一种牡丹中参与花青苷转运和积累的gst基因及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种牡丹中参与花青苷转运和积累的gst(glutathione s
‑
transferase)基因及其应用。
背景技术：
2.植物花色是观赏植物重要的观赏性状之一，花色改良一直是园艺工作者重要的育种目标。牡丹(paeonia suffruticosa)是我国传统名花的精品，素有“花中之王”的美誉，经长期栽培选育，已形成多种色系，在国内外市场都备受喜爱。
3.但是，长期以来牡丹的育种模式主要以品种间杂交为主，在育种过程中随机性和盲目性较高，通常要耗费大量的时间和精力经过多代的选育才能得到理想中的品种。近年来，随着科学技术的飞速发展，利用转基因技术的靶向分子育种技术在农作物和园艺花卉得到了广泛的运用。所述分子育种主要通过转基因技术将控制相关表型性状的基因在目标植物中过表达或敲除，从而使植物获得或丢失相应的表型，最终得到理想的品种。因此，筛选控制相关表型性状的关键基因是分子育种的前提基础和重要资源。
4.花青苷(anthocyanin)作为类黄酮中最重要的显色物质，是花青素经羟基化、甲氧基化、糖基化和酰基化等一系列修饰后形成的稳定化合物，可以控制花朵红色、粉色、紫罗兰及蓝色等颜色的变化，使植物呈现五彩缤纷的色彩。目前，花青苷的合成途径已被研究的较为清晰，具有高度保守性，其调控机制也在许多模式和非模式植物中得到了报道。但花色的最终呈现还需花青苷到液泡的转运和积累，目前通过基因敲除和互补试验证明，gsts家族的一些成员参与了花青苷的运输，是将花青苷从内质网运至液泡的高效转运者。玉米bronze2(bz2)基因是最早发现的与花青素转运有关的gst家族成员，在bz2缺失突变体中检测到花青素累积在细胞质中，而没有被转运至液泡；拟南芥atgstf12(attt19)被证明参与花青素/原花青素的转运和积累；草莓中的rap编码gst转运蛋白，其瞬时敲除会导致果实着色减少；苹果mdgstf6基因被证明参与花青苷转运，过表达于拟南芥tt19突变体中能够恢复其花青苷缺失的表型，等等。
5.尽管gst已在多种植物中被证实参与花青苷的转运和积累，但研究多集中在模式植物或农作物上，对于观赏花卉在该基因家族的研究却相对匮乏，尤其是在牡丹中更是鲜有报道。
6.因此，补充gst基因在牡丹中促进花青苷转运和积累所发挥的作用，是未来牡丹花色分子改良育种的重要基础和前提。
技术实现要素：
7.本发明的目的是提供一个牡丹中参与花青苷转运和积累的gst基因及其应用，来完善牡丹中控制花朵红色性状通路的完整性。
8.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
9.本发明的牡丹中参与花青苷转运和积累的gst基因，从牡丹(p.suffruticosa)中
分离和鉴定出一个参与花青苷转运和积累的gst基因，该基因的cds序列为：
10.atggtagttaaggtgtatggctcagctaaagcggcttgtccacaaagagtgatggtttgccttctggaaaaggaggtggaatttgaaattatacatgttgatcttgaatctggagagcacaaaaagccagatttccttgctcggcagccgtttgggcaagttccagccatcgaggatggtgacttgaaactttttgaatccagggcaatcataagatactatgcagccaagtttgataaccgcggttcaaacctgttgggaaccactttggaagagagagctttgatggatcaatggctagaagttgaagcccacaatttcaatgatttggtttacactattgtgcttcagatcgtaattctcccccgtatgggacaaggtactgacttggcattagtccgcacctgtgaagaaaagcttgagaaagtgcttgatgtgtacgagcaaaggttgtcaaagagcagctacctggccggagacgatttcacactcgctgatctcagtcatcttcctggtctcagatacctcataaatgaagctggaaaaggatacctggtgaccgtgaggaagaatgtgaatgcatggtgggagaatatatcaaatcgtccttcttggaagaaattaatgaatcttgttaattaa。
11.上述的牡丹中参与花青苷转运和积累的gst基因的应用，通过转基因技术靶向调控，进行转基因育种。
12.与现有技术相比，本发明的牡丹中参与花青苷转运和积累的gst基因，其功能通过异源转化至拟南芥tt19突变体和通过在牡丹花瓣中病毒诱导的基因沉默(vigs)技术均得到了验证，其能够参与花青苷的转运和积累。在拟南芥中，过表达于拟南芥tt19突变体中能够恢复其花青苷缺失的表型；牡丹中，通过靶向沉默目标基因，可以明显减少花青苷在牡丹花瓣中的积累，使粉色花瓣明显变浅。因此，这一个gst基因能够丰富和完善牡丹花朵红色性状的转基因材料库，为未来培育牡丹红色性状花朵的分子育种提供了有力支持。
13.序列表
14.gst基因—psgstf3的cds序列。
具体实施方式
15.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
16.本发明提供的技术方案具体是从牡丹(p.suffruticosa)中分离和鉴定出一个参与花青苷转运和积累的gst基因，命名为psgstf3。对于被证实具有花青苷转运和积累功能的gsts基因在不同植物中虽然发挥着相似的功能，但其cds序列并不相同。因此，在牡丹中分离和鉴定出参与花青苷转运和积累的gst，便能够丰富牡丹转基因分子育种的基因材料库，为未来培育红色性状花朵的牡丹提供支持。
17.本发明中分离和鉴定出的psgstf3基因的cds序列为：
18.atggtagttaaggtgtatggctcagctaaagcggcttgtccacaaagagtgatggtttgccttctggaaaaggaggtggaatttgaaattatacatgttgatcttgaatctggagagcacaaaaagccagatttccttgctcggcagccgtttgggcaagttccagccatcgaggatggtgacttgaaactttttgaatccagggcaatcataagatactatgcagccaagtttgataaccgcggttcaaacctgttgggaaccactttggaagagagagctttgatggatcaatggctagaagttgaagcccacaatttcaatgatttggtttacactattgtgcttcagatcgtaattctcccccgtatgggacaaggtactgacttggcattagtccgcacctgtgaagaaaagcttgagaaagtgcttgatgtgtacgagcaaaggttgtcaaagagcagctacctggccggagacgatttcacactcgctgatctcagtcatcttcctggtctcagatacctcataaatgaagctggaaaaggatacctggtgaccgtgaggaagaatgtgaatgcatggtgggagaatatatca
aatcgtccttcttggaagaaattaatgaatcttgttaattaa。
19.上述的牡丹中参与花青苷转运和积累的gst基因的应用，通过转基因技术靶向调控，进行转基因育种。
20.用于拟南芥中，过表达于拟南芥tt19突变体中能够恢复其花青苷缺失的表型。
21.用于牡丹中，通过靶向沉默目标基因，明显减少花青苷在牡丹花瓣中的积累，使粉色花瓣明显变浅。
22.下面将分别以在拟南芥tt19突变体中过表达psgstf3基因和在牡丹花瓣中沉默psgstf3基因为例，对利用本发明提供gst基因进行转基因育种的实现过程进行描述，进而验证相应的转基因育种过程的可行性。
23.本发明中所述的gst基因参与花青苷转运和积累的功能分别在拟南芥和牡丹中被证实的具体过程如下：
24.一、psgstf3基因异源转化拟南芥tt19突变体
25.1)从牡丹花瓣中提取总rna，反转录为cdna。然后利用psgstf3的特异性引物克隆得到其完整的cds序列，并测序，以确保序列的完整性和准确性；
26.2)通过无缝克隆的方式将psgstf3完整的cds序列构建到植物表达载体phb的两个酶切位点(hind3和xbai)之间，测序；
27.3)将构建好的表达载体转入到农杆菌gv3101中,涂布于含卡那霉素50μg/ml的lb平板上，倒置放于28℃培养箱培养2
‑
3天。随机挑选单菌落，做菌落pcr，鉴定正确的农杆菌单克隆做标记待用；
28.4)挑取正确的农杆菌单克隆接种到1.5ml含相应抗生素的lb液体培养基中，28℃，200rpm，振荡培养24小时；
29.5)按1％比例将过小摇的农杆菌培养物接种加入100ml含有抗生素的lb液体培养基中，28℃，200rpm，振荡培养到od600＝1.0左右，4000rpm，离心15min，收集菌体；
30.6)将菌体用转化buffer吹打均匀，重悬至od600＝1.0左右；
31.7)将所有的花序倒置入事先用转化buffer悬浮好的菌液中约30秒钟，7天后按上述方法重复转化一次；
32.8)2
‑
3周后，尽量少浇营养液，加速衰老，成熟种子收在纸袋中，干燥器中7天，备用；
33.9)把消毒后的种子点种到1/2ms培养基(含筛选抗生素：30μg/ml hyg)平板上，封口；
34.10)4℃冰箱内春化48h，放入到人工气候室中开始萌发生长。植物生长环境为：相对湿度60％，温度23℃，光照周期16h光照，8h黑暗；光照强度为80
‑
200umol/m2/s；
35.11)8
‑
15天后观察，区分出阳性苗移栽到种植土中，随时观察表型，并拍照。
36.二、利用病毒诱导的基因沉默(vigs)技术在牡丹花瓣中沉默psgstf3基因
37.1)从牡丹花瓣中提取总rna，反转录为cdna，选定psgstf3基因272bp的非保守结构域碱基序列设计上下游特异性引物，克隆目标序列，测序以确保序列的准确性；
38.2)通过无缝克隆的方式将psgstf3基因的272bp碱基序列构建到植物表达载体ptrv2
‑
gfp的两个酶切位点(bamhi和psti)之间，测序；
39.3)将构建好的表达载体转入到农杆菌gv3101中,涂布于lb(卡那50μg/ml，利福平
25μg/ml)平板上，倒置放于28℃培养箱培养2
‑
3天。随机挑选单菌落，做菌落pcr，鉴定正确的农杆菌单克隆做标记待用；
40.4)挑取正确的农杆菌单克隆接种到5ml含相应抗生素的lb液体培养基中，28℃，200rpm，震荡16
‑
20h，菌液至浑独而不泛白；
41.5)按1％比例将小摇的农杆菌培养物接种加入100ml lb液体培养基(卡那100μg/ml，利福平25μg/ml，mes 10mm，as 200um)中，28℃，200rpm过夜摇，在菌液浓度达到od600＝1.8时取出，5000rpm，离心10min，收集菌体；
42.6)用农杆菌侵染缓冲液(mes 10mm；as 100um；mgc12 10mm；无菌水作为溶剂)悬浮菌体，调节od600＝1.0左右；将ptrv1分别与含有ptrv2
‑
gfp(对照)、ptrv2
‑
gfp
‑
psgstf3的农杆菌侵染缓冲液等体积混合，分别在两种混合好的侵染缓冲液中加入终浓度为0.01％的silwet l
‑
77，黑暗条件下室温24℃静置4h，备用；
43.7)侵染具体操作为：试验材料为牡丹品种
‘
赵粉’，挑选未开放且紧实的花苞，使用注射器，在花苞内、花萼及花茎中注射菌液，每个花苞的菌液用量在3ml左右，挂牌详细标明处理组别等重要信息；
44.8)注射完成后，用黑色塑料袋包裹好，进行遮光处理，24h后取下遮光袋，正常环境生长；
45.9)经过7天左右，表型便可出现，进行拍照及gfp荧光检测。
46.经过上述实现方案可以看出，本发明可以丰富牡丹花朵中促进花青苷转运和积累的转基因材料库，利用本发明通过转基因技术可靶向调控牡丹花朵的红色性状。
47.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种牡丹中参与花青苷转运和积累的gst(glutathione s
‑
transferase)基因及其应用。
背景技术：
2.植物花色是观赏植物重要的观赏性状之一，花色改良一直是园艺工作者重要的育种目标。牡丹(paeonia suffruticosa)是我国传统名花的精品，素有“花中之王”的美誉，经长期栽培选育，已形成多种色系，在国内外市场都备受喜爱。
3.但是，长期以来牡丹的育种模式主要以品种间杂交为主，在育种过程中随机性和盲目性较高，通常要耗费大量的时间和精力经过多代的选育才能得到理想中的品种。近年来，随着科学技术的飞速发展，利用转基因技术的靶向分子育种技术在农作物和园艺花卉得到了广泛的运用。所述分子育种主要通过转基因技术将控制相关表型性状的基因在目标植物中过表达或敲除，从而使植物获得或丢失相应的表型，最终得到理想的品种。因此，筛选控制相关表型性状的关键基因是分子育种的前提基础和重要资源。
4.花青苷(anthocyanin)作为类黄酮中最重要的显色物质，是花青素经羟基化、甲氧基化、糖基化和酰基化等一系列修饰后形成的稳定化合物，可以控制花朵红色、粉色、紫罗兰及蓝色等颜色的变化，使植物呈现五彩缤纷的色彩。目前，花青苷的合成途径已被研究的较为清晰，具有高度保守性，其调控机制也在许多模式和非模式植物中得到了报道。但花色的最终呈现还需花青苷到液泡的转运和积累，目前通过基因敲除和互补试验证明，gsts家族的一些成员参与了花青苷的运输，是将花青苷从内质网运至液泡的高效转运者。玉米bronze2(bz2)基因是最早发现的与花青素转运有关的gst家族成员，在bz2缺失突变体中检测到花青素累积在细胞质中，而没有被转运至液泡；拟南芥atgstf12(attt19)被证明参与花青素/原花青素的转运和积累；草莓中的rap编码gst转运蛋白，其瞬时敲除会导致果实着色减少；苹果mdgstf6基因被证明参与花青苷转运，过表达于拟南芥tt19突变体中能够恢复其花青苷缺失的表型，等等。
5.尽管gst已在多种植物中被证实参与花青苷的转运和积累，但研究多集中在模式植物或农作物上，对于观赏花卉在该基因家族的研究却相对匮乏，尤其是在牡丹中更是鲜有报道。
6.因此，补充gst基因在牡丹中促进花青苷转运和积累所发挥的作用，是未来牡丹花色分子改良育种的重要基础和前提。
技术实现要素：
7.本发明的目的是提供一个牡丹中参与花青苷转运和积累的gst基因及其应用，来完善牡丹中控制花朵红色性状通路的完整性。
8.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
9.本发明的牡丹中参与花青苷转运和积累的gst基因，从牡丹(p.suffruticosa)中
分离和鉴定出一个参与花青苷转运和积累的gst基因，该基因的cds序列为：
10.atggtagttaaggtgtatggctcagctaaagcggcttgtccacaaagagtgatggtttgccttctggaaaaggaggtggaatttgaaattatacatgttgatcttgaatctggagagcacaaaaagccagatttccttgctcggcagccgtttgggcaagttccagccatcgaggatggtgacttgaaactttttgaatccagggcaatcataagatactatgcagccaagtttgataaccgcggttcaaacctgttgggaaccactttggaagagagagctttgatggatcaatggctagaagttgaagcccacaatttcaatgatttggtttacactattgtgcttcagatcgtaattctcccccgtatgggacaaggtactgacttggcattagtccgcacctgtgaagaaaagcttgagaaagtgcttgatgtgtacgagcaaaggttgtcaaagagcagctacctggccggagacgatttcacactcgctgatctcagtcatcttcctggtctcagatacctcataaatgaagctggaaaaggatacctggtgaccgtgaggaagaatgtgaatgcatggtgggagaatatatcaaatcgtccttcttggaagaaattaatgaatcttgttaattaa。
11.上述的牡丹中参与花青苷转运和积累的gst基因的应用，通过转基因技术靶向调控，进行转基因育种。
12.与现有技术相比，本发明的牡丹中参与花青苷转运和积累的gst基因，其功能通过异源转化至拟南芥tt19突变体和通过在牡丹花瓣中病毒诱导的基因沉默(vigs)技术均得到了验证，其能够参与花青苷的转运和积累。在拟南芥中，过表达于拟南芥tt19突变体中能够恢复其花青苷缺失的表型；牡丹中，通过靶向沉默目标基因，可以明显减少花青苷在牡丹花瓣中的积累，使粉色花瓣明显变浅。因此，这一个gst基因能够丰富和完善牡丹花朵红色性状的转基因材料库，为未来培育牡丹红色性状花朵的分子育种提供了有力支持。
13.序列表
14.gst基因—psgstf3的cds序列。
具体实施方式
15.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
16.本发明提供的技术方案具体是从牡丹(p.suffruticosa)中分离和鉴定出一个参与花青苷转运和积累的gst基因，命名为psgstf3。对于被证实具有花青苷转运和积累功能的gsts基因在不同植物中虽然发挥着相似的功能，但其cds序列并不相同。因此，在牡丹中分离和鉴定出参与花青苷转运和积累的gst，便能够丰富牡丹转基因分子育种的基因材料库，为未来培育红色性状花朵的牡丹提供支持。
17.本发明中分离和鉴定出的psgstf3基因的cds序列为：
18.atggtagttaaggtgtatggctcagctaaagcggcttgtccacaaagagtgatggtttgccttctggaaaaggaggtggaatttgaaattatacatgttgatcttgaatctggagagcacaaaaagccagatttccttgctcggcagccgtttgggcaagttccagccatcgaggatggtgacttgaaactttttgaatccagggcaatcataagatactatgcagccaagtttgataaccgcggttcaaacctgttgggaaccactttggaagagagagctttgatggatcaatggctagaagttgaagcccacaatttcaatgatttggtttacactattgtgcttcagatcgtaattctcccccgtatgggacaaggtactgacttggcattagtccgcacctgtgaagaaaagcttgagaaagtgcttgatgtgtacgagcaaaggttgtcaaagagcagctacctggccggagacgatttcacactcgctgatctcagtcatcttcctggtctcagatacctcataaatgaagctggaaaaggatacctggtgaccgtgaggaagaatgtgaatgcatggtgggagaatatatca
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19.上述的牡丹中参与花青苷转运和积累的gst基因的应用，通过转基因技术靶向调控，进行转基因育种。
20.用于拟南芥中，过表达于拟南芥tt19突变体中能够恢复其花青苷缺失的表型。
21.用于牡丹中，通过靶向沉默目标基因，明显减少花青苷在牡丹花瓣中的积累，使粉色花瓣明显变浅。
22.下面将分别以在拟南芥tt19突变体中过表达psgstf3基因和在牡丹花瓣中沉默psgstf3基因为例，对利用本发明提供gst基因进行转基因育种的实现过程进行描述，进而验证相应的转基因育种过程的可行性。
23.本发明中所述的gst基因参与花青苷转运和积累的功能分别在拟南芥和牡丹中被证实的具体过程如下：
24.一、psgstf3基因异源转化拟南芥tt19突变体
25.1)从牡丹花瓣中提取总rna，反转录为cdna。然后利用psgstf3的特异性引物克隆得到其完整的cds序列，并测序，以确保序列的完整性和准确性；
26.2)通过无缝克隆的方式将psgstf3完整的cds序列构建到植物表达载体phb的两个酶切位点(hind3和xbai)之间，测序；
27.3)将构建好的表达载体转入到农杆菌gv3101中,涂布于含卡那霉素50μg/ml的lb平板上，倒置放于28℃培养箱培养2
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3天。随机挑选单菌落，做菌落pcr，鉴定正确的农杆菌单克隆做标记待用；
28.4)挑取正确的农杆菌单克隆接种到1.5ml含相应抗生素的lb液体培养基中，28℃，200rpm，振荡培养24小时；
29.5)按1％比例将过小摇的农杆菌培养物接种加入100ml含有抗生素的lb液体培养基中，28℃，200rpm，振荡培养到od600＝1.0左右，4000rpm，离心15min，收集菌体；
30.6)将菌体用转化buffer吹打均匀，重悬至od600＝1.0左右；
31.7)将所有的花序倒置入事先用转化buffer悬浮好的菌液中约30秒钟，7天后按上述方法重复转化一次；
32.8)2
‑
3周后，尽量少浇营养液，加速衰老，成熟种子收在纸袋中，干燥器中7天，备用；
33.9)把消毒后的种子点种到1/2ms培养基(含筛选抗生素：30μg/ml hyg)平板上，封口；
34.10)4℃冰箱内春化48h，放入到人工气候室中开始萌发生长。植物生长环境为：相对湿度60％，温度23℃，光照周期16h光照，8h黑暗；光照强度为80
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200umol/m2/s；
35.11)8
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15天后观察，区分出阳性苗移栽到种植土中，随时观察表型，并拍照。
36.二、利用病毒诱导的基因沉默(vigs)技术在牡丹花瓣中沉默psgstf3基因
37.1)从牡丹花瓣中提取总rna，反转录为cdna，选定psgstf3基因272bp的非保守结构域碱基序列设计上下游特异性引物，克隆目标序列，测序以确保序列的准确性；
38.2)通过无缝克隆的方式将psgstf3基因的272bp碱基序列构建到植物表达载体ptrv2
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gfp的两个酶切位点(bamhi和psti)之间，测序；
39.3)将构建好的表达载体转入到农杆菌gv3101中,涂布于lb(卡那50μg/ml，利福平
25μg/ml)平板上，倒置放于28℃培养箱培养2
‑
3天。随机挑选单菌落，做菌落pcr，鉴定正确的农杆菌单克隆做标记待用；
40.4)挑取正确的农杆菌单克隆接种到5ml含相应抗生素的lb液体培养基中，28℃，200rpm，震荡16
‑
20h，菌液至浑独而不泛白；
41.5)按1％比例将小摇的农杆菌培养物接种加入100ml lb液体培养基(卡那100μg/ml，利福平25μg/ml，mes 10mm，as 200um)中，28℃，200rpm过夜摇，在菌液浓度达到od600＝1.8时取出，5000rpm，离心10min，收集菌体；
42.6)用农杆菌侵染缓冲液(mes 10mm；as 100um；mgc12 10mm；无菌水作为溶剂)悬浮菌体，调节od600＝1.0左右；将ptrv1分别与含有ptrv2
‑
gfp(对照)、ptrv2
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gfp
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psgstf3的农杆菌侵染缓冲液等体积混合，分别在两种混合好的侵染缓冲液中加入终浓度为0.01％的silwet l
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77，黑暗条件下室温24℃静置4h，备用；
43.7)侵染具体操作为：试验材料为牡丹品种
‘
赵粉’，挑选未开放且紧实的花苞，使用注射器，在花苞内、花萼及花茎中注射菌液，每个花苞的菌液用量在3ml左右，挂牌详细标明处理组别等重要信息；
44.8)注射完成后，用黑色塑料袋包裹好，进行遮光处理，24h后取下遮光袋，正常环境生长；
45.9)经过7天左右，表型便可出现，进行拍照及gfp荧光检测。
46.经过上述实现方案可以看出，本发明可以丰富牡丹花朵中促进花青苷转运和积累的转基因材料库，利用本发明通过转基因技术可靶向调控牡丹花朵的红色性状。
47.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
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