一种用于慢病毒载体制备的低温混匀装置和慢病毒载体的纯化方法与流程

1.本发明属于病毒生物技术领域，具体涉及一种用于慢病毒载体制备的低温混匀装置和慢病毒载体的纯化方法。


背景技术：

2.近年来，随着对于造成癌症发病和持续的分子机理认识的不断加深，以及基因转运载体的发展推动着基因治疗技术不断进步，基因治疗应用的载体之一的慢病毒载体成为基因疗法中的新成员。慢病毒载体是以hiv
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1(人类免疫缺陷1型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，属于逆转录病毒科，为rna病毒。它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
3.由于慢病毒载体会应用于离体细胞修饰，并将回输至患者体内，因此它的制备过程对环境、人员、设备的无菌控制要求非常高。病毒载体的制备主要包括细胞扩增、病毒包装质粒的转染、病毒纯化、病毒储存以及应用。我们的产品对纯化工序质量要求较高，其中必须在病毒上清液中加入核酸酶，低温消化14
‑
16小时，从而降低外源性核酸含量。因此开发出一种低温混匀装置，用于提高核酸酶消化效率，对病毒下游纯化生产工艺有显著改善，对慢病毒载体制备的稳定性有显著提升，满足基因治疗领域不断发展的要求。


技术实现要素：

4.为了获得符合生产质量管理规范(gmp)要求的慢病毒载体，减少人为因素的影响，提高核酸酶消化效率，一方面，本发明提供一种用于慢病毒载体制备的低温混匀装置，包括磁力耦合搅拌电机、系统控制单元和水夹套控温单元；系统控制单元分别与磁力耦合搅拌电机、水夹套控温单元信号连接，用于控制磁力耦合搅拌电机和水夹套控温单元；水夹套控温单元包括水夹套箱体；水夹套箱体的底部设置有磁力耦合搅拌电机，顶部设置有开口，侧壁包括内壁、外壁以及位于内壁和外壁之间的冷却剂通道。
5.在一个实施方案中，冷却剂为水。水夹套箱体的工作温度为2
‑
60℃。磁力耦合搅拌电机的变频转速为30rpm
‑
280rpm。
6.在一个实施方案中，还包括底座，用于放置磁力耦合搅拌电机、系统控制单元和水夹套控温单元；底座的底部设置有万向轮；万向轮带有刹车。
7.进一步地，万向轮的数量为4个，分设在底座的四角。底座的四角上设置有支撑件，调节支撑件的高低，使得底座处于水平位置。
8.在一个实施方案中，系统控制单元包括控制模块和触摸屏；控制模块与触摸屏信号连接，通过触摸屏上的操作界面实现控制模块对磁力耦合搅拌电机和水夹套控温单元的控制。
9.在一个实施方案中，控制模块具备审计追踪功能，可按用户级别设定密码保护和执行权限，至少包括三级操作权限。
10.在一个实施方案中，系统控制单元分别与磁力耦合搅拌电机、水夹套控温单元信号连接为电信号连接。
11.在一个实施方案中，控制模块与触摸屏信号连接为电信号连接或者数字信号连接。
12.在一个实施方案中，还包括称重模块，用于称量水夹套箱体中的内容物的重量；称重模块与触摸屏信号连接，通过触摸屏显示称量结果；称重模块包括求和模块，用于计算选定的多次称量结果之和，并通过触摸屏显示计算结果。
13.在一个实施方案中，还包括一次性混合搅拌袋；磁力耦合搅拌电机上设置有搅拌隔离套；
14.一次性混合搅拌袋包括袋体和搅拌叶轮；搅拌叶轮设置在袋体内，含有磁石，与搅拌隔离套磁力连接，使得搅拌叶轮通过磁力作用在磁力耦合搅拌电机控制下进行搅拌。
15.在一个实施方案中，搅拌叶轮为三叶浆。三叶浆的叶片为塑料材质。
16.在一个实施方案中，称重模块确定用于慢病毒载体制备的低温混匀装置中的内容物的重量，可精确到内容物重量的0.3％；内容物为一次性混合搅拌袋及其内装盛的含有核酸酶的病毒上清液。称重模块还包括接线和显示选择的数据接口。
17.在一个实施方案中，系统控制单元带有a/c电机。用于慢病毒载体制备的低温混匀装置上设置有ph电极和温度电极。在触摸屏上显示重量、转速、ph和温度信息，实现称重控制，趋势查询，数据记录等功能。趋势查询指各参数信息在搅拌过程中随时间产生的变化，可生成图表进行趋势分析。
18.在一个实施方案中，还包括把手，用于推动该低温混匀装置。
19.另一方面，本发明还提供一种慢病毒载体的纯化方法，采用如上所述的用于慢病毒载体制备的低温混匀装置进行慢病毒载体纯化过程中的低温混匀；
20.包括以下步骤：
21.步骤1、开启系统控制单元，设定水夹套控温单元中的冷却剂的温度为2
‑
8℃；
22.步骤2、将含有核酸酶的病毒上清液导入一次性混合搅拌袋后，将一次性混合搅拌袋放入水夹套箱体中；
23.步骤3、设定搅转转速和搅拌时间，使得搅拌叶轮转动，进行核酸酶内切。
24.在一个实施方案中，步骤2中，一次性混合搅拌袋在使用前经γ射线辐照。
25.在一个实施方案中，步骤2中，含有核酸酶的病毒上清液中的核酸酶终浓度为50
±
5u/ml；含有核酸酶的病毒上清液中还含有终浓度1.0
‑
2.0mm的硫酸镁。
26.在一个实施方案中，在步骤3设定的搅拌转速下，使得搅拌叶轮的剪切力在2000
‑
3500s
‑1之间；搅拌时间为1.5
‑
2.5h。优选地，搅拌时间为2h。
27.本发明的有益效果：
28.1、一种用于慢病毒载体制备的低温混匀装置，可保证核酸酶在2
‑
8℃环境下进行消化步骤，并以一定的剪切力搅拌混匀病毒上清液，使核酸酶与病毒上清液充分混合，完全内切外源性核酸。
29.2、现有技术中，原本需要核酸酶消化14
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16h，耗时过长，对人力安排和产品质量均有一定程度的挑战；本发明涉及的低温混匀装置可通过适度搅拌提高核酸酶内切效率，减少人力成本，缩短核酸酶消化时间，有利于慢病毒载体的标准化生产。
30.3、本发明涉及的低温混匀装置通过一次性混匀搅拌袋中的搅拌叶轮与磁力耦合搅拌电机的搅拌隔离套磁力连接，从而实现一次性混合搅拌袋与磁力耦合搅拌电机密闭连接，实现无菌环境下的快速溶液混合。比起目前传统的不锈钢配液罐，具有一次性设备独有的无菌优势，更加适用于慢病毒载体制备过程。
31.4、依据本发明涉及的低温混匀装置配置的一次性混匀搅拌袋，病毒上清液在澄清过滤后直接泵入一次性混匀搅拌袋中进行低温混匀搅拌，提高了操作效率。
32.以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
33.图1是本发明的一个具体实施方式中涉及的用于慢病毒载体制备的低温混匀装置的立体结构示意图。
34.图2是本发明的一个具体实施方式中涉及的用于慢病毒载体制备的低温混匀装置的侧面的结构示意图。
35.图3是本发明的一个具体实施方式中涉及的搅拌叶轮与搅拌隔离套的结构示意图。
具体实施方式
36.为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，进一步阐述本发明。但本发明不仅限于以下实施的案例。
37.须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
38.实施例1
39.图1和2示出了本实施例所涉及的用于慢病毒载体制备的低温混匀装置，该装置包括磁力耦合搅拌电机5、系统控制单元1、水夹套控温单元2、底座3、称重模块、一次性混合搅拌袋和把手4。
40.系统控制单元1分别与磁力耦合搅拌电机5、水夹套控温单元2信号连接，用于控制磁力耦合搅拌电机5和水夹套控温单元2。
41.水夹套控温单元2包括水夹套箱体。水夹套箱体的底部设置有磁力耦合搅拌电机5，顶部设置有开口，侧壁包括内壁21、外壁22以及位于内壁21和外壁22之间的冷却剂通道。冷却剂通道用于盛装冷却剂，冷却剂可以为水，也可以为其他液体。水夹套箱体的工作温度为2
‑
60℃。磁力耦合搅拌电机5的变频转速为30rpm
‑
280rpm。
42.底座3用于放置磁力耦合搅拌电机5、系统控制单元1和水夹套控温单元2。底座3的底部设置有万向轮31。万向轮31带有刹车。万向轮31的数量为4个，分设在底座3的四角。底座3的四角上设置有支撑件，调节支撑件的高低，使得底座处于水平位置。
43.系统控制单元1包括控制模块和触摸屏。控制模块与触摸屏信号连接，通过触摸屏
上的操作界面实现控制模块对磁力耦合搅拌电机5和水夹套控温单元2的控制。控制模块具备审计追踪功能，可按用户级别设定密码保护和执行权限，至少包括三级操作权限。
44.称重模块用于称量水夹套箱体中的内容物的重量。称重模块与触摸屏信号连接，通过触摸屏显示称量结果。称重模块包括求和模块，用于计算选定的多次称量结果之和，并通过触摸屏显示计算结果。称重模块确定用于慢病毒载体制备的低温混匀装置中的内容物的重量，可精确到内容物重量的0.3％。内容物为一次性混合搅拌袋及其内装盛的含有核酸酶的病毒上清液。称重模块还包括接线和显示选择的数据接口。
45.磁力耦合搅拌电机5上设置有搅拌隔离套51(见图3)。一次性混合搅拌袋包括袋体和搅拌叶轮61。搅拌叶轮61设置在袋体内，含有磁石，与搅拌隔离套51磁力连接，使得搅拌叶轮61通过磁力作用在磁力耦合搅拌电机5控制下进行搅拌。搅拌叶轮61为三叶浆。三叶浆的叶片为塑料材质。
46.系统控制单元带有a/c电机。用于慢病毒载体制备的低温混匀装置上设置有ph电极和温度电极。在触摸屏上显示重量、转速、ph和温度信息，实现称重控制，趋势查询，数据记录等功能。
47.把手4用于推动该低温混匀装置。
48.实施例2
49.本实施例涉及一种慢病毒载体的纯化方法，其采用实施例1中的用于慢病毒载体制备的低温混匀装置进行慢病毒载体纯化过程中的低温混匀。
50.该方面包括以下步骤：
51.步骤1、开启系统控制单元，设定水夹套控温单元中的冷却剂的温度为2
‑
8℃。
52.步骤2、将含有核酸酶的病毒上清液导入一次性混合搅拌袋后，将一次性混合搅拌袋放入水夹套箱体中；一次性混合搅拌袋在使用前经γ射线辐照。含有核酸酶的病毒上清液中的核酸酶终浓度为50
±
5u/ml；含有核酸酶的病毒上清液中还含有终浓度1.0
‑
2.0mm的硫酸镁。
53.步骤3、设定搅转转速和搅拌时间，使得搅拌叶轮转动，进行核酸酶内切。在设定的搅拌转速下，使得搅拌叶轮的剪切力在2000
‑
3500s
‑1之间；搅拌时间为1.5
‑
2.5h。
54.实施例3病毒上清液装入一次性混合搅拌袋
55.开始病毒澄清，待病毒液超滤结束，用平衡液顶洗管路并排空到澄清样品收集袋中。这里使用的澄清样品收集袋为本发明的一次性混合搅拌袋。该一次性混合搅拌袋内带有含磁石的搅拌叶轮，与磁力耦合搅拌电机上的搅拌隔离套磁力连接，从而实现一次性混合搅拌袋与磁力耦合搅拌电机密闭连接，实现无菌环境下的快速溶液混合。
56.实施例4含有核酸酶的病毒上清液的配制
57.开启生物安全柜，将需紫外照射物品及环境监测平皿用70％乙醇消毒后放入生物安全柜中，合理摆放。紫外照射30min。核对核酸酶包装应完好无破损、无污点、无霉斑、颜色澄清无色；在生物安全柜内，根据上清收获液量，按以下公式计算出核酸酶和mgso4的加入量，使加入到病毒上清液后核酸酶的终浓度为50
±
5u/ml、硫酸镁的终浓度1.0
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2.0mm。
58.[0059][0060]
实施例5
[0061]
在实施例2结束后，进行超滤步骤。
[0062]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。