基于非标记探针熔解技术检测CYP2D6基因拷贝数的方法、引物对与非标记探针组合及试剂盒与流程

技术特征：
1.一种基于非标记探针熔解技术检测cyp2d6基因拷贝数的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、设计非标记探针、上游引物和生物素标记下游引物；根据人cyp2d6基因以及cyp2d8p基因的序列特点，设计非标记探针、上游引物和生物素标记下游引物；步骤2、获取待测样本的基因组dna；步骤3、配制反应体系；在同一反应体系中加入待测样本的基因组dna、上游引物、生物素标记下游引物、dna聚合酶，dntps脱氧核糖核苷三磷酸以及pcr buffer；步骤4、进行pcr反应；将配制好的反应体系置于pcr仪进行pcr反应，实现基因扩增；步骤5、获取单链pcr产物；吸附带有生物素标记的双链pcr产物，并通过诱导dna变性，分离得到带有生物素标记的单链pcr产物；步骤6、分析熔解曲线并判定cyp2d6基因的拷贝数；将单链pcr产物、非标记探针和双链荧光染料混合孵育，进行溶解反应，绘制溶解曲线，进行熔解曲线分析；根据熔解曲线中cyp2d6基因和cyp2d8p基因产物熔解峰的荧光强度比值，判定待测样本cyp2d6基因的拷贝数。2.根据权利要求1所述的基于非标记探针熔解技术检测cyp2d6基因拷贝数的方法，其特征在于：步骤1中的生物素标记下游引物、上游引物及非标记探针如下：5
’‑
生物素标记下游引物(18nt)：5
’‑
生物素
‑
cctgtacccttcctccct
‑3’
上游引物(18nt)：5
’‑
tggtggctgacctgttct
‑3’
非标记探针(20nt)：5
’‑
tgatcctacatccggatgtg
‑
spacer
‑3’
。3.根据权利要求2所述的基于非标记探针熔解技术检测cyp2d6基因拷贝数的方法，其特征在于：所述非标记探针中的spacer选自c3 spacer、c6 spacer、spacer9、spacer18或pc sapcer中的一种。4.根据权利要求1
‑
3任一所述的基于非标记探针熔解技术检测cyp2d6基因拷贝数的方法，其特征在于：步骤6根据下式判定待测样本cyp2d6基因的拷贝数：cyp2d8p熔解峰荧光值/cyp2d6熔解峰荧光值＝k
·
(cyp2d8p拷贝数/cyp2d6拷贝数)，其中k是一个常数。5.根据权利要求4所述的基于非标记探针熔解技术检测cyp2d6基因拷贝数的方法，其特征在于：若待测样本的cyp2d8p熔解峰荧光值/cyp2d6熔解峰荧光值在1.31～1.51之间，则该待测样本的cyp2d6基因拷贝数为1；
若待测样本的cyp2d8p熔解峰荧光值/cyp2d6熔解峰荧光值在0.91～1.20之间，则该待测样本的cyp2d6基因拷贝数为2；若待测样本cyp2d6熔解峰缺失，仅存在cyp2d8p熔解峰，则该待测样本的cyp2d6基因拷贝数为0。6.根据权利要求4所述的基于非标记探针熔解技术检测cyp2d6基因拷贝数的方法，其特征在于：步骤5中利用链霉亲和素标记的磁珠吸附带有生物素标记的双链pcr产物。7.根据权利要求6所述的基于非标记探针熔解技术检测cyp2d6基因拷贝数的方法，其特征在于，步骤3中以单管反应体系20μl计，各个加入物的用量如下：上游引物：250～500nm；生物素标记下游引物：250～500nm；dna聚合酶：0.5～1u；四种dntps，各100～250μm；10
×
pcr buffer：2.0μl；基因组dna：1
‑
50ng，去离子水补足体积20μl。8.根据权利要求7所述的基于非标记探针熔解技术检测cyp2d6基因拷贝数的方法，其特征在于：步骤4中pcr反应参数设置如下：94～95℃，1～10min，不循环；94～95℃，5～20sec；60～62℃，20～30sec，共计31～33个循环。9.根据权利要求8所述的基于非标记探针熔解技术检测cyp2d6基因拷贝数的方法，其特征在于：步骤6中以单管反应体系25μl计，反应管中加入物的量如下：非标记探针500～650nm；链霉亲和素标记磁珠250～500μg；荧光染料浓度为0.5～1
×
；去离子水补足体积25μl；步骤6中溶解程序设置如下：95℃，1min；42℃
→
80℃持续收集荧光，每秒0.1～0.3℃梯度升温。10.一种用于检测cyp2d6基因拷贝数的引物对与非标记探针组合，其特征在于，包括：5
’‑
生物素标记下游引物(18nt)：5
’‑
生物素
‑
cctgtacccttcctccct
‑3’
上游引物(18nt)：5
’‑
tggtggctgacctgttct
‑3’
非标记探针(20nt)：5
’‑
tgatcctacatccggatgtg
‑
spacer
‑3’
。11.根据权利要求10所述的用于检测cyp2d6基因拷贝数的引物对与非标记探针组合，其特征在于：所述非标记探针中的spacer选自c3 spacer，c6 spacer，spacer9，spacer18，或pc sapcer中的一种。12.一种用于检测cyp2d6基因拷贝数的试剂盒，其特征在于：包括上述引物与非标记探针组合。13.根据权利要求12所述的一种用于检测cyp2d6基因拷贝数的试剂盒，其特征在于：还包括dna聚合酶、dntps及pcr buffer。

技术总结
本发明涉及一种检测CYP2D6基因拷贝数的方法，尤其涉及一种基于非标记探针熔解技术检测CYP2D6基因拷贝数的方法、引物对与非标记探针组合及试剂盒。克服传统检测基因拷贝数方法存在的成本高、周期长及普适性低等缺陷。方法包括以下步骤：(1)非标记探针、生物素标记下游引物和上游引物的设计及合成；(2)获取待测样本的基因组DNA；(3)配制PCR反应体系；(4)进行PCR反应；(5)利用链霉亲和素标记的磁珠获取单链PCR产物；(6)熔解曲线分析及CYP2D6基因拷贝数判定。本发明在不需要荧光探针的前提下，即可完成CYP2D6基因拷贝数分析。可完成CYP2D6基因拷贝数分析。


技术研发人员：戴鹏高 刘金辉 王会娟 颜桦 李刚 陈超
受保护的技术使用者：陕西佰美基因股份有限公司
技术研发日：2021.08.20
技术公布日：2021/11/23