专利名称：Bt发酵中增效物质的离交回收方法
技术领域：
本发明涉及回收的增效物质技术领域，更具体涉及一种Bt发酵中增效物质 的离交回收方法，离子交换法工艺回收上清液中的增效物质，可以与高倍离心菌 浆混合加助剂生产出16000 IU/u 1的Bt SC液态制剂，可以生产出新型的Bt制 剂，丰富剂型品种，满足特殊市场需求。解吸液喷雾干燥制得上清粉与原粉混合 可以生产出高品质的Bt原粉，提高效价回收率，增加经济效益。
背景技术：
随着人们环保意识的提高，生态环境越来越恶劣的压力，人们对农药的残留 要求也越来越高，对绿色食品的渴望和需求也越来越强烈，生物农药作为一种环 保、无残留的农药在近几十来深受各国的关注，也在不断深入的大力发展中。Bt 商品化制剂是目前世界上使用最广泛的生物农药之一，对其进行了很深入的研 究、应用、推广。近年研究发现某些苏云金芽孢杆菌(Bt)或蜡质芽孢杆菌发酵上 清液中含有某种自身无杀虫活性，但对Bt的晶体和芽孢表现较强增效作用的活 性成分。如苏云金芽孢杆菌HD-1菌株产生一种非蛋白质的小分子可溶性增效因 子，当与晶体混用时有增效作用，KB500菌株(Bt./"/r"sAi.)能产生更多的这 种增效因子，对斜蚊夜蛾(&ofi^^era 的增效作用可达32倍
(Asano, S,, , et al. ， 1994; Asano, S, ， ， et al., 1995)。苏云金芽孢杆菌GC-91 菌株发酵上清液有增效作用，上清液中含有某种增效物质，离心丢弃上清液是导 致毒力严重损失的根本原因，上清液对粉剂的最高增效倍数可达23.5倍，且上 清液对不同菌粉的增效力不同，对GC-91菌粉增效极为显著，而对HD-1菌粉较 为缓慢(李青等，1997)。苏云金芽孢杆菌79007发酵上清液对苏云金芽孢杆菌 7216-R和HD-1-580有明显的增效作用，增加30%上清液,7216-R和HD-1-580的 对棉铃虫效价分别提高46%和50%%,增加50%,提高幅度更大，效价增加1倍以上 (吴继星等，1997)。对苏云金芽孢杆菌Bta的发酵液进行生物测定，发现发酵原液(Bta离心沉淀物 上清液)对斜纹夜蛾三龄幼虫的LC5(1比去掉上清液的沉 淀物降低了 37.2%，说明发酵上清液能够显著提高发酵沉淀物对斜纹夜蛾的毒力 (余健秀等，2002)。
'蜡状芽孢杆菌(fecj7J^cere^)菌株UW85是最近发现的具有生物防治病 毒潜能的菌株。1989年美国威斯康辛大学的Handelsman从苜蓿植物的根部首次 分离到蜡状芽孢杆菌菌株UW85,通过研究表明菌株UW85的培养液可以抑制苜蓿 猝到病的发生，其抗病机理是因为该菌株在形成芽孢的同时还产生两类抗生素， 通过离子交换树脂和高压纸相电泳对这两种抗生素进行纯化，一类抗生素命名为 ZwittermicinA，它是一种分子量为396Da的氨基多元醇化合物(aminopolyol)， 另一类抗生素命名为Kanosamine，是一种3_氨基-3_脱氧D-葡萄糖的化合物 (Handlsman, ， et al. ， 1990; Minler, et al.， 1995; Silo-suh et al., 1994)。
首次发现Zwittermicin A对苏云金芽孢杆菌具有增效作用，但又不同于 一般的化学增效剂，ZwittermicinA是一种杀虫活性极低的物质，其半致死浓 度LCa,为3000Pg/g，但是，他能使微生物杀虫活性至少增加50%,而其它已知 能增效的杀虫活性物质，如苏云金素、胰蛋白酶抑制剂等本身都具有杀虫活性。 ZwitterraiciriA的增效作用涉及三个有关方面(1)增加与杀虫有关的芽孢杆 菌的杀虫活性；(2)增强化学杀虫剂的杀虫活性；(3)增强具有杀虫性能病毒的 杀虫性(Manker，et al. ， 1994)。例如，Zwittermicin A能使苏云金芽孢杆菌 杀虫晶体蛋白(ICPs)的杀虫活性增加1.5-1000倍，这些ICPs包括Cryl(含 CryIA、 CryIB、 CryIC) 、 CryII、 CryIII、 CryIV、 CryV和CryVI蛋白，且对原 毒素和活化毒素都有增效作用。Zwittermicin A —方面可使与杀虫有关的芽孢 杆菌的杀虫活性增加，另一方面也降低害虫对芽孢杆菌的抗药性,害虫对生物农 药抗药性的增加与实用生物农药的剂量成正相关， 一旦加入Zwittermicin A , 就可降低生物农药的用量，即降低了害虫对生物农药的选择压力。例如在 BI0BIT HPWP制剂中加入4. 0g Zwittermicin A /BIU可以使来自美国加州的田 间抗性小菜蛾的LU抗性比率下降10倍。
Zwittermicin A与苏云金芽孢杆菌制剂组合对鳞翅目，双翅目，鞘翅目，蜱 螨目等中的一些种类具有增效作用，但对不同的昆虫,其增效作用不同，即使在同 一目中的昆虫也是如此。例如对甜菜夜蛾的增效作用最高，对粉纹夜蛾次之。(Chen ， et al. ， 1994)。 Zwittermicin A 对鳞翅目夜蛾科的甜菜夜蛾增效作 用明显，增效倍数可达7. 33倍,对鞘翅目的柳蓝叶甲和菜蛾科的小菜蛾增效作用 不明显，增效倍数仅为0.02, 0.25倍；对双翅目的致倦库蛟有拮抗作用(李晗 等，1998)。
Zwittermicin A的增效作用方式是增强晶体毒素对昆虫中肠细胞结合位点 的亲和性。从而提高毒效，其本身并不被昆虫细胞吸收(Zimanyi et al. ， 1995)。
苏云金芽孢杆菌增效物质可由苏云金芽孢杆菌自身产生，如苏云金芽孢杆菌 HD-l、 GC-91、 79007、 MP-342 、 Bta和KN-ll等，(Asano, S. , ， et al. ， 1994; Asano，S., ， et al. ， 1995;李青等，1997;吴继星等，1997;杨自文等，2001; 余健秀等，2002;陈振民等，2004);还可由蜡状芽孢杆菌(fe"7A/s carew) 菌株UW85和12 - 14产生(Manker， et al., 1994;陈在佴等，2003)。
研究发现国际上大多数苏云金芽孢杆菌产品均不同程度地含有 Zwittermicin A (Wu， D， et al.,1995)。 Zwittermicin A最初发现由蜡状芽 孢杆菌UW85产生，后又发现枯草芽孢杆菌(泡ci7Aw^6ti"、)、苏云金芽孢 杆菌的某些亚种也产生Zwittermicin A ，它主要存在这些芽孢杆菌发酵上清液 中(Manker et al. ， 1994;李晗1998)。
由于Zwittermicin A增效作用明显，离心丢弃上清液导致毒力严重损失， 而且上清液COD含量很高，污水净化处理成本也很高，Zwittermicin A回收工 艺得到研究。杨自文研究了苏云金芽胞杆菌MP-342菌株发酵上清夜中增效物质 的减压浓縮-喷雾干燥回收工艺，回收原粉制备工艺中的离心废液，获得了含固 量为45%的上清浓縮液和上清粉；不同减压浓縮条件及喷雾干燥对上清浓縮液和 上清粉的增效作用无显著影响(杨自文等，2001)。陈振民应用膜过滤技术对苏 云金芽胞杆菌KN-11增效物质回收工艺进行了改进，发现纳滤膜(200D)能完全 截留KN-11增效物质，通过3种膜过滤(0. 1 u m微滤膜、10, 000D超滤膜和200D 纳滤膜)的总回收率达到85.5%;与常规回收工艺比较，膜过滤回收工艺能显著 提高浓縮液和粉的增效物质含量(分别为99. 35U/ml， 457.70 U/g)，同时除去 了大部分的糖、氮等可溶性杂质，使浓缩液和粉保持了较好的理化性状。(陈振 民等，2005)。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种Bt发酵中增效物质的离交回收方法，方法 简便，操作易行，提高了产品效价收率，降低了生产成本，提升了产品质量和市 场竟争力。
为了实现上述的目的，本发明的主要技术方案是
Bt发酵液经蝶片式工业离心机分离，收集全部上清液加入一定量蛋白质絮
凝剂和金属离子絮凝剂，调节pH值进行反应，然后再经板框过滤除去其中的固 形物；清液通过离子交换柱进行吸附，吸附完成后经过解析，收集洗脱液，得到 含有增效物质成分的解析液。解析液的使用第一种方案是按含量以一定比例加 入到菌浆中，配制成高效价的Bt水剂品种；第二种方案是收集的解析液只接进 行喷雾千燥制成白色或灰白色的高含量增效物质粉，按含量以一定比例与Bt原 粉混合配制高效价的、物理性状指标优良的Bt原粉第三种方案是对解析液进 行脱盐处理，脱盐后的含增效物质清液进行喷雾干燥制成超高含量的增效物质粉 作为科研样品用。本发明采用Bt发酵液上清液，加入蛋白质絮凝剂和重金属络 和剂经前处理去除固形物和部分水溶性物质及离子，再经离子交换技术提取增效 物质有效成分，所得解析液就可达到有效成分IO倍的浓缩效果，水溶性含固很 低，.解析液经喷雾干燥制得高含量的增效物质粉，此工艺所制增效物质粉性状良 好，整套工艺合理可行，可大规模化回收Bt发酵液中的增效物质，设备一次性 投入，运行成本不高、维护简单，是目前最经济、高效、规模化的回收Bt上清 液中的增效物质成分生产工艺方案。Bt发酵液上清液经过此工艺之后的废液 COD含量较初始液大幅下降，降低了污水处理成本。
一种Bt发酵中增效物质的离交回收方法，其歩骤是 (1) BT上清液的预处理，通过添加蛋白质絮凝剂硫酸锌、亚铁氰化钾和金 属离子络合剂草酸在pH值4.0-4.5的条件的作用下进行沉淀反应，通过板框过滤 除去其中的沉淀物，滤液进柱前调PH6.5-7.5.
每批次发酵的正常Bt发酵液经工业离心机离心分离所得全部上清液约20 吨(约20立方)加入一定比例的蛋白质絮凝剂0.15% (重量比)的硫酸锌和0.1% (重量比)的亚铁氰化钾，然后用草酸调节pH值4.0-4.5反应2 4小时。反应后的料液进入板框过滤机进行过滤，过滤出来的清液调PH7.0进入离子交换柱进行 吸附。滤渣作为固体废物收集集中处理。
(2) 选择吸附容量高，选择性好，机械强度高，使用寿命长的吸附树脂ZJ-16 用于吸附Bt增效物质。
通过与安徽三星树脂科技有限公司合作，开发出一种大孔离子交换树脂 (ZJ-16,市场上均有购置)，其比表面积大，孔径大小合适，分布均匀，交换容 量大，对Bt增效物质的吸附容量大，选择性好。由于该树脂是大孔树脂，交联 度大，机械强度好，抗污染能力强，再生操作方便容易，使用寿命也很经济。在 一个体积为6立方米的离交柱中可以连续吸附60—80吨滤液达到树脂饱和。每 次咴附饱和后作为一离交批次，进行解析，收集解析液。离子交换柱通过清洗和 再生，进行下一批次的吸附。根据Bt发酵液的生产规模大小设计制造一根或多 根离子交换柱，进行工业规模化的Bt增效物质回收。
(3) 收集所得解析液根据需要进行加工处理。其歩骤是
A、精加工生产高效价的Bt水悬液型制剂。目前Bt水悬剂BT8000的效价 做到8000IU/ul已达到极限，加工成本已经很高，性价比不高，主要因为在加工 过程中在发酵液浓缩过程中增效物质损失太大，固形物含量增加，剂型化空间很 小，在质量控制方面很困难造成成本增加但难以取得理想效果。本发明通过离交 收集的Zwittermicin A解析液本身就是很高含量的增效物质溶液平均浓度达到 50U/ml，用高倍浓缩的Bt菌浆加入增效物质解析液可以混制成20000IU/ul的流 动性能良好的Bt悬液，然后加入剂化型助剂4%氯化钠、0.4%苯甲酸钠、0.3% 黄原胶(重量比)可以生产出高达16000IU/ul商品化Bt水剂，达到国际先进水 平。
B、加工高效价的Bt原粉。把Zwittermicin A解析液用喷雾干燥塔加工成增 效物质粉，可制得400 500U/g的工业用增效物质粉，把此粉按8%~10%的比例 加入到Bt原粉中，通过气流粉碎和混筛可加工得到高效价的Bt原粉。这种工艺 加工的原粉生物效价高、性状良好、收率高、可剂型化加工空间大，不但提高了 产品品质而且提高了生产收率。此种原粉可用来生产新型的高效价的Bt粉剂类 品种，为Bt粉剂深加工拓宽了空间。C、加工高纯度高含量的增效物质科研用粉。解析液进行脱盐处理，脱盐后 的含增效物质清液进行喷雾干燥制成超高含量的增效物质粉作为科研样品用。收 集解析时中部高含量的解析液，然后通过通过离子交换柱(交换柱内装填吸附一 价、二价离子的专用树脂选择性吸附盐类物质)精制脱盐，进一步的提纯，解析 清液用喷雾干燥塔喷粉，精制得到900-1000U/g白色增效物质精粉。增效物质精 粉杂质少、含量高用来做科研材料。
本发明与现有增效物质回收工艺技术相比，有以下优点和效果 A、选择性好，达到了粗提纯的目的。以前报道的增效物质回收工艺方法， 主发原理都是以物理手段为主，通过除水的方式达到增效物质在单位体积的浓度 提高，在增效物质浓度提高的同时占绝对百分含量的水溶性杂质也快速的增加 了，导致回收效率低、收率低、品质不好，利用价值低。本发明有很好的选择性 提纯，绝大多数水溶性杂质被分离开，主要有效成分的回收率很高。
'B、工业化简单容易，系统运行成本低。本发明工艺方案工业规模的应用设 备投入不大，主要设备一次投入，整体运行成本不高，操作简单方便，便于推广 应用，可以取得很明显的经济效益。比常规的增效物质回收工艺和膜过滤增效物 质回收工艺方案具有明显的优势。常规工艺难以有效的回收增效物质，膜过滤系 统运行维护成本太高而且效果还略差于本发明的工艺方案，在工业规模的应用中 竟争力差。
C、 可方便加工制造出高品质的增效物质粉和精制粉。本发明工艺方案工作 通量很大，单柱系统就可达到工业规模级的需求。
D、 可开发新的Bt制剂。有了高含量的增效物质溶液和粉剂，开发高效价 的Bt水剂和高效价的Bt粉剂提供了可行方案，提高了市场竞争力。
E、 本发明工艺方案可简单、经济的回收Bt发酵液中的增效物质，能取得很 明显的经济效益。此前由于回收工艺方法回收的增效物质可能影响产品品质或成 本难以接受导致产品加工过程中产生的Bt发酵液上清液基本上都直接当废水处 理掉，造成环保处理压力大、成本高，本发明突破了这个困难，能有效回Bt发 酵液上清液中的有效成分，还可以降低排放时的COD含量减轻了污水处理的压 力和成本。
综上所述，本发明的方法有很高的实用价值，在Bt发酵液中的增效物质回收方面取得技术方面和经济价值方面都取得很好结果，对于环境、经济和社会的可持 续发展具有重要的意义。是一种新的、高效、经济、工业化、环保的Bt发酵液 中增效物质的回收工艺方法。回收的增效物质成分可大幅度提高Bt的生物效价 收率，而且采用此工艺回收生产的增效物质粉，性状优良，可以开发新型的Bt 制剂品种和高效的Bt原粉。上清液经离交工艺后，其废水COD含量会下降30%， 使污水处理更加容易。
具体实施例方式
实施例1:
一种Bt发酵中增效物质的离交回收方法，其步骤是
(1) BT上清液的预处理，通过添加蛋白质絮凝剂硫酸锌、亚铁氰化钾和金
属离子络合剂草酸在pH值4或4.2或4.3或4.5的条件的作用下进行沉淀反应， 通过板框过滤除去其中的沉淀物，滤液进柱前调PH7.0
每批次发酵的正常Bt发酵液经工业离心机离心分离所得全部上清液约20吨 (约20立方)加入一定重量比例的蛋白质絮凝剂0.15%的硫酸锌和亚铁氰化钾 0.1%的草酸，然后调节pH值4或4.1或4.2或4.4或4.5反应2或3或4小时。 反应后的料液进入板框过滤机进行过滤，过滤出来的清液调PH7.0进入离子交换 柱进行吸附。滤渣作为固体废物收集集中处理。
(2) 选择吸附容量高，选择性好，机械强度高，使用寿命长的吸附树脂ZJ-16 用于吸附Bt增效物质。
通过与安徽三星树脂科技有限公司合作，开发出一种大孔离子交换树脂 (ZJ-16，市场上均有购置)，其比表面积大，孔径大小合适，分布均匀，交换容 量大，对Bt增效物质的吸附容量大，选择性好。由于该树脂是大孔树脂，交联 度大，机械强度好，抗污染能力强，再生操作方便容易，使用寿命也很经济。在 一个体积为6立方米的离交柱中可以连续吸附60-80吨滤液达到树脂饱和。每次 吸附饱和后作为一离交批次，进行解析，收集解析液。离子交换柱通过清洗和再 生，进行下一批次的吸附。根据Bt发酵液的生产规模大小设计制造一根或多根 离子交换柱，进行工业规模化的Bt增效物质回收。
(3) 收集所得解析液根据需要进行加工处理。其步骤是A、精加工生产高效价的Bt水悬液型制剂。目前Bt水悬剂BT8000的效价 做到8000IU/ul已达到极限，加工成本己经很高，性价比不高，主要因为在加工 过程中在发酵液浓缩过程中增效物质损失太大，固形物含量增加，剂型化空间很 小，在质量控制方面很困难造成成本增加但难以取得理想效果。本发明通过离交 收集的Zwittermicin A解析液本身就是很高含量的增效物质溶液平均浓度达到 50U/ml，用高倍浓縮的Bt菌浆加入一定量的增效物质解析液可以混制成 20000IU/ul的流动性能良好的Bt悬液，然后加入剂化型助剂4%氯化钠、0.4%苯 甲酸钠、0.3%黄原胶(重量比)可以生产出高达16000IU/ul商品化Bt水剂，达 到国际先进水平。
B、 加工高效价的Bt原粉。把ZwittermicinA解析液用喷雾干燥塔加工成增 效物质粉，可制得400~500U/g的工业用增效物质粉，把此粉按重量的8%~10% 的比例加入到Bt原粉中，通过气流粉碎和混筛可加工得到高效价的Bt原粉。这 种工艺加工的原粉生物效价高、性状良好、收率高、可剂型化加工空间大，不但 提高了产品品质而且提高了生产收率。此种原粉可用来生产新型的高效价的Bt 粉剂类品种，为Bt粉剂深加工拓宽了空间。
C、 加工高纯度高含量的增效物质科研用粉。ZwittermicinA进行脱盐处理， 脱盐后的含增效物质清液进行喷雾干燥制成超高含量的增效物质粉作为科研样 品用。收集解析时中部高含量的解析液，然后通过通过离子交换柱(交换柱内装 填吸附一价、二价离子的专用树脂选择性吸附盐类物质)精制脱盐，进一步的提 纯，解析清液用喷雾干燥塔喷粉，精制得到900 1000U/g白色增效物质精粉。增 效物质精粉杂质少、含量高用来做科研材料。
权利要求
1、一种Bt发酵中增效物质的离交回收方法，其步骤是(1)BT上清液的预处理，通过添加蛋白质絮凝剂硫酸锌、亚铁氰化钾和金属离子络合剂草酸在pH值4.0-4.5的条件下进行沉淀反应，通过板框过滤除去其中的沉淀物，滤液进柱前调PH6.5-7.5，每批次发酵的正常Bt发酵液经工业离心机离心分离所得上清液，加入蛋白质絮凝剂0.15％的硫酸锌和0.1％的亚铁氰化钾，然后用草酸调节pH值4.0-4.5反应2～4小时，反应后的料液进入板框过滤机进行过滤，过滤出来的清液调PH7.0进入离子交换柱进行吸附；(2)选择吸附容量高，选择性好，机械强度高，使用寿命长的吸附树脂ZJ-16用于吸附Bt增效物质，其比表面积大，孔径大小合适，分布均匀，交换容量大，对Bt增效物质的吸附容量大，在离交柱中连续吸附滤液达到树脂饱和，每次吸附饱和后作为一离交批次，进行解析，收集解析液，离子交换柱通过清洗和再生，进行下一批次的吸附；(3)收集所得解析液根据需要进行加工处理，其步骤是A、加工生产高效价的Bt水悬液型制剂，通过离交收集的解析液，含量的增效物质溶液平均浓度达到50U/ml，用高倍浓缩的Bt菌浆加入增效物质解析液混制成20000IU/ul的Bt悬液，然后加入剂化型助剂氯化钠、苯甲酸钠、黄原胶生产出Bt水剂；B、加工高效价的Bt原粉，把解析液用喷雾干燥塔加工成增效物质粉，制得400～500U/g的工业用增效物质粉，把此粉按8％～10％的比例加入到Bt原粉中，通过气流粉碎和混筛加工得到Bt原粉；C、加工高纯度高含量的增效物质科研用粉，解析液进行脱盐处理，脱盐后的含增效物质清液进行喷雾干燥制成超高含量的增效物质粉，收集解析时中部高含量的解析液，然后通过通过离子交换柱脱盐，进一步的提纯，解析清液用喷雾干燥塔喷粉，制得到白色增效物质粉。
全文摘要
本发明公开了一种Bt发酵中增效物质的离交回收方法，其步骤(1)Bt上清液的预处理，通过添加蛋白质絮凝剂硫酸锌、亚铁氰化钾和金属离子络合剂草酸在pH值条件下进行沉淀反应，通过板框过滤除去其中的沉淀物，滤液进柱前调pH6；(2)选择吸附容量高，选择性好，机械强度高，使用寿命长的吸附树脂ZJ-16用于吸附Bt增效物质；(3)收集所得解析液根据需要进行加工处理，其步骤是A.加工生产高效价的Bt水悬液型制剂，通过离交收集的解析液，加入剂化型助剂氯化钠、苯甲酸钠、黄原胶生产出Bt水剂；B.加工高效价的Bt原粉；C.加工高纯度高含量的增效物质科研用粉。本发明方法简便，操作易行，提高了产品效价收率，降低了生产成本，提升了产品质量。
文档编号C07C237/00GK101508656SQ200910061189
公开日2009年8月19日 申请日期2009年3月20日 优先权日2009年3月20日
发明者刘华梅, 青 李, 杨克华, 程治国, 翔 谢, 陈振民, 黄志远, 龚永华 申请人:武汉科诺生物科技股份有限公司
技术领域：
本发明涉及回收的增效物质技术领域，更具体涉及一种Bt发酵中增效物质 的离交回收方法，离子交换法工艺回收上清液中的增效物质，可以与高倍离心菌 浆混合加助剂生产出16000 IU/u 1的Bt SC液态制剂，可以生产出新型的Bt制 剂，丰富剂型品种，满足特殊市场需求。解吸液喷雾干燥制得上清粉与原粉混合 可以生产出高品质的Bt原粉，提高效价回收率，增加经济效益。
背景技术：
随着人们环保意识的提高，生态环境越来越恶劣的压力，人们对农药的残留 要求也越来越高，对绿色食品的渴望和需求也越来越强烈，生物农药作为一种环 保、无残留的农药在近几十来深受各国的关注，也在不断深入的大力发展中。Bt 商品化制剂是目前世界上使用最广泛的生物农药之一，对其进行了很深入的研 究、应用、推广。近年研究发现某些苏云金芽孢杆菌(Bt)或蜡质芽孢杆菌发酵上 清液中含有某种自身无杀虫活性，但对Bt的晶体和芽孢表现较强增效作用的活 性成分。如苏云金芽孢杆菌HD-1菌株产生一种非蛋白质的小分子可溶性增效因 子，当与晶体混用时有增效作用，KB500菌株(Bt./"/r"sAi.)能产生更多的这 种增效因子，对斜蚊夜蛾(&ofi^^era 的增效作用可达32倍
(Asano, S,, , et al. ， 1994; Asano, S, ， ， et al., 1995)。苏云金芽孢杆菌GC-91 菌株发酵上清液有增效作用，上清液中含有某种增效物质，离心丢弃上清液是导 致毒力严重损失的根本原因，上清液对粉剂的最高增效倍数可达23.5倍，且上 清液对不同菌粉的增效力不同，对GC-91菌粉增效极为显著，而对HD-1菌粉较 为缓慢(李青等，1997)。苏云金芽孢杆菌79007发酵上清液对苏云金芽孢杆菌 7216-R和HD-1-580有明显的增效作用，增加30%上清液,7216-R和HD-1-580的 对棉铃虫效价分别提高46%和50%%,增加50%,提高幅度更大，效价增加1倍以上 (吴继星等，1997)。对苏云金芽孢杆菌Bta的发酵液进行生物测定，发现发酵原液(Bta离心沉淀物 上清液)对斜纹夜蛾三龄幼虫的LC5(1比去掉上清液的沉 淀物降低了 37.2%，说明发酵上清液能够显著提高发酵沉淀物对斜纹夜蛾的毒力 (余健秀等，2002)。
'蜡状芽孢杆菌(fecj7J^cere^)菌株UW85是最近发现的具有生物防治病 毒潜能的菌株。1989年美国威斯康辛大学的Handelsman从苜蓿植物的根部首次 分离到蜡状芽孢杆菌菌株UW85,通过研究表明菌株UW85的培养液可以抑制苜蓿 猝到病的发生，其抗病机理是因为该菌株在形成芽孢的同时还产生两类抗生素， 通过离子交换树脂和高压纸相电泳对这两种抗生素进行纯化，一类抗生素命名为 ZwittermicinA，它是一种分子量为396Da的氨基多元醇化合物(aminopolyol)， 另一类抗生素命名为Kanosamine，是一种3_氨基-3_脱氧D-葡萄糖的化合物 (Handlsman, ， et al. ， 1990; Minler, et al.， 1995; Silo-suh et al., 1994)。
首次发现Zwittermicin A对苏云金芽孢杆菌具有增效作用，但又不同于 一般的化学增效剂，ZwittermicinA是一种杀虫活性极低的物质，其半致死浓 度LCa,为3000Pg/g，但是，他能使微生物杀虫活性至少增加50%,而其它已知 能增效的杀虫活性物质，如苏云金素、胰蛋白酶抑制剂等本身都具有杀虫活性。 ZwitterraiciriA的增效作用涉及三个有关方面(1)增加与杀虫有关的芽孢杆 菌的杀虫活性；(2)增强化学杀虫剂的杀虫活性；(3)增强具有杀虫性能病毒的 杀虫性(Manker，et al. ， 1994)。例如，Zwittermicin A能使苏云金芽孢杆菌 杀虫晶体蛋白(ICPs)的杀虫活性增加1.5-1000倍，这些ICPs包括Cryl(含 CryIA、 CryIB、 CryIC) 、 CryII、 CryIII、 CryIV、 CryV和CryVI蛋白，且对原 毒素和活化毒素都有增效作用。Zwittermicin A —方面可使与杀虫有关的芽孢 杆菌的杀虫活性增加，另一方面也降低害虫对芽孢杆菌的抗药性,害虫对生物农 药抗药性的增加与实用生物农药的剂量成正相关， 一旦加入Zwittermicin A , 就可降低生物农药的用量，即降低了害虫对生物农药的选择压力。例如在 BI0BIT HPWP制剂中加入4. 0g Zwittermicin A /BIU可以使来自美国加州的田 间抗性小菜蛾的LU抗性比率下降10倍。
Zwittermicin A与苏云金芽孢杆菌制剂组合对鳞翅目，双翅目，鞘翅目，蜱 螨目等中的一些种类具有增效作用，但对不同的昆虫,其增效作用不同，即使在同 一目中的昆虫也是如此。例如对甜菜夜蛾的增效作用最高，对粉纹夜蛾次之。(Chen ， et al. ， 1994)。 Zwittermicin A 对鳞翅目夜蛾科的甜菜夜蛾增效作 用明显，增效倍数可达7. 33倍,对鞘翅目的柳蓝叶甲和菜蛾科的小菜蛾增效作用 不明显，增效倍数仅为0.02, 0.25倍；对双翅目的致倦库蛟有拮抗作用(李晗 等，1998)。
Zwittermicin A的增效作用方式是增强晶体毒素对昆虫中肠细胞结合位点 的亲和性。从而提高毒效，其本身并不被昆虫细胞吸收(Zimanyi et al. ， 1995)。
苏云金芽孢杆菌增效物质可由苏云金芽孢杆菌自身产生，如苏云金芽孢杆菌 HD-l、 GC-91、 79007、 MP-342 、 Bta和KN-ll等，(Asano, S. , ， et al. ， 1994; Asano，S., ， et al. ， 1995;李青等，1997;吴继星等，1997;杨自文等，2001; 余健秀等，2002;陈振民等，2004);还可由蜡状芽孢杆菌(fe"7A/s carew) 菌株UW85和12 - 14产生(Manker， et al., 1994;陈在佴等，2003)。
研究发现国际上大多数苏云金芽孢杆菌产品均不同程度地含有 Zwittermicin A (Wu， D， et al.,1995)。 Zwittermicin A最初发现由蜡状芽 孢杆菌UW85产生，后又发现枯草芽孢杆菌(泡ci7Aw^6ti"、)、苏云金芽孢 杆菌的某些亚种也产生Zwittermicin A ，它主要存在这些芽孢杆菌发酵上清液 中(Manker et al. ， 1994;李晗1998)。
由于Zwittermicin A增效作用明显，离心丢弃上清液导致毒力严重损失， 而且上清液COD含量很高，污水净化处理成本也很高，Zwittermicin A回收工 艺得到研究。杨自文研究了苏云金芽胞杆菌MP-342菌株发酵上清夜中增效物质 的减压浓縮-喷雾干燥回收工艺，回收原粉制备工艺中的离心废液，获得了含固 量为45%的上清浓縮液和上清粉；不同减压浓縮条件及喷雾干燥对上清浓縮液和 上清粉的增效作用无显著影响(杨自文等，2001)。陈振民应用膜过滤技术对苏 云金芽胞杆菌KN-11增效物质回收工艺进行了改进，发现纳滤膜(200D)能完全 截留KN-11增效物质，通过3种膜过滤(0. 1 u m微滤膜、10, 000D超滤膜和200D 纳滤膜)的总回收率达到85.5%;与常规回收工艺比较，膜过滤回收工艺能显著 提高浓縮液和粉的增效物质含量(分别为99. 35U/ml， 457.70 U/g)，同时除去 了大部分的糖、氮等可溶性杂质，使浓缩液和粉保持了较好的理化性状。(陈振 民等，2005)。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种Bt发酵中增效物质的离交回收方法，方法 简便，操作易行，提高了产品效价收率，降低了生产成本，提升了产品质量和市 场竟争力。
为了实现上述的目的，本发明的主要技术方案是
Bt发酵液经蝶片式工业离心机分离，收集全部上清液加入一定量蛋白质絮
凝剂和金属离子絮凝剂，调节pH值进行反应，然后再经板框过滤除去其中的固 形物；清液通过离子交换柱进行吸附，吸附完成后经过解析，收集洗脱液，得到 含有增效物质成分的解析液。解析液的使用第一种方案是按含量以一定比例加 入到菌浆中，配制成高效价的Bt水剂品种；第二种方案是收集的解析液只接进 行喷雾千燥制成白色或灰白色的高含量增效物质粉，按含量以一定比例与Bt原 粉混合配制高效价的、物理性状指标优良的Bt原粉第三种方案是对解析液进 行脱盐处理，脱盐后的含增效物质清液进行喷雾干燥制成超高含量的增效物质粉 作为科研样品用。本发明采用Bt发酵液上清液，加入蛋白质絮凝剂和重金属络 和剂经前处理去除固形物和部分水溶性物质及离子，再经离子交换技术提取增效 物质有效成分，所得解析液就可达到有效成分IO倍的浓缩效果，水溶性含固很 低，.解析液经喷雾干燥制得高含量的增效物质粉，此工艺所制增效物质粉性状良 好，整套工艺合理可行，可大规模化回收Bt发酵液中的增效物质，设备一次性 投入，运行成本不高、维护简单，是目前最经济、高效、规模化的回收Bt上清 液中的增效物质成分生产工艺方案。Bt发酵液上清液经过此工艺之后的废液 COD含量较初始液大幅下降，降低了污水处理成本。
一种Bt发酵中增效物质的离交回收方法，其歩骤是 (1) BT上清液的预处理，通过添加蛋白质絮凝剂硫酸锌、亚铁氰化钾和金 属离子络合剂草酸在pH值4.0-4.5的条件的作用下进行沉淀反应，通过板框过滤 除去其中的沉淀物，滤液进柱前调PH6.5-7.5.
每批次发酵的正常Bt发酵液经工业离心机离心分离所得全部上清液约20 吨(约20立方)加入一定比例的蛋白质絮凝剂0.15% (重量比)的硫酸锌和0.1% (重量比)的亚铁氰化钾，然后用草酸调节pH值4.0-4.5反应2 4小时。反应后的料液进入板框过滤机进行过滤，过滤出来的清液调PH7.0进入离子交换柱进行 吸附。滤渣作为固体废物收集集中处理。
(2) 选择吸附容量高，选择性好，机械强度高，使用寿命长的吸附树脂ZJ-16 用于吸附Bt增效物质。
通过与安徽三星树脂科技有限公司合作，开发出一种大孔离子交换树脂 (ZJ-16,市场上均有购置)，其比表面积大，孔径大小合适，分布均匀，交换容 量大，对Bt增效物质的吸附容量大，选择性好。由于该树脂是大孔树脂，交联 度大，机械强度好，抗污染能力强，再生操作方便容易，使用寿命也很经济。在 一个体积为6立方米的离交柱中可以连续吸附60—80吨滤液达到树脂饱和。每 次咴附饱和后作为一离交批次，进行解析，收集解析液。离子交换柱通过清洗和 再生，进行下一批次的吸附。根据Bt发酵液的生产规模大小设计制造一根或多 根离子交换柱，进行工业规模化的Bt增效物质回收。
(3) 收集所得解析液根据需要进行加工处理。其歩骤是
A、精加工生产高效价的Bt水悬液型制剂。目前Bt水悬剂BT8000的效价 做到8000IU/ul已达到极限，加工成本已经很高，性价比不高，主要因为在加工 过程中在发酵液浓缩过程中增效物质损失太大，固形物含量增加，剂型化空间很 小，在质量控制方面很困难造成成本增加但难以取得理想效果。本发明通过离交 收集的Zwittermicin A解析液本身就是很高含量的增效物质溶液平均浓度达到 50U/ml，用高倍浓缩的Bt菌浆加入增效物质解析液可以混制成20000IU/ul的流 动性能良好的Bt悬液，然后加入剂化型助剂4%氯化钠、0.4%苯甲酸钠、0.3% 黄原胶(重量比)可以生产出高达16000IU/ul商品化Bt水剂，达到国际先进水 平。
B、加工高效价的Bt原粉。把Zwittermicin A解析液用喷雾干燥塔加工成增 效物质粉，可制得400 500U/g的工业用增效物质粉，把此粉按8%~10%的比例 加入到Bt原粉中，通过气流粉碎和混筛可加工得到高效价的Bt原粉。这种工艺 加工的原粉生物效价高、性状良好、收率高、可剂型化加工空间大，不但提高了 产品品质而且提高了生产收率。此种原粉可用来生产新型的高效价的Bt粉剂类 品种，为Bt粉剂深加工拓宽了空间。C、加工高纯度高含量的增效物质科研用粉。解析液进行脱盐处理，脱盐后 的含增效物质清液进行喷雾干燥制成超高含量的增效物质粉作为科研样品用。收 集解析时中部高含量的解析液，然后通过通过离子交换柱(交换柱内装填吸附一 价、二价离子的专用树脂选择性吸附盐类物质)精制脱盐，进一步的提纯，解析 清液用喷雾干燥塔喷粉，精制得到900-1000U/g白色增效物质精粉。增效物质精 粉杂质少、含量高用来做科研材料。
本发明与现有增效物质回收工艺技术相比，有以下优点和效果 A、选择性好，达到了粗提纯的目的。以前报道的增效物质回收工艺方法， 主发原理都是以物理手段为主，通过除水的方式达到增效物质在单位体积的浓度 提高，在增效物质浓度提高的同时占绝对百分含量的水溶性杂质也快速的增加 了，导致回收效率低、收率低、品质不好，利用价值低。本发明有很好的选择性 提纯，绝大多数水溶性杂质被分离开，主要有效成分的回收率很高。
'B、工业化简单容易，系统运行成本低。本发明工艺方案工业规模的应用设 备投入不大，主要设备一次投入，整体运行成本不高，操作简单方便，便于推广 应用，可以取得很明显的经济效益。比常规的增效物质回收工艺和膜过滤增效物 质回收工艺方案具有明显的优势。常规工艺难以有效的回收增效物质，膜过滤系 统运行维护成本太高而且效果还略差于本发明的工艺方案，在工业规模的应用中 竟争力差。
C、 可方便加工制造出高品质的增效物质粉和精制粉。本发明工艺方案工作 通量很大，单柱系统就可达到工业规模级的需求。
D、 可开发新的Bt制剂。有了高含量的增效物质溶液和粉剂，开发高效价 的Bt水剂和高效价的Bt粉剂提供了可行方案，提高了市场竞争力。
E、 本发明工艺方案可简单、经济的回收Bt发酵液中的增效物质，能取得很 明显的经济效益。此前由于回收工艺方法回收的增效物质可能影响产品品质或成 本难以接受导致产品加工过程中产生的Bt发酵液上清液基本上都直接当废水处 理掉，造成环保处理压力大、成本高，本发明突破了这个困难，能有效回Bt发 酵液上清液中的有效成分，还可以降低排放时的COD含量减轻了污水处理的压 力和成本。
综上所述，本发明的方法有很高的实用价值，在Bt发酵液中的增效物质回收方面取得技术方面和经济价值方面都取得很好结果，对于环境、经济和社会的可持 续发展具有重要的意义。是一种新的、高效、经济、工业化、环保的Bt发酵液 中增效物质的回收工艺方法。回收的增效物质成分可大幅度提高Bt的生物效价 收率，而且采用此工艺回收生产的增效物质粉，性状优良，可以开发新型的Bt 制剂品种和高效的Bt原粉。上清液经离交工艺后，其废水COD含量会下降30%， 使污水处理更加容易。
具体实施例方式
实施例1:
一种Bt发酵中增效物质的离交回收方法，其步骤是
(1) BT上清液的预处理，通过添加蛋白质絮凝剂硫酸锌、亚铁氰化钾和金
属离子络合剂草酸在pH值4或4.2或4.3或4.5的条件的作用下进行沉淀反应， 通过板框过滤除去其中的沉淀物，滤液进柱前调PH7.0
每批次发酵的正常Bt发酵液经工业离心机离心分离所得全部上清液约20吨 (约20立方)加入一定重量比例的蛋白质絮凝剂0.15%的硫酸锌和亚铁氰化钾 0.1%的草酸，然后调节pH值4或4.1或4.2或4.4或4.5反应2或3或4小时。 反应后的料液进入板框过滤机进行过滤，过滤出来的清液调PH7.0进入离子交换 柱进行吸附。滤渣作为固体废物收集集中处理。
(2) 选择吸附容量高，选择性好，机械强度高，使用寿命长的吸附树脂ZJ-16 用于吸附Bt增效物质。
通过与安徽三星树脂科技有限公司合作，开发出一种大孔离子交换树脂 (ZJ-16，市场上均有购置)，其比表面积大，孔径大小合适，分布均匀，交换容 量大，对Bt增效物质的吸附容量大，选择性好。由于该树脂是大孔树脂，交联 度大，机械强度好，抗污染能力强，再生操作方便容易，使用寿命也很经济。在 一个体积为6立方米的离交柱中可以连续吸附60-80吨滤液达到树脂饱和。每次 吸附饱和后作为一离交批次，进行解析，收集解析液。离子交换柱通过清洗和再 生，进行下一批次的吸附。根据Bt发酵液的生产规模大小设计制造一根或多根 离子交换柱，进行工业规模化的Bt增效物质回收。
(3) 收集所得解析液根据需要进行加工处理。其步骤是A、精加工生产高效价的Bt水悬液型制剂。目前Bt水悬剂BT8000的效价 做到8000IU/ul已达到极限，加工成本己经很高，性价比不高，主要因为在加工 过程中在发酵液浓缩过程中增效物质损失太大，固形物含量增加，剂型化空间很 小，在质量控制方面很困难造成成本增加但难以取得理想效果。本发明通过离交 收集的Zwittermicin A解析液本身就是很高含量的增效物质溶液平均浓度达到 50U/ml，用高倍浓縮的Bt菌浆加入一定量的增效物质解析液可以混制成 20000IU/ul的流动性能良好的Bt悬液，然后加入剂化型助剂4%氯化钠、0.4%苯 甲酸钠、0.3%黄原胶(重量比)可以生产出高达16000IU/ul商品化Bt水剂，达 到国际先进水平。
B、 加工高效价的Bt原粉。把ZwittermicinA解析液用喷雾干燥塔加工成增 效物质粉，可制得400~500U/g的工业用增效物质粉，把此粉按重量的8%~10% 的比例加入到Bt原粉中，通过气流粉碎和混筛可加工得到高效价的Bt原粉。这 种工艺加工的原粉生物效价高、性状良好、收率高、可剂型化加工空间大，不但 提高了产品品质而且提高了生产收率。此种原粉可用来生产新型的高效价的Bt 粉剂类品种，为Bt粉剂深加工拓宽了空间。
C、 加工高纯度高含量的增效物质科研用粉。ZwittermicinA进行脱盐处理， 脱盐后的含增效物质清液进行喷雾干燥制成超高含量的增效物质粉作为科研样 品用。收集解析时中部高含量的解析液，然后通过通过离子交换柱(交换柱内装 填吸附一价、二价离子的专用树脂选择性吸附盐类物质)精制脱盐，进一步的提 纯，解析清液用喷雾干燥塔喷粉，精制得到900 1000U/g白色增效物质精粉。增 效物质精粉杂质少、含量高用来做科研材料。
权利要求
1、一种Bt发酵中增效物质的离交回收方法，其步骤是(1)BT上清液的预处理，通过添加蛋白质絮凝剂硫酸锌、亚铁氰化钾和金属离子络合剂草酸在pH值4.0-4.5的条件下进行沉淀反应，通过板框过滤除去其中的沉淀物，滤液进柱前调PH6.5-7.5，每批次发酵的正常Bt发酵液经工业离心机离心分离所得上清液，加入蛋白质絮凝剂0.15％的硫酸锌和0.1％的亚铁氰化钾，然后用草酸调节pH值4.0-4.5反应2～4小时，反应后的料液进入板框过滤机进行过滤，过滤出来的清液调PH7.0进入离子交换柱进行吸附；(2)选择吸附容量高，选择性好，机械强度高，使用寿命长的吸附树脂ZJ-16用于吸附Bt增效物质，其比表面积大，孔径大小合适，分布均匀，交换容量大，对Bt增效物质的吸附容量大，在离交柱中连续吸附滤液达到树脂饱和，每次吸附饱和后作为一离交批次，进行解析，收集解析液，离子交换柱通过清洗和再生，进行下一批次的吸附；(3)收集所得解析液根据需要进行加工处理，其步骤是A、加工生产高效价的Bt水悬液型制剂，通过离交收集的解析液，含量的增效物质溶液平均浓度达到50U/ml，用高倍浓缩的Bt菌浆加入增效物质解析液混制成20000IU/ul的Bt悬液，然后加入剂化型助剂氯化钠、苯甲酸钠、黄原胶生产出Bt水剂；B、加工高效价的Bt原粉，把解析液用喷雾干燥塔加工成增效物质粉，制得400～500U/g的工业用增效物质粉，把此粉按8％～10％的比例加入到Bt原粉中，通过气流粉碎和混筛加工得到Bt原粉；C、加工高纯度高含量的增效物质科研用粉，解析液进行脱盐处理，脱盐后的含增效物质清液进行喷雾干燥制成超高含量的增效物质粉，收集解析时中部高含量的解析液，然后通过通过离子交换柱脱盐，进一步的提纯，解析清液用喷雾干燥塔喷粉，制得到白色增效物质粉。
全文摘要
本发明公开了一种Bt发酵中增效物质的离交回收方法，其步骤(1)Bt上清液的预处理，通过添加蛋白质絮凝剂硫酸锌、亚铁氰化钾和金属离子络合剂草酸在pH值条件下进行沉淀反应，通过板框过滤除去其中的沉淀物，滤液进柱前调pH6；(2)选择吸附容量高，选择性好，机械强度高，使用寿命长的吸附树脂ZJ-16用于吸附Bt增效物质；(3)收集所得解析液根据需要进行加工处理，其步骤是A.加工生产高效价的Bt水悬液型制剂，通过离交收集的解析液，加入剂化型助剂氯化钠、苯甲酸钠、黄原胶生产出Bt水剂；B.加工高效价的Bt原粉；C.加工高纯度高含量的增效物质科研用粉。本发明方法简便，操作易行，提高了产品效价收率，降低了生产成本，提升了产品质量。
文档编号C07C237/00GK101508656SQ200910061189
公开日2009年8月19日 申请日期2009年3月20日 优先权日2009年3月20日
发明者刘华梅, 青 李, 杨克华, 程治国, 翔 谢, 陈振民, 黄志远, 龚永华 申请人:武汉科诺生物科技股份有限公司
再多了解一些
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