一种精子染色质免疫共沉淀方法与流程

1.本发明涉及靶向核酸纯化及二代测序建库样本预处理技术领域，更具体的说是涉及一种精子染色质免疫共沉淀方法。


背景技术：

2.目前，研究蛋白质间的相互作用的方法有多种，常用的有酵母双杂交洗脱、免疫共沉淀、pull
‑
down等方法。其中，免疫共沉淀是相对稳定、简便的方法，也是在蛋白质组的科学研究中得到了广泛应用的一种方法。
3.免疫共沉淀是以抗体和抗原之间特异性结合为基础的用于研究蛋白质相互作用的技术。主要利用非变性剂裂解完整细胞，维持了细胞内许多蛋白质间的相互作用，便于检测蛋白质之间的相互作用。利用抗蛋白质a的抗体与a形成免疫复合物并沉淀，而细胞内与a稳定结合的蛋白质b同时被沉淀下来。蛋白质b的沉淀是基于与a的物理性相互作用，这种技术被称为免疫共沉淀。该技术利用抗原抗体形成蛋白复合物沉淀，将蛋白质复合物溶解，再将蛋白质b分离出来。免疫共沉淀方法是确定两种蛋白质在细胞生理条件下相互作用的有效方法。
4.然而由于精子上含有的组蛋白量很少(大约为6～15％)，因此现有技术中针对精子的组蛋白修饰相关的免疫共沉淀方法效率都比较低。
5.综上，如何提供一种效率高的精子染色质免疫共沉淀方法是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种精子染色质免疫共沉淀方法。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种精子染色质免疫共沉淀方法，包括如下步骤：
9.(1)精子消化：将精子经多聚甲醛固定、清洗、裂解后，采用微球菌核酸酶消化
‑
超声相结合的方法对精子进行消化，得消化液；其中，
10.超声参数：超声30s(选择超声装置的低功率)、间隔45s，10个循环；
11.微球菌核酸酶消化参数：酶加入量为200u/106个精子，酶解温度37℃，酶解时间30min；
12.(2)染色质分离：将所述消化液经初清后得染色质；
13.(3)染色质免疫共沉淀：抗体与protein a agarose形成复合物，再与染色质中相应的抗原结合，之后经清洗、洗脱后得免疫共沉淀反应液。
14.进一步的，所述步骤(1)的具体操作为：
15.(11)将精子使用质量浓度为0.5％的多聚甲醛固定；
16.(12)20～25℃、5,000g，离心10min，弃上清；
17.(13)加入4℃预冷的pbs进行清洗，之后20～25℃、5,000g，离心10min，弃上清，保
留精子沉淀；
18.(14)按照500μl/106个精子的量加入裂解液，20～25℃孵育1hr，得混合液a；
19.所述裂解液包括如下质量浓度的组分：0.5％的sds和10mm的dtt；
20.(15)裂解后加入1m的n
‑
乙基顺丁烯二酰亚胺；
21.(16)之后采用超声处理，超声30s(选择超声装置的低功率)、间隔45s，10个循环；超声后使用微球菌核酸酶消化，酶加入量为200u/106个精子，酶解温度37℃，酶解时间30min，得消化液。
22.取得的有益效果：使染色质充分释放。
23.进一步的，所述步骤(2)的具体操作为：
24.(21)向消化液中加入等比例的稀释缓冲液，所述稀释缓冲液包括如下质量浓度的组分：1％triton x
‑
100、2mm edta、150mm nacl、20mm tris
‑
hcl，ph8.0；
25.(22)加入protein a agarose在4℃条件下震荡2hr，进行初清；
26.(23)5,000rpm离心1min，保留上清液即为染色质。
27.取得的有益效果：获得足够多的染色质。
28.进一步的，步骤(3)中所述抗体为h3k4me2或h3k27me3的抗体。
29.进一步的，所述步骤(3)的具体操作为：
30.(31)向所述染色质中加入抗体，染色质与抗体的体积质量比为8μl:1μg，4℃震荡过夜；
31.(32)加入染色质体积4/5的protein a agarose，震荡2hr；
32.(33)5,000rpm离心1min，弃上清；
33.(34)先后以tseⅰ，tseⅱ，缓冲液ⅲ和te缓冲液各洗涤两次，每次4℃震荡2min，弃上清，得免疫共沉淀后样品；
34.所述tseⅰ包括如下质量浓度的组分：20mm tris
‑
hcl、0.5m edta、0.1％sds、150mm nacl和1％tritonx
‑
100，ph8.0；
35.所述tseⅱ包括如下质量浓度的组分：20mm tris
‑
hcl、0.5m edta、0.1％sds、500mm nacl和1％tritonx
‑
100，ph8.0；
36.所述缓冲液ⅲ包括如下质量浓度的组分：10mm tris
‑
hcl、1mm edta、1％np
‑
40和1％脱氧胆酸钠，ph8.0；
37.所述te缓冲液包括如下质量浓度的组分：10mm tris
‑
hcl和0.5m edta，ph8.0；
38.(35)免疫共沉淀后样品加入染色质5倍体积的洗脱液重悬，65℃水浴5min，继而20～25℃震荡15min；
39.所述洗脱液包括如下质量浓度的组分：1％的sds和0.1m的nahco3；
40.(36)12,000rpm离心2min，取洗脱上清液；
41.(37)重复35～36，将两次洗脱上清液合并；
42.(38)向洗脱上清液中加入其0.04倍体积的5m nacl，0.01倍体积的2mg/ml rnase，65℃水浴4hr；
43.(39)加入洗脱上清液0.02倍体积的0.5m edta，0.04倍体积的1.5m tris
‑
hcl，0.01倍体积的蛋白酶k，65℃水浴2hr，得免疫共沉淀反应液。
44.取得的有益效果：去除与dna结合的蛋白，方便后续dna的纯化和检测。
45.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：把超声与酶消化结合起来，大大提高消化效率，显著增加dna的回收率，有助于降低后续建库的难度，大大提高了精子免疫共沉淀的效率。
附图说明
46.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
47.图1附图为本发明实施例1消化液琼脂糖凝胶电泳结果；
48.图2附图为本发明实施例1中h3k4me2阳性和阴性位点的验证；
49.图3附图为本发明实施例1中h3k27me3阳性和阴性位点的验证；
50.图4附图为本发明实施例2中h3k4me2阳性和阴性位点的验证；
51.图5附图为本发明实施例2中h3k27me3阳性和阴性位点的验证；
52.图6附图为本发明实施例3中超声优化消化液琼脂糖凝胶电泳图，其中s代表上清，p代表沉淀。
具体实施方式
53.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
54.本发明实施例所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；实施例中未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
55.实施例1
56.1.取冻存于
‑
80℃的人精子(数量约为2
×
107)，加入质量浓度0.5％的多聚甲醛(pfa)，22℃固定10min。
57.2. 22℃、5,000g，离心10min，弃去上清。
58.3.加入4℃预冷的pbs清洗一次，22℃、5,000g，离心10min，弃去上清。
59.4.向精子沉淀中加入300μl裂解液(0.5％sds，10mm dtt)，22℃孵育1hr。
60.5.之后加入3μl 1m的n
‑
乙基顺丁烯二酰亚胺，终止dtt的作用。
61.6.之后采用超声处理，超声30s(选择超声装置的低功率)、间隔45s，10个循环；超声后使用微球菌核酸酶消化，酶加入量为200u/106个精子，酶解温度37℃，酶解时间30min，得消化液。
62.7.上述消化液12,000rpm离心15min，转移上清至另一1.5ml ep管。
63.8.向其中加入稀释缓冲液，补足1ml，所述稀释缓冲液包括如下质量浓度的组分：1％tritonx
‑
100、2mm edta、150mm nacl、20mm tris
‑
hcl，ph8.0。
64.9.加入50μl protein a agarose在4℃震荡2hr，进行初清。
65.10. 5,000rpm离心1min，转移上清至另一1.5ml ep管。
66.11.取40μl作为input样品，其余样品进行后续操作(12～17)；
67.余下样品等分入2个1.5ml ep管，一个加入5μg的h3k4me2抗体或h3k27me3抗体，另一个加入igg 5μg(对照)；
68.4℃震荡过夜。
69.12.每管加入50μlproteina agarose，震荡2hr。
70.13. 5,000rpm离心1min，弃上清。
71.14.先后以tseⅰ，tseⅱ，缓冲液ⅲ和te缓冲液各洗涤两次，每次4℃震荡2min(每次以1ml注射器吸去上清)。
72.tseⅰ包括如下质量浓度的组分：20mm tris
‑
hcl、0.5m edta、0.1％sds、150mm nacl和1％tritonx
‑
100，ph8.0；
73.tseⅱ包括如下质量浓度的组分：20mm tris
‑
hcl、0.5m edta、0.1％sds、500mm nacl和1％tritonx
‑
100，ph8.0；
74.缓冲液ⅲ包括如下质量浓度的组分：10mm tris
‑
hcl、1mm edta、1％np
‑
40和1％脱氧胆酸钠，ph8.0；
75.te缓冲液包括如下质量浓度的组分：10mm tris
‑
hcl和0.5m edta，ph8.0。
76.15.加入200μl新配制的洗脱液(1％sds，0.1m nahco3)重悬，65℃水浴5min，继而20～25℃震荡15min。
77.16. 12,000rpm离心2min，保留上清即为洗脱上清液，转移洗脱上清液至另一1.5ml ep管。
78.17.重复15～16，将两次缓冲上清液合并，约400μl。
79.18.向400μl缓冲上清液中加入16μl 5mnacl，4μl 2mg/ml rnase；
80.同时以180μl洗脱液elutionbuffer将input样品补足体积至200μl，加入8μl 5mnacl，4μl 2mg/ml rnase，65℃水浴4hr。
81.19.加入8μl 0.5m edta，16μl 1.5m tris
‑
hcl，4μl蛋白酶k；
82.同时input样品中加入8μl 1.5m tris
‑
hcl，4μl蛋白酶k，65℃水浴2hr。
83.20.抽提dna(无水乙醇及70％乙醇预先放入
‑
80℃冰箱)
84.a.加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇，混匀。
85.b.12,000rpm、22℃离心5min。
86.c.转移上清至另一1.5ml ep管，加入1/10体积的3mnaac(ph5.2)，1.5μl糖原，2倍体积的无水乙醇，
‑
80℃冰箱沉淀15min。
87.d.4℃12,000rpm离心15min，弃上清。
88.e.70％乙醇洗涤一次，12,000rpm离心10min，弃上清。
89.f.1ml无水乙醇洗涤以利于dna干燥，12,000rpm离心10min。
90.g.晾干后以100μl te缓冲液溶解dna。
91.将消化液进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所述。图1结果表明，可以稳定的获得条带均一且集中的单核小体，具备进行免疫共沉淀(ip)条件。
92.利用获得的人精子的单核小体，用h3k4me2和h3k27me3的抗体分别进行了免疫共沉淀。定量pcr的结果显示，人精子上存在h3k27me3修饰的位点(lif，hoxa9，myc，h2b1c，gata6)得到显著的富集，而不存在h3k27me3修饰的位点(nanog，gdf3，brdt，ig)没有富集
(图2)。人精子上存在h3k4me2修饰的位点(brdt，taf8，pgk2)得到显著的富集，而不存在h3k4me2修饰的位点(lif，ig，stra8)没有富集(图3)。
93.此外，由于人精子样品的珍贵和稀缺性，通过调整精子数量，并测定chip后获得dna的产量，我们对可以满足chip
‑
seq所需的最少精子数量进行了摸索，发现在使用2
×
107的人精子数量时(20m)(表1)，是能基本满足chip
‑
seq的要求的(chip后获得10ng以上的dna量)。
94.表1精子数量与chip后回收的dna产量
[0095][0096][0097]
实施例2
[0098]
将人精子换成小鼠精子，其余操作同实施例1。
[0099]
h3k4me2和h3k27me3阳性和阴性位点的验证如图4、图5所示。
[0100]
实施例3
[0101]
对超声条件进行优化，分别将超声循环数改为0、3、6、10，之后对消化液的上清和沉淀进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示。
[0102]
将采用上述条件消化、免疫共沉淀后的上清和沉淀，计算dna得率，结果如表2所示。
[0103]
表2超声条件优化后dna得率
[0104]
样品浓度(ng/μl)0
‑
s254.40
‑
p342.43
‑
s361.53
‑
p52.96
‑
s210.66
‑
p91.210
‑
s106.210
‑
p48.0
[0105]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0106]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。