区域内的上述四个位置具有随机突变的31a3衍生抗体。在这个31a3衍生的子文库选择过程中，将31a3
‑
higg1蛋白用作竞争者来筛选对fgf19具有更高结合亲和力的结合者。经过严格的生物淘选步骤(stringent bio
‑
panning selection step)后，获得了一小组亲和力提高的抗体。所得抗体之一，g1a8，其中三个氨基酸与31a3不同，展现出与亲本抗体31a3相比27倍的亲和力增加和降低60倍更慢的解离速率，以及更强的抗增殖活性(图2、图3a
‑
b和图4a)。
[0116]
另一种变体抗体hs29基于对获得自淘选的抗体小组进行序列分析而产生。hs29具有与g1a8相似的结合表位、抗增殖活性和结合亲和力(图8)。
[0117]
实施例5.体外和体内效力
[0118]
在体外活性研究中，g1a8阻断了fgf19
‑
fgfr4相互作用，ic
50
值为1.39nm(图4b)。此外，g1a8还对外源性fgf19处理的hep3b细胞发挥强大的抗增殖作用(图4a)。
[0119]
然后使用异种移植小鼠模型评估了它的体内抗肿瘤活性(图5)。本发明人首先建立了稳定表达萤光素酶的hep3b
‑
luc23细胞系，并因此能够使用体内生物发光成像对肿瘤生长进行量化。在小鼠右胁皮下注射这些hep3b
‑
luc23细胞，然后分为具有等同平均肿瘤生物发光强度的三组，之后接受腹膜内注射抗体治疗(200μg g1a8或同种型对照)，每周两次，
进行四周。通过测量肿瘤体积和相对肿瘤细胞生物发光强度随时间监测肿瘤生长，表明与同种型对照抗体相比，g1a8显著抑制了肿瘤生长(图5a
‑
c)。
[0120]
还评估了针对形成自移植的野生型hep3b细胞的异种移植肿瘤的抗肿瘤效力。当肿瘤体积达到约100mm3大小时开始抗体治疗。携带hep3b的小鼠被分成具有等同平均肿瘤体积的三组，并每周两次接受腹膜内注射的抗体(200μg g1a8或同种型对照抗体)，持续三周。与涉及hep3b
‑
luc23异种移植物的上述结果一样，g1a8显著抑制了hep3b肿瘤进展(图5d)。此外，与同种型对照组相比，用g1a8治疗显著延长了小鼠的存活期(图5e)。
[0121]
hs29表现出与g1a8相似的强抗增殖活性(图8c)。在患者来源的异种移植物(pdx)肿瘤模型中测试了hs29的抗肿瘤活性(图9a)。当平均肿瘤体积达到约150mm3时开始hs29治疗。与对照小鼠相比，接受腹膜内注射10mg/kg hs29的小鼠显示出肿瘤生长停滞。值得注意的是，随着肿瘤继续生长，对照小鼠显示出显著的体重减轻，且其中两只因肿瘤进展导致的生理状况不佳而死亡；而hs29治疗的小鼠维持了稳定的体重并保持健康(图9d)。这些数据证实了hs29在体外和体内均有抗肿瘤活性。
[0122]
实施例6.小鼠和食蟹猴中的安全性评估
[0123]
发现本技术的抗体，特别是g1a8，不显示与鼠fgf15的交叉反应性，鼠fgf15是人fgf19的直系同源物，与fgf19仅具有49％的氨基酸同一性(tj wright等人，dev biol 269,264
‑
275(2004))。鉴于这一观察结果，上述小鼠肿瘤异种移植模型可能不适合评估g1a8治疗的安全概貌。尽管如此，回顾人fgf19可以通过鼠fgfr4在小鼠中发挥其胆汁酸调节功能以抑制肝脏cyp7a1转录(m.zhou等人，2014，同上；r.goetz等人，2007，同上)(图1c)，这种小鼠模型被用于评估g1a8是否影响肝脏cyp7a1转录。令人惊讶地发现g1a8不影响fgf19诱导的对肝脏cyp7a1转录的抑制(图4c)，表明g1a8没有明显干扰fgf19的胆汁酸调节功能。
[0124]
先前的研究(pai等人，toxicological sciences:an official journal of the society of toxicology 126,446
‑
456(2012))表明，在食蟹猴中施用人源化抗fgf19抗体(1a6)会导致胆汁酸代谢紊乱，原因是受到破坏的fgf19功能和增加的cyp7a1基因表达，临床表现为体重减轻、食物消耗量低、严重腹泻，并最终导致在10和30mg/kg治疗组中所有动物的计划外安乐死(unscheduled euthanasia)。食蟹猴fgf19的氨基酸序列与人fgf19的氨基酸序列几乎相同(具有98％的氨基酸同一性)。本发明人还测试了本技术的抗体的交叉反应性并验证了g1a8以相似的结合亲和力结合食蟹猴fgf19和人fgf19(图3a和图6l)。因此，食蟹猴被确定为评估g1a8安全性概貌的良好模型，特别是评估其是否损害fgf19的胆汁酸调节功能。
[0125]
四只未经治疗的食蟹猴随机分为两组，并接受静脉内注射的对照盐水或10mg/kg g1a8(第1天)，和30mg/kg g1a8(第16天)。每组包括一名雄性和一名雌性。在整个研究期间收集了血液样品(图6a)。
[0126]
所有猴子都完成了两剂g1a8施用的治疗，并且无一表现出1a6(与fgf19的c末端结合)报告过的任何临床副作用，包括体重减轻、食物消耗量低、液体粪便或腹泻(图6b)。先前在猴子中进行的1a6治疗(单剂量)的研究报告了血清总胆汁酸(tba)、丙氨酸转氨酶(alt)和天冬氨酸转氨酶(ast)水平的显著增加(pai等，toxicological sciences:an official journal of the society of toxicology 126,446
‑
456(2012))。尽管g1a8治疗组的猴子最初在g1a8(10mg/kg)治疗后第15天(第一个测试时间点)显示出血清tba浓度略有增加，但
在第16天时第二次施用更高剂量的30mg/kg之后没有观察到进一步的增加；而是观察到了减少(图6c)。这一发现提示，在第15天观察到的血清tba水平的轻微增加可能可以用动物的正常生理变化来解释。总胆红素(tbil)、丙氨酸转氨酶(alt)和天冬氨酸转氨酶(ast)的血清水平在用对照盐水或g1a8处理的猴子中没有显著差异，表明施用g1a8没有引起肝损伤(图6，gi)。
[0127]
本发明人还从负责胆汁酸再循环的器官(肝脏、回肠和肾脏)收集了猴组织样品，以评估已知影响胆汁酸代谢的多个基因的表达水平(图6，d
‑
f)。在用g1a8处理的动物的肝脏中，未发现cyp7a1基因表达的增加，并且与对照组中的动物相比，已知编码胆汁酸转运蛋白的其他基因的表达没有显示出显著增加(图6d)。在肾脏和回肠中，g1a8治疗组和对照组之间胆汁酸转运蛋白基因的表达没有差异(图6e
‑
f)，表明胆汁酸的再循环和代谢维持在正常生理水平。两种不同g1a8剂量的血清浓度
‑
时间曲线显示，在分别给药10mg/kg和30mg/kg的食蟹猴中，g1a8的终末半衰期相似，分别为174.29小时和188.38小时(图6，j和k)。
[0128]
总之，这些在食蟹猴中的安全性评估实验证明了不存在与g1a8施用相伴的胆汁酸相关毒性，并因此表明在治疗环境中g1a8处理不太可能导致胆汁酸的严重吸收不良或其他与胆汁酸相关的副作用。
[0129]
实施例7.fgf19
‑
g1a8结构分析
[0130]
与fgf19复合的g1a8的fab版本的结构通过x射线晶体学以分辨率测定，以了解本技术的抗体与fgf19之间相互作用的分子基础。选择抗体g1a8用于该分析。
[0131]
该结构通过分子置换法解析并在具有良好的几何形状的条件下精修至0.216/0.278的r
work
/r
free
(表1，见下文)。在fgf19和g1a8的结构中，对fgf19显示明确定义的电子密度的残基37
‑
172进行建模。fgf19和g1a8的结构显示出完美的形状互补，掩埋了的总表面。g1a8的可变重链(vh)和轻链(vl)的掩埋表面积几乎相同(与)。包含g1a8的表位的大部分残基位于fgf19的n末端，并且位于由seq id no:1的氨基酸残基38
‑
45组成的片段(seq id no:2)内，该片段位于vh和vl之间的裂口中(图7，a和b)。这一发现与如上所述g1a8特异性靶向fgf19的n末端的设计特征一致。
[0132]
表1.晶体学统计数据
[0133][0134][0135]
*括号中的值适用于最高壳层(highest shell)。
[0136]
具体而言，来自fgf19的第38至45位的八个残基通过疏水性和极性接触的混合与来自g1a8的vh和vl的所有六个互补决定区(cdr)环进行广泛的相互作用，如图7c和表2所示。在n末端中的fgf19残基trp38的侧链锚定在来自hcdr1
‑
3的ala33、ser52、ser57、tyr59、
gln102和leu104形成的疏水口袋中，而另一侧fgf19的arg45与分别来自hcdr3和lcdr2的glu103和asp52进行盐桥相互作用(图7c)。fgf19/trp38ala突变体显示了对g1a8降低的结合亲和力，而arg45突变为ala导致结合完全丧失(图7d)，证实了这些相互作用的重要性。fgf19 arg45还与来自hcdr3的asn100产生额外的氢键相互作用(图7c)。g1a8的亲本抗体31a3在同一位置有一个val，这种差异可能是31a3亲和力低于g1a8的原因(图2和图3a)。g1a8
‑
fgf19复合结构还揭示了fgf19的c末端的残基168
‑
172与fgf19和g1a8相互作用界面处的n末端非常接近。fgf19在c末端的残基leu169与n末端一致与lcdr2的tyr51和pro57形成疏水相互作用。tyr51和fgf19/pro167的骨架羰基之间的氢键进一步稳定了fgf19 c末端的相互作用。由于解离速率更快，leu169突变为ala导致抗体结合亲和力降低(图7d)。
[0137]
表2.g1a8和fgf19之间的接触残基
[0138][0139]
*总结了原子间距离小于的接触残基。下划线的残基参与氢键或盐桥相互作用。