FoSyn1基因在调控内生真菌或水稻共生体系耐镉性中的用途的制作方法

fosyn1基因在调控内生真菌或水稻共生体系耐镉性中的用途
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及fosyn1基因在调控内生真菌或水稻共生体系耐镉性中的用途。


背景技术：

2.随着我国工业化、城市化和农业集约化生产的快速发展，农田重金属污染问题日益严重，严重威胁粮食质量安全和人类健康。水稻作为我国重要的粮食作物，目前稻米镉超标的问题异常严峻，如何降低稻米中镉积累问题备受关注。随着人们环保意识的提升，绿色防控在农业防治中的地位逐年上升。因此，寻求一种环境友好、生态安全、高效经济、可推广应用的对策来解决稻米镉积累问题是本领域共识。
3.近年来，菌物学家和生态学家日益关注内生真菌在植物抗逆，尤其是在抗重金属胁迫方面的应用。1989年，buttrey研究发现内生真菌(acremonium coenophialum)能够降低高羊茅体内的铜含量(buttrey,1989)，由此内生真菌对宿主重金属耐性的作用才被发现。内生真菌作为定殖在健康植物内部的有益真菌，生物学功能十分丰富，许多真菌能够在高浓度的重金属环境下生存，得益于很多独特的耐性机制，比如胞外重金属的隔离与螯合、重金属绑定在细胞壁上、胞内隔离与络合、区隔化等(fomina et al.,2005)。内生真菌具有的金属隔离和螯合系统能够提高寄主植物对重金属的耐受性(aly et al.,2011)。因此，这种利用内生真菌为植物“提质增效”的生物技术亦可成为与传统的抗逆育种和转基因培育技术并驾齐驱的新手段，应用前景十分广阔。
4.申请号为201410068912.2的发明专利公开了一种从疣粒野生稻的根部分离出的稻镰状瓶霉，保藏号为cgmcc no.2737，该菌株可以增强植物对重金属的耐受性，达到与植物互惠共生的关系。
5.目前，针对内生真菌响应重金属胁迫的调控基因研究较少，通过探究内生真菌互作的分子机理，挖掘相关基因，进而利用分子生物学手段改造内生真菌相关性能，以提升互作对象的耐镉性，将其开发成生物防控制剂应用于农业生产，具有重要的应用价值。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种从水稻内生真菌中克隆得到的调控菌种自身以及与水稻共生体系耐镉胁迫能力的基因，为提高水稻耐受性和保证粮食安全提供了研究思路。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明从保藏号为cctcc no:m 2021505的瓶霉属内生真菌falciphora oryzae fo
‑
r20中鉴定克隆到具有耐镉胁迫特性的基因fosyn1。在重金属镉胁迫条件下，该基因的表达显著上调。
9.fosyn1基因全长1842bp，核苷酸序列如seq id no.1所示。fosyn1编码一个505aa的蛋白序列，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
10.本发明利用同源重组的技术，对内生真菌falciphora oryzae fo
‑
r20基因组中的
fosyn1基因进行敲除，获得突变体δfosyn1，相较于野生型菌株，该突变体对镉的最低抑菌浓度从20mg/l降低到了12.5mg/l。在镉胁迫条件下，相较于内生真菌野生型
‑
水稻共生体系，与突变体共生的水稻苗期株高显著降低了34.69％，上述结果表明，fosyn1基因是调控内生真菌耐镉胁迫能力以及影响宿主耐镉的关键基因。
11.因此，本发明提供了核苷酸序列如seq id no.1所示的fosyn1基因在调控瓶霉属内生真菌或瓶霉属内生真菌
‑
水稻共生体系耐镉性中的用途。该基因增强了内生真菌自身以及内生真菌
‑
水稻共生体系对重金属镉胁迫的耐受性。fosyn1基因沉默后使得瓶霉属内生真菌或瓶霉属内生真菌
‑
水稻共生体系对镉胁迫的耐受性降低。
12.进一步地，所述瓶霉属内生真菌
‑
水稻共生体系的构建方法包括：将内生真菌falciphora oryzae fo
‑
r20与水稻共培养，使其定殖于水稻根部组织中。
13.优选的，共培养前，将内生真菌falciphora oryzae fo
‑
r20菌株接种于pda培养基进行活化培养，25℃黑暗培养7天。
14.优选的，所述共培养包括将萌发后的水稻种子与内生真菌falciphora oryzae fo
‑
r20菌丝块接种于无菌的1/2ms培养基上进行培养。
15.优选的，共培养的条件为：22
‑
25℃下培养20
‑
25天，每天光照16h，暗培养8h。
16.本发明还提供了一种提高水稻对镉胁迫耐受性的方法，包括：将核苷酸序列如seq id no.1所示的fosyn1基因导入瓶霉属内生真菌获得重组菌，再将重组菌与水稻共培养，获得重组菌
‑
水稻共生体系。
17.本发明具备的有益效果：
18.本发明首次公开水稻内生真菌中调控对镉胁迫耐受性的基因fosyn1，通过对fosyn1基因的的克隆和分析，并利用同源重组的技术对该基因进行功能验证，发现敲除fosyn1基因导致菌株自身以及与之共生的水稻对于镉胁迫的耐受性显著降低，该研究结果在可持续农业中具有巨大的应用潜力，为提高水稻耐受性和保证粮食安全提供了研究思路。
附图说明
19.图1为内生真菌基因敲除突变体δfosyn1菌株的菌落形貌。
20.图2为内生真菌在含不同浓度(0～25.0mg
·
l
‑1)镉的pda培养基上的生长情况，其中wt为野生型菌株，δfosyn1为fosyn1基因敲除突变体，fosyn1c为回补菌株。
21.图3为镉胁迫下(镉浓度为5μm)与内生真菌共生的水稻的生长情况，(a)为水稻植株照片，(b)水稻株高的统计结果，(c)为水稻叶片叶绿色含量的统计结果。显著性：**表示p<0.01。
具体实施方式
22.下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
23.在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
24.本发明以课题组前期工作从云南疣粒野生稻根系中分离得出一株新的瓶霉属内生真菌falciphora oryzae fo
‑
r20为材料，敲除fosyn1基因，对阐明内生真菌fo
‑
r20
‑
水稻共生体系响应重金属镉胁迫的分子机理具有重要意义。
25.实施例1 fosyn1基因分析
26.内生真菌falciphora oryzae fo
‑
r20分离自疣粒野生稻根系，2021年5月8日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为：cctcc no:m 2021505。
27.前期研究表明，内生真菌falciphora oryzae fo
‑
r20定殖于水稻植株根部组织中，可以显著提升水稻对镉的耐受性。这种互利共生关系为研究水稻逆境响应的分子机制和提高品质提供了基础。
28.我们对falciphora oryzae fo
‑
r20在重金属镉胁迫和自然状态下的蛋白质组学进行了分析，共鉴定出88个显著差异表达蛋白。其中50个蛋白上调表达，38个蛋白下调表达。我们发现一个syntaxin1蛋白fosyn1在镉胁迫下显著上调表达。我们选择该基因作为候选基因，探索其在falciphora oryzae fo
‑
r20耐镉性方面的作用。
29.具体的，fosyn1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，该基因序列中包含了一个内含子。其编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。
30.实施例2验证fosyn1基因功能
31.供试内生真菌：falciphora oryzae fo
‑
r20；
32.供试植物：水稻oryza sativa l.，常规品种，co39。
33.1、菌株培养
34.将保存于滤纸片上的fo
‑
r20菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂(pda)固体培养基上进行活化培养，25℃，黑暗培养7d，备用。
35.pda培养基：每升含葡萄糖20g，马铃薯200g，琼脂15g。根据待配培养基的体积称取所需马铃薯，水煮后捣碎溶解过滤，加入葡萄糖和琼脂，121℃高压蒸汽灭菌20min。
36.2、基因突变体菌株δfosyn1的获得
37.设计目的基因上下游引物，扩增上下游片段和sur片段。具体引物见表1。
38.表1
[0039][0040]
通过限制性内切酶xbai和hindⅲ酶切载体pko1b。根据clonexpress ii one step clone kit(vazyme，中国)的操作说明，将回收后的片段和酶切后的pko1b载体连接在一起，构建基因敲除载体并在大肠杆菌感受态dh5α中进行转化。挑出长好的转化子放入1ml lb液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)中，37℃，200rpm震荡4
‑
6h，吸取1
‑
2μl菌液加入到验证体系中，进行pcr扩增和凝胶电泳。
[0041]
根据axyprep
‑
96(axygen，us)的操作指南进行质粒的提取。并将质粒转入农杆菌感受态agl1中，通过农杆菌介导的转化方法获得突变体δfosyn1，提取转化子的dna进行长短片段验证和拷贝数验证，将验证正确的转化子接种到pda培养基上进行后续实验，并接种到pda斜面上进行保存。突变体δfosyn1在pda培养基上的生长情况如图1所示。
[0042]
另外，将fosyn1基因回补至fosyn1敲除突变体中，得到回补菌株fosyn1c。
[0043]
结果显示，敲除突变体菌株δfosyn1和回补菌株fosyn1c在菌落形态上与野生型菌株无差异，菌丝呈匍匐状，气生菌丝不茂盛，菌丝呈黑褐色。
[0044]
3、fo
‑
r20野生型菌株、突变体菌株δfosyn1、回补菌株fosyn1c接种于含不同浓度(0～25.0mg
·
l
‑1)镉的pda培养基
[0045]
将野生型菌饼和基因敲除突变体δfosyn1的菌饼(直径为0.5cm)接种在含有不同浓度(0～25.0mg
·
l
‑1)镉的pda培养基上，25℃黑暗培养5
‑
7天，观察其生长情况。
[0046]
如图2所示，与野生型菌株相比，δfosyn1的最低抑制浓度降低，为12.5mg
·
l
‑1，表明fosyn1的缺失会导致稻镰状瓶霉对重金属镉的耐性降低。回补突变体菌株fosyn1c对镉的耐受性恢复，与野生型一致。
[0047]
4、fo
‑
r20野生型菌株、突变体菌株δfosyn1、回补菌株fosyn1c与水稻根部共培养
[0048]
将水稻种子去壳后放置在三角瓶中，用1％的naclo表面消毒15min，用无菌水清洗3次后备用。将消毒后的种子均匀平铺在1/2ms(murashige and skoog)培养基上，用parafilm封口膜封口，置于25℃植物培养箱(16h光照/8h黑暗)。3天后种子露白，将其移入含5μm镉的1/2ms培养基的组培瓶中，每瓶10颗种子。同时接入3块菌饼(直径为0.5cm)。对照
组为无菌pda琼脂块。设3个重复。
[0049]
5、统计水稻幼苗的株高和叶绿素含量
[0050]
株高测量：将水稻与野生型菌株、突变体菌株和回补菌株fosyn1c共生培养15d后，每个组培管选取三株测量株高，每次三个重复，每个实验重复三次。
[0051]
叶绿素含量测量：将水稻与野生型菌株和突变体菌株共生培养15d后，通过叶绿素含量测定仪spad
‑
502(日本)对每个组培管中的三株水稻进行叶片的叶绿素含量的测量，每次三个重复，每个实验重复三次。
[0052]
结果如图3所示，与接种野生型的水稻相比，接种δfosyn1的水稻在重金属胁迫下出现了发育不良(图3a)，株高显著降低的现象，降低了34.69％(图3b)。叶片的叶绿素含量与野生型接种的幼苗相比没有明显变化(图3c)。接种回补菌株fosyn1c的水稻恢复了对水稻耐镉性提高的特性，与野生型菌株的功能一致。这些结果表明，fosyn1的缺失会导致falciphora oryzae fo
‑
r20对镉的耐受性降低，从而影响共生体系对镉的耐受性。