用于筛选鉴定B2组腺病毒引物探针组合及其应用的制作方法

用于筛选鉴定b2组腺病毒引物探针组合及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于筛选鉴定b2组腺病毒引物探针组合及其应用。


背景技术：

2.数字pcr(digital pcr，dpcr)是继实时荧光定量pcr(real
‑
time quantitative pcr，qpcr)之后的高灵敏核酸绝对定量分析技术，通过把反应体系均分到大量独立的微反应单元中进行pcr扩增，并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸拷贝数实现定量分析。与传统pcr技术相比，数字pcr技术不依赖于标准曲线，具有更高灵敏度、准确度及高耐受性，可实现对样品的绝对定量分析。近年来，随着微流控技术日臻成熟，基于微流控技术的数字pcr技术得到了快速的发展，在基因突变检测、拷贝数变异检测、病毒微生物检测、转基因食品检测以及测序等方面均得到广泛的应用。
3.人腺病毒(human adenovirus，hadv)属于哺乳动物腺病毒属，为无包膜的双链dna病毒，可划分为a
‑
g共7个亚属，目前已发现至少90个基因型别，不同腺病毒的组织嗜性不同，腺病毒感染可导致多种临床表现和疾病，包括呼吸道疾病(如普通感冒、支气管炎、肺炎等)，消化道疾病(如腹泻、胃肠炎等)，眼结膜炎，膀胱炎和神经系统疾病等。个别病例可出现重症和危重情况，甚至死亡。尤其是免疫系统较弱或慢性呼吸系统疾病、心脏病等患者，感染腺病毒后引发严重疾病的风险较高。
4.呼吸道腺病毒传染性较强，常可引起暴发流行，主要发生在密闭、拥挤和潮湿的环境，如军营、学校、托幼机构、医院等。近年来，属于b2组的hadv
‑
11、hadv
‑
14以及hadv
‑
55在成人特别是学校和军队特殊人群中引起日益频繁的急性呼吸道传染病流行。


技术实现要素：

5.本发明提供了筛选鉴定b2组腺病毒引物探针组合及其应用，本发明的引物具有筛选功能，可以通过是否能得到扩增产物判断样品中是否有b2组腺病毒；同时本发明提供了包含所述引物的产品，以及包含所述引物的产品在筛选鉴定b2组腺病毒中的应用。
6.第一方面，本发明提供了一对筛选鉴定b2组腺病毒的引物，所述引物包括序列如seq id no:1所示的hadvh55_f4上游引物和序列如seq id no:2所示的hadvh55_r4下游引物；
7.优选地，所述引物是序列如seq id no:1所示的hadvh55_f4上游引物和序列如seq id no:2所示的hadvh55_r4下游引物组成。
8.第二方面，本发明提供了一种筛选鉴定b2组腺病毒的引物探针组合，所述引物探针组合包括序列如seq id no:1所示的hadvh55_f4上游引物、序列如seq id no:2所示的hadvh55_r4下游引物、序列如seq id no:3所示的hadvh55_p4探针；
9.优选地，所述引物探针组合是由序列如seq id no:1所示的hadvh55_f4上游引物、序列如seq id no:2所示的hadvh55_r4下游引物、序列如seq id no:3所示的hadvh55_p4探
针组合而成；
10.优选地，所述hadvh55_p4探针的两端连接有淬灭基团和荧光基团；
11.优选地，所述hadvh55_p4探针5’端连接第一荧光基团；
12.优选地，所述hadvh55_p4探针3’端连接第一淬灭基团；
13.优选地，本发明所述荧光基团(第一荧光基团、第二荧光基团、第三荧光基团)包括但不限于fam、fitc、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas red或lc red460；
14.优选地，本发明所述淬灭基团(第一淬灭基团、第二淬灭基团、第三淬灭基团)包括但不限于bbq
‑
650、bhq
‑
0、bhq
‑
1、bhq
‑
2、bhq
‑
3、dabcyl quencher deoxythymidine dt、dabcyl quencher
‑
3'、dabcyl
‑
5'、mgb 3'cdpi3、mgb
‑
5'cdpi3、tamra nhs；
15.优选地，所述第一荧光基团是fam；
16.优选地，所述第一淬灭基团是bhq1。
17.第三方面，本发明提供了一种筛选鉴定b2组腺病毒的试剂盒，所述试剂盒中包括前述一对筛选鉴定b2组腺病毒的引物或一种筛选鉴定b2组腺病毒的引物探针组合。
18.第四方面，本发明提供了一种区别b1和b2组腺病毒的试剂盒，所述试剂盒中除了包括前述一对筛选鉴定b2组腺病毒的引物或一种筛选鉴定b2组腺病毒的引物探针组合，还包括检测其他病毒的试剂。
19.优选地，所述筛选鉴定b2组腺病毒的试剂盒或区别b1和b2组腺病毒的试剂盒还包括对内参基因检测的试剂和/或仪器；
20.优选地，所述内参基因是rpp30；
21.优选地，所述对内参基因检测的试剂包括如seq id no:4所示的rpp30_f2_4上游引物和seq id no:5所示的rpp30_r_4下游引物；
22.优选地，所述对内参基因检测的试剂还包括序列如seq id no:6所示的rpp30_p3_4探针；
23.优选地，所述rpp30_p3_4探针的两端连接有淬灭基团和荧光基团；
24.优选地，所述rpp30_p3_4探针5’端连接第二荧光基团；
25.优选地，所述rpp30_p3_4探针3’端连接第二淬灭基团；
26.优选地，所述第二荧光基团与第一荧光基团相同或不相同；
27.优选地，所述第二淬灭基团与第一淬灭基团相同或不相同；
28.优选地，所述第二荧光基团与第一荧光基团不相同；
29.优选地，所述第二淬灭基团与第一淬灭基团相同；
30.优选地，所述第二荧光基团是vic；
31.优选地，所述第二淬灭基团是bhq1；
32.优选地，所述筛选鉴定b2组腺病毒的试剂盒或区别b1和b2组腺病毒的试剂盒中还包括阴性对照(水)和/或标准样品；
33.优选地，所述筛选鉴定b2组腺病毒的试剂盒或区别b1和b2组腺病毒的试剂盒中还包括pcr反应所需要的试剂和/或仪器；
34.优选地，所述筛选鉴定b2组腺病毒的试剂盒或区别b1和b2组腺病毒的试剂盒中还包括可以体现pcr扩增结果的试剂和/或仪器；
35.优选地，所述筛选鉴定b2组腺病毒的试剂盒或区别b1和b2组腺病毒的试剂盒中还
包括配制pcr反应体系的试剂和/或仪器；
36.优选地，所述配制pcr反应体系的试剂包括dna聚合酶、水、无机盐、ph调节剂。
37.优选地，所述dna聚合酶包括taq、bst、vent、phi29、pfu、tru、tth、tl1、tac、tne、tma、tih、tf1、pwo、kod、sac、sso、poc、pab、mth、pho、es4dna聚合酶、klenow。
38.优选地，所述无机盐包括碳酸氢钠、氯化钙、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、氯化钠、一水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和丙酮酸钠。
39.优选地，所述ph调节剂包括酸性ph调节剂、碱性ph调节剂。
40.优选地，所述碱性ph调节剂包括但不限于氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、三乙胺、二乙醇胺、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、tris(三羟甲基氨基甲烷)、精氨酸、赖氨酸、组氨酸和甘氨酸。
41.优选地，所述酸性ph调节剂包括但不限于选自维生素c(又称抗坏血酸)、乳酸、苹果酸、富马酸、枸橼酸、酒石酸、琥珀酸、盐酸、磷酸和醋酸。
42.优选地，所述其他病毒是b1组腺病毒。
43.优选地，检测其他病毒的试剂包括序列如seq id no:7所示的advh_f3上游引物和序列如seq id no:8所示的advh_r3下游引物。
44.优选地，检测其他病毒的试剂包括还包括序列如seq id no:9所示的advh_p3探针。
45.优选地，所述advh_p3探针的两端连接有淬灭基团和荧光基团。
46.优选地，所述advh_p3探针5’端连接第三荧光基团；
47.优选地，所述advh_p3探针3’端连接第三淬灭基团。
48.优选地，所述第三荧光基团与第一荧光基团/第二荧光基团相同或不相同。
49.优选地，所述第三淬灭基团与第一淬灭基团/第二淬灭基团相同或不相同。
50.优选地，所述第三荧光基团与第一荧光基团相同，与第二荧光基团不相同。
51.优选地，所述第三淬灭基团与第一淬灭基团和第二淬灭基团相同。
52.优选地，所述第三荧光基团是fam。
53.优选地，所述第三淬灭基团是bhq1。
54.第五方面，本发明提供了一种筛选鉴定b2组腺病毒的方法，所述方法包括使用前述引物、引物探针组合、筛选鉴定b2组腺病毒的试剂盒或区别b1和b2组腺病毒的试剂盒任一对样品进行基于pcr原理的扩增反应。
55.优选地，所述b2组腺病毒包括但不限于11型腺病毒、14型腺病毒、55型腺病毒。
56.优选地，所述方法还包括读取实验结果并判断样品中是否有b2组腺病毒的步骤。
57.第六方面，本发明提供了一种区别b1和b2组腺病毒的方法，所述方法使用前述区别b1和b2组腺病毒的试剂盒对样品进行基于pcr原理的扩增反应。
58.优选地，所述b2组腺病毒包括但不限于11型腺病毒、14型腺病毒、55型腺病毒。
59.优选地，所述b1组腺病毒包括但不限于3型腺病毒、7型腺病毒。
60.优选地，所述区别b1和b2组腺病毒的方法中，检测b1组腺病毒的试剂与检测b2组腺病毒的试剂可以在一个或多个反应体系中。
61.优选地，所述试剂包括引物、引物探针组合。
62.优选地，所述多个是两个。
63.优选地，所述区别b1和b2组腺病毒的方法中，检测b1组腺病毒的试剂浓度与检测b2组腺病毒的试剂浓度不同。
64.优选地，所述检测b1组腺病毒的试剂浓度是检测b2组腺病毒的试剂浓度的2倍、3倍、4倍或更多倍。
65.优选地，所述检测b2组腺病毒的试剂浓度是检测b1组腺病毒的试剂浓度的2倍、3倍、4倍或更多倍。
66.优选地，所述浓度是工作浓度(终浓度)。
67.优选地，所述浓度是引物浓度和/或探针浓度。
68.优选地，所述筛选鉴定b2组腺病毒或区别b1和b2组腺病毒的方法是非诊断目的的；
69.优选地，所述基于pcr原理的扩增反应是数字pcr。
70.优选地，所述数字pcr包括液滴式数字pcr和芯片式数字pcr。
71.优选地，所述数字pcr是液滴式数字pcr(ddpcr)。
72.优选地，所述筛选鉴定b2组腺病毒或区别b1和b2组腺病毒的还包括提取和处理样品的步骤。
73.优选地，所述样品是疑似含有b1组腺病毒和/或b2组腺病毒的样品。
74.优选地，所述样品包括采集自人体的样品或来自环境的样品。
75.优选地，所述采集自人体的样品包括血清、全血、粪便、咽拭子、鼻涕、唾液、汗液、毛发、口腔细胞、脓液、浓缩滤液、脑脊髓液、精液。
76.优选地，所述来自环境的样品包括细菌培养物、细菌菌落、病毒悬液、环境浓缩物、粮食、原料、水样或水浓缩物。
77.第七方面，本发明提供了前述引物、引物探针组合、筛选鉴定b2组腺病毒、区别b1和b2组腺病毒的试剂盒在筛选鉴定b2组腺病毒或区别b1和b2组腺病毒中的应用。
78.第八方面，本发明提供了前述引物、引物探针组合、筛选鉴定b2组腺病毒、区别b1和b2组腺病毒的试剂盒在制备筛选鉴定b2组腺病毒或区别b1和b2组腺病毒的产品中的应用。
附图说明
79.图1为内参基因检测第1组引物探针组合的数字pcr检测可视化结果图。
80.图2为内参基因检测第2组引物探针组合的数字pcr检测可视化结果图。
81.图3为内参基因检测第3组引物探针组合的数字pcr检测可视化结果图。
82.图4为采用b2组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物检测11型腺病毒与健康人咽拭子混合物的数字pcr检测可视化结果图。
83.图5为采用b2组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物检测14型腺病毒与健康人咽拭子混合物的数字pcr检测可视化结果图。
84.图6为采用b2组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物检测55型腺病毒与健康人咽拭子混合物的数字pcr检测可视化结果图。
85.图7为采用b2组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物检测3型腺病毒与健康人咽拭子混合物的数字pcr检测可视化结果图。
86.图8为采用b2组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物检测7型腺病毒与健康人咽拭子混合物的数字pcr检测可视化结果图。
87.图9为采用b1、b2组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物检测b1和b2型腺病毒与健康人咽拭子混合物的数字pcr检测可视化结果图。
88.图10为采用b1、b2组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物检测3型腺病毒与健康人咽拭子混合物的数字pcr检测可视化结果图。
89.图11为采用b1、b2组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物检测7型腺病毒与健康人咽拭子混合物的数字pcr检测可视化结果图。
90.图12为采用b1、b2组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物检测11型腺病毒与健康人咽拭子混合物的数字pcr检测可视化结果图。
91.图13为采用b1、b2组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物检测14型腺病毒与健康人咽拭子混合物的数字pcr检测可视化结果图。
92.图14为采用b1、b2组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物检测55型腺病毒与健康人咽拭子混合物的数字pcr检测可视化结果图。
具体实施方式
93.下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
94.实施例1、筛选位点并设计引物和探针
95.课题组筛选b2组腺病毒的特异性序列，并设计不同引物和探针，引物探针序列如表1所示：
96.表1.引物探针序列
[0097][0098]
采用11、14、55型腺病毒(本实验室保存的样品)为模版检测使用takara的one step primescript
tm rt
‑
pcr kit(perfect real time)(code no.rr064)试剂盒，反应体系共25μl，其中2x one step rt
‑
pcr buffer 12.5μl，takara ex taqhs 0.5μl，rox reference dyeⅱ0.5μl，引物探针混合液3μl，rnase free dh2o 6.5μl，dna2μl。
[0099]
反应条件为95℃10s，95℃5s，60℃34s，40个循环(收集荧光信号)。实验在abi7500仪器上进行。
[0100]
根据数据，ct值结果展示为：根据数据，ct值结果如表2所示：
[0101]
表2.以上4组引物进行qpcr时的ct值
[0102]
分型第1组第2组第3组第4组检测11型17.8925.4213.5912.83检测14型17.0615.9713.9113.69检测55型15.017.614.815.5
[0103]
根据上述结果综合考虑，选择第四组引物探针组合，继而对第4组引物与美宁康城销售的引物探针组合(厂商：南京美宁康城生物科技有限公司；产品：呼吸道腺病毒dna检测试剂盒；货号：bp0211
‑
32)进行比较：
[0104]
经qpcr检测11型腺病毒，本发明引物的ct值为12.83，美宁康城销售的腺病毒检测试剂的ct值为23.94；
[0105]
经qpcr检测14型腺病毒，本发明引物的ct值为13.69，美宁康城销售的腺病毒检测试剂的ct值为24.5；
[0106]
经pcr检测55型腺病毒，本发明引物的ct值为15.5，美宁康城销售的腺病毒检测试
剂为20.4。
[0107]
以上实验说明，本发明的引物可以快速检测到样品中是否存在b2组(11、14型和55型等)腺病毒。
[0108]
实施例2、筛选内参基因及其引物探针
[0109]
课题组采用呼吸道细胞管家基因rpp30作为内参基因，设置3组引物对照，如表3所示：
[0110]
表3.检测rpp30内参基因的引物和探针序列
[0111][0112][0113]
选择课题组保有的患者的咽拭子样本进行数字pcr检测：
[0114]
仪器：新羿td
‑
1微滴式数字pcr系统、a300 fast thermal cycler快速梯度pcr仪(longgene朗基)。
[0115]
反应体系：预混液15μl【引物探针混合液：adv7型引物500nm、探针200nm、rpp30引物600nm、探针300nm(浓度为pcr体系终浓度)】、3μl adv7 3μl rpp30、7μl h2o、2μl模板。
[0116]
扩增条件为：95℃600s，94℃30s，55℃60s，42个循环，12℃300s，变温速度设置为1.5度/秒。数字pcr检测的样本拷贝数结果如表4所示：
[0117]
表4. 3组引物探针组合进行检测的拷贝数
[0118]
样品编号123样本备注信息z2，rpp30
‑
1z2，rpp30
‑
2z2，rpp30
‑
3拷贝数(vic)357.3467.6374.6
[0119]
同时数字pcr检测可视化图如图1
‑
3所示，图中绿色(浅色，右侧)数据点为阳性点，第三组引物探针组合rpp30
‑
3的数据点最为密集、与对照的黑色数据点区分最明显，检测效果最好。
[0120]
以上数据说明，对于内参基因筛选的探针引物可以稳定的检测到内参rpp30，可以起到指示检测效果的作用，所以继续使用本实施例筛选到的引物探针组合进行下一步实验。
[0121]
实施例3、b2组腺病毒和内参基因的同时检测样品
[0122]
以实施例1筛选到的b2组腺病毒检测引物探针和实施例2筛选到的内参基因引物探针配制反应体系，反应体系与实施例1一致，对11型、14型和55型腺病毒与健康人咽拭子提取物分别混合制成模拟感染者的咽拭子待测样本进行检测。其中健康人咽拭子提取物为待测样本提供内参基因。
[0123]
图4为实施例1筛选到的b2组腺病毒检测引物探针和实施例2筛选到的内参基因引物探针检测11型腺病毒和健康人咽拭子混合物的3次重复检测结果图，其中检测11型腺病毒拷贝数为519.1、526.9和620.7，内参基因拷贝数分别为197.8、190.1和215.1。
[0124]
图5为实施例1筛选到的b2组腺病毒检测引物探针和实施例2筛选到的内参基因引物探针检测14型腺病毒和健康人咽拭子混合物的3次重复检测结果图，其中14型腺病毒检测拷贝数分别为778.2、725.4和749.9；内参检测拷贝数为236、216.7和227.9。
[0125]
图6为实施例1筛选到的b2组腺病毒检测引物探针和实施例2筛选到的内参基因引物探针检测55型腺病毒和健康人咽拭子混合物的3次重复检测结果图，其中55型腺病毒检测拷贝数为2174.3、2271.9和2314.7，内参检测拷贝数为：203.8、257.7和200.3。
[0126]
以上检测说明本发明的引物探针检测b2组(11型、14型和55型等)腺病毒具有较好的效果和重复性。
[0127]
为进一步验证本发明引物探针的检测特异性，采用对3型、7型腺病毒与健康人咽拭子提取物分别混合制成模拟感染者的咽拭子待测样本进行检测，结果如下：
[0128]
图7为实施例1筛选到的b2组腺病毒检测引物探针和实施例2筛选到的内参基因引物探针检测3型腺病毒和健康人咽拭子混合物的3次重复检测结果图，其中3型腺病毒检测拷贝数均为0，内参基因检测拷贝数为268.2、232.1和246。
[0129]
图8为实施例1筛选到的b2组腺病毒检测引物探针和实施例2筛选到的内参基因引物探针检测7型腺病毒和健康人咽拭子混合物的3次重复检测结果图，其中7型腺病毒拷贝数均为0，内参基因检测拷贝数为220.1、226.4和210.2。
[0130]
以上结果显示，本发明中的b2腺病毒检测引物探针具有良好的检测特异性。
[0131]
实施例4、b1组和b2组腺病毒的混合检测
[0132]
反应体系与实施例1一致，对55型和3型腺病毒的混合样品进行验证，此体系中包含实施例1筛选到的b2组腺病毒检测引物探针(引物终浓度250nm，探针终浓度100nm)、实施例2筛选到的内参基因引物探针(引物终浓度600nm，探针终浓度300nm)和检测b1组组腺病毒的引物探针(引物和探针的序列如seq id no:7
‑
9所示，探针的5’端连接fam、探针的3’端连接bhq1，引物终浓度500nm，探针终浓度200nm)。
[0133]
检测结果如图9所示，检测b1组组腺病毒的引物探针的浓度高，所以荧光强度也更高，说明本将b2组腺病毒检测引物探针、内参基因引物探针、b1组腺病毒检测引物探针混合在同一个体系中时，可以实现对b1和b2组腺病毒的同时检测。
[0134]
继续对3型、7型、11型、14型和55型分别与健康人咽拭子组成混合物模拟的患者咽拭子样本进行检测。结果如下：
[0135]
图10显示上述引物探针组合检测3型腺病毒与健康人咽拭子混合物的3次重复检测结果，结果显示3型腺病毒的拷贝数分别为31095.3、31515.7和34524.1，内参基因检测拷贝数分别为：221.6、229.2和247.6。同样样本采用单独b1组腺病毒引物探针组合检测的拷
贝数为33153.4，30616.5和34048.7，二者结果接近，表明混合引物和探针对3型腺病毒的检测无显著影响。
[0136]
图11显示上述引物探针组合检测7型腺病毒与健康人咽拭子混合物的3次重复检测结果，结果显示7型腺病毒的拷贝数为，3208、3248.8和3048.8，内参基因拷贝数为193.1、208.9和358.9。同样样本采用单独b1组腺病毒检测引物和探针的检测3次重复的结果为3874.8、3725.6和3410.9，二者间差异较小，提示混合引物和探针对7型腺病毒检测无显著影响。
[0137]
图12显示上述引物探针组合检测11型腺病毒与健康人咽拭子混合物的3次重复检测结果，结果显示11型腺病毒的拷贝数为531、567.6和565.8，内参基因检测数为242.6、198.1和250.6。同样样本采用单独b1组腺病毒检测引物和探针的检测3次重复的结果为519.1、526.9和620.7，二者间差异较小，提示混合引物和探针对11型腺病毒检测无显著影响。图13显示上述引物探针组合检测14型腺病毒与健康人咽拭子混合物的3次重复检测结果，结果显示14型腺病毒的拷贝数为746.1、759.9和692.9。单独采用b2组腺病毒检测引物和探针检测同一样本的结果为778.2、725.4和749.9。检测结果差异相对较小，显示混合引物探针对检测影响不大。
[0138]
图14显示上述引物探针组合检测55型腺病毒与健康人咽拭子混合物的3次重复检测结果，结果显示55型腺病毒拷贝数为2051.1、1949和1947，内参基因拷贝数为218.1、219.7和338.7。单独采用b2组腺病毒引物探针组合检测同一样本的拷贝数为2174.3、2271.9和2314.7，差异相对较小，表明混合引物探针对检测影响不大。
[0139]
实施例5、通过qpcr验证本发明设计b2组腺病毒引物探针与美宁康城销售腺病毒检测试剂盒在患者检测中的优势
[0140]
采用5例腺病毒55型感染者咽拭子样本，分别采用本发明设计b2组腺病毒引物探针以及美宁康城销售腺病毒检测试剂盒进行qpcr检测，结果如下表5所示：
[0141]
表5.样品名称和检测结果
[0142][0143]
在检测阳性的sample6和sample9样本中，本发明中的试剂的ct值明显低于美宁康城销售的腺病毒检测试剂。
[0144]
实施例6、最低检测限的确定
[0145]
实验采用b2组引物探针 b1组引物探针 内参基因引物探针组合检测60例健康人
的咽拭子样本，结果如表6。经计算最低检测限位5copies/test(计算方法如表7，参考文献(milbury et al.2014))。
[0146]
b2组引物探针/b1组引物探针在单独使用时的最低检测限不会高于混合以后的最低检测限。因此b1组 内参基因引物探针组合和b2组 内参基因引物探针组合分别的最低检测限为5copies/test，或者低于5copies/test。
[0147]
b2组引物探针、b1组引物探针在检测上具有良好的特异性，并不会交叉。
[0148]
表6. 60例健康人的数字pcr检测数据
[0149]
[0150][0151]
表7.最低检测限计算方法
[0152]