一种用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法与流程

1.本发明涉及一种用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法，属于生物检测技术领域。


背景技术：

2.布鲁氏菌病(brucellosis)是由布鲁氏杆菌(brucella)感染引起的疾病，是一种人畜共患性全 身传染病，简称"布病"，又有地中海弛张热、马耳他热、波浪热等称谓。世界动物卫生组织(oie) 将其列为法定动物报告疾病。布鲁菌可通过皮肤黏膜、呼吸道、消化道等途径侵入机体，引 起发热、流产、不育、虚弱、关节痛等临床症状。布鲁菌宿主广泛、传染性强，不同种布鲁 菌具有宿主间交叉感染的能力，对畜牧业和人类健康均构成严重威胁。因此，在当前严峻的 防控形势下研发简便、快速、精确的布鲁氏杆菌检测技术就显得非常迫切。
3.布鲁氏杆菌(brucella)是一种革兰氏阴性的不运动细菌，无荚膜(光滑型有微荚膜)，触酶、 氧化酶阳性，绝对嗜氧菌，可还原硝酸盐，细胞内寄生，可以在很多种家畜体内存活。目前， 布鲁菌属主要有7个种，为羊种布鲁菌、牛种布鲁菌、猪种布鲁菌、犬种布鲁菌、绵羊附睾种 布鲁菌、沙林鼠种布鲁菌和海洋哺乳动物种布鲁菌共21个生物型。布鲁菌广泛分布于世界各 地，调查全世界有170个国家和地区有布鲁菌病报道发生，最严重的地区位于地中海沿岸和阿 拉伯半岛诸国，该病在印度、墨西哥、美国的南部和中部地区也较普遍。尽管一些国家已经 有效控制了布鲁菌病，但中亚地区逐渐成为人布鲁菌病的新发地区。据统计，全球每年出现 约50万例人布鲁菌病。布鲁菌病在我国也广泛存在，尤其是在以畜牧业生产为主的地区。2009 年全国布鲁菌病监测数据显示，全国有29个省区、市发生畜间布鲁菌病，牛、羊、猪等感染 量达百万头之多，见于内蒙、东北、西北等牧区。人布鲁菌病亦呈上升趋势，人布鲁菌病疫 情表现出明显的职业性、地区性、季节性，人布鲁菌病可能与接触感染动物有关。因此，必 须从根本上预防和控制动物布鲁菌病。
4.目前，主要是使用传统的病原分离培养、血清学检测技术和分子生物学检测技术等进行 布鲁氏杆菌检测。这些传统的检测方法存在诸多局限性，如常规生化识别过程繁琐、周期长、 效率低；免疫检测特异性不强，容易造成漏检；rt
‑
pcr需要耗时、繁琐、仪器昂贵不便携带 和需要专业人员操作等。这就使得开发布鲁氏菌病的简便、快速、精准的现场诊断方法变得 尤为重要。因此，亟需提供一种简单快速，且灵敏度、特异性高的特异性片段以及检测方法。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供一种用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法。
6.本发明技术方案如下：
7.一种用于检测布鲁氏杆菌的crrna，其特征在于，所述crrna选自如下所示的序列：
补足，然后进行5等份分配，每9μl一份，每份加待测样本1μl，总体积10μl。
34.扩增条件为：反应温度39～42℃，孵育时间5～20min。
35.其中，rpa基础反应球、再水合缓冲液和醋酸镁缓冲液均来自于twistamp
r
basic试剂盒， rpa基础反应球为球状固体，内含重组酶、聚合酶等成分。
36.根据本发明优选的，步骤(3)中，所述第一检测体系为：tris
‑
hcl(400mm)、mgcl
2 (120mm)、neb酶切buffer 1μl、ssdna(0.1μm)、crrna(wt)1μl、rnase inhibitor1μl、cas12a蛋白1μl，rpa扩增产物1μl，总体积20μl。
37.所述第二检测体系为：tris
‑
hcl(400mm)、mgcl2(120mm)、ssrna(2μm)、crrna (vac)1μl、rnase inhibitor 1μl、cas13a蛋白2μl、t7 polymerase 0.5μl、rntp 0.8μl，rpa 扩增产物1μl，总体积20μl。
38.进一步优选的，所述ssdna为5
’‑
dig
‑
ttatt
‑
tamra
‑3’
；
39.所述ssrna为5
’‑
fam
‑
uuuuuuuuuuuuuu
‑
biotin
‑3’
。
40.根据本发明优选的，步骤(4)中，所述无酶水和第一检测体系的体积比为1:3。
41.本发明未详细说明的均为现有技术。
42.本发明的技术特点：
43.本发明第一检测体系中的cas12a蛋白与crrna(wt)结合形成cas12a
‑
crrna(wt) 复合物，该复合物能够特异性地识别rpa扩增产物中的dna(wt)，若rpa扩增产物中 有dna(wt)片段，cas12a蛋白被激活，并对ssdna报告基团进行切割，被切割的ssdna 报告基团不能与胶体金形成显示带，表明待测样品为阳性，是野毒株。若rpa扩增产物中无 dna(wt)片段，cas12a蛋白则不会被激活，ssdna报告基团与胶体金及配体结合，形成 显示带，表明待测样品为阴性，不是野毒株。
44.第二检测体系中的cas13a蛋白与crrna(vac)结合成cas13a
‑
crrna(vac)复合物， 该复合物能够特异性地识别rpa扩增产物中的dna(vac)，若rpa扩增产物中有dna(vac) 片段，cas13a蛋白被激活，并对ssrna报告基团进行切割。被切割的ssrna报告基团不能 与胶体金形成显示带，表明样品为阳性，是疫苗株。若rpa扩增产物中无dna(vac)片段， cas13a则不会被激活，ssrna报告基团与胶体金及配体结合，形成显示带，表明样品为阴性， 不是疫苗株。
45.有益效果：
46.1、本发明提供的用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒可以仅用一个试纸条同时区分待测样品是 牛种布鲁氏杆菌野毒株或布鲁氏杆菌a19疫苗株，有效解决了现有技术中a19疫苗株和野毒 株分别鉴定区分的问题。并且本发明提供的检测方法与传统的检测方法相对比特异性强、检 测限低、灵敏度高，显色效果好，检测周期短，能够达到肉眼可见。
47.2、本发明提供的检测方法将rpa扩增技术与crispr系统联用，通过合理配比降低相 互之间的干扰，使反应试剂之间依然能够准确地、特异地实现各自的功能，使扩增和检测结 合进行，还能够将rpa扩增技术的高灵敏度与crispr检测技术的高特异性相结合，整个检 测过程耗时较短，在一个小时内即可完成检测，且操作步骤简单，为布鲁氏杆菌病的净化提 供全新的思路和方法。
附图说明
48.图1为差异基因分析图。
49.图2为rpa反应原理图。
50.图3为本发明试剂盒检测原理示意图。
51.图4为本发明实施例3的检测结果照片。
52.图中：t1为第一检测线，t2为第二检测线，a为野毒株和a19疫苗株均阴性的牛血样本， b为野毒株阴性和a19疫苗株阳性的牛血样本，c为野毒株阳性和a19疫苗株阴性的牛血样 本，d为无酶水对照组。
具体实施方式
53.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的 描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施 方式，都属于本发明所保护的范围。
54.以下实施例中cas12a蛋白和cas13a蛋白，北京科昕生物科技有限公司。
55.twistamp
r
basic试剂盒，twistdx
‑
默瑞(上海)生物科技有限公司有售。
56.实施例1用于检测布鲁氏杆菌的crrna和dna的设计及获得
57.登录ncbi，从genbank中下载基因序列包括：牛种疫苗株a19、野毒株代表株(a13334、 2308、9
‑
941、104m、bd、bab8416、clpp、mc、bj1毒株)及国外常用疫苗毒株(s19、 rb51)等菌株进行基因组生物信息学分析和差异性分析比对，分析结果如图1所示。
58.由图1可知，牛种疫苗株a19、野毒株代表株和国外常用疫苗毒株之间基因序列存在差 异。牛种疫苗株a19和野毒株具体的的差异部分是两个碱基缺失和一个碱基突变，具体分别 是为dna(wt)和dna(vac)，其序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示，其中 疫苗株dna(wt)含有碱基taaaa，而野毒株dna(vac)对应的碱基为t
‑‑
ca。然后 根据dna(wt)和dna(vac)的基因序列，设计得到crrna(wt)和crrna(vac)， 其序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示，本发明设计的crrna(wt)和crrna(vac) 中含有部分spacer片段，该部分片段能够特异性的匹配到疫苗株taaaa区域和野毒株的共 差异t
‑‑
ca区域。从而激活对应的cas蛋白核酸酶活性，对体系中的报告基团进行切割
59.获得crrna(wt)和crrna(vac)的具体操作方法如下：以dna(wt)和dna(vac) 为模板，分别进行退火反应形成双链dna，然后进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收纯化dna片 段，在t7 rna聚合酶作用下转录生成rna，回收纯化得到crrna(wt)和crrna(vac)， 将纯化的crrna(wt)和crrna(vac)分装冻存至
‑
80℃。
60.退火体系：把待退火的dna oligo(合成的引物)用经灭菌的milli
‑
q水或重蒸水配制成 50μm。溶解annealing buffer for dna oligos(5x)，混匀备用。
61.62.按照上述顺序依次加入各种试剂，混匀。
63.t7 primer的序列如下：
[0064]5’‑
gaaattaatacgactcactataggg
‑3’
。
[0065]
如下设置pcr仪进行退火反应：
[0066]
步骤温度时间说明195℃2分钟充分变性2每8秒下降0.1℃，降至25℃约90分钟退火34℃长时间保持暂时存放
[0067]
转录体系为：模板dna 1μg，t7 rna聚合酶混合物2μl，ntp buffer mix 10μl，无酶 水补足，总体积30μl。
[0068]
转录条件为：37℃，16h
[0069]
实施例2用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒
[0070]
本实施例试剂盒包括胶体金试纸条、胶体金试纸条卡壳、微孔杯、twistamp
r
basic试剂 盒、crrna(wt)、crrna(vac)、cas13a蛋白、cas12a蛋白、rpa扩增引物、tris
‑
hcl (400mm)、mgcl2(120mm)、neb酶切bμffer、ssdna(0.1μm)、rnase inhibitor、ssrna (2μm)、t7 polymerase、rntp。
[0071]
所述胶体金试纸条包括底板，以及依次衔接贴合于底板的样品垫、连接垫、硝酸纤维素 膜和吸收垫；所述硝酸纤维素膜上设置有第一检测线和第二检测线。第一检测线上固定有 tamra配体，所述第二检测线上固定有biotin配体。
[0072]
实施例3采用实施例2所述试剂盒进行布鲁氏杆菌检测的方法
[0073]
分别取无a19疫苗株、无野毒株基因组的牛血样本20μl，有a19疫苗株、无野毒株基 因组的牛血样本20μl，有a19疫苗株、无野毒株基因组的牛血样本20μl，无a19疫苗株、 有野毒株基因组的牛血样本20μl作为待测样本，然后以20μl无酶水作为对照组，进行布鲁 氏杆菌检测。
[0074]
具体方法，包括步骤如下：
[0075]
(1)将待检测样本经80℃、10分钟预灭活处理，然后加入20μl的np
‑
40裂解液，震 荡15s至混匀，置于95
‑
99℃的恒温仪加热10min，得到待测样本的基因组；
[0076]
(2)以提取的待测样本基因组为模板，加入至含有反应液和rpa的反应体系中，进行 目的基因的核酸扩增；
[0077]
rpa扩增反应体系：rpa基础反应球一管，再水合缓冲液29.5μl，醋酸镁缓冲液2.5μl， 正向引物2.5μl，反向引物2.5μl，其余用无酶水8μl补足，总体积45μl，然后进行5等份 分配，每9μl一份，每份加待测样本1μl，可同时扩增五个样本的rpa反应，每个反应体积 10μl。
[0078]
扩增条件为：反应温度40℃，孵育时间15min。
[0079]
其中，rpa基础反应球、再水合缓冲液和醋酸镁缓冲液均来自于twistamp
r
basic试剂盒。
[0080]
rpa扩增引物：
[0081]
正向引物：
[0082]5’‑
gaaattaatacgactcactatagggatgagctgacggtttccgagaccggcga taa
‑3’
[0083]
反向引物：5
’‑
ttgtgacggcgcgcataacggatcgtcgctt
‑3’
；
[0084]
rpa扩增条件：反应温度40℃，孵育时间10min；
[0085]
其中，rpa基础反应球、pbs缓冲液和醋酸镁缓冲液均来自于twistamp
r
basic试剂盒； rpa扩增为现有技术，具体原理请见图2。
[0086]
(3)取rpa扩增产物分别建立第一检测体系和第二检测体系，在37℃下，孵育40min；
[0087]
所述第一检测体系为：tris
‑
hcl(400mm)、mgcl2(120mm)、neb酶切buffer 1μl、 ssdna(0.1μm)、crrna(wt)1μl、rnase inhibitor 1μl、cas12a蛋白1μl，rpa扩增 产物1μl，总体积20μl。
[0088]
所述第二检测体系为：tris
‑
hcl(400mm)、mgcl2(120mm)、ssrna(2μm)、crrna (vac)1μl、rnase inhibitor 1μl、cas13a蛋白2μl、t7 polymerase 0.5μl、rntp 0.8μl，rpa 扩增产物1μl，总体积20μl。
[0089]
其中ssrna为5
’‑
dig
‑
ttatt
‑
tamra
‑3’
；
[0090]
ssdna为5
’‑
fam
‑
uuuuuuuuuuuuuu
‑
biotin
‑3’
。
[0091]
(4)将20μl第一检测体系和20μl第二检测体系混合均匀，再加入60μl无酶水得到反 应液，然后将反应液滴入微孔杯中，让反应液被样品垫吸收，依次向第一检测线和第二检测 线流去，10分钟后，得到检测结果。
[0092]
根据图3所示的原理可知，若第一检测线无条带，表明待测样本是野毒株，反之，则表 明待测样本不是野毒株；第二检测线无条带，表明待测样本是a19疫苗株，反之，则表明待 测样本不是a19疫苗株；当第一检测线和第二检测线均无条带时表明，待测样本为野毒株和 a19疫苗株混合型感染。
[0093]
因此，本实施例的检测结果如图4所示。由图4可知，无a19疫苗株、无野毒株基因组 的牛血样本的检测结果为第一检测线和第二检测线均显示条带，均为阴性，既不是野毒株也 不是a19疫苗株；有a19疫苗株、无野毒株基因组的牛血样本的检测结果为第一检测线显示 条带，第二检测线不显示条带，为野毒株阴性和a19疫苗株阳性，是a19疫苗株；无a19 疫苗株、有野毒株基因组的牛血样本的检测结果为第一检测线不显示条带，第二检测线显示 条带，为野毒株阳性和a19疫苗株阴性，是野毒株；无酶水作的检测结果为第一检测线和第 二检测线均不显示条带，为对照组。