煮沸法提基因组DNA在浸矿菌中的应用的制作方法

煮沸法提基因组dna在浸矿菌中的应用
技术领域
1.本发明涉及浸矿菌基因提取技术领域，具体为一种煮沸法提基因组dna 在浸矿菌中的应用。


背景技术：

2.微生物冶金中涉及到的大多数浸矿微生物都是一些极端环境下生长的化能自养菌，包括细菌和古生菌，相对于其他环境下的微生物具有生长速度慢，菌体浓度普遍较低的特点。在研究这些低丰度的微生物分子生物学特征时，需收集大量样品以满足dna提取的需要，且在提取的过程中易受到浸出体系中的ph、离子浓度、矿渣等干扰，使dna提取也变得困难。
3.dna提取方法有很多，但是没有哪一种方法是被定为科学界的标准，每种方法都有它的优缺点。目前，环境样品的dna提取可分为直接提取法、间接提取法及他们的改进，直接提取法可得到高回收率的dna，但其纯度较低，会影响到后续的pcr扩增和使群落分析失真；间接提取法可得到较高纯度的dna 和保真dna的多样性，但这种方法只适用于细菌[75]。实验室常采用的细菌 dna提取方法有碱裂解法、sds裂解法、chelex
‑
100法、ctab法、液氮研磨法等，但这些常规提取细菌dna的方法往往只能针对革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌中的一类，缺乏通用性。


技术实现要素：

[0004]
(一)解决的技术问题
[0005]
针对现有技术的不足，本发明提供了一种煮沸法提基因组dna在浸矿菌中的应用，解决了现有对浸矿菌dna提取中纯度不高且缺乏通用性的问题。
[0006]
(二)技术方案
[0007]
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种煮沸法提基因组dna在浸矿菌中的应用，包括以下步骤：
[0008]
步骤一、对浸矿菌进行培养：通过利用9k培养基加入相应的培养物质，然后通过稀硫酸调节ph值，121℃灭菌20分钟，将浸矿菌放入培养基中，在合适的温度下进行培养；
[0009]
步骤二、对浸矿菌进行收集：当浸矿菌涨到对数期时，收集菌液，在 12000r/min的条件下离心3分钟，收集菌体，进行洗涤，然后用无菌水悬浮各菌液，以血球计数板计数，选取两份，每份含菌量为108个；
[0010]
步骤三、清洗：取得到的浸矿菌，加入到1，5ml的离心管中，进行离心，然后吸取上清液；
[0011]
步骤四、进行煮沸处理：向步骤三中的细胞中加入60μlte缓冲液，将细胞悬浮起来，在100℃的沸水中水浴2分钟；
[0012]
步骤五、进行提取dna：将水浴后的细胞液在13000r/min高速下离心1 分钟，提取上清液，在零下20℃保存备用；
[0013]
步骤六、进行测定：对内部浓度、pcr扩增、灵敏度进行测定。
[0014]
优选的，所述步骤1中的浸矿菌包括嗜酸氧化亚铁硫杆菌、嗜酸氧化硫硫杆菌、嗜铁钩端螺旋菌、喜温硫杆菌、嗜热硫氧化硫化杆菌、嗜热嗜酸铁质菌。
[0015]
优选的，所述9k培养基包括：(nh4)2so43g/l，kcl0.1g/l，k2hpo40.5g， mgso4·
7h2o0.5g/l，ca(no3)20.01g/l。
[0016]
优选的，所述嗜酸氧化亚铁硫杆菌、嗜酸氧化硫硫杆菌的培养条件为温度30℃、ph2.0，所述嗜铁钩端螺旋菌的培养条件为温度40℃、ph1.6，所述喜温硫杆菌的培养条件为温度40℃、ph2.0，所述嗜热硫氧化硫化杆菌的培养条件为温度40℃、ph1.5，所述嗜热嗜酸铁质菌的培养条件为温度40℃、ph1.0。
[0017]
优选的，所述步骤二中洗涤的顺序为：先用ph2.0的无菌水洗涤两次，然后再用ph7.0的无菌水洗涤两次。
[0018]
优选的，所述步骤三中离心的转速为12000r/min，离心时间为3分钟。
[0019]
优选的，所述步骤六中浓度采用微量分光光度计，pcr扩增采用eb染色、凝胶成像，灵敏度采取扩增反应制取相应反应曲线。
[0020]
优选的，所述步骤四中进行水浴的仪器为超级恒温水浴槽。
[0021]
(三)有益效果
[0022]
本发明提供了一种煮沸法提基因组dna在浸矿菌中的应用。具备以下有益效果：
[0023]
1、本发明，通过合理的提取步骤，使步骤简化，节约提取的时间，提取迅速，且成本消耗低。
[0024]
2、本发明，整个提取步骤在一个试管中完成，可以有效避免在转移的过程中被污染，提高了内部的纯度，同时减少了操作上的失误。
[0025]
3、本发明，通过煮沸水浴裂解，可以有效使内部的dna提取率较高，使得其可以确保低丰度的微生物被检测到，得到的dna较为灵敏、保真。
[0026]
4、本发明的提取方法可以极端环境中低菌体密度的浸矿菌pcr及后续分子水平的生态群落分析，可以解决浸矿菌dna因胞外多聚物的包裹难提取、研磨断裂或有机试剂污染等问题。
附图说明
[0027]
图1为本发明不同方法提取的基因组dna做模板的pcr产物凝胶电泳分析图；
[0028]
图2为本发明real
‑
time pcr标准曲线。
具体实施方式
[0029]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0030]
实施例一：
[0031]
本发明实施例提供一种煮沸法提基因组dna在浸矿菌中的应用，包括以下步骤：
[0032]
步骤一、对浸矿菌进行培养：通过利用9k培养基加入相应的培养物质，然后通过稀
硫酸调节ph值，121℃灭菌20分钟，将浸矿菌放入培养基中，在合适的温度下进行培养；
[0033]
步骤二、对浸矿菌进行收集：当浸矿菌涨到对数期时，收集菌液，在 12000r/min的条件下离心3分钟，收集菌体，进行洗涤，先用ph2.0的无菌水洗涤两次，然后再用ph7.0的无菌水洗涤两次，然后用无菌水悬浮各菌液，以血球计数板计数，选取两份，每份含菌量为108个；
[0034]
步骤三、清洗：取得到的浸矿菌，加入到1，5ml的离心管中，在离心的转速为12000r/min的条件下，离心3分钟，然后吸取上清液；
[0035]
步骤四、进行煮沸处理：向步骤三中的细胞中加入60μlte缓冲液，将细胞悬浮起来，通过超级恒温水浴槽在100℃的沸水中水浴2分钟；
[0036]
步骤五、进行提取dna：将水浴后的细胞液在13000r/min高速下离心1 分钟，提取上清液，在零下20℃保存备用。
[0037]
所述步骤1中的浸矿菌包括嗜酸氧化亚铁硫杆菌(acidithiobacillusferrooxidans)、嗜酸氧化硫硫杆菌(acidithiobacillus thiooxidans)、嗜铁钩端螺旋菌(leptospirillum ferriphilum)、喜温硫杆菌 (acidithiobacillus caldus)、嗜热硫氧化硫化杆菌(sulfobacillusthermosulfidooxidans)、嗜热嗜酸铁质菌(ferroplasma thermophilum)。
[0038]
嗜酸氧化亚铁硫杆菌、嗜酸氧化硫硫杆菌、嗜铁钩端螺旋菌、喜温硫杆菌、嗜热硫氧化硫化杆菌、嗜热嗜酸铁质菌的培养条件如下表：
[0039]
表一各种菌的培养条件
[0040][0041][0042]
对比例一：本对比例与实施例一的不同之处在于：实施例中采用煮沸裂解法，本对比例采用传统的试剂盒法进行提取dna，具体提取步骤如下：
[0043]
(1)取含108个菌的菌悬液到1.5ml的离心管中，12000r/min，离心3min，然后吸净上清，加入150μlte将细胞悬浮起来，加入10μl溶菌酶，混匀室温放置10min；
[0044]
(2)加入500μldigestionbuffer混匀后，加入3μlproteasek，混匀， 55℃保温20min；
[0045]
(3)高速室温12000r/min离心5min，将上清转移到1.5ml无菌离心管中，加入300μlsolutionb，混匀；
[0046]
(4)将样品全部转移到3s柱，柱子放入2.0mlcollectiontube，转移时用1mltip头取样品；用台式离心机，12000r/min，室温离心1min；
[0047]
(5)取下3s柱，弃去离心管中的废液；将柱子放回同一根离心管中，加入500μlwashsolution，12,000r/min室温离心1min；重复该步骤一次；
[0048]
(6)取下3s柱，弃去离心管中的全部废液.将柱子放回同一根离心管中，10000r/min，室温离心2min，以除去残留的washsolution；
[0049]
在柱子中央加入60μlte，将柱子放入新的干净1.5ml或2.0ml离心管中，室温或37～55℃放置2min；12000r/min，室温离心1min；收集管中的液体即为基因组dna，将dna转移到200μlep管中，
‑
20℃保藏备用。
[0050]
(一)进行分析浓度、纯度以及回收率
[0051]
取上述用两种方法提取得到的12种dna样品，以te为空白对照，在 nanodrop微量分光光度计上测定dna浓度，od
260
/od
280
，每浓度个样品测三次求平均值。计算回收率：回收率(ng/108个)＝浓度(ng/μl)
×
60μl。
[0052]
得到结果如下：
[0053]
表2基因组dna浓度、纯度和回收率
[0054]
[0055]
(二)pcr扩增
[0056]
上下游引物各0.5μl，2
×
pcrmastermix12.5μl，模板1μl，用无菌ddh2o 补至25μl，于微量离心管中在pcr仪上按下列参数扩增。pcr条件：95℃预处理3min，95℃30s，56℃30s，72℃30s(32个循环)，经72℃延伸10min，取10μl扩增产物2％琼脂糖凝胶电泳，以250bp
‑ⅰ
dnaladder作为分子量标准，空白对照为阴性对照，eb染色，凝胶成像系统下观察。
[0057]
pcr扩增所用的6对引物分别是针对a.ferrooxidans、a.thiooxidans 和l.ferriphilum的gyrb基因，a.caldus和s.thermosulfidooxidans的 arsb基因，f.thermophilum的16s rrna而设计的特异性引物。各种引物的长度和序列如下表所示：
[0058]
表三：引物及序列
[0059]
[0060][0061]
其电泳结果如图1所示：图中1、7所对应的菌株为氧化亚铁硫杆菌(产物长度160bp)；2、8所对应的菌株为氧化硫硫杆菌(产物长度175bp)；3、9 所对应的菌株为嗜铁钩端螺旋菌(产物长度168bp)；4、10所对应的菌株为喜温硫杆菌(产物长度150bp)；5，11所对应的菌株为嗜热硫氧化硫化杆菌 (产物长度261bp)；6，12所对应的菌株为嗜热嗜酸铁质菌(产物长度为 248bp),a为试剂盒法；b为煮沸法。
[0062]
(三)灵敏度检验
[0063]
两种方法的灵敏度测定选取浸矿过程中常用到的嗜酸氧化亚铁硫杆菌，将该菌液以1:10倍比稀释后，取6组菌液作为样本，菌量分别为1、102、103、 104、105、106个。用上述两种方法分别提取这6组样本的基因组dna，然后进行real
‑
timepcr扩增，扩增条件与上步pcr扩增条件相同。以嗜酸氧化亚铁硫杆菌纯菌的全基因组dna为模板进行pcr扩增，将产物按1:10倍稀释(拷贝数为10～109copy/ml)后作为real
‑
timepcr标准品，以此作标准曲线。反应条件：95℃预变性3min；然后95℃变性30s，特异性退火温度退火30s， 72℃延伸30s，实时荧光检测，共40个循环；熔解曲线分析：95℃1min，55℃ 10s，每个循环后温度上升0.5℃，时间10s，产物特异性分析，共80个循环。
[0064]
其结果曲线如图2所示：从图2中可知，煮沸裂解法能从较少(102个) 的菌体中提取得到dna，且不同浓度的提取拷贝数与原始菌量以大致相同的倍数(10倍)增加，变化较一致。试剂盒法要从含103个菌体的样品中才能提取到dna，但是提取的基因组dna随着菌体的10倍增加而呈2倍递增的趋势， dna拷贝数与初始菌量偏差较大，且在提取过程中，菌量越多，dna损失越严重。
[0065]
结果表明，煮沸裂解法较试剂盒法更能从浓度较低的菌液中提取到dna，比较灵敏，这对于群落分析时混合菌基因组dna的提取有较好的保真性，能较准确的分析出原来混合体系中各种菌的比例。
[0066]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。