基于非标记探针熔解技术检测CYP2D6基因拷贝数的方法、引物对与非标记探针组合及试剂盒与流程

基于非标记探针熔解技术检测cyp2d6基因拷贝数的方法、引物对与非标记探针组合及试剂盒
技术领域
1.本发明涉及一种检测cyp2d6基因拷贝数的方法，尤其涉及一种基于非标记探针熔解技术检测cyp2d6基因拷贝数的方法、引物对与非标记探针组合及试剂盒。


背景技术：

2.人cyp2d6基因编码的产物是一种i相药物代谢酶，参与约30％临床药物的代谢。cyp2d6基因存在广泛的基因多态性和拷贝数变异，其中拷贝数变异会造成该酶活性的显著改变。通过分析cyp2d6基因的拷贝数和多态性，可实现该酶活性的快速检测。
3.传统检测基因拷贝数的方法多种多样，包括taqman荧光探针技术、多重连接探针扩增技术(multiplex ligation
‑
dependent probe amplification,mlpa)和新一代测序技术等。尽管这些技术应用广泛，但其缺陷依旧明显：taqman荧光探针合成原料成本高、获取难度大，且通常无法克服信噪比低的缺陷，实验数据可重复性差。mlpa技术操作复杂，且需要毛细管电泳进行产物分析，整个实验耗时过长。新一代测序技术适合大样本的检测，但其依托的测序平台价格昂贵，且需要专业实验操作和数据分析人员，不适宜在普通实验室、基层医院或医学检验所开展。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种基于非标记探针熔解技术检测cyp2d6基因拷贝数的方法、引物对与非标记探针组合及试剂盒，以克服传统检测基因拷贝数方法存在的上述缺陷。
5.非标记探针是一种不携带任何荧光基团的寡核苷酸探针，且其3’末端核苷酸的
‑
oh被封闭，能和互补的模板链杂交，但不能作为引物。
6.双链荧光染料是一类可与dna双链结合的小分子，以sybr green为代表。双链荧光染料在游离状态下无法被激发出荧光，但结合于dna双链的小沟后，可被激发出特定波长的荧光。
7.当非标记探针与模板链杂交后，双链荧光染料结合与二者形成的双链小沟位置，此时可收集到特定波长的荧光信号。若此时缓慢升高体系温度，探针与模板形成的双链解链，荧光染料重新游离，可得到荧光强度随温度升高而降低的线性关系。将荧光强度对温度变化时间求导数便得到熔解曲线，熔解曲线的峰值为荧光信号降低速率最大时对应的温度，即为探针与模板的结合强度(退火温度)。由于模板序列的差别，同一条探针与不同模板的结合强度有细微的差别，表现在熔解峰的不同。传统的熔解曲线法常用于目标产物的鉴定和单核苷酸多态性分析。
8.而本发明根据前期研究，发现通过反向利用“竞争性扩增”的原理，可将cyp2d6基因的同源基因cyp2d8p作为其拷贝数定量的参照物，且两基因拷贝数的比值可通过探针熔解产生的熔解峰的比值换算而来。
9.本发明的技术方案是：
10.一种基于非标记探针熔解技术检测cyp2d6基因拷贝数的方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
11.步骤1、设计非标记探针、生物素标记下游引物和上游引物；
12.根据人cyp2d6基因以及cyp2d8p基因的序列特点，设计非标记探针、上游引物和生物素标记下游引物；其中cyp2d8p基因是与cyp2d6基因序列高度相似的假基因，拷贝数极其稳定，人体细胞中均有两个拷贝。
13.步骤2、获取待测样本的基因组dna；
14.步骤3、配制反应体系；
15.在同一反应体系中加入待测样本的基因组dna、生物素标记下游引物、上游引物、dna聚合酶，dntps(脱氧核糖核苷三磷酸)以及pcr buffer；
16.步骤4、进行pcr反应；
17.将配制好的反应体系置于pcr仪进行pcr反应，实现基因扩增；
18.步骤5、获取单链pcr产物；
19.吸附带有生物素标记的双链pcr产物，并通过诱导dna变性，分离得到带有生物素标记的单链pcr产物；
20.步骤6、分析熔解曲线并判定cyp2d6基因的拷贝数；
21.将单链pcr产物、非标记探针和双链荧光染料混合孵育，进行溶解反应，绘制溶解曲线，进行熔解曲线分析；
22.根据熔解曲线中cyp2d6基因和cyp2d8p基因产物熔解峰的荧光强度比值，判定待测样本cyp2d6基因的拷贝数。
23.进一步地，步骤1中的生物素标记下游引物和上游引物及非标记探针如下：
[0024]5’‑
生物素标记下游引物(18nt)：
[0025]5’‑
生物素
‑
cctgtacccttcctccct
‑3’
[0026]
上游引物(18nt)：
[0027]5’‑
tggtggctgacctgttct
‑3’
[0028]
非标记探针(20nt)：
[0029]5’‑
tgatcctacatccggatgtg
‑
spacer
‑3’
。
[0030]
进一步地，上述非标记探针中的spacer可选自c3 spacer，c6 spacer，spacer9，spacer18，或pc sapcer中的一种。
[0031]
进一步地，步骤6根据下式判定待测样本cyp2d6基因的拷贝数：
[0032]
cyp2d8p熔解峰荧光值/cyp2d6熔解峰荧光值＝k
·
(cyp2d8p拷贝数/cyp2d6拷贝数)，其中k是一个常数。
[0033]
进一步地，若样本的cyp2d8p熔解峰荧光值/cyp2d6熔解峰荧光值在1.31～1.51之间，则该样本的cyp2d6基因拷贝数为1；若样本的cyp2d8p熔解峰荧光值/cyp2d6熔解峰荧光值在0.91～1.20之间，则该样本的cyp2d6基因拷贝数为2；若样本cyp2d6熔解峰缺失，仅存在cyp2d8p熔解峰，则该样本的cyp2d6基因拷贝数为0。
[0034]
进一步地，步骤5中利用链霉亲和素标记的磁珠吸附带有生物素标记的双链pcr产物。
[0035]
进一步地，步骤3中以单管反应体系20μl计，各个加入物的用量如下：上游引物，
250～500nm；生物素标记下游引物，250～500nm；dna聚合酶，0.5～1u；四种dntps，各100～250μm；10
×
pcr buffer，2.0μl；基因组dna，1
‑
50ng，去离子水补足体积20μl。
[0036]
进一步地，步骤4中pcr反应参数设置如下：94～95℃，1～10min，不循环；94～95℃，5～20sec；60～62℃，20～30sec，共计31～33个循环。
[0037]
进一步地，步骤6中以单管反应体系25μl计，反应管中加入物的量如下：非标记探针500～650nm；链霉亲和素标记磁珠250～500μg；荧光染料浓度为0.5～1
×
；去离子水补足体积25μl；
[0038]
步骤6中溶解程序设置如下：
[0039]
95℃，1min；42℃
→
80℃持续收集荧光，每秒0.1～0.3℃梯度升温。
[0040]
本发明还提供一种用于检测cyp2d6基因拷贝数的引物对与非标记探针组合，其特殊之处在于，包括：
[0041]5’‑
生物素标记下游引物(18nt)：
[0042]5’‑
生物素
‑
cctgtacccttcctccct
‑3’
[0043]
上游引物(18nt)：
[0044]5’‑
tggtggctgacctgttct
‑3’
[0045]
非标记探针(20nt)：
[0046]5’‑
tgatcctacatccggatgtg
‑
spacer
‑3’
；
[0047]
进一步地，上述非标记探针中的spacer可选自c3 spacer，c6 spacer，spacer9，spacer18，或pc sapcer中的一种。
[0048]
本发明还提供一种用于检测cyp2d6基因拷贝数的试剂盒，其特殊之处在于：包括上述引物与非标记探针组合。
[0049]
进一步地，上述试剂盒还包括dna聚合酶、dntps及pcr buffer。
[0050]
本发明的有益效果是：
[0051]
1、本发明能够准确定量cyp2d6基因拷贝数；
[0052]
本发明首次利用非标记探针熔解技术进行基因拷贝数定量，将生物素标记下游引物进行pcr反应，利用链霉亲和素标记磁珠进行单链pcr产物分离，并将非标记探针、双链荧光染料与单链pcr产物分离进行混合孵育，获得熔解曲线，并对曲线分析，根据熔解曲线中cyp2d6基因和cyp2d8p基因产物熔解峰的荧光强度比值，可准确定量cyp2d6基因拷贝数。
[0053]
2、本发明方法普适性强，成本低；
[0054]
本发明方法不涉及荧光探针的酶切或链置换反应，因此所有适合pcr的dna聚合酶均适用于本体系，且无需添加其他特殊组分。同时，本技术体系适用于各种型号的荧光定量pcr平台，不需要如芯片机等特殊的仪器设备。
[0055]
3、本发明方法操作简单，实验耗时短；
[0056]
本发明方法无需样本特殊处理等步骤，整个操作流程仅需要2小时即可完成样本的分析。
[0057]
4、本发明方法结果分析简单，实验数据可重复性好；
[0058]
本发明对每个样本只需知道其熔解峰信号强度便可完成结果判定，无需参照标准品，可完全依靠仪器配套的软件同时分析大量样本，实验数据可重复性好。
附图说明
[0059]
图1为本发明非标记探针和生物素标记下游引物信息示意图。其中1
‑
1为非标记探针示意图，1
‑
2为生物素标记下游引物示意图。
[0060]
图2为本发明的实验流程和设计原理示意图。其中，2
‑
1为本发明中引物对和非标记探针的工作原理，2
‑
2为本发明中非标记探针的工作原理，2
‑
3为本发明中通过非标记探针熔解进行cyp2d6基因拷贝数定量工作原理。
[0061]
图3
‑
1为基因拷贝数为2的样本cyp2d6基因检测实验结果图。
[0062]
图3
‑
2为基因拷贝数为1的样本cyp2d6基因检测实验结果图。
[0063]
图3
‑
3为基因拷贝数为0的样本cyp2d6基因检测实验结果图。
[0064]
图4为本发明应用于80例样本cyp2d6基因拷贝数检测的数据统计。其中4
‑
1为cyp2d6基因拷贝数为1的样本与cyp2d6基因拷贝数为2的样本拷贝数检测的数据统计，4
‑
2为本发明计算cyp2d6基因拷贝数的参考范围。
具体实施方式
[0065]
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，显然所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明的保护的范围。
[0066]
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
[0067]
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
[0068]
本发明利用生物素标记下游引物与待测样本的基因组dna进行pcr反应，利用链霉亲和素标记磁珠进行单链pcr产物分离，并将非标记探针、双链荧光染料与单链pcr产物分离进行混合孵育，获得熔解曲线，并对曲线分析，根据熔解曲线中cyp2d6基因和cyp2d8p基因产物熔解峰的荧光强度比值，可准确定量cyp2d6基因拷贝数。
[0069]
本发明巧妙的反向利用了“特异性扩增”的原理，利用cyp2d6和其假基因cyp2d8p的序列相似性，设计引物对，所设计的引物对可同时扩增cyp2d6和cyp2d8p，以此保障同一个反应体系中两个基因得到完全等效的扩增。区别于cyp2d6基因，cyp2d8p基因在人群中的拷贝数极其稳定，即每人均携带2个拷贝的cyp2d8p基因。本发明根据cyp2d6基因以及cyp2d8p基因的序列特点，设计的引物对中，上游引物为普通引物，下游引物的5’端标记有生物素，在保证高效扩增cyp2d6及cyp2d8p的同时，可确保cyp2d7p基因不能得到扩增。
[0070]
非标记探针是一种不携带任何荧光基团的寡核苷酸探针，且其3’末端核苷酸的
‑
oh被封闭，不能作为引物。本发明中的非标记探针可与生物素标记下游引物延伸得到的dna链特异性杂交，形成“局部”dna双链。双链荧光染料与该dna双链的小沟结合后，可被激发出特定波长的荧光。在孵育过程中，缓慢升高体系温度，非标记探针与dna双链解链，荧光染料重新游离，可得到荧光强度随温度升高而降低的线性关系，从而获得熔解曲线。
[0071]
图1为本发明中用到的非标记探针和生物素标记下游引物的示意图。
[0072]
请参阅图1中1
‑
1所示，为本发明中所涉及到的非标记探针示意图。该探针的长度为20nt，其3’末端核苷酸的
‑
oh修饰有spacer基团，使其无法作为引物。
[0073]
请参阅图1中1
‑
2所示，为本发明中生物素标记下游引物的示意图。该引物长度为18nt，其5’末端核苷酸链接了生物素分子，可以与链霉亲和素分子特异性结合。
[0074]
图2为本发明技术体系的实验流程和设计原理示意图。
[0075]
请参阅图2中2
‑
1所示，为本发明中引物对和非标记探针的工作原理。在同一个反应中，生物素标记的下游引物和普通上游引物组合可同时作用于cyp2d6基因及其假基因cyp2d8p，二者的扩增效率完全一致，呈现竞争关系。因此，在限定循环数的前提下，两基因扩增产物的终量取决于样本中二者初始拷贝数差异。非标记探针可与下游引物延伸形成的dna链结合，形成“局部”双链结构。由于非标记探针与cyp2d6基因的扩增产物序列呈完全互补配对，但与cyp2d8p基因的扩增产物序列存在两个碱基的错误配对，因此探针与cyp2d6基因扩增产物的结合强度显著高于其与cyp2d8p基因的扩增产物的结合强度。这种差异可通过熔解进行有效区分。
[0076]
请参阅图2中2
‑
2所示，为本发明中非标记探针的工作原理。pcr反应完成后，cyp2d6基因的扩增产物和cyp2d8p基因的扩增产物均被标记上生物素分子。此时在反应体系中加入链霉亲和素标记的磁珠，即可通过生物素
‑
链霉亲和素的特异性亲和作用，将双链pcr产物吸附于磁珠表面。此后，通过调整体系的ph至12.8～13.2，破坏维系dna双链的氢键，被磁珠吸附的dna双链发生解螺旋。由于生物素与链霉亲和素的结合并不受到ph的影响，因此碱变性使磁珠仅吸附了标记有生物素的dna单链。这些dna单链均是由生物素标记的下游引物延伸形成的。非标记探针与磁珠表面结合的dna单链互补配对，形成“局部”双链。局部双链可以被体系中存在的双链荧光染料结合，并被激发出特定波长的荧光信号。
[0077]
请参阅图2中2
‑
3所示，为本发明中通过探针熔解进行cyp2d6基因拷贝数定量工作原理。如图中所示，缓慢升高体系温度，非标记探针与dna单链形成的双链发生解螺旋，荧光染料重新变成游离状态，体系的荧光强度下降。当温度达到探针的退火温度时，解螺旋的速率最快。如果对整个升温过程求取荧光强度和时间的导数，即荧光变化速率，便可以得到熔解曲线图。图中的熔解峰指示了探针熔解的退火温度，反映了探针与模板的结合强度。由于非标记探针与cyp2d6基因扩增产物序列呈完全互补配对，但与cyp2d8p基因扩增产物序列存在两个碱基的错误配对。因此cyp2d8p基因扩增产物对应的探针熔解退火温度显著低于cyp2d6基因扩增产物对应的探针熔解退火温度。在熔解曲线上表现为cyp2d8p基因扩增产物对应的熔解峰在左，而cyp2d6基因扩增产物对应的熔解峰在右。熔解峰的荧光值是两基因扩增产物的终量的表征，其比例即可反映出两基因初始拷贝数差异，计算等式为：cyp2d8p熔解峰荧光值/cyp2d6熔解峰荧光值＝k
·
(cyp2d8p拷贝数/cyp2d6拷贝数)，其中k是一个常数。
[0078]
针对待测样本，本发明的基于非标记探针熔解技术检测cyp2d6基因拷贝数的方法，包括以下步骤：
[0079]
(1)非标记探针和扩增引物对的设计及合成
[0080]5’‑
生物素标记下游引物(18nt):
[0081]5’‑
生物素
‑
cctgtacccttcctccct
‑3’
[0082]
上游引物(18nt):
[0083]5’‑
tggtggctgacctgttct
‑3’
[0084]
非标记探针(20nt):
[0085]5’‑
tgatcctacatccggatgtg
‑
c3 spacer
‑3’
[0086]
(2)获取待测样本的基因组dna；
[0087]
(3)配制反应体系；
[0088]
在同一反应管中加入待测样本的基因组dna、上游引物、生物素标记下游引物、dna聚合酶，dntps(脱氧核糖核苷三磷酸)以及pcr buffer。
[0089]
以单管反应体系20μl计，反应管中加入上游引物，250nm；生物素标记下游引物，250nm；dna聚合酶，0.5u；四种dntps，各125μm；10
×
pcr buffer，2.0μl；基因组dna，10ng，去离子水补足体积20μl。在其他实施例中，加入物满足以下即可：以单管反应体系20μl计，上游引物：250～500nm；生物素标记下游引物：250～500nm；dna聚合酶：0.5～1u；四种dntps，各100～250μm；10
×
pcr buffer：2.0μl；基因组dna：1
‑
50ng，去离子水补足体积20μl。
[0090]
(4)pcr反应；
[0091]
将配制好的反应体系在pcr仪上进行基因扩增，反应参数设置如下：95℃，2.5min，不循环；94℃，10sec；60℃，20sec，共计31个循环。在其他实施例中，pcr反应参数满足如下即可：94～95℃，1～10min，不循环；94～95℃，5～20sec；60～62℃，20～30sec，共计31～33个循环。
[0092]
(5)利用链霉亲和素标记的磁珠获取单链pcr产物；
[0093]
利用链霉亲和素标记磁珠吸附带有生物素标记的双链pcr产物，并通过诱导dna变性，分离得到带有生物素标记的单链pcr产物。其中链霉亲和素标记磁珠直径为500nm，用量为500μg，碱变性的ph值为13.0，最终使用1
×
pcr buffer重新悬浮磁珠，溶液体积为20μl。
[0094]
(6)熔解曲线分析及cyp2d6基因拷贝数判定；
[0095]
以单管反应体系25μl计，在20μl的基础上，向反应管中加入非标记探针，500nm；链霉亲和素标记磁珠，500μg；sybr green染料浓度为1
×
，去离子水补足体积25μl。在荧光定量pcr平台进行熔解反应，设置程序为：95℃，1min；42℃
→
80℃持续收集荧光，每秒0.3℃梯度升温。
[0096]
在其他实施例中满足：以单管反应体系25μl计，反应管中加入物的量如下：非标记探针500～650nm；链霉亲和素标记磁珠250～500μg；荧光染料浓度为0.5～1
×
；去离子水补足体积25μl；
[0097]
相应地，本发明还可以提供一种用于检测cyp2d6基因拷贝数的试剂盒，包括上述引物、非标记探针组合、dna聚合酶、dntps及pcr buffer。
[0098]
以下是采用本发明所提供的技术方案对3例cyp2d6基因拷贝数分别为0、1和2的样本进行检测的示例，以进一步体现本发明的技术效果。其中1号样本cyp2d6基因拷贝数为2，2号样本cyp2d6基因拷贝数为1，3号样本cyp2d6基因拷贝数为0(cyp2d6基因完全缺失型)，3例样本均预先通过新一代测序技术进行拷贝数判定。
[0099]
扩增体系体积统一为20μl，每个样本单独配置反应体系。各体系中均加入上游引物，250nm；生物素标记下游引物，250nm；mega dna聚合酶(菲鹏生物股份有限公司)，0.5u；dntps，各125μm；10
×
pcr buffer(菲鹏生物股份有限公司)，2.0μl；基因组dna，10ng，去离
子水补足体积20μl。将配制好的体系置于abi veritipcr仪。反应参数设置如下95℃，2.5min，不循环；94℃，10sec，60℃，20sec，共计31个循环。程序运行完成后，在各反应管中加入直径500nm，浓度为50mg/ml的链霉亲和素标记磁珠10μl，室温静置2min。使用10％的naoh溶液调整体系ph至13.0，室温静置2min。使用磁场吸附磁珠，移除体系中的液体，并加入20μl的1
×
pcr buffer(菲鹏生物股份有限公司)重新悬浮磁珠。
[0100]
在各反应管原有20μl溶液中加入非标记探针，500nm；10
×
的sybr green染料2.5μl，去离子水补足体积25μl。将反应管置于steponeplus
tm
荧光实时定量pcr仪，设置熔解程序参数如下：95℃，1min；42℃
→
80℃收集荧光，每秒0.3℃梯度升温。反应完成后，根据仪器软件提供结果计算cyp2d8p熔解峰荧光值和cyp2d6熔解峰荧光值。实验结果如图3
‑
1、图3
‑
2及图3
‑
3所示。
[0101]
请参阅图3
‑
1所示，1号样本cyp2d6基因拷贝数为2，其cyp2d8p熔解峰荧光值/cyp2d6熔解峰荧光值为1.1。
[0102]
请参阅图3
‑
2所示，2号样本cyp2d6基因拷贝数为1，其cyp2d8p熔解峰荧光值/cyp2d6熔解峰荧光值为1.4。
[0103]
请参阅图3
‑
3所示，3号样本cyp2d6基因拷贝数为0，其cyp2d6熔解峰缺失，仅存在cyp2d8p熔解峰。
[0104]
以下是采用本发明所提供的技术方案对80例已知cyp2d6基因拷贝数的样本进行检测的示例，以进一步体现本发明的技术效果。
[0105]
请参阅图4中4
‑
1所示，cyp2d6基因拷贝数为1的样本，其cyp2d8p熔解峰荧光值/cyp2d6熔解峰荧光值的平均数为1.404(1.31～1.51)；cyp2d6基因拷贝数为2的样本，其cyp2d8p熔解峰荧光值/cyp2d6熔解峰荧光值的平均数为1.043(0.91～1.20)，两组样本的数据无交叉覆盖现象。
[0106]
请参阅图4中4
‑
2所示，本发明计算cyp2d6基因拷贝数的参考范围是：若样本的cyp2d8p熔解峰荧光值/cyp2d6熔解峰荧光值在1.31～1.51之间，则该样本的cyp2d6基因拷贝数为1；若样本的cyp2d8p熔解峰荧光值/cyp2d6熔解峰荧光值在0.91～1.20之间，则该样本的cyp2d6基因拷贝数为2；若样本cyp2d6熔解峰缺失，仅存在cyp2d8p熔解峰，则该样本的cyp2d6基因拷贝数为0。
[0107]
以上实施例不应视为对本发明保护范围的限制，本发明在模板的准备和pcr的环节确定了最佳的实施方式和参数，但本领域技术人员基于本发明技术思想和设计的引物体系，按照常规的操作方式(如试剂配比、扩增过程参数等)足以快速检测cyp2d6基因拷贝数，较之于现有技术有显著进步。