一种用于提高细胞外囊泡产量并促进细胞外囊泡包装目标蛋白的方法与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于提高细胞外囊泡产量并促进细胞外囊泡包装目标蛋白的方法。


背景技术：

2.细胞可以向外界释放膜结构的囊泡，称为细胞外囊泡(extracellular vesicles,ev)。ev具有多种作用：(1)由于ev携带有来源于细胞的核酸、蛋白质、脂质、糖类等物质信息，进入循环中的ev可作为细胞分化、组织器官发育、疾病发生发展不同阶段的标志物；(2)ev是不同类型、不同状态的细胞之间进行信号转导、物质传递的一种形式，阻断或抑制某些ev介导的病理性细胞间的通讯可以延缓疾病的发生、发展；(3)ev可以作为生物纳米材料广泛应用于疾病治疗和基因工程等领域。
3.ev可以作为一种治疗载体，通过人为装载的货物而发挥作用。与脂质体或聚合物纳米材料载体相比，ev纳米治疗平台具有生物相容性好、毒性低、安全性高、可改造性强、循环半衰期长等优点，但存在产量低，装载效率低等缺陷。
4.当前，采用ev包装目标蛋白货物的方法主要有以下几种：(1)先提取细胞自然产生的ev，再通过室温孵育、电穿孔、超声、冻融、挤压、皂苷辅助装载等物理方法将目标货物直接装载到ev内部，再将装载好的ev从溶液中纯化出来。该方法的弊端在于包装货物后的ev纯化过程操作繁琐，并且难以保证物理装载处理后ev囊泡结构的完整性和货物的有效性。(2)直接在细胞内过表达目标货物，使之在细胞质内的浓度升高，进而随机、非特异地被包装至ev中，称为被动装载。该方法的缺点是装载效率低，载货ev的产量低。(3)针对不同的货物进行编码序列的改造，将目标货物与ev标记物以直接或间接的形式偶联在一起，使货物被主动装载至ev中。该方法的缺点是改造后货物的编码序列与野生型货物不同，与ev标记物偶联的货物细胞内定位及功能会受到偶联结构的影响。因此，有必要研制可以提高ev产量的方法，并提高ev的装载效率。


技术实现要素：

5.为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种装载系统编码质粒，该装载系统编码质粒为含肉豆蔻酰化肽段【myr(chmp6)】的装载系统编码质粒【pmyr(chmp6)】，可用于提高细胞外囊泡的产量，并促进细胞外囊泡包装目标蛋白，提高ev的装载效率。
6.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
7.本发明提供了一种装载系统编码质粒，所述装载系统编码质粒为含肉豆蔻酰化肽段【myr(chmp6)】的装载系统编码质粒【pmyr(chmp6)】，所述肉豆蔻酰化肽段的氨基酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq id no.2所示，所述装载系统编码质粒可用于提高细胞外囊泡的产量，并促进细胞外囊泡包装目标蛋白。
8.所述肉豆蔻酰化肽段为chmp6蛋白的n端结构，chmp6是内体分选复合物
(endosomal sorting complex required for transport
‑ⅲ
，escrt
‑ⅲ
)的核心组成成分，参与多囊泡内体的形成及内容物分选，其n端存在肉豆蔻酰基修饰。
9.优选地，所述装载系统编码质粒还包括gfp和ha，即pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha，所述装载系统编码质粒的氨基酸序列如seq id no.3所示。所述gfp用于细胞转染后荧光显微镜观察转染效果，ha用于蛋白免疫印迹检测转染效果。
10.本发明还提供了一种提高细胞外囊泡产量的方法，即将上述的装载系统编码质粒转染到细胞中进行表达，即可提高细胞产生外囊泡的数量。
11.通过在细胞中转染装载系统编码质粒pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha发现，含有肉豆蔻酰化肽段的包装系统可显著提高细胞产生ev的数量。
12.本发明还提供了一种促进细胞外囊泡包装目标蛋白的方法，即将上述的装载系统编码质粒和目标蛋白编码质粒共同传染到细胞中进行过表达，即可提高细胞外囊泡包装目标蛋白的数量。
13.通过将目标蛋白与装载系统编码质粒myr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha共同转染的细胞中，发现含有myr(chmp6)的装载系统编码质粒myr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha能有效促进大分子蛋白货物被包装至ev中。
14.优选地，在上述的一种提高细胞外囊泡产量的方法或上述的一种促进细胞外囊泡包装目标蛋白的方法中，所述细胞包括hek293细胞。
15.优选地，在上述的一种提高细胞外囊泡产量的方法或上述的一种促进细胞外囊泡包装目标蛋白的方法中，当所述细胞的密度培养至60
‑
80％时再进行转染。
16.优选地，在上述的一种提高细胞外囊泡产量的方法或上述的一种促进细胞外囊泡包装目标蛋白的方法中，所述转染采用脂质体法。
17.优选地，在上述的一种促进细胞外囊泡包装目标蛋白的方法中，所述目标蛋白编码质粒包括mcherry
‑
nluc
‑3×
flag、cre
‑3×
flag、lenticrispr v2，所述mcherry
‑
nluc
‑3×
flag的氨基酸序列如seq id no.10所示，其主要结构为荧光蛋白mcherry，荧光素酶nluc和蛋白标签flag；所述cre
‑3×
flag的氨基酸序列如seq id no.15所示。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
19.本发明提供了一种装载系统编码质粒，该装载系统编码质粒为含肉豆蔻酰化肽段的装载系统编码质粒，将该装载系统编码质粒单独在细胞中表达，能使细胞产生的ev数量明显增高；将该载系统编码质粒与目标蛋白货物在细胞中同时过表达，能使目标货物高效的装载至细胞产生的ev中，显著提高细胞释放的ev装载的蛋白货物产量。本发明的ev包装目标蛋白的方法直接在培养的细胞中进行蛋白货物与装载系统的共转染即可达到ev货物装载的效果，操作简单，且不需要将包装系统与目标货物以直接或间接的形式进行偶联，避免了对目标货物进行序列改造，同时避免了物理装载法可能导致的ev及货物完整性破坏，使货物与野生型蛋白质的序列高度一致，而且也不会影响货物在细胞内的定位和功能。
附图说明
20.图1为细胞转染pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha及不转染pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha后获得的ev粒径、浓度对比图(装载系统组为转染pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha，对照组为不转染pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha)；
21.图2为细胞转染pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha及不转染pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha后获得的ev形态学对比图(装载系统组为转染pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha，对照组为不转染pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha)；
22.图3为在mcherry
‑
nluc
‑3×
flag货物转染量固定的情况下，转染不同量的pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha后细胞培养上清的荧光素酶活性对比图(纵坐标的relative cm rlu为相对荧光素酶活性；横坐标表示24孔板内1个孔转染的质粒质量；柱状图表示平均值
±
标准误；散点表示每个样品检测值)；
23.图4为货物mcherry
‑
nluc
‑3×
flag单独过表达，以及货物与ev标记物cd9、arrdc1或肉豆蔻酰化肽段myr(chmp6)直接偶联的细胞内分布对比图；
24.图5为货物mcherry
‑
nluc
‑3×
flag与装载系统pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha或不含myr(chmp6)的对照pgfp
‑
ha共转染后的细胞内分布对比图；
25.图6为在pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha转染量固定的情况下，转染不同量的mcherry
‑
nluc
‑3×
flag货物后细胞培养上清的荧光素酶活性对比图(纵坐标relative cm rlu为相对荧光素酶活性；横坐标表示24孔板内1个孔转染的质粒质量；柱状图表示平均值
±
标准误；散点表示每个样品检测值)；
26.图7为货物cre
‑3×
flag与装载系统pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha或不含myr(chmp6)的对照pgfp
‑
ha共同转染后细胞产生的ev中蛋白货物、装载系统以及ev标记物的对比图；
27.图8为货物cas9
‑
flag与装载系统pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha或不含myr(chmp6)的对照pgfp
‑
ha共同转染后细胞产生的ev中蛋白货物、装载系统以及ev标记物的对比图。
28.图7、图8中，同时检测细胞和外囊泡中各蛋白(flag、ha、alix、cd81、calnexin)的表达情况，检测细胞可以观察质粒转染的效果，避免某一组实验操作有误导致转染失败，或质粒构建有问题不能正常表达等原因导致的假阳性或假阴性。此外，在免疫印迹实验蛋白上样量相近的情况下，理论上细胞内有calnexin，而囊泡中没有或极少；囊泡中则富含cd81，alix，而细胞中较少(没有条带可能是低于检测阈值)，这可以反映囊泡提取的操作和产物是否正常。
具体实施方式
29.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
30.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
31.实施例1一种装载系统编码质粒及其应用
32.所述装载系统编码质粒为含肉豆蔻酰化肽段myr(chmp6)的装载系统编码质粒pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha，其中，其中gfp用于细胞转染后荧光显微镜观察转染效果，ha用于蛋白免疫印迹检测转染效果；所述装载系统编码质粒可用于提高细胞外囊泡的产量，并促进细胞外囊泡包装目标蛋白。
33.myr(chmp6)的氨基酸序列(seq id no.1)为：mgnlfgrkkqsr；核酸序列(seq id no.2)为：atgggtaacctgttcggccgcaagaagcagagccgc。
34.pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha的氨基酸序列(seq id no.3)为：mgnlfgrkkqsrggstgggggsggggstsmpamkiecritgtlngvefelvgggegtpeqgrmtnkmkstkgaltfspyllshvmgygfyhfgtypsgyenpflhainnggytntriekyedggvlhvsfsyryeagrvigdfkvvgtgfpedsviftdkiirsnatvehlhpmgdnvlvgsfartfslrdggyysfvvdshmhfksaihpsilqnggpmfafrrveelhsntelgiveyqhafktpiafarsrdishgfppavaaqddgtlpmscaqesgmdrhpaacasarinvggggssgypydvpdya(直线下划线部分为gfp序列；波浪线下划线部分为ha序列，其余除myr(chmp6)序列外为连接序列)。
35.实施例2一种提高细胞外囊泡(ev)产量的方法
36.该方法包括以下步骤：
37.(1)构建含肉豆蔻酰化肽段【myr(chmp6)】的装载系统编码质粒pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha：
38.用浓度为100μm的引物chmp6
‑
f(5
’‑
ctaccaccgccgccaccggtactaccgccgcggctctgcttcttgcggccgaaca
‑3’
，seq id no.4)和chmp6
‑
r(5
’‑
agacaccgactctagaggccgccaccatgggtaacctgttcggccgcaagaagcaga
‑3’
，seq id no.5)各取0.25μl,不另外添加dna模板，与primestar hs dna polymerase试剂(tak ara)参照说明书配置为50μl反应体系，经pcr【反应参数设置为98℃30s
→
98℃
×
30s
→
(98℃
×
10s
→
61℃
×
5s
→
72℃
×
10s)
×
35个循环
→
72℃
×
5min
→
4℃
×
∞】获得片段myr(chmp6)；用引物gfp
‑
f(5
’‑
aggaggcggtagcactagtatgcccgccatgaagatcg
‑3’
，seq id no.6)和引物gfp
‑
r(5
’‑
cccacattgatcctagcagaagcacag
‑3’
，seq id no.7)扩增质粒pgreenfire1
‑
nf
‑
kb(tr012pa
‑
1；system bioscien ces)获得gfp片段；委托金唯智生物科技有限公司合成ha片段，序列为agcgtaatctggaacatcgtatgggta(seq id no.8)。以上片段使用in
‑
fusion试剂(takara)与酶切去除mcherry片段的质粒plv
‑
mcherry(addgene plasmid#36084)参照说明书配置为5μl反应体系于50℃连接反应1小时获得pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha。
39.(2)使用含10％胎牛血清(gibco)，100units/ml青霉素g 100μg/ml链霉素(gibco)的dmem高糖培养基(hyclone)用150mm的大皿培养hek293细胞(bosc
‑
23；成都飞鸥尔生物科技有限公司)，在37℃，5％二氧化碳的环境下培养至密度达60
‑
80％时，使用lipo293试剂(上海碧云天生物技术有限公司)按照说明书步骤转染pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha 35μg。
40.(3)培养24小时后，用dmem基础培养基洗涤细胞2次，并将培养液更换为25ml的无血清dmem培养基。继续培养24小时后，收集细胞培养基上清，4℃、300g离心10分钟，留取上清，弃去沉淀；获得的上清再4℃、2000g离心20分钟，留取上清，弃去沉淀；获得的上清再4℃、12000g离心30分钟，留取上清，弃去沉淀；用0.22μm的滤器将获得的上清过滤，过滤后的上清移至超离管内，然后使用贝克曼落地式离心机(型号为optima xe
‑
100，转头为type 70ti)4℃、120,000g离心70min，离心结束后，小心倒掉上清，加1
×
pbs缓冲液至管口再重复一次超速离心以洗涤沉淀。最后将获得的ev沉淀用1
×
pbs缓冲液重悬，以用于后续的检测。
41.为检测转染pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha后细胞产生的ev形态和数量变化(以不转染pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha的ev为对照)，采用纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis，nta；nanosight ns300,malvern)和电镜(jem
‑
1200ex；jeol)对ev进行检测。
42.如图1、图2所示，通过在hek293细胞中转染pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha，对照组不转染pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha，收集细胞产生的ev，通过nta及电镜检测ev的形态及浓度，证明含有肉豆蔻酰化肽段的包装系统能显著提高细胞产生ev的数量且不会改变ev的形态学特征。
43.实施例3一种促进细胞外囊泡(ev)包装目标蛋白的方法
44.通过装载系统myr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha辅助hek293细胞装载mcherry
‑
nluc
‑3×
flag蛋白货物至ev，具体方法包括以下步骤：
45.(1)构建含肉豆蔻酰化肽段【myr(chmp6)】的装载系统编码质粒pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha：构建方法同实施例2。
46.(2)构建目标蛋白货物的编码质粒mcherry
‑
nluc
‑3×
flag：
47.委托金唯智生物科技有限公司合成nluc
‑3×
flag片段(序列为cttatcgtcatcgtctttgtaatccttatcgtcatcgtctttgtaatccttatcgtcatcgtctttgtaatcgctagcactgccgccaccgcccgccagaatgcgttcgcacagccgccagccggtcactccgttgatggttactcggaacagcagggagccgtcggggttgatcaggcgctcgtcgataattttgttgccgttccacagggtccctgttacagtgatctttttgccgtcgaacacggcgatgccttcatacggccgtccgaaatagtcgatcatgttcggcgtaaccccgtcgattaccagtgtgccatagtgcaggatcaccttaaagtgatgatcatccacagggtacaccaccttaaaaattttttcgatctggcccatttggtcgccgctcagaccttcatacgggatgatgacatggatgtcgatcttcagcccattttcaccgctcaggacaatcctttggatcggagttacggacaccccgagattctgaaacaaactggacacacctccctgttcaaggacttggtccaggttgtagccggctgtctgtcgccagtccccaacgaaatcttcgagtgtgaagac，seq id no.9)；使用in
‑
fusion试剂(takara)将上述合成的片段与酶切的质粒载体plv
‑
mcherry(addgene plasmid#36084)参照说明书配置为5μl反应体系于50℃连接反应1小时获得mcherry
‑
nluc
‑3×
flag。
48.mcherry
‑
nluc
‑3×
flag货物的氨基酸序列(seq id no.10)为vskgeednmaiikefmrfkvhmegsvnghefeiegegegrpyegtqtaklkvtkggplpfawdilspqfmygskayvkhpadipdylklsfpegfkwervmnfedggvvtvtqdsslqdgefiykvklrgtnfpsdgpvmqkktmgweassermypedgalkgeikqrlklkdgghydaevkttykakkpvqlpgaynvniklditshnedytiveqyeraegrhstggmdelykssggggsggggsvftledfvgdwrqtagynldqvleqggvsslfqnlgvsvtpiqrivlsgenglkidihviipyeglsgdqmgqiekifkvvypvddhhfkvilhygtlvidgvtpnmidyfgrpyegiavfdgkkitvtgtlwngnkiiderlinpdgsllfrvtingvtgwrlcerilaggggsasdykddddkdykddddkdykddddk(直线下划线部分为nluc片段，其为一种荧光素酶，能使用nanoglo luciferase assay system(promega)进行活性检测)。
49.(3)构建货物mcherry
‑
nluc
‑3×
flag与ev标记物cd9、arrdc1、myr(chmp6)直接偶联的质粒cd9
‑
mcherry
‑
nluc
‑3×
flag,arrdc1
‑
mcherry
‑
nluc
‑3×
flag,myr(chmp6)
‑
mcherry
‑
nluc
‑3×
flag:
50.使用tri reagent(sigma)根据说明书提取hek293细胞(bosc
‑
23；成都飞鸥尔生物科技有限公司)的rna，使用revertaid first strand cdna synthesis kit(#k1622；thermos cientific)根据说明书进行逆转录反应获得hek293细胞的cdna。以获得的cdna为模板，使用引物cd9
‑
f(5
’‑
aagacaccgactctagaggccgccaccatgccggtcaaaggaggc
‑3’
，seq id no.11)和cd9
‑
r(5
’‑
gcttcctcctcctccgcttccacctcctccagcgctgaccatctcgcggttcctg
‑3’
，seq id no.12)经pcr扩增获得cd9片段；使用引物arrdc1
‑
f(5
’‑
aagacaccgactctagaggccgccaccatggggcgagtgcagctc
‑3’
，seq id no.13)和arrdc1
‑
r(5
’‑
cgcttccacctcctccggatccgctctcaggggtcaggctg
‑3’
，seq id no.14)经pcr扩增获得arrdc1片段。
51.使用in
‑
fusion试剂(takara)将上述cd9，arrdc1或myr(chmp6)片段(获得方法同
实例2)分别与酶切的mcherry
‑
nluc
‑3×
flag质粒参照说明书配置为5μl反应体系于50℃连接反应1小时获得cd9
‑
mcherry
‑
nluc
‑3×
flag,arrdc1
‑
mcherry
‑
nluc
‑3×
flag,myr(chmp6)
‑
mcherry
‑
nluc
‑3×
flag。
52.(4)使用24孔板培养hek293细胞(bosc
‑
23；成都飞鸥尔生物科技有限公司)密度达80％时(培养方法同实施例2)，使用lipo293试剂(上海碧云天生物技术有限公司)按说明书步骤同时转染目标蛋白货物mcherry
‑
nluc
‑3×
flag及装载系统pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha，或分别单独转染cd9
‑
mcherry
‑
nluc
‑3×
flag,arrdc1
‑
mcherry
‑
nluc
‑3×
flag,myr(chmp6)
‑
mcherry
‑
nluc
‑3×
flag。
53.(5)培养24小时后，将培养液更换为新鲜的dmem完全培养基；
54.(6)继续培养24小时后，收集细胞培养基上清进行以下检测：
55.1)为探究在mcherry
‑
nluc
‑3×
flag货物转染量固定的情况下，转染不同量的pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha对包装效率的影响。将mcherry
‑
nluc
‑3×
flag的转染量设置为500ng，pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha(以gfp
‑
ha为对照)的转染量设置为0
‑
500ng，具体搭配以及转染量见图3。使用nanoglo luciferase assay system(promega，萤光素酶检测系统)根据说明书步骤对转染不同pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha量的细胞培养上清进行荧光素酶活性检测(细胞培养基上清中的nluc荧光素酶活性反映细胞释放至细胞培养上清中的货物量)。由图3可以看出，当myr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha与货物mcherry
‑
nluc
‑3×
flag以1：2的质量比转染细胞时，能获得最高的ev货物产量。但myr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha的转染量与ev货物产量不呈线性相关关系。
56.2)以货物mcherry
‑
nluc
‑3×
flag单独过表达为对照，对比货物与ev标记物cd9、arrdc1或肉豆蔻酰化肽段myr(chmp6)直接偶联，以及货物与装载系统pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha或不含myr(chmp6)的对照pgfp
‑
ha共转染后的细胞内分布情况。使用lsm 780激光扫描显微镜(zeiss)观察细胞内荧光蛋白的分布。如图4所示，发现单独过表达的mcherry
‑
nluc
‑3×
flag在细胞内弥散分布，但与ev标记物cd9、arrdc1或肉豆蔻酰化肽段myr(chmp6)直接偶联的蛋白货物在细胞内的分布会受到偶联结构的影响。而与装载系统pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha共转染的蛋白货物仍能在细胞内弥散分布，不受装载系统的影响(如图5所示),证明该装载系统不影响蛋白货物的细胞内分布，此方法获得的ev被靶细胞摄取后蛋白货物的定位不受包装系统限制。说明含有肉豆蔻酰化肽段的包装系统与蛋白货物共表达不会影响蛋白货物的细胞内分布。
57.3)为探究在pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha装载系统(以gfp
‑
ha为对照)的转染量固定时，转染不同量的mcherry
‑
nluc
‑3×
flag货物对货物装载效率的影响。将pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha或gfp
‑
ha的转染量设置为500ng，mcherry
‑
nluc
‑3×
flag或mcherry的转染量设置为0
‑
500ng，具体搭配以及转染量见图6。使用nanoglo luciferase assay system(promega，萤光素酶检测系统)根据说明书步骤检测转染不同mcherry
‑
nluc
‑3×
flag货物量时细胞培养上清的荧光素酶活性。由图6可见，pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha辅助蛋白货物装载的效果与货物转染量成正比。
58.实施例4一种促进细胞外囊泡(ev)包装目标蛋白的方法
59.通过装载系统myr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha辅助hek293细胞装载cre
‑3×
flag蛋白货物至ev，具体方法包括以下步骤：
60.(1)构建含肉豆蔻酰化肽段【myr(chmp6)】的装载系统编码质粒pmyr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha：构建方法同实施例2。
61.(2)构建目标的编码质粒pcre
‑3×
flag：
62.委托金唯智生物科技有限公司合成cre片段(序列为atcgccatcttccagcaggcgcaccattgcccctgtttcactatccaggttacggatatagttcatgacaatatttacattggtccagccaccagcttgcatgatctccggtattgaaactccagcgcgggccatatctcgcgcggctccgacacgggcactgtgtccagaccaggccaggtatctctgaccagagtcatccttagcgccgtaaatcaatcgatgagttgcttcaaaaatcccttccagggcgcgagttgatagctggctggtggcagatggcgcggcaacaccattttttctgacccggcaaaacaggtagttattcggatcatcagctacaccagagacggaaatccatcgctcgaccagtttagttacccccaggctaagtgccttctctacacctgcggtgctaaccagcgttttcgttctgccaatatggattaacattctcccaccgtcagtacgtgagatatctttaaccctgatcctggcaatttcggctatacgtaacagggtgttataagcaatccccagaaatgccagattacgtatatcctggcagcgatcgctattttccatgagtgaacgaacctggtcgaaatcagtgcgttcgaacgctagagcctgttttgcacgttcaccggcatcaacgttttcttttcggatccgccgcataaccagtgaaacagcattgctgtcacttggtcgtggcagcccggaccgacgatgaagcatgtttagctggcccaaatgttgctggatagtttttactgccagaccgcgcgcctgaagatatagaagataatcgcgaacatcttcaggttctgcgggaaaccatttccggttattcaacttgcaccatgccgcccacgaccggcaaacggacagaagcattttccaggtatgctcagaaaacgcctggcgatccctgaacatgtccatcaggttcttgcgaacctcatcactcgttgcatcgaccggtaatgcaggcaaattttggtgtacggtcagtaaattggacaccttcctcttcttcttggg，seq id no.15)，使用in
‑
fusion试剂(takara)根据说明书将上述合成片段与酶切去除mcherry
‑
nluc片段的mcherry
‑
nluc
‑3×
flag质粒配置为5μl反应体系于50℃连接反应1小时，构建得到质粒pcre
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flag，货物cre
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flag的氨基酸序列为mpkkkrkvsnlltvhqnlpalpvdatsdevrknlmdmfrdrqafsehtwkmllsvcrswaawcklnnrkwfpaepedvrdyllylqarglavktiqqhlgqlnmlhrrsglprpsdsnavslvmrrirkenvdagerakqalafertdfdqvrslmensdrcqdirnlaflgiayntllriaeiarirvkdisrtdggrmlihigrtktlvstagvekalslgvtklverwisvsgvaddpnnylfcrvrkngvaapsatsqlstralegifeathrliygakddsgqrylawsghsarvgaardmaragvsipeimqaggwtnvnivmnyirnldsetgamvrlledgdggggsasdykddddkdykddddkdykddddkgggggs。
63.(3)用150mm的大皿培养hek293细胞至密度达60
‑
80％时(培养方法同实施例2)，使用lipo293试剂(上海碧云天生物技术有限公司)按照说明书步骤转染目标蛋白货物pcre
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flag 35μg及装载系统pmyr(chmp6)
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gfp
‑
ha 35μg。
64.(4)培养24小时后，用dmem基础培养基洗涤细胞2次，并将培养液更换为25ml无血清dmem培养基。继续培养24小时后，收集细胞培养基上清，4℃、300g离心10分钟，留取上清，弃去沉淀；获得的上清再4℃、2000g离心20分钟，留取上清，弃去沉淀；获得的上清再4℃、12000g离心30分钟，留取上清，弃去沉淀；用0.22μm的滤器将获得的上清过滤，过滤后的上清移至超离管内，然后使用贝克曼落地式离心机(型号为optima xe
‑
100，转头为type 70ti)，4℃、120,000g离心70min。离心结束后，小心倒掉上清，加1
×
pbs缓冲液再重复一次超速离心以洗涤沉淀。最后将获得的ev沉淀用ripa裂解液重悬，以用于后续的检测。
65.为了检测包装系统myr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha对细胞产生的ev中标记物及货物含量的影响，通过提取cre
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flag与装载系统pmyr(chmp6)
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gfp
‑
ha或不含myr(chmp6)的对照pgfp
‑
ha共同转染后细胞产生的ev，使用蛋白免疫印迹进行进一步的鉴定：
66.将蛋白(flag、ha、alix、cd81、calnexin)通过sds
‑
page电泳分离，转至pvdf膜
(merck millipore)，然后使用抗体检测不同的蛋白；其中，检测内质网标记物calnexin(proteintech,66903
‑1‑
ig)鉴定提取的ev纯度；通过flag(proteintech,20543
‑1‑
ap)检测蛋白货物含量；通过ha(proteintech,51064
‑1‑
ap)检测包装系统的含量；通过检测ev标记物alix(proteintech,12422
‑1‑
ap)、cd81(proteintech,66866
‑1‑
ig)验证ev的数量。
67.如图7所示，蛋白免疫印迹内质网标记物calnexin(重组人钙连蛋白)小于检测阈值，证明提取的ev质粒较好。通过蛋白免疫印迹检测flag(标签蛋白)，发现货物cre
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flag与装载系统myr(chmp6)
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gfp
‑
ha共同转染后的细胞产生的ev中，含有的货物(分子量约40kda)量明显多于对照组，说明含有myr(chmp6)的装载系统myr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha能有效促进蛋白货物cre被包装至ev中；利用ha(标签蛋白)检测包装系统，发现myr(chmp6)能够促进包装系统本身进入ev；检测ev标记物alix、cd81，可见转染了myr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha的细胞产生的ev含有更多的标记物，进一步印证了myr(chmp6)
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gfp
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ha具有增加ev产量的功能。
68.实施例5一种促进细胞外囊泡(ev)包装目标蛋白的方法
69.通过装载系统myr(chmp6)
‑
gfp
‑
ha辅助hek293细胞装载cas9
‑
flag蛋白货物至ev，具体方法包括以下步骤：
70.(1)构建含肉豆蔻酰化肽段【myr(chmp6)】的装载系统编码质粒pmyr(chmp6)
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gfp
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ha：构建方法同实施例2。
71.(2)用150mm的大皿培养hek293细胞至密度达60
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80％时(培养方法同实施例2)，使用lipo293试剂(上海碧云天生物技术有限公司)按照说明书步骤转染目标蛋白货物lenticrispr v2(addgene plasmid#52961，编码货物cas9
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flag)35μg及装载系统pmyr(chmp6)
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gfp
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ha 35μg。
72.(3)ev的提取及鉴定方法同实施例3。
73.如图8所示，通过提取lenticrispr v2与装载系统pmyr(chmp6)
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gfp
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ha或不含myr(chmp6)的对照pgfp
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ha共同转染后细胞产生的ev，经蛋白免疫印迹检测发现，蛋白免疫印迹内质网标记物calnexin(钙连蛋白)小于检测阈值，证明提取的ev质量较好。通过蛋白免疫印迹检测flag(标签蛋白)，发现货物cas9
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flag与装载系统myr(chmp6)
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gfp
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ha共同转染的细胞产生的ev中，含有的货物(分子量约170kda)量明显多于对照组，说明含有myr(chmp6)的装载系统myr(chmp6)
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gfp
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ha能有效促进大分子蛋白货物cas9被包装至ev中；利用ha(标签蛋白)检测包装系统，发现myr(chmp6)能够促进包装系统本身进入ev；检测ev标记物alix、cd81，可见转染了myr(chmp6)
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gfp
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ha的细胞产生的ev含有更多的标记物，进一步印证了myr(chmp6)
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gfp
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ha具有增加ev产量的功能。
74.以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。