一种用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法与流程

技术特征：
1.一种用于检测布鲁氏杆菌的crrna，其特征在于，所述crrna选自如下所示的序列：crrna(wt)：其序列如seq id no.1所示；crrna(vac)：其序列如seq id no.2所示。2.一种用于检测布鲁氏杆菌的crdna，其特征在于，所述crdna选自如下所示的序列：crdna(wt)：其序列如seq id no.3所示；crdna(vac)：其序列如seq id no.4所示。3.一种用于检测布鲁氏杆菌的dna，其特征在于，所述dna选自如下所示的序列：dna(wt)：其序列如seq id no.5所示；dna(vac)：其序列如seq id no.6所示。4.一种用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的crrna或权利要求2所述的crdna。5.如权利要求4所述的用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括cas蛋白；进一步优选的，所述cas蛋白为cas13a蛋白和cas12a蛋白。6.如权利要求5所述的用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括胶体金试纸条、胶体金试纸条卡壳和微孔杯；所述胶体金试纸条包括底板，以及依次衔接贴合于底板的样品垫、连接垫、硝酸纤维素膜和吸收垫；所述硝酸纤维素膜上设置有第一检测线和第二检测线；所述第一检测线上固定有tamra配体，所述第二检测线上固定有biotin配体。7.一种利用权利要求6所述试剂盒检测布鲁氏杆菌的方法，其特征在于，所述方法包括步骤如下：(1)提取待测样本的基因组；(2)以提取的待测样本基因组为模板，加入至含有反应液和聚合酶的反应体系中，进行rpa扩增；(3)取rpa扩增产物分别建立第一检测体系和第二检测体系，在37℃下，孵育30～60min；(4)将第一检测体系和第二检测体系按照等体积混合均匀，再加入无酶水得到反应液，然后将反应液滴入微孔杯中，5～10分钟后，第一检测线无条带，表明待测样本是野毒株，反之，则表明待测样本不是野毒株；第二检测线无条带，表明待测样本是a19疫苗株，反之，则表明待测样本不是a19疫苗株；当第一检测线和第二检测线均无条带时表明，待测样本既为野毒株和疫苗株混合型感染。8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述待测样本为经过80℃、10分钟预灭活处理的牛全血、牛尿液或牛唾液。9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述rpa扩增的引物为：正向引物：5
’‑
gaaattaatacgactcactatagggatgagctgacggtttccgagaccggcgataa
‑3’
反向引物：5
’‑
ttgtgacggcgcgcataacggatcgtcgctt
‑3’
；所述rpa扩增体系为：rpa基础反应球一管，再水合缓冲液29.5μl，醋酸镁缓冲液2.5μl，正向引物2.5μl，反向引物2.5μl，其余用无酶水8μl补足，然后进行5等份分配，每9μl一份，每份加待测样本1μl，总体积10μl；
扩增条件为：反应温度39～42℃，孵育时间5～20min。10.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述第一检测体系为：tris
‑
hcl(400mm)、mgcl2(120mm)、neb酶切buffer 1μl、ssdna(0.1μm)、crrna(wt)1μl、rnase inhibitor 1μl、cas12a蛋白1μl，rpa扩增产物1μl，总体积20μl；所述第二检测体系为：tris
‑
hcl(400mm)、mgcl2(120mm)、ssrna(2μm)、crrna(vac)1μl、rnase inhibitor 1μl、cas13a蛋白2μl、t7 polymerase 0.5μl、rntp 0.8μl，rpa扩增产物1μl，总体积20μl；步骤(4)中，所述无酶水和第一检测体系的体积比为1:3；进一步优选的，所述ssdna为5
’‑
dig
‑
ttatt
‑
tamra
‑3’
；所述ssrna为5
’‑
fam
‑
uuuuuuuuuuuuuu
‑
biotin
‑3’
。

技术总结
本发明涉及一种用于检测布鲁氏杆菌的用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法。所述试剂盒包括crRNA，crRNA选自crRNA(WT)或crRNA(Vac)，crRNA序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。或通过crDNA(WT)或crDNA(Vac)转录得到crRNA，crDNA序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明对牛种疫苗株A19、野毒株进行基因组生物信息学分析和差异性分析比对，发现牛种疫苗株A19和野毒株存在显著差异。然后根据该差异设计crRNA，并结合CRISPR系统和RPA等温扩增技术，实现了仅用一个试纸条同时区分待测样品是布鲁氏杆菌野毒株或布鲁氏杆菌A19疫苗株，有效解决了现有技术中A19疫苗株和野毒株分别鉴定区分的问题。分别鉴定区分的问题。


技术研发人员：王国俊 李学洋
受保护的技术使用者：内蒙古大学
技术研发日：2021.07.15
技术公布日：2021/11/14