一种适合嗜热链球菌培养及游离胞外多糖测定的化学成分确定培养基及其制备方法与流程

1.本发明涉及一种适合嗜热链球菌培养及游离胞外多糖测定的化学成分确定培养基及其制备方法，属于生物技术领域。
技术背景
2.乳酸菌产生的食品级胞外多糖(eps)被认为具有多种理化及生理功能。根据eps所处的位置可将eps分为附着在细菌表面的荚膜多糖(cps)和分泌到环境中的游离多糖eps(free
‑
eps，f
‑
eps)研究表明，f
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eps可改善发酵乳粘度、脱水缩合敏感性、硬度、感官特性以及流变特性，赋予产品良好的柔滑口感，同时，f
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eps还能够降低稳定剂的使用量，降低生产成本。此外，最近的研究表明，f
‑
eps具有免疫调节、抗肿瘤等功能，还可能成为肠道菌群的益生元，因而受到乳制品行业的广泛关注。嗜热链球菌(streptococcus thermophilus，s.thermophilus)是酸奶的主要发酵剂，也是发酵乳制品中应用最广泛的细菌之一。多数嗜热链球菌在生长过程中能够产生游离胞外多糖(free eps，f
‑
eps)，一般而言，嗜热链球菌在脱脂乳培养基中的f
‑
eps产量约为50～400μg/ml。
3.嗜热链球菌的生长需要多种的营养素，因此常用m17或脱脂乳这类含复杂有机营养成分的培养基来培养嗜热链球菌，以保证嗜热链球菌快速生长。脱脂乳培养基是最常用于嗜热链球菌f
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eps分离的培养基，嗜热链球菌在脱脂乳培养基中往往能产生更多的f
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eps，但从发酵乳中分离f
‑
eps是一个繁琐复杂的过程，并且有损失大量eps的风险。使用等复杂的培养基(如m17等)时，f
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eps分离过程相对简单，但m17培养基中含有大量的干扰成分(如，酵母提取物含有酵母多糖，大豆蛋白胨中可能含有大豆多糖)，这些成分会导致f
‑
eps产量被过高的评估或是对f
‑
eps化学性质错误评价。
4.如果能够开发出一款能够支持嗜热链球菌快速生长、便于游离胞外多糖分离且分离纯度高的培养基，将会大大促进游离胞外多糖的量效及构效关系研究。


技术实现要素：

5.本发明的目的就是针对上述现有技术的缺陷，提供能够支持嗜热链球菌快速生长和提升游离胞外多糖产量的化学确定培养基及其应用，本发明设计的化学确定培养基能够不引入复杂有机成分，支持嗜热链球菌快速生长，提升游离胞外多糖产量，提高分离纯度和效率，能够作为筛选、分离纯化游离胞外多糖的嗜热链球菌培养基，具体为一种适合嗜热链球菌培养及游离胞外多糖测定的化学成分确定培养基及其制备方法。
6.本发明的目的是这样实现的：一种适合嗜热链球菌培养及游离胞外多糖测定的化学成分确定培养基，其特征在于，所述的培养基包括1种碳水化合物、9～20种游离氨基酸、6种维生素、6种无机盐及3种有机盐、离子水；
7.所述碳水化合物包括乳糖，其中，乳糖占培养基重量的1～4％；
8.所述游离氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、
谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸；其中，丙氨酸占培养基重量的0～0.18％，精氨酸占培养基重量的0～0.35％，天冬酰胺占培养基重量的0～0.27％，天冬氨酸占培养基重量的0～0.26％，半胱氨酸占培养基重量的0.01～0.24％，谷氨酰胺占培养基重量的0～0.29％，谷氨酸占培养基重量的0.01～0.30％，甘氨酸占培养基重量的0～0.15％，组氨酸占培养基重量的0.01～0.31％，异亮氨酸占培养基重量的0.01～0.27％，亮氨酸占培养基重量的0.01～0.27％，赖氨酸占培养基重量的0～0.29％，蛋氨酸占培养基重量的0.01～0.30％，苯丙氨酸占培养基重量的0～0.33％，脯氨酸占培养基重量的0～0.06％，丝氨酸占培养基重量的0～0.05％，苏氨酸占培养基重量的0～0.06％，色氨酸占培养基重量的0.01～0.41％，酪氨酸占培养基重量的0.01～0.036％，缬氨酸占培养基重量的0.01～0.23％；
9.所述维生素包括抗坏血酸钠、泛酸钙、烟酸、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素，其中，抗坏血酸钠占培养基重量的0.05％～0.1％，泛酸钙占培养基重量的0.0001～0.0005％，烟酸占培养基重量的0.0001～0.0005％，盐酸吡哆醇占培养基重量的0.0001～0.0025％，核黄素占培养基重量的0.0001～0.0005％，盐酸硫胺素占培养基重量的0.0001～0.0005％；
10.所述无机盐包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化镁、氯化钙、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，其中，磷酸二氢钾占培养基重量的0.2～0.3％，磷酸氢二钾占培养基重量的0.2～0.3％，氯化镁占培养基重量的0.02～0.05％，氯化钙占培养基重量的0.005～0.01％，磷酸二氢钠占培养基重量的0.12～0.36％，磷酸氢二钠占培养基重量的0.14～0.43％
11.所述有机盐包括柠檬酸三铵、尿素、乙酸钠；其中，柠檬酸三铵占培养基重量的0.06～0.1％，尿素占培养基重量的0.01～0.024％，乙酸钠占培养基重量的0.01～0.1％；
12.其余为离子水。
13.一种适合嗜热链球菌培养及游离胞外多糖测定的化学成分确定培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
14.步骤(1)、准备原料，原料包括乳糖、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、抗坏血酸钠、泛酸钙、烟酸、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化镁、氯化钙、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、柠檬酸三铵、尿素、乙酸钠、去离子水，其各成分重量百分比为：
15.乳糖1～4％、丙氨酸0～0.18％、精氨酸0～0.35％、天冬酰胺0～0.27％、天冬氨酸0.01～0.26％、半胱氨酸0.01～0.24％、谷氨酰胺0～0.29％、谷氨酸0.01～0.30％、甘氨酸0～0.15％、组氨酸0.01～0.31％、异亮氨酸0.01～0.27％、亮氨酸0.01～0.27％、赖氨酸0～0.29％、蛋氨酸0.01～0.30％、苯丙氨酸0～0.33％、脯氨酸0～0.06％、丝氨酸0～0.05％、苏氨酸0～0.06％、色氨酸0.01～0.41％、酪氨酸0.01～0.036％、缬氨酸0.01～0.23％、抗坏血酸钠0.05％～0.1％、泛酸钙0.0001～0.0005％、烟酸0.0001～0.0005％、盐酸吡哆醇0.0001～0.0025％、核黄素0.0001～0.0005％、盐酸硫胺素0.0001～0.0005％、磷酸二氢钾0.2～0.3％、磷酸氢二钾0.2～0.3％、氯化镁0.02～0.05％、氯化钙0.005～0.01％、磷酸二氢钠0.12～0.36％、磷酸氢二钠0.14～0.43％、柠檬酸三铵0.06～0.1％、尿素0.01～0.024％、乙酸钠0.01～0.1％，其余为去离子水；
16.步骤(2)、将乳糖溶解于去离子水中，浓度为配方中要求比例的5倍，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液a，其中，乳糖配方中要求的浓度为1～4％；
17.步骤(3)、将柠檬酸三铵、尿素、乙酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、抗坏血酸钠、酪氨酸溶解于去离子水中，浓度为配方中要求浓度的2倍，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液b；其中，柠檬酸三铵、尿素、乙酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、抗坏血酸钠、酪氨酸配方中要求的浓度分别为0.06～0.1％、0.01～0.024％、0.01～0.1％、0.2～0.3％、0.2～0.3％、0.02～0.05％、0.12～0.36％、0.14～0.43％、0.05～0.1％、0.01～0.036％；
18.步骤(3)、将氯化钙溶解于去离子水中，浓度为100倍配方中要求的浓度，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液c，其中，氯化钙配方中要求浓度为0.005～0.01％；
19.步骤(4)、将16种氨基酸溶解于0.1m naoh中，16种氨基酸为丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸，各氨基酸浓度为100倍配方中要求的浓度，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液d，其中，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸配方中要求的浓度分别为0～0.18％、0～0.35％、0～0.27％、0～0.26％、0.01～0.24％、0～0.29％、0.01～0.30％、0～0.15％、0.01～0.31％、0.01～0.27％、0.01～0.27％、0～0.29％、0.01～0.30％、0～0.33％、0～0.06％、0～0.05％、0～0.06％、0.01～0.41％、0.01～0.23％；
20.步骤(5)、将组氨酸、异亮氨酸、谷氨酸溶解于去离子水中，组氨酸、异亮氨酸、谷氨酸浓度均为浓度为100倍配方中要求的浓度，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液e，其中，组氨酸、异亮氨酸、谷氨酸配方中要求浓度分别为0.02～0.31％、0.01～0.26、0.01～0.29％；
21.步骤(6)、将泛酸钙、烟酸、盐酸吡哆醇、核黄素和盐酸硫胺素溶解于去离子水中，泛酸钙、烟酸、盐酸吡哆醇、核黄素和盐酸硫胺素浓度均为100倍配方中要求的浓度，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液f；其中，泛酸钙、烟酸、盐酸吡哆醇、核黄素和盐酸硫胺素配方中要求的浓度分别为0.0001～0.0005％、0.0001～0.0005％、0.0001～0.0025％、0.0001～0.0005％、0.0001～0.0005％；
22.步骤(7)、将冷却后的料液a、b、c、d、e、f和无菌去离子水分别按20:50:1:1:1:1:26的比例进行混合，即得培养基。
23.一种适合嗜热链球菌培养及游离胞外多糖测定的化学成分确定培养基对嗜热链球菌游离胞外多糖的快速提取及定量测定的应用。
24.一种适合嗜热链球菌培养及游离胞外多糖测定的化学成分确定培养基对对不同游离胞外多糖产量的嗜热链球菌筛选的应用。
25.本发明方法先进科学，通过本发明，提供的一种适合嗜热链球菌培养及游离胞外多糖测定的化学成分确定培养基及其制备方法，所述配方包括：1种碳水化合物、9～20种游离氨基酸、6种维生素、6种无机盐及3种有机盐，详情见表1。
26.表1嗜热链球菌化学成分确定培养基配方
[0027][0028][0029]
配置1l培养基，所述的制备方法包括下述步骤：
[0030]
步骤(1)、准备原料，原料包括乳糖、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、抗坏血酸钠、泛酸钙、烟酸、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化镁、氯化钙、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、柠檬酸三铵、尿素、乙酸钠、去离子水，其各成分重量百分比为：
[0031]
乳糖1～4％、丙氨酸0～0.18％、精氨酸0～0.35％、天冬酰胺0～0.27％、天冬氨酸0.01～0.26％、半胱氨酸0.01～0.24％、谷氨酰胺0～0.29％、谷氨酸0.01～0.30％、甘氨酸0～0.15％、组氨酸0.01～0.31％、异亮氨酸0.01～0.27％、亮氨酸0.01～0.27％、赖氨酸0～0.29％、蛋氨酸0.01～0.30％、苯丙氨酸0～0.33％、脯氨酸0～0.06％、丝氨酸0～0.05％、苏氨酸0～0.06％、色氨酸0.01～0.41％、酪氨酸0.01～0.036％、缬氨酸0.01～0.23％、抗坏血酸钠0.05％～0.1％、泛酸钙0.0001～0.0005％、烟酸0.0001～0.0005％、盐酸吡哆醇0.0001～0.0025％、核黄素0.0001～0.0005％、盐酸硫胺素0.0001～0.0005％、磷酸二氢钾0.2～0.3％、磷酸氢二钾0.2～0.3％、氯化镁0.02～0.05％、氯化钙0.005～0.01％、磷酸二氢钠0.12～0.36％、磷酸氢二钠0.14～0.43％、柠檬酸三铵0.06～0.1％、尿素0.01～0.024％、乙酸钠0.01～0.1％，其余为去离子水；
[0032]
步骤(2)、将乳糖溶解于去离子水中，浓度为配方中要求比例的5倍，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液a，其中，乳糖配方中要求的浓度为1～4％；
[0033]
步骤(3)、将柠檬酸三铵、尿素、乙酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、抗坏血酸钠、酪氨酸溶解于去离子水中，浓度为配方中要求浓度的2倍，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液b；其中，柠檬酸三铵、尿素、乙酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、抗坏血酸钠、酪氨酸配方中要求的浓度分别为0.06～0.1％、0.01～0.024％、0.01～0.1％、0.2～0.3％、0.2～0.3％、0.02～0.05％、0.12～0.36％、0.14～0.43％、0.05～0.1％、0.01～0.036％；
[0034]
步骤(3)、将氯化钙溶解于去离子水中，浓度为100倍配方中要求的浓度，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液c，其中，氯化钙配方中要求浓度为0.005～0.01％；
[0035]
步骤(4)、将16种氨基酸溶解于0.1m naoh中，16种氨基酸为丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸，各氨基酸浓度为100倍配方中要求的浓度，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液d，其中，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸配方中要求的浓度分别为0～0.18％、0～0.35％、0～0.27％、0.0～0.26％、0.01～0.24％、0～0.29％、0～0.15％、0.01～0.27％、0～0.29％、0.01～0.30％、0～0.33％、0～0.06％、0～0.05％、0～0.06％、0.01～0.41％、0.01～0.23％；
[0036]
步骤(5)、将组氨酸、异亮氨酸、谷氨酸溶解于去离子水中，组氨酸、异亮氨酸、谷氨酸浓度均为浓度为100倍配方中要求的浓度，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液e，其中，组氨酸、异亮氨酸、谷氨酸配方中要求浓度分别为0.01～0.31％、0.01～0.27、0.01～0.30％；
[0037]
步骤(6)、将泛酸钙、烟酸、盐酸吡哆醇、核黄素和盐酸硫胺素溶解于去离子水中，泛酸钙、烟酸、盐酸吡哆醇、核黄素和盐酸硫胺素浓度均为100倍配方中要求的浓度，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液f；其中，泛酸钙、烟酸、盐酸吡哆醇、核黄素和盐酸硫胺素配方中要求的浓度分别为0.0001～0.0005％、0.0001～0.0005％、0.0001～0.0025％、0.0001～0.0005％、0.0001～0.0005％；
[0038]
步骤(7)、将冷却后的料液a、b、c、d、e、f和无菌去离子水按20:50:1:1:1:1:26的比例混合，即将200ml料液a、500ml料液b、10ml料液c、10ml料液d、10ml料液e、10ml料液f和
260ml无菌去离子水混合，即得。
[0039]
本发明中，所述的化学成分均为分析纯化学品，亦可全替换为食品级。
[0040]
本发明的积极进步效果在于：
[0041]
(1)本发明培养基配方，该培养基不包含复杂有机成分，可支持嗜热链球菌快速生长，提高游离胞外多糖产量。
[0042]
(2)本发明培养基配方，该培养基不包含热敏成分，各料液可直接高温灭菌，制备工艺简单可行。
[0043]
(3)本发明培养基配方，该培养基应用于嗜热链球菌游离胞外多糖分离时，背景信号低于5μg/ml，样品回收率超过90％，分离纯化时间不超过48h。
[0044]
综上，本发明公开了一种适合嗜热链球菌快速生长且能提升其游离胞外多糖产量的化学成分确定的培养基配方，还公开了上述培养基在筛选产游离胞外多糖嗜热链球菌中的应用。本发明设计的培养基能嗜热链球菌游离胞外多糖产量，且对产游离胞外多糖嗜热链球菌具有优良的区分度，分离步骤简便，得到的游离胞外多糖纯度高。
附图说明
[0045]
图1是嗜热链球菌dali 02在不同培养基中生长情况。
[0046]
图2是空白cdm背景信号及黄原胶在cdm中回收率。
[0047]
图3是不同嗜热链球菌游离胞外多糖产量；
[0048]
图4是嗜热链球菌dali 02在不同实施例培养基中游离胞外多糖产量。
具体实施方式
[0049]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中为注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件进行。
[0050]
实施例1
[0051]
配方：
[0052]
[0053][0054]
使用本发明培养基可简化游离胞外多糖的提取步骤，节省提取时间。具体方法如下：
[0055]
(1)将5g乳糖溶解于100ml去离子水中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液a，料液a中乳糖浓度为5％；
[0056]
(2)将0.6g柠檬酸三铵、0.24g尿素、1g乙酸钠、3g磷酸二氢钾、3g磷酸氢二钾、0.2g氯化镁、3.6g磷酸二氢钠、4.3g磷酸氢二钠、0.5g抗坏血酸钠、0.181g酪氨酸溶解于500ml去离子水中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液b，料液b中柠檬酸三铵、尿素、乙酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、抗坏血酸钠、酪氨酸浓度分别为0.12％、0.048％、0.2％、0.6％、0.6％、0.1％、0.72％、0.86％、0.1％、0.036％；
[0057]
(3)将0.5g氯化钙溶解于100ml去离子水中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液c，料液c中氯化钙浓度为0.5％；
[0058]
(4)将1.21g半胱氨酸、1.47g谷氨酸、3.103g组氨酸、2.62g异亮氨酸、2.62g亮氨酸、1.49g蛋氨酸、4.08g色氨酸和2.34g缬氨酸9种游离氨基酸溶解于100ml 0.1m naoh中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液d，料液d中各氨基酸浓度为1.21％、1.47％、1.55％、1.31％、1.31％、1.49％、2.04％、1.17％；
[0059]
(5)将0.01g泛酸钙、0.01g烟酸、0.05g盐酸吡哆醇、0.01g核黄素和0.01g盐酸硫胺素溶解于100ml去离子水中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液e，料液e中泛酸钙、烟酸、盐酸吡哆醇、核黄素和盐酸硫胺素的浓度分别为0.01％、0.01％、0.05％、0.01％和0.01％；
[0060]
(6)将冷却后的料液a、b、c、d、e和无菌去离子水按20:50:1:1:1:27的比例混合，即将200ml料液a、500ml料液b、10ml料液c、10ml料液d、10ml料液e和270ml无菌去离子水混合，即得。
[0061]
实施例2
[0062]
配方：
[0063][0064][0065]
使用本发明培养基可简化游离胞外多糖的提取步骤，节省提取时间。具体方法如下：
[0066]
(1)将20g乳糖溶解于100ml去离子水中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液a，料液a中乳糖浓度为20％；
[0067]
(2)将0.6g柠檬酸三铵、0.24g尿素、1g乙酸钠、3g磷酸二氢钾、3g磷酸氢二钾、0.2g氯化镁、3.6g磷酸二氢钠、4.3g磷酸氢二钠、0.5g抗坏血酸钠、0.181g酪氨酸溶解于500ml去
离子水中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液b，料液b中柠檬酸三铵、尿素、乙酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、抗坏血酸钠、酪氨酸浓度分别为0.12％、0.048％、0.2％、0.6％、0.6％、0.1％、0.72％、0.86％、0.1％、0.036％；
[0068]
(3)将0.5g氯化钙溶解于100ml去离子水中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液c，料液c中氯化钙浓度为0.5％；
[0069]
(4)将0.89g丙氨酸、1.74g精氨酸、1.33g天冬酰胺、1.33g天冬氨酸、1.21g半胱氨酸、1.46g谷氨酰胺、0.75g甘氨酸、1.31g亮氨酸、1.46g赖氨酸、1.49g蛋氨酸、1.65g苯丙氨酸、1.15g脯氨酸、1.05g丝氨酸、1.19g苏氨酸、2.04g色氨酸、1.17g缬氨酸溶解于0.1m naoh中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液d，料液d中，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸的浓度分别为0.89％、1.74％、1.33％、1.33％、1.46％、0.75％、1.31％、1.46％、1.49％、1.65％、1.15％、1.05％、1.19％、2.04％、1.81％、1.17％。
[0070]
(5)将31.03g组氨酸、26.24g异亮氨酸、29.43g谷氨酸溶解于100ml去离子水中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液e，料液e中组氨酸、异亮氨酸、谷氨酸浓度分别为31.03％、26.23％、29.42％；
[0071]
(5)将0.01g泛酸钙、0.01g烟酸、0.05g盐酸吡哆醇、0.01g核黄素和0.01g盐酸硫胺素溶解于100ml去离子水中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液e，料液e中泛酸钙、烟酸、盐酸吡哆醇、核黄素和盐酸硫胺素的浓度分别为0.01％、0.01％、0.05％、0.01％和0.01％；
[0072]
(6)将冷却后的料液a、b、c、d、e、f和无菌去离子水按20:50:1:1:1:1:26的比例混合，即将200ml料液a、500ml料液b、10ml料液c、10ml料液d、10ml料液e、10ml料液f和260ml无菌去离子水混合，即得。
[0073]
实施例3
[0074]
配方：
[0075][0076]
使用本发明培养基可简化游离胞外多糖的提取步骤，节省提取时间。具体方法如下：
[0077]
(1)将10g乳糖溶解于100ml去离子水中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液a，料液a中乳糖浓度为10％；
[0078]
(2)将0.6g柠檬酸三铵、0.24g尿素、1g乙酸钠、3g磷酸二氢钾、3g磷酸氢二钾、0.2g氯化镁、3.6g磷酸二氢钠、4.3g磷酸氢二钠、0.5g抗坏血酸钠、0.181g酪氨酸溶解于500ml去离子水中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液b，料液b中柠檬酸三铵、尿素、乙酸钠、磷酸
二氢钾、磷酸氢二钾、氯化镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、抗坏血酸钠、酪氨酸浓度分别为0.12％、0.048％、0.2％、0.6％、0.6％、0.1％、0.72％、0.86％、0.1％、0.036％；
[0079]
(3)将0.5g氯化钙溶解于100ml去离子水中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液c，料液c中氯化钙浓度为0.5％；
[0080]
(4)将0.89g丙氨酸、1.74g精氨酸、1.33g天冬酰胺、1.33g天冬氨酸、1.21g半胱氨酸、1.46g谷氨酰胺、0.75g甘氨酸、1.31g亮氨酸、1.46g赖氨酸、1.49g蛋氨酸、1.65g苯丙氨酸、1.15g脯氨酸、1.05g丝氨酸、1.19g苏氨酸、2.04g色氨酸、1.17g缬氨酸溶解于0.1m naoh中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液d，料液d中，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸的浓度分别为0.89％、1.74％、1.33％、1.33％、1.46％、0.75％、1.31％、1.46％、1.49％、1.65％、1.15％、1.05％、1.19％、2.04％、1.81％、1.17％。
[0081]
(5)将31.03g组氨酸、26.24g异亮氨酸、29.43g谷氨酸溶解于100ml去离子水中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液e，料液e中组氨酸、异亮氨酸、谷氨酸浓度分别为31.03％、26.23％、29.42％；
[0082]
(5)将0.01g泛酸钙、0.01g烟酸、0.05g盐酸吡哆醇、0.01g核黄素和0.01g盐酸硫胺素溶解于100ml去离子水中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液e，料液e中泛酸钙、烟酸、盐酸吡哆醇、核黄素和盐酸硫胺素的浓度分别为0.01％、0.01％、0.05％、0.01％和0.01％；
[0083]
(6)将冷却后的料液a、b、c、d、e、f和无菌去离子水按20:50:1:1:1:1:26的比例混合，即将200ml料液a、500ml料液b、10ml料液c、10ml料液d、10ml料液e、10ml料液f和260ml无菌去离子水混合，即得。
[0084]
实施例4
[0085]
配方：
[0086]
[0087][0088]
使用本发明培养基可简化游离胞外多糖的提取步骤，节省提取时间。具体方法如下：
[0089]
(1)将5g乳糖溶解于100ml去离子水中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液a，料液a中乳糖浓度为5％；
[0090]
(2)将0.6g柠檬酸三铵、0.24g尿素、1g乙酸钠、3g磷酸二氢钾、3g磷酸氢二钾、0.2g氯化镁、3.6g磷酸二氢钠、4.3g磷酸氢二钠、0.5g抗坏血酸钠、0.181g酪氨酸溶解于500ml去离子水中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液b，料液b中柠檬酸三铵、尿素、乙酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、抗坏血酸钠、酪氨酸浓度分别为0.12％、0.048％、0.2％、0.6％、0.6％、0.1％、0.72％、0.86％、0.1％、0.036％；
[0091]
(3)将0.5g氯化钙溶解于100ml去离子水中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液c，料液c中氯化钙浓度为0.5％；
[0092]
(4)将0.89g丙氨酸、1.74g精氨酸、1.33g天冬酰胺、1.33g天冬氨酸、1.21g半胱氨
酸、1.46g谷氨酰胺、0.75g甘氨酸、1.31g亮氨酸、1.46g赖氨酸、1.49g蛋氨酸、1.65g苯丙氨酸、1.15g脯氨酸、1.05g丝氨酸、1.19g苏氨酸、2.04g色氨酸、1.17g缬氨酸溶解于0.1m naoh中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液d，料液d中，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸的浓度分别为0.89％、1.74％、1.33％、1.33％、1.46％、0.75％、1.31％、1.46％、1.49％、1.65％、1.15％、1.05％、1.19％、2.04％、1.81％、1.17％。
[0093]
(5)将1.55g组氨酸、1.31g异亮氨酸、1.47g谷氨酸溶解于100ml去离子水中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液e，料液e中组氨酸、异亮氨酸、谷氨酸浓度分别为1.55％、1.31％、1.47％；
[0094]
(5)将0.01g泛酸钙、0.01g烟酸、0.05g盐酸吡哆醇、0.01g核黄素和0.01g盐酸硫胺素溶解于100ml去离子水中，121℃灭菌15min，冷却备用，得到料液e，料液e中泛酸钙、烟酸、盐酸吡哆醇、核黄素和盐酸硫胺素的浓度分别为0.01％、0.01％、0.05％、0.01％和0.01％；
[0095]
(6)将冷却后的料液a、b、c、d、e、f和无菌去离子水按20:50:1:1:1:1:26的比例混合，即将200ml料液a、500ml料液b、10ml料液c、10ml料液d、10ml料液e、10ml料液f和260ml无菌去离子水混合，即得。
[0096]
效果实施例1嗜热链球菌dali 02生长情况测定
[0097]
①
将嗜热链球菌dali 02按2％接菌量分别接入m17(青岛海博生物技术有限公司)，实施例1所述培养基和实施例2所述培养基中，42℃培养24h，每0.5h测定一次od600值，绘制菌株生长曲线，结果如图1所示。
[0098]
从图1可以看出，嗜热链球菌dali 02在实施例1所述培养基中生长速度较慢，在实施例2所述培养基和m17培养基中能够快速生长。
[0099]
效果实施例2背景信号及回收率测定
[0100]
①
将0.5％黄原胶溶解于实施例1所得培养基，得到阳性对照组(cdm
‑
pc)。
[0101]
②
以实施例1所得培养基为阴性对照(cdm
‑
nc)
[0102]
③
将阳性对照组和阴性对照组分别移入透析袋中(截留量：8000
‑
14000mw)，透析48h，每4h换一次透析水。
[0103]
④
透析完成后，使用苯酚
‑
硫酸法测定其胞外多糖含量。
[0104]
从图2可以看出，本发明所述培养基背景信号低于5μg/ml，样品回收率超过90％。
[0105]
效果实施例3产游离胞外多糖嗜热链球菌的筛选
[0106]
①
将多种嗜热链球菌按2％接菌量分别接入实施例3所述培养基和脱脂乳培养基中，42℃培养6h。
[0107]
②
培养完成后，取5ml使用实施例2所述培养基培养的样品，离心(8000g，5min，4℃)取上清，上清转入透析袋中(截留量：8000
‑
14000mw)，透析48h，每4h换一次透析水。
[0108]
③
培养完成后，取5ml脱脂乳培养基培养的样品，调节ph值等于7，加入蛋白酶k，55℃酶解16h，酶解完成后加入3倍乙醇，4℃静置16h。静置后，离心(12000g，15min，4℃)收集沉淀，重悬于5ml去离子水中，加入80％tca至终浓度为20％，4℃静置8h，离心12000g，15min，4℃)取上清，加入3倍体积乙醇，4℃静置16h。静置后，离心(12000g，20min，4℃)收集沉淀，重悬于1ml去离子水中，转入透析袋中(截留量：8000
‑
14000mw)，透析48h，每4h换一次透析水。
[0109]
④
透析完成后，使用苯酚
‑
硫酸法测定其胞外多糖含量。结果如图3所示。
[0110]
从图3可以看出，使用脱脂乳培养基和实施例3所述培养基对不同游离胞外多糖产量的嗜热链球菌有良好的区分度，而一般化学确定培养基则无法区分。各嗜热链球菌在本发明所述培养基中游离胞外多糖产量略低于在还原脱脂乳中产量，但对不同游离胞外多糖产量的嗜热链球菌具有良好的区分度，且测定时间较还原脱脂乳培养基中节省三分之二。
[0111]
效果实施例4嗜热链球菌dali 02游离胞外多糖产量
[0112]
①
将热链球菌dali 02按2％接菌量分别接入实施例3所述培养基和脱脂乳培养基中，42℃培养6h。
[0113]
②
培养完成后，取5ml使用实施例2所述培养基培养的样品，离心(8000g，5min，4℃)取上清，上清转入透析袋中(截留量：8000
‑
14000mw)，透析48h，每4h换一次透析水。
[0114]
③
透析完成后，使用苯酚
‑
硫酸法测定其胞外多糖含量。结果如图4所示。
[0115]
从图4可以看出，嗜热链球菌dali 02在不同实施例培养基中，可得到不同的游离胞外多糖产量。