专利名称：改良的疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及有改良之免疫原性的疫苗组合物。具体地说，本发明的组合物包含一种多肽免疫原，并结合有免疫佐剂功能的长链烷基化合物。
众所周知，疫苗在预防疾病中是很重要的。疫苗的作用在于通过使宿主动物接触特定激活动物免疫系统的外来物质，而赋予宿主以对抗这种物质的免疫力，又不会使宿主患病。目前，已开发了大约20种商品疫苗。这些疫苗中大多数是使用不同方法对病原生物体或该生物体的蛋白质进行去毒性处理而制得的，这些方法包括分离生物体的特定非毒性部分或用化学物质、热或遗传减毒处理生物体的毒性部分。去毒性处理常常产生被未定组成之毒性付产物污染的异源产物。结果将会损害不纯去毒性疫苗作为免疫原性材料的效力。此外，有时还会出现持久性的有害付作用。一个众所周知的例子是使用完整的百日咳杆菌(B.Pertussis)作为预防儿童百日咳之疫苗的基础。目前在美国使用的疫苗基本上都是40年代引入的同一型式的疫苗。付作用包括从很小的不良反应到麻痹、持久性脑损伤甚至死亡。
重组和其他尖端化学技术的出现有利地推动了较纯的，因而也更为安全的疫苗的开发。然而，因为这种改善的纯度常常意味着除去了天然性免疫刺激物，所以这些新疫苗较之它们的前体的作用弱，或者免疫原性较差。为了弥补上述缺陷，而在疫苗中联合使用免疫佐剂，以引发增高的抗体生成能力。
目前仅使用了铝和钙盐作为商品疫苗的佐剂。但铝和钙盐并不是强有力的免疫佐剂。已发现钙盐只能有限地使用，而铝盐则可在注射部分引起暂时的或慢性局部肉芽肿。L.H.Collier(Lancet，pp.1364-1367，1970)提到，对破伤风之反应的发生率和严重程度取决于抗原的纯度以及铝佐剂的存在。铝佐剂的制备并不总是可以重复的。此外，铝可单独刺激IgE抗体的产生，后者可介导速发性超敏感反应(参见T.Matuwhasi，et al.，J.Infectious Disease，146，290(1982))。
近年来已将注意力集中在使用有机化合物作为佐剂上。只有很少几种有机化合物能够以与商业上可接受的无机盐相似的方法发挥作用，即可作为一种缓慢释放载体或抗原(疫苗)存储材料，从而使抗原在注射部位长期缓慢释放。这类有机化合物的例子包括有机表面活性剂和乳化剂，如Pluronics和Tetronies，它们是由BASF公司生产的聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物。
这种佐剂性能的缓慢释放机制很早即被接受作人体使用，因为它可降低对免疫系统造成过度刺激的可能性。过度刺激免疫系统可导致如在使用强力免疫佐剂(如弗氏佐剂)时发生的自家免疫反应。因此，缓慢释放机制是更可取的机制。
虽然已显示大多数有机佐剂是强有力的免疫刺激剂，但这类高活性佐剂是有毒性的，故不能用于人体。已知的有机佐剂有弗氏完全佐剂和胞壁酰二肽，它们都是强有力的免疫刺激剂，但考虑到毒性问题，两者均只限于在动物实验中使用。许多模拟铝盐的有机佐剂比铝盐的毒性更大。例如，据报导由D.Gall(Immwnology，11，369-386，1986)介绍的长链烷基胺即是一种可总地破坏胞膜结构的毒性化合物。
已知不同组合物的大的高分子量异源抗原将与作为佐剂的不溶性有机分子相复合。这是一种非特异性结合现象，其中如果抗原材料是大的并且是完全不同的，便可与任何不溶性有机分子结合，不管其电荷及极性如何。有机佐剂与生物分子之间的复合作用是通过各种弱的非共价结合力，如疏水相互作用和氢键产生的。
Overell的美国专利4，428，932号和Moloney等人的美国专利4，258，294号中介绍了这一现象。Overell公开了酪氨酸烷基酯作为一种佐剂，当与异源多组份高分子量变应原，如黑麦、草和花粉提取物相复合时，可用于变态反应的脱敏治疗。Moloney等人则教导当与异源多组份高分子量破伤风类毒素及Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊髓灰质炎病毒复合时，可用氨基酸的长链醇酯作为佐剂。
因此，需要发展一种无毒性的疫苗一佐剂组合物，其应具有改善了免疫原性，并且其中的免疫原和佐剂均没有毒性。
本发明涉及含有同源免疫原性多肽及无毒性长链烷基免疫佐剂的改良疫苗组合物。因此，根据本发明的一个方面，其提供了一种含有同源免疫原性多肽和作为佐剂之长链烷基化合物的疫苗组合物，其中的佐剂化合物的量足以放大免疫原多肽的免疫原性。
根据本发明的另一个方面，其提供了一种引发免疫反应的方法，该方法包括给包括人在内的温血动物使用有效量的本发明的疫苗组合物。
已令人惊奇地发现，根据本发明，无毒性、带正电荷的长链烷基化合物，特别是氨基酸或肽的酯能够以一种选择性方式结合同源多肽。这种一种依赖于以不溶性酯之形式存在的氨基酸的类型及同源性多肽之类型的特异性现象。这种未曾预料的特异性是根据本发明所使用之同源多肽的特征，且未能由相似分子量的多糖表现出来。根据本发明还发现，当用无毒的长链烷基化合物，特别是长链烷基氨基酸酯代替常规含铝佐剂时，在所产生的抗体异型方面可表现出一种或多种效应。一种效应涉及IgE抗体的产生。具体地说，当使用本发明的长链烷基佐剂化组合物时，IgE抗体的水平基本上没有升高，且可保持在不使用佐剂时所观察的水平;相比之下，当使用含铝佐剂时则观察到IgE水平升高。IgE抗体可介导即刻超敏感反应。曾报导在用含铝佐剂疫苗免疫时，由于IgE的产生而出现过敏反应甚至导致死亡(参见上文提到的Matuhasi等人的报导)。因此，用本发明的长链烷基佐剂化组合物观察到的减低IgE产生的水平，将有益于治疗效果。
另一种效应是当在本发明的组合物中使用长链烷基佐剂时，IgG2a抗体对IgG1的比例比使用铝佐剂时高，而且两抗体异型水平均增加。这一比例增高也对疗效有利，因为就激活补体和抗体依赖性细胞胞毒性机制以及对肿瘤和寄生物的抗性来说，IgG2a抗体是最为有效的小鼠抗体。
本文中用于限定本发明疫苗组合物中所用多肽使用的术语“同源”，是指一种免疫原性多肽基本上是由化学合成或生物合成制备之致病因子的一个或多个抗原决定基组成的。如果存在一个以上抗原决定基时，同源抗原性多肽将包含一个或多个免疫优势抗原决定基。当存在一个抗原决定基时，一般利用化学合成，而当存在一个以上抗原决定基的情况下，则可使用化学或生物学合成。同源多肽可包含致病因子的其他部分，这些部分是无毒的，并且不会对同源多肽的抗原性有不利影响。
无毒性佐剂最好是氨基酸或肽的带正电荷的酯，特别是氨基酸，二肽或三肽的含14至20个碳原子之烷基醇酯。
用于本发明组合物中的同源免疫原性多肽是无毒的，并且能够在宿主体内引发免疫反应。免疫原多肽主要由衍生于爱滋病、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、破伤风、脊髓灰质炎、百日咳(淋巴细胞增多促进因子(LPF)毒素)、单纯性疱疹、呼吸道合胞病毒、麻疹、流感病毒、狂犬病、雷萨热(lassa faver)、轮状病毒、腺病毒、鼻病毒、口蹄疫、牛和猫白血病病毒、牛疫病毒、革登热病毒、蜱传播的脑炎、疟疾和付流感病等病原因子的一个或多个抗原决定基组成的。
在许多情况下，可望修饰天然存在之多肽免疫原的氨基酸序列，以制得更适用于疫苗组合物的同源多肽，而又不改变其免疫原性质。这些改变的例子包括修饰氨基酸侧链，以模拟转译后修饰，或改变免疫原的化学性质。修饰多肽以改善免疫原的体内寿命也是可能的。此外，还可能在多肽的氨基或羧基末端加上一个半胱氨酸残基，以有利于多肽偶联载体蛋白上。
这些改变或修饰可以是保守或非保守的，可以是插入、缺失和置换。这些改变包括结合用于蛋白质合成的天然存在的氨基酸，如gly、ala;val、ile、leu;asp、glu;asn，gln;ser，thr;lys，arg;phe，tyr;ala，ser;ala，thr;ala，val;ala，pro;ala，glu;leu，gln;gly，phe;ile，ser;和ile，met。
可用任何常规方法产生免疫原性源多肽。因此，可用重组或合成技术，或结合两种技术产生该多肽。Maniatis等人(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1982)描述了已知的重组技术。例如可通过用编码所需多肽之基因转染选择的细胞，以表达该多肽。
适用的化学合成方法包括固相或溶液相肽合成或酶促合成。如M.Bodanszky(Principles of Peptide Synthesis，Springer Verlag，1984)，John Morrow Stuart和Janis Dillaha Young(Solid Phase Peptide Synthesis，Second edition，1984)均已描述过有关的适用方法。
多肽可以是经用已知技术截短的、延长的或修饰的。此外，该多肽可以是线性的或成环的。
可用任何通用技术纯化免疫原性多肽。可使用任何只破坏或除去其他生物分子和不要的材料，而留下不影响所需之免疫原性多肽的化学或生物合成方法。最好用层析技术纯化免疫原性多肽。具体地说，使用的层析技术可以是大小排阻层析、离子交换层析、亲和层析，或更好是高效液相层析，或合用上述不同的层析方法。可用凝胶电泳法证实免疫原性多肽的纯度。
免疫原性多肽应有可被宿主识别并确定为外来物质的足够大小。一般免疫原的分子量至少为10，000道尔顿。为使特定宿主能够识别，则必须将小于标准大小的多肽偶联到载体上，并使多肽-载体结合物有免疫原性。优选的载体是蛋白质。适于动物使用的优选载体是牛血清白蛋白和钥孔血兰蛋白(KLH)。适于人使用的载体包括百日咳疫苗(LPF)、借助突变得到的抗原上相似于细菌毒素但无毒的交联反应材料(GRMs)，且最好是按照Pappenheimer等人(An Immunological Study of the Diphtheria Toxin Molecule，Immunochemistry 9，891-906，1972)所述方法制得的CRM197，以及其他细菌蛋白质载体，如脑膜炎球菌外膜蛋白质。最好载体蛋白质本身就是一种免疫原。
可用本领域已知的常规方法将多肽偶联到载体上。虽然使用对称性连接臂如烷基二醛(如戊二醛)或二亚氨酸烷基酯(辛二亚氨酸二甲酯)也在本发明范围内，但最好使用异双功能连接臂。因后者可避免将导致异源制剂不纯的载体分子交联等付作用，故可确保使多肽以一种限定的和可再现的方式连接到载体上。优选的异双功能连接臂的例子包括如J.Carlsson等人(Biochem.J.173，723-737，1978)所描述的N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯和J.D.Bangs等人(J.Cell Biology 103，255-263，1986)所描述的硫代琥珀酰亚胺基4-(对位马来酰亚胺基苯基)丁酸酯。更优选的是S.Hashida等人(J.Applied Biochem.6，56-63，1984)所描述的硫代琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己基-1-羧酸酯。
适用的同源多肽是那些基本上由与肝炎病表面抗原相同之氨基酸组成的多肽，如基本上由与乙型肝炎表面抗相同之氨基酸组成的源多肽。另一个例子是由肝炎表面抗原的一个或多个抗原决定基组成的同源多肽。再一个例子是基本上由与单纯泡疹病毒gD亚基之表面抗原相同的氨基酸序列组成的同源多肽、基本上由人类免疫缺陷病毒之gP120的一个或多个抗原决定基组成的同源多肽、基本上由人类免疫缺陷病毒之gP41的一个或多个抗原决定基组成的同源多肽，或基本上由与淋巴细胞增多促进因子(LPF)相同的氨基酸序列组成的同源多肽。
长链烷基佐剂及其在宿主内的代谢所产生的任何化合物均应是无毒的。众所周知，长链脂肪醇是天然存在的无毒物质。例如，已发现十八醇对人体是完全无毒的，如经口服大于15g/kg的LD50剂量也未见有任何毒性(参见Gosselin，“Clinical Toxicology of Commercial Products”，Fourth Edition，1976)。也已发现酪氨酸十八醇酯对动物是无毒的，而且大多数天然存在的氨基酸都是无毒的(C.L.Penney，et al，Vaccine，4，99-100，1986)。因此可以预见，酪氨酸十八醇酯和其他醇酯及氨基酸在人体内不会有任何毒性。
该佐剂应在含水介质中形成大小在150μm-1mM(18目-100目)之间，且最好为250μm(60目)的微颗粒，从而形成持久均匀的悬浮液。此外，该佐剂微颗粒应能吸附免疫原，以便使免疫原能在宿主体内缓慢释放。
在本发明的一个优选实施方案中，佐剂是有下列通式的化合物
其中C是氢原子、氨基酸残基，或包括多达10个氨基酸的肽残基(即至多为十肽);D是氢原子，或医药上可接受的酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、乳酸或乙酸;E是4-羟基苄基、苄基、4-羟基苯基、苯基、4-氨丁基、异丙基、甲基、氢、或其他天然存在的氨基酸残基;A是(CH2)n、氧或CH2O;B是(CH2)n或氧，这里n是0至4，但A不等于B的(CH2)n或氧;且R是含有12至20个碳原子的烷基基团。
C较好是氢、氨基酸、二肽或三肽。如果C是氨基酸，则佐剂的氨基酸序列可选自如酪氨酰甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰酪氨酸、或苯丙氨酰甘氨酸。如果C是二肽，则佐剂的氨基酸序列可选自如酪氨酰甘氨酰甘氨酸或酪氨酰丙氨酰甘氨酸。如果氨基酸残基是手性的，则可使用D-对映体、L-对映体或其混合物。特别优选的是包含α-氨基酸的佐剂。
特别优选的E选自于4-羟苄基、苄基、4-羟苯基、苯基和氢。E最好是4-羟苄基。
当A是CH2O且B是(CH2)n时，该化合物是N-氨酰基乙醇胺-O-硬脂酸盐，当A是CH2O且B是氧时，该化合物是碳酸盐。
更优选的是，佐剂是氨基酸酯盐酸化物，其中C是氢、D是盐酸、A是(CH2)n、n是0至4，且B是氧。
最优选的是，佐剂是酪氨酸十八醇酯盐酸化物，其中C是氢，D是盐酸，E是4-羟苄基，R是十八烷基，A是(CH2)n，其中n是0且B是氧。
一般说来，当C是氢时，佐剂的骨架基本上由肽键构成，即一个氨基酸残基的羧化物以头对尾的方式直接连接到相邻残基的氨基上。或者，肽键可以是硫代酰胺。
可用任何常规方法制备佐剂。例如，可用任何一种已建立的方法，如M.Bodanszky等人(“Peptide Synthesis”，Second Edition，Willey，New York，1976)和R.W.Roeske(Peptides(N.Y)3，102(1981))所述的方法合成佐剂的氨基酯部分。特别优选的方法是使用按C.Penney等人(J.Organic Chemistry 50，1457-1459(1985))所述的甲磺酸催化的酯化方法。
当佐剂是二或三肽时，可按照上文提到的“Peptide Synthesis”中所述的方法生成肽键。此外，也可用固相或溶液相合成法生成肽键。在生成酰胺、硫代酰胺或硫酯键中已知的许多方法和试剂都是适用的。
在制备佐剂期间，可以暂时保护反应性功能基团。例如，可用尿烷型基团保护胺，用叔丁基或苄基基团保护醇，用酯基团保护酸。上文提到的“Peptide Synthesis”中已描述了适用的保护/去保护条件和方法。
可用以前介绍过的任何一种已知技术纯化佐剂。优选的纯化技术是如W.Clark Still等人(J.Organic Chemistry 43，2923-2925(1978))描述的硅凝胶层析，特别是“急速”层析技术。但其他一些层析法，包括HPLC也可用于纯化该佐剂。有些情况下，无须纯化即可合成得到分析纯的产物。
可按照生产佐剂化组合物的已知方法，在适当的无菌条件下，将佐剂与同源免疫原性多肽进行物理混合，以制得本发明的疫苗组合物。从上面的讨论可以看出，免疫原性多肽可以在其自身或与适当载体偶联的基础上与佐剂混合。在人体内引发免疫反应所需的佐剂和同源多肽免疫原(无论是单独使用或与载体偶联)的量是相互关联的，但一般都在常规疫苗之用量的范围之内。例如，增加佐剂的用量时，即可减少免疫原的使用量，反之亦然。组合物中优选的佐剂量为0.01至5mg/ml，如0.05mg/ml至3mg/ml，较好是0.5至1.0mg/ml。免疫原的优选用量为大约1至100μg/ml，较好是5至40μg/ml。使用剂量将依据接受疫苗的宿主及宿主的大小、体重和年龄等因素而定。
可使用制备其他药用多肽组合物的相似技术配制本发明的疫苗组合物。因此，可将佐剂和免疫原以冻干形式储存，并于给药前重新溶解于生理上可接受的载体中。另外，也可将佐剂和免疫原加在载体中储存。优选的载体是无菌溶液，特别是无菌缓冲溶液，如磷酸盐缓冲盐水。任何可在保留混合物之免疫反应性的载体中混合佐剂与免疫原的方法都是适用的。
载体可含有防腐剂或其他用于改善混合物之储存稳定性或效力的已知添加剂。适用的防腐剂如包括乙基汞硫代水杨酸钠。
本发明疫苗的单剂体积可有所变化，但一般是在常规疫苗通用之范围内。在上述的免疫原和佐剂浓度下，单剂的体积较好约在0.1ml和1.5ml之间，更好约在0.2ml和0.5ml之间。
本发明的疫苗组合物可经任何常规方式给药。较好的给药方法包括皮下、肌肉内、皮内注射，或经鼻内滴入给药。另外，可由生物可扩散的植入剂释放该混合物。可以一次给药，也可以在数日或数周内连续给药。
下列非限制性实施例旨在进一步阐述本发明。
实施例1本实施例描述同源乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的制备。由用Mowht Sinai School of Medicine提供的乙型肝炎病毒表面抗原(Sells，et al.，Production of Hepatitis B Virus Particles in HepG2 cells transfected with cloned Hepatitis B virus DNA，Proc Natl Acad Sci USA，84，1005(1987))转染的人3T3细胞中分离重组HBsAg。使细胞生长于添加了10�S(Gibco)、1mM丙酮酸钠和0.5%庆大霉素的RPMI培养基(Gibco)中。此时，可使用两个纯化程序，即密度梯度离心或免疫亲和层析。在密度梯度离心中，将细胞悬浮液以2000rpm离心10分钟以除去完整的3T3细胞，然后用浓度为10%(w/w)的聚乙二醇(MW8000)沉淀纯化抗原。将所得沉淀物重新悬浮于TNE缓冲液(10mMTris/MCl(PH8.0)，100mM NaCl，1mM EDTA(PH8.0))中，并在加于SW41同质异晶聚合物管内的含20%至50%(W/V)氯化铯梯度的TNE缓冲液中进行离心。于4℃下，以35，000rpm梯度离心60小时。由管底部收集各部分并使用析光仪测定密度。合并有一定密度(1.351-1.358)的部分并对PBS透析，浓缩后以相当于20ng/ml抗原的标准品作为阳性对照，使用Abbot RIA试剂盒分析同源HBsAg的浓度。
以2，000rpm将细胞悬浮液离心10分钟，除去所有完整的3T3细胞，以常规进行免疫亲和层析。将抗HBsAg单克隆抗体共价连接到溴化氰活化的Sepharose CL4B上，制得抗HBsAg亲和柱并用PBS洗涤之。检查洗脱液的OD280nm值，其应小于0.010(OD280nm＝280nm处的光密度(吸光率))。使悬浮液过柱两次，以确保抗原吸附到柱上。然后将柱洗3次以除去柱上非特异结合的蛋白质(检查O.D.280nm小于0.01)，再用甘氨酸/HCl(PH2.8)洗脱。准备10个管，各管内加入足够的Tris缓冲液(PH11)，以中和2ml甘氨酸/HCl洗脱部分。10个管均测O.D.280nm并用RlA法检测HBsAg。合并含同源多肽的部分并对PBS透析。用PBS将柱洗3次。柱被放在PBS/迭氮钠中保存。
实施例2下面描述同源多肽免疫原与长链烷基氨基酸酯免疫佐剂相复合的一般方法。将长链烷基氨基酸酯免疫佐剂(50mg)放在25ml带刻度的或小的锥形烧瓶(有螺旋纹，并用底塞或其他密闭固定材料制动的)。将盐形式的免疫佐剂放在烘箱内，在一适当温度如指定的熔点温度下加热20小时灭菌。向冷却的烧瓶内加入过滤除菌的25ml磷酸盐缓冲盐水(750mM，pH＝6-7)。将所得悬浮液轻轻搅拌3-20小时，将底塞换成玻璃塞，整个存放在4℃下备用。
为了使免疫佐剂与同源多肽复合，将悬浮液置于室温下并彻底搅拌。用大腔吸管将所需体积的悬浮液移入等体积多肽溶液中，使免疫佐剂的终浓度为1mg/ml。但也可以根据需要加入所需浓度的免疫佐剂来调整体积。于4℃将免疫佐剂-多肽悬浮液轻轻混合过夜。复合反应结束时，静置悬浮液，必要时可以离心，并检测上清液的280nm吸光率以确定未结合之多肽的墨。一般来说，有30%-90%结合的肽即表明免疫佐剂-多肽免疫原复合物是好的。
实施例3本实施例证明几种氨基酸十八醇酯与作为候选肝炎疫苗之同质多肽合用时的佐剂性能。
对非对照组，在佐剂存在下用50ng乙型肝炎表面抗原免疫BALB/C小鼠;对照组则在没有佐剂情况下免疫。乙型肝炎表面抗原是从用该表面抗原之基因转染的3T3细胞中得到的。按实施例2中所述，将100μg氨基酸十八醇酯与多肽复合。于第1天，经肌肉内途径给小鼠注射总体积0.1ml的该混合物，并在第7、14、21、28、35、42和61天采血。于第21天用35ng多肽对小鼠作加强免疫。
用放射免疫法检测血清中的抗体浓度。抗体浓度是经过与使用单克隆抗体制得的标准曲线进行而估算的。结果示于表1中。
表1在氨基酸十八醇酯免疫佐剂存在下对乙型肝炎表面抗原的抗体生成反应接种后不同时间(天)的抗HBsAg抗体浓度佐剂 (ng/ml)7天 14天 21天 28天 35天 61天盐水 43 36 32 61 59 58明矾 44 53 46 163 320 516酪氨酸十八醇酯 68 91 58 355 833 752β-丙氨酸十八醇酯 31 45 44 120 337 373甘氨酸十八醇酯 47 38 51 147 748 301脯氨酸十八醇酯 49 35 41 72 409 168亮氨酸十八醇酯 48 42 37 160 590 496赖氨酸十八醇酯 33 55 39 51 67 53Forphenicinol31 40 26 65 306 98十八醇酯Forphenicine100 112 116 908 592 355十八醇酯Bhatnagar P.K.等人(Proc.Natl.Acad.Science，USA，Vol.79，4400-4404(1982))已描述了乙型肝炎表面抗原之氨基酸1至226的氨基酸序列(HBsAg-adw(S 基因产物))。
表1中的结果表明，在氨基酸长链烷基酯和免疫原性多肽，乙型肝炎表面抗原之间观察到的佐剂效应是一种特异性现象。这可通过将酪氨酸十八醇酯与赖氨酸十八醇酯相比较，并将Forphenicinol十八醇酯与forphenicine十八醇酯相比较看出来。
实施例4本实施例证明酪氨酸十八醇酯作为剂量的函数与候选肝炎疫苗多肽合用的佐剂性能。
方法基本同上所述，不同的是用80ng乙型肝炎表面抗原免疫小鼠，用50ng作加强免疫，并于第7、14、28和35天放血。对于非对照组小鼠，在佐剂存在下免疫;对照组小鼠则不给佐剂。结果示于表2中。
表2在酪氨酸十八醇酯存在下对乙型肝炎表面抗原的抗体反应被吸附的天数＊佐剂 抗原(%) 7 14 21 28 35盐水 0 188 40 13 2388 702明矾 73 880 761 639 12310 8726100μg 70 1107 537 1279 19679 1342750μg 60 2064 846 4000 18804 2061610μg 53 611 2314 342 8403 10005＊CPM，放血前值为11.5
表2所示结果表明，佐剂效果依赖于存在于组合物中之长链烷基酯，即酪氨酸十八酯的浓度。随着给予的佐剂量的增加，抗体滴度成比例地增加，以至达到最佳滴度值，此后抗体滴度便不再增加。
实施例5本实施例证明酪氨酸十八醇酯作为剂量的函数，及在不同动物体内与相当于人类免疫缺陷病毒(HIV-1)衣壳蛋白之融合源序列的多肽合用所发挥的佐剂性能。
1)HIV肽序列HIV的肽序列如下。
产物BC-101303-H-Val-Ala-Pro-Thr-Lys-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-Val-Gly-lle-Gly-Ala-Leu-Phe-Leu-Gly-Phe-Leu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser-535 M.W.3585.14(骨架)2)小鼠实验用100μg相当HIV-1残基503-535之氨基酸序列的化学合成的多肽(已偶联到钥孔
血兰蛋白(KLH)上)免疫BALB/C小鼠。按实施例2中所述方法使10μg-100μg酪氨酸十八醇酯盐酸化物与该多肽复合。于第1天给小鼠注射总体积0.1ml的该混合物，并于第21天作加强注射。于第7、14、21、28和35天放血。
用放射免疫法测定血清中的抗体浓度。经与使用多克隆抗体得到的标准曲线进行比较，以估算抗体浓度。结果如表3中所示。
表3在酪氨酸十八醇酯存在下对HIV-1多肽(残基503-535)的抗体生成反应免疫后天数＊佐剂 7 14 21 2.8 35盐水 1.04 0.84 1.03 8.56 11.19明矾 1.59 5.54 3.16 86.6 82.1100μg 0.87 1.65 2.04 155.3 138.050μg 1.18 0.75 2.99 54.2 86.210μg 1.61 3.15 1.49 85.9 131.9＊抗肽抗体浓度，μg/ml表3所示结果表明，长链烷基酯，即酪氨酸十八醇酯，与另一种免疫原性多肽，即衍生于HlV蛋白质gp41之氨基酸503至535的多肽合用表现出浓度依赖性佐剂效果。另外，当达到最佳抗体滴度后，该滴度便不再增加。
3)狒狒实验用300μg已与钥孔、
血兰蛋白偶联的、相当于HlV-1残基503-535之氨基酸序列的化学合成多肽免疫两只狒狒。按实施例2中所述方法将500μg酪氨酸十八醇酯盐酸化物与该多肽复合。于第一天注射总体积1.0ml的该混合物，并于第35天作加强免疫。于第一次免疫前3天、免疫后14、32和49天采血。用另外两只狒狒作同样实验，但使用的免疫原是相当于HIV-1之氨基酸序列526-535的多肽。
用放射免疫法间接检测血清中的抗体浓度。通过在用肽-白蛋白结合物包被的平板上保温样品，并与I125标记的免抗猴免疫球蛋白反应进行滴定。结果示于表4中。
表4所示结果表明，可在高等动物，如狒狒身上观察到长链烷基酯(酪氨酸十八醇酯)和免疫原性HIV多肽间的佐剂效果。
实施例6本实施例证明从铝佐剂化候选肝炎疫苗改为酪氨酸十八醇酯佐剂化候选肝炎疫苗时发生的抗体型改变。
方法如实施例5第2部分(小鼠)所述，不同的是使用50μg酪氨酸十八醇酯进行第一次和第二次(21天)免疫。用放射免疫法检测抗体反应的异型，其中使用了氚标记的抗小鼠异型抗体。在用免疫亲和纯化之乙型肝炎表面抗原包被的平板上保温样品，以进行滴定。结果以结合了异型抗体的放射活性(cpm)表示，并示于下列表5中。
表5中所示结果表明，用免疫原性多肽(乙型肝炎表面抗原)进行免疫时，将佐剂由铝改为长链烷基酯(酪氨酸十八醇酯-OT)可引起抗体反应之异型的改变。具体地说，与对照组所得数据相比，当使用铝时IgE抗体的水平升高，而当使用酪氨酸十八醇酯时则IgE水平没有明显升高。
权利要求
1.一种疫苗组合物，含有同源免疫原性多肽及有效量的下列通式的至少一种佐剂
其中C选自氢、氨基酸残基，和肽残基；D选自氢和医药上可接受的酸；E选自4-羟苄基、苄基、4-羟苯基、苯基、4-氨丁基、异丙基、甲基、氢和天然存在的氨基酸残基；A是(CH2)n、氧或CH2O，且B是(CH2)n或氧、这里n是0至4，条件是A和B的(CH2)n和氧不是一样的；且R是有12至20个碳原子的烷基。
2.根据权利要求1的组合物，其中所说的佐剂包含有L-构型的氨基酸。
3.根据权利要求1的组合物，其中所说的佐剂包含有D-构型的氨基酸。
4.根据权利要求1的组合物，其中所说的佐剂包含D和L-构型氨基酸的混合物。
5.根据权利要求1的组合物，其中E选自4-羟苄基、苄基、4-羟苯基、苯基和氢。
6.根据权利要求5的组合物，其中E是4-羟苄基。
7.根据权利要求1的组合物，其中C选自氢、氨基酸，和包括多达10个氨基酸残基的肽残基。
8.根据权利要求7的组合物，其中所说的肽残基选自二肽和三肽。
9.根据权利要求7的组合物，其中C氨基酸并选自于酪氨酰甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰酪氨酸和苯丙氨酰甘氨酸。
10.根据权利要求8的组合物，其中C是二肽并选自于酪氨酰甘氨酰甘氨酸和酪氨酰丙氨酰甘氨酸。
11.根据权利要求1的组合物，其中医药上可接受的酸选自盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸，乳酸和乙酸。
12.根据权利要求1的组合物，其中所说的佐剂包含α-氨基酸。
13.根据权利要求1的组合物，其中所说的同源多肽选自于线性和成环多肽。
14.根据权利要求1的组合物，其中所说的同源多肽是与生物学载体偶联的。
15.根据权利要求14的组合物，其中所说的载体选自破伤风类毒素、白喉类毒素、无细胞百日咳疫苗(LPS)、交联反应材料(CRM)和细菌蛋白质载体。
16.根据权利要求15的组合物，其中所说的CRM是CRM197。
17.根据权利要求1的组合物，其中所说的同源多肽基本上是选自爱滋病、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、破伤风、脊髓灰质炎、百日咳(淋巴细胞增多促进因子毒素)、单纯性疱疹、呼吸道合胞病毒、麻疹、流感病毒、狂犬病、雷萨热(lassa fever)、轮状病毒、腺病毒、鼻病毒、口蹄疫、牛和猫白血病病毒、牛疫病毒、革登热病毒、蜱传播的脑炎、疟疾和付流感病毒的致病因子衍生的一个或多个抗原决定基组成的。
18.根据权利要求1的组合物，其中所说的同源多肽基本上与肝炎病毒的表面抗原有同样的氨基酸序列。
19.根据权利要求1的组合物，其中所说的同源多肽包含肝炎病毒表面抗原的一个或多个抗原决定基。
20.根据权利要求1的组合物，其中所说的同源多肽包含基本上与乙型肝炎表面抗原相同的氨基酸序列。
21.根据权利要求1的组合物，其中所说的同源多肽具有基本上与单纯疱疹病毒的gD亚单位之表面抗原相同的氨基酸序列。
22.根据权利要求1的组合物，其中所说的同源多肽包含人类免疫缺陷病毒之gp120的一个或多个抗原决定基。
23.根据权利要求1的组合物，其中所说的同源多肽包含人类免疫缺陷病毒之gp41的一个或多个抗原决定基。
24.根据权利要求1的组合物，其中所说的同源多肽具有基本上与淋巴细胞增多促进因子相同的氨基酸序列。
25.根据权利要求1的组合物，其中所说的佐剂是含14至20个碳原子之烷基醇以及氨基酸、二肽或三肽的酯。
26.根据权利要求25的组合物，其中所说的佐剂是酪氨酸十八醇酯。
27.一种引发病人体内免疫反应的方法，该方法包括给所说的病人使用治疗有效量的权利要求1的疫苗组合物。
28.根据权利要求27的方法，其中所说的组合物是经肌肉内、皮内、皮下途径，或以滴鼻方式给药的。
29.根据权利要求27的方法，其中给予所说的疫苗组合物基本上不增高IgE抗体水平，并且不增加IgG2a对IgG1抗体的比例。
全文摘要
提供了包含长链烷基化合物作为结合同源免疫原性多肽免疫佐剂的改良的疫苗组合物。本发明的组合物可用于激活免疫系统，以一种预防方式赋予宿主以抗该免疫原的免疫力。
文档编号C07K14/16GK1056816SQ91102899
公开日1991年12月11日 申请日期1991年5月7日 优先权日1990年5月7日
发明者查里斯托夫·L·佩尼 申请人:北美疫苗公司
技术领域：
本发明涉及有改良之免疫原性的疫苗组合物。具体地说，本发明的组合物包含一种多肽免疫原，并结合有免疫佐剂功能的长链烷基化合物。
众所周知，疫苗在预防疾病中是很重要的。疫苗的作用在于通过使宿主动物接触特定激活动物免疫系统的外来物质，而赋予宿主以对抗这种物质的免疫力，又不会使宿主患病。目前，已开发了大约20种商品疫苗。这些疫苗中大多数是使用不同方法对病原生物体或该生物体的蛋白质进行去毒性处理而制得的，这些方法包括分离生物体的特定非毒性部分或用化学物质、热或遗传减毒处理生物体的毒性部分。去毒性处理常常产生被未定组成之毒性付产物污染的异源产物。结果将会损害不纯去毒性疫苗作为免疫原性材料的效力。此外，有时还会出现持久性的有害付作用。一个众所周知的例子是使用完整的百日咳杆菌(B.Pertussis)作为预防儿童百日咳之疫苗的基础。目前在美国使用的疫苗基本上都是40年代引入的同一型式的疫苗。付作用包括从很小的不良反应到麻痹、持久性脑损伤甚至死亡。
重组和其他尖端化学技术的出现有利地推动了较纯的，因而也更为安全的疫苗的开发。然而，因为这种改善的纯度常常意味着除去了天然性免疫刺激物，所以这些新疫苗较之它们的前体的作用弱，或者免疫原性较差。为了弥补上述缺陷，而在疫苗中联合使用免疫佐剂，以引发增高的抗体生成能力。
目前仅使用了铝和钙盐作为商品疫苗的佐剂。但铝和钙盐并不是强有力的免疫佐剂。已发现钙盐只能有限地使用，而铝盐则可在注射部分引起暂时的或慢性局部肉芽肿。L.H.Collier(Lancet，pp.1364-1367，1970)提到，对破伤风之反应的发生率和严重程度取决于抗原的纯度以及铝佐剂的存在。铝佐剂的制备并不总是可以重复的。此外，铝可单独刺激IgE抗体的产生，后者可介导速发性超敏感反应(参见T.Matuwhasi，et al.，J.Infectious Disease，146，290(1982))。
近年来已将注意力集中在使用有机化合物作为佐剂上。只有很少几种有机化合物能够以与商业上可接受的无机盐相似的方法发挥作用，即可作为一种缓慢释放载体或抗原(疫苗)存储材料，从而使抗原在注射部位长期缓慢释放。这类有机化合物的例子包括有机表面活性剂和乳化剂，如Pluronics和Tetronies，它们是由BASF公司生产的聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物。
这种佐剂性能的缓慢释放机制很早即被接受作人体使用，因为它可降低对免疫系统造成过度刺激的可能性。过度刺激免疫系统可导致如在使用强力免疫佐剂(如弗氏佐剂)时发生的自家免疫反应。因此，缓慢释放机制是更可取的机制。
虽然已显示大多数有机佐剂是强有力的免疫刺激剂，但这类高活性佐剂是有毒性的，故不能用于人体。已知的有机佐剂有弗氏完全佐剂和胞壁酰二肽，它们都是强有力的免疫刺激剂，但考虑到毒性问题，两者均只限于在动物实验中使用。许多模拟铝盐的有机佐剂比铝盐的毒性更大。例如，据报导由D.Gall(Immwnology，11，369-386，1986)介绍的长链烷基胺即是一种可总地破坏胞膜结构的毒性化合物。
已知不同组合物的大的高分子量异源抗原将与作为佐剂的不溶性有机分子相复合。这是一种非特异性结合现象，其中如果抗原材料是大的并且是完全不同的，便可与任何不溶性有机分子结合，不管其电荷及极性如何。有机佐剂与生物分子之间的复合作用是通过各种弱的非共价结合力，如疏水相互作用和氢键产生的。
Overell的美国专利4，428，932号和Moloney等人的美国专利4，258，294号中介绍了这一现象。Overell公开了酪氨酸烷基酯作为一种佐剂，当与异源多组份高分子量变应原，如黑麦、草和花粉提取物相复合时，可用于变态反应的脱敏治疗。Moloney等人则教导当与异源多组份高分子量破伤风类毒素及Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊髓灰质炎病毒复合时，可用氨基酸的长链醇酯作为佐剂。
因此，需要发展一种无毒性的疫苗一佐剂组合物，其应具有改善了免疫原性，并且其中的免疫原和佐剂均没有毒性。
本发明涉及含有同源免疫原性多肽及无毒性长链烷基免疫佐剂的改良疫苗组合物。因此，根据本发明的一个方面，其提供了一种含有同源免疫原性多肽和作为佐剂之长链烷基化合物的疫苗组合物，其中的佐剂化合物的量足以放大免疫原多肽的免疫原性。
根据本发明的另一个方面，其提供了一种引发免疫反应的方法，该方法包括给包括人在内的温血动物使用有效量的本发明的疫苗组合物。
已令人惊奇地发现，根据本发明，无毒性、带正电荷的长链烷基化合物，特别是氨基酸或肽的酯能够以一种选择性方式结合同源多肽。这种一种依赖于以不溶性酯之形式存在的氨基酸的类型及同源性多肽之类型的特异性现象。这种未曾预料的特异性是根据本发明所使用之同源多肽的特征，且未能由相似分子量的多糖表现出来。根据本发明还发现，当用无毒的长链烷基化合物，特别是长链烷基氨基酸酯代替常规含铝佐剂时，在所产生的抗体异型方面可表现出一种或多种效应。一种效应涉及IgE抗体的产生。具体地说，当使用本发明的长链烷基佐剂化组合物时，IgE抗体的水平基本上没有升高，且可保持在不使用佐剂时所观察的水平;相比之下，当使用含铝佐剂时则观察到IgE水平升高。IgE抗体可介导即刻超敏感反应。曾报导在用含铝佐剂疫苗免疫时，由于IgE的产生而出现过敏反应甚至导致死亡(参见上文提到的Matuhasi等人的报导)。因此，用本发明的长链烷基佐剂化组合物观察到的减低IgE产生的水平，将有益于治疗效果。
另一种效应是当在本发明的组合物中使用长链烷基佐剂时，IgG2a抗体对IgG1的比例比使用铝佐剂时高，而且两抗体异型水平均增加。这一比例增高也对疗效有利，因为就激活补体和抗体依赖性细胞胞毒性机制以及对肿瘤和寄生物的抗性来说，IgG2a抗体是最为有效的小鼠抗体。
本文中用于限定本发明疫苗组合物中所用多肽使用的术语“同源”，是指一种免疫原性多肽基本上是由化学合成或生物合成制备之致病因子的一个或多个抗原决定基组成的。如果存在一个以上抗原决定基时，同源抗原性多肽将包含一个或多个免疫优势抗原决定基。当存在一个抗原决定基时，一般利用化学合成，而当存在一个以上抗原决定基的情况下，则可使用化学或生物学合成。同源多肽可包含致病因子的其他部分，这些部分是无毒的，并且不会对同源多肽的抗原性有不利影响。
无毒性佐剂最好是氨基酸或肽的带正电荷的酯，特别是氨基酸，二肽或三肽的含14至20个碳原子之烷基醇酯。
用于本发明组合物中的同源免疫原性多肽是无毒的，并且能够在宿主体内引发免疫反应。免疫原多肽主要由衍生于爱滋病、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、破伤风、脊髓灰质炎、百日咳(淋巴细胞增多促进因子(LPF)毒素)、单纯性疱疹、呼吸道合胞病毒、麻疹、流感病毒、狂犬病、雷萨热(lassa faver)、轮状病毒、腺病毒、鼻病毒、口蹄疫、牛和猫白血病病毒、牛疫病毒、革登热病毒、蜱传播的脑炎、疟疾和付流感病等病原因子的一个或多个抗原决定基组成的。
在许多情况下，可望修饰天然存在之多肽免疫原的氨基酸序列，以制得更适用于疫苗组合物的同源多肽，而又不改变其免疫原性质。这些改变的例子包括修饰氨基酸侧链，以模拟转译后修饰，或改变免疫原的化学性质。修饰多肽以改善免疫原的体内寿命也是可能的。此外，还可能在多肽的氨基或羧基末端加上一个半胱氨酸残基，以有利于多肽偶联载体蛋白上。
这些改变或修饰可以是保守或非保守的，可以是插入、缺失和置换。这些改变包括结合用于蛋白质合成的天然存在的氨基酸，如gly、ala;val、ile、leu;asp、glu;asn，gln;ser，thr;lys，arg;phe，tyr;ala，ser;ala，thr;ala，val;ala，pro;ala，glu;leu，gln;gly，phe;ile，ser;和ile，met。
可用任何常规方法产生免疫原性源多肽。因此，可用重组或合成技术，或结合两种技术产生该多肽。Maniatis等人(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1982)描述了已知的重组技术。例如可通过用编码所需多肽之基因转染选择的细胞，以表达该多肽。
适用的化学合成方法包括固相或溶液相肽合成或酶促合成。如M.Bodanszky(Principles of Peptide Synthesis，Springer Verlag，1984)，John Morrow Stuart和Janis Dillaha Young(Solid Phase Peptide Synthesis，Second edition，1984)均已描述过有关的适用方法。
多肽可以是经用已知技术截短的、延长的或修饰的。此外，该多肽可以是线性的或成环的。
可用任何通用技术纯化免疫原性多肽。可使用任何只破坏或除去其他生物分子和不要的材料，而留下不影响所需之免疫原性多肽的化学或生物合成方法。最好用层析技术纯化免疫原性多肽。具体地说，使用的层析技术可以是大小排阻层析、离子交换层析、亲和层析，或更好是高效液相层析，或合用上述不同的层析方法。可用凝胶电泳法证实免疫原性多肽的纯度。
免疫原性多肽应有可被宿主识别并确定为外来物质的足够大小。一般免疫原的分子量至少为10，000道尔顿。为使特定宿主能够识别，则必须将小于标准大小的多肽偶联到载体上，并使多肽-载体结合物有免疫原性。优选的载体是蛋白质。适于动物使用的优选载体是牛血清白蛋白和钥孔血兰蛋白(KLH)。适于人使用的载体包括百日咳疫苗(LPF)、借助突变得到的抗原上相似于细菌毒素但无毒的交联反应材料(GRMs)，且最好是按照Pappenheimer等人(An Immunological Study of the Diphtheria Toxin Molecule，Immunochemistry 9，891-906，1972)所述方法制得的CRM197，以及其他细菌蛋白质载体，如脑膜炎球菌外膜蛋白质。最好载体蛋白质本身就是一种免疫原。
可用本领域已知的常规方法将多肽偶联到载体上。虽然使用对称性连接臂如烷基二醛(如戊二醛)或二亚氨酸烷基酯(辛二亚氨酸二甲酯)也在本发明范围内，但最好使用异双功能连接臂。因后者可避免将导致异源制剂不纯的载体分子交联等付作用，故可确保使多肽以一种限定的和可再现的方式连接到载体上。优选的异双功能连接臂的例子包括如J.Carlsson等人(Biochem.J.173，723-737，1978)所描述的N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯和J.D.Bangs等人(J.Cell Biology 103，255-263，1986)所描述的硫代琥珀酰亚胺基4-(对位马来酰亚胺基苯基)丁酸酯。更优选的是S.Hashida等人(J.Applied Biochem.6，56-63，1984)所描述的硫代琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己基-1-羧酸酯。
适用的同源多肽是那些基本上由与肝炎病表面抗原相同之氨基酸组成的多肽，如基本上由与乙型肝炎表面抗相同之氨基酸组成的源多肽。另一个例子是由肝炎表面抗原的一个或多个抗原决定基组成的同源多肽。再一个例子是基本上由与单纯泡疹病毒gD亚基之表面抗原相同的氨基酸序列组成的同源多肽、基本上由人类免疫缺陷病毒之gP120的一个或多个抗原决定基组成的同源多肽、基本上由人类免疫缺陷病毒之gP41的一个或多个抗原决定基组成的同源多肽，或基本上由与淋巴细胞增多促进因子(LPF)相同的氨基酸序列组成的同源多肽。
长链烷基佐剂及其在宿主内的代谢所产生的任何化合物均应是无毒的。众所周知，长链脂肪醇是天然存在的无毒物质。例如，已发现十八醇对人体是完全无毒的，如经口服大于15g/kg的LD50剂量也未见有任何毒性(参见Gosselin，“Clinical Toxicology of Commercial Products”，Fourth Edition，1976)。也已发现酪氨酸十八醇酯对动物是无毒的，而且大多数天然存在的氨基酸都是无毒的(C.L.Penney，et al，Vaccine，4，99-100，1986)。因此可以预见，酪氨酸十八醇酯和其他醇酯及氨基酸在人体内不会有任何毒性。
该佐剂应在含水介质中形成大小在150μm-1mM(18目-100目)之间，且最好为250μm(60目)的微颗粒，从而形成持久均匀的悬浮液。此外，该佐剂微颗粒应能吸附免疫原，以便使免疫原能在宿主体内缓慢释放。
在本发明的一个优选实施方案中，佐剂是有下列通式的化合物
其中C是氢原子、氨基酸残基，或包括多达10个氨基酸的肽残基(即至多为十肽);D是氢原子，或医药上可接受的酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、乳酸或乙酸;E是4-羟基苄基、苄基、4-羟基苯基、苯基、4-氨丁基、异丙基、甲基、氢、或其他天然存在的氨基酸残基;A是(CH2)n、氧或CH2O;B是(CH2)n或氧，这里n是0至4，但A不等于B的(CH2)n或氧;且R是含有12至20个碳原子的烷基基团。
C较好是氢、氨基酸、二肽或三肽。如果C是氨基酸，则佐剂的氨基酸序列可选自如酪氨酰甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰酪氨酸、或苯丙氨酰甘氨酸。如果C是二肽，则佐剂的氨基酸序列可选自如酪氨酰甘氨酰甘氨酸或酪氨酰丙氨酰甘氨酸。如果氨基酸残基是手性的，则可使用D-对映体、L-对映体或其混合物。特别优选的是包含α-氨基酸的佐剂。
特别优选的E选自于4-羟苄基、苄基、4-羟苯基、苯基和氢。E最好是4-羟苄基。
当A是CH2O且B是(CH2)n时，该化合物是N-氨酰基乙醇胺-O-硬脂酸盐，当A是CH2O且B是氧时，该化合物是碳酸盐。
更优选的是，佐剂是氨基酸酯盐酸化物，其中C是氢、D是盐酸、A是(CH2)n、n是0至4，且B是氧。
最优选的是，佐剂是酪氨酸十八醇酯盐酸化物，其中C是氢，D是盐酸，E是4-羟苄基，R是十八烷基，A是(CH2)n，其中n是0且B是氧。
一般说来，当C是氢时，佐剂的骨架基本上由肽键构成，即一个氨基酸残基的羧化物以头对尾的方式直接连接到相邻残基的氨基上。或者，肽键可以是硫代酰胺。
可用任何常规方法制备佐剂。例如，可用任何一种已建立的方法，如M.Bodanszky等人(“Peptide Synthesis”，Second Edition，Willey，New York，1976)和R.W.Roeske(Peptides(N.Y)3，102(1981))所述的方法合成佐剂的氨基酯部分。特别优选的方法是使用按C.Penney等人(J.Organic Chemistry 50，1457-1459(1985))所述的甲磺酸催化的酯化方法。
当佐剂是二或三肽时，可按照上文提到的“Peptide Synthesis”中所述的方法生成肽键。此外，也可用固相或溶液相合成法生成肽键。在生成酰胺、硫代酰胺或硫酯键中已知的许多方法和试剂都是适用的。
在制备佐剂期间，可以暂时保护反应性功能基团。例如，可用尿烷型基团保护胺，用叔丁基或苄基基团保护醇，用酯基团保护酸。上文提到的“Peptide Synthesis”中已描述了适用的保护/去保护条件和方法。
可用以前介绍过的任何一种已知技术纯化佐剂。优选的纯化技术是如W.Clark Still等人(J.Organic Chemistry 43，2923-2925(1978))描述的硅凝胶层析，特别是“急速”层析技术。但其他一些层析法，包括HPLC也可用于纯化该佐剂。有些情况下，无须纯化即可合成得到分析纯的产物。
可按照生产佐剂化组合物的已知方法，在适当的无菌条件下，将佐剂与同源免疫原性多肽进行物理混合，以制得本发明的疫苗组合物。从上面的讨论可以看出，免疫原性多肽可以在其自身或与适当载体偶联的基础上与佐剂混合。在人体内引发免疫反应所需的佐剂和同源多肽免疫原(无论是单独使用或与载体偶联)的量是相互关联的，但一般都在常规疫苗之用量的范围之内。例如，增加佐剂的用量时，即可减少免疫原的使用量，反之亦然。组合物中优选的佐剂量为0.01至5mg/ml，如0.05mg/ml至3mg/ml，较好是0.5至1.0mg/ml。免疫原的优选用量为大约1至100μg/ml，较好是5至40μg/ml。使用剂量将依据接受疫苗的宿主及宿主的大小、体重和年龄等因素而定。
可使用制备其他药用多肽组合物的相似技术配制本发明的疫苗组合物。因此，可将佐剂和免疫原以冻干形式储存，并于给药前重新溶解于生理上可接受的载体中。另外，也可将佐剂和免疫原加在载体中储存。优选的载体是无菌溶液，特别是无菌缓冲溶液，如磷酸盐缓冲盐水。任何可在保留混合物之免疫反应性的载体中混合佐剂与免疫原的方法都是适用的。
载体可含有防腐剂或其他用于改善混合物之储存稳定性或效力的已知添加剂。适用的防腐剂如包括乙基汞硫代水杨酸钠。
本发明疫苗的单剂体积可有所变化，但一般是在常规疫苗通用之范围内。在上述的免疫原和佐剂浓度下，单剂的体积较好约在0.1ml和1.5ml之间，更好约在0.2ml和0.5ml之间。
本发明的疫苗组合物可经任何常规方式给药。较好的给药方法包括皮下、肌肉内、皮内注射，或经鼻内滴入给药。另外，可由生物可扩散的植入剂释放该混合物。可以一次给药，也可以在数日或数周内连续给药。
下列非限制性实施例旨在进一步阐述本发明。
实施例1本实施例描述同源乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的制备。由用Mowht Sinai School of Medicine提供的乙型肝炎病毒表面抗原(Sells，et al.，Production of Hepatitis B Virus Particles in HepG2 cells transfected with cloned Hepatitis B virus DNA，Proc Natl Acad Sci USA，84，1005(1987))转染的人3T3细胞中分离重组HBsAg。使细胞生长于添加了10�S(Gibco)、1mM丙酮酸钠和0.5%庆大霉素的RPMI培养基(Gibco)中。此时，可使用两个纯化程序，即密度梯度离心或免疫亲和层析。在密度梯度离心中，将细胞悬浮液以2000rpm离心10分钟以除去完整的3T3细胞，然后用浓度为10%(w/w)的聚乙二醇(MW8000)沉淀纯化抗原。将所得沉淀物重新悬浮于TNE缓冲液(10mMTris/MCl(PH8.0)，100mM NaCl，1mM EDTA(PH8.0))中，并在加于SW41同质异晶聚合物管内的含20%至50%(W/V)氯化铯梯度的TNE缓冲液中进行离心。于4℃下，以35，000rpm梯度离心60小时。由管底部收集各部分并使用析光仪测定密度。合并有一定密度(1.351-1.358)的部分并对PBS透析，浓缩后以相当于20ng/ml抗原的标准品作为阳性对照，使用Abbot RIA试剂盒分析同源HBsAg的浓度。
以2，000rpm将细胞悬浮液离心10分钟，除去所有完整的3T3细胞，以常规进行免疫亲和层析。将抗HBsAg单克隆抗体共价连接到溴化氰活化的Sepharose CL4B上，制得抗HBsAg亲和柱并用PBS洗涤之。检查洗脱液的OD280nm值，其应小于0.010(OD280nm＝280nm处的光密度(吸光率))。使悬浮液过柱两次，以确保抗原吸附到柱上。然后将柱洗3次以除去柱上非特异结合的蛋白质(检查O.D.280nm小于0.01)，再用甘氨酸/HCl(PH2.8)洗脱。准备10个管，各管内加入足够的Tris缓冲液(PH11)，以中和2ml甘氨酸/HCl洗脱部分。10个管均测O.D.280nm并用RlA法检测HBsAg。合并含同源多肽的部分并对PBS透析。用PBS将柱洗3次。柱被放在PBS/迭氮钠中保存。
实施例2下面描述同源多肽免疫原与长链烷基氨基酸酯免疫佐剂相复合的一般方法。将长链烷基氨基酸酯免疫佐剂(50mg)放在25ml带刻度的或小的锥形烧瓶(有螺旋纹，并用底塞或其他密闭固定材料制动的)。将盐形式的免疫佐剂放在烘箱内，在一适当温度如指定的熔点温度下加热20小时灭菌。向冷却的烧瓶内加入过滤除菌的25ml磷酸盐缓冲盐水(750mM，pH＝6-7)。将所得悬浮液轻轻搅拌3-20小时，将底塞换成玻璃塞，整个存放在4℃下备用。
为了使免疫佐剂与同源多肽复合，将悬浮液置于室温下并彻底搅拌。用大腔吸管将所需体积的悬浮液移入等体积多肽溶液中，使免疫佐剂的终浓度为1mg/ml。但也可以根据需要加入所需浓度的免疫佐剂来调整体积。于4℃将免疫佐剂-多肽悬浮液轻轻混合过夜。复合反应结束时，静置悬浮液，必要时可以离心，并检测上清液的280nm吸光率以确定未结合之多肽的墨。一般来说，有30%-90%结合的肽即表明免疫佐剂-多肽免疫原复合物是好的。
实施例3本实施例证明几种氨基酸十八醇酯与作为候选肝炎疫苗之同质多肽合用时的佐剂性能。
对非对照组，在佐剂存在下用50ng乙型肝炎表面抗原免疫BALB/C小鼠;对照组则在没有佐剂情况下免疫。乙型肝炎表面抗原是从用该表面抗原之基因转染的3T3细胞中得到的。按实施例2中所述，将100μg氨基酸十八醇酯与多肽复合。于第1天，经肌肉内途径给小鼠注射总体积0.1ml的该混合物，并在第7、14、21、28、35、42和61天采血。于第21天用35ng多肽对小鼠作加强免疫。
用放射免疫法检测血清中的抗体浓度。抗体浓度是经过与使用单克隆抗体制得的标准曲线进行而估算的。结果示于表1中。
表1在氨基酸十八醇酯免疫佐剂存在下对乙型肝炎表面抗原的抗体生成反应接种后不同时间(天)的抗HBsAg抗体浓度佐剂 (ng/ml)7天 14天 21天 28天 35天 61天盐水 43 36 32 61 59 58明矾 44 53 46 163 320 516酪氨酸十八醇酯 68 91 58 355 833 752β-丙氨酸十八醇酯 31 45 44 120 337 373甘氨酸十八醇酯 47 38 51 147 748 301脯氨酸十八醇酯 49 35 41 72 409 168亮氨酸十八醇酯 48 42 37 160 590 496赖氨酸十八醇酯 33 55 39 51 67 53Forphenicinol31 40 26 65 306 98十八醇酯Forphenicine100 112 116 908 592 355十八醇酯Bhatnagar P.K.等人(Proc.Natl.Acad.Science，USA，Vol.79，4400-4404(1982))已描述了乙型肝炎表面抗原之氨基酸1至226的氨基酸序列(HBsAg-adw(S 基因产物))。
表1中的结果表明，在氨基酸长链烷基酯和免疫原性多肽，乙型肝炎表面抗原之间观察到的佐剂效应是一种特异性现象。这可通过将酪氨酸十八醇酯与赖氨酸十八醇酯相比较，并将Forphenicinol十八醇酯与forphenicine十八醇酯相比较看出来。
实施例4本实施例证明酪氨酸十八醇酯作为剂量的函数与候选肝炎疫苗多肽合用的佐剂性能。
方法基本同上所述，不同的是用80ng乙型肝炎表面抗原免疫小鼠，用50ng作加强免疫，并于第7、14、28和35天放血。对于非对照组小鼠，在佐剂存在下免疫;对照组小鼠则不给佐剂。结果示于表2中。
表2在酪氨酸十八醇酯存在下对乙型肝炎表面抗原的抗体反应被吸附的天数＊佐剂 抗原(%) 7 14 21 28 35盐水 0 188 40 13 2388 702明矾 73 880 761 639 12310 8726100μg 70 1107 537 1279 19679 1342750μg 60 2064 846 4000 18804 2061610μg 53 611 2314 342 8403 10005＊CPM，放血前值为11.5
表2所示结果表明，佐剂效果依赖于存在于组合物中之长链烷基酯，即酪氨酸十八酯的浓度。随着给予的佐剂量的增加，抗体滴度成比例地增加，以至达到最佳滴度值，此后抗体滴度便不再增加。
实施例5本实施例证明酪氨酸十八醇酯作为剂量的函数，及在不同动物体内与相当于人类免疫缺陷病毒(HIV-1)衣壳蛋白之融合源序列的多肽合用所发挥的佐剂性能。
1)HIV肽序列HIV的肽序列如下。
产物BC-101303-H-Val-Ala-Pro-Thr-Lys-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-Val-Gly-lle-Gly-Ala-Leu-Phe-Leu-Gly-Phe-Leu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser-535 M.W.3585.14(骨架)2)小鼠实验用100μg相当HIV-1残基503-535之氨基酸序列的化学合成的多肽(已偶联到钥孔
血兰蛋白(KLH)上)免疫BALB/C小鼠。按实施例2中所述方法使10μg-100μg酪氨酸十八醇酯盐酸化物与该多肽复合。于第1天给小鼠注射总体积0.1ml的该混合物，并于第21天作加强注射。于第7、14、21、28和35天放血。
用放射免疫法测定血清中的抗体浓度。经与使用多克隆抗体得到的标准曲线进行比较，以估算抗体浓度。结果如表3中所示。
表3在酪氨酸十八醇酯存在下对HIV-1多肽(残基503-535)的抗体生成反应免疫后天数＊佐剂 7 14 21 2.8 35盐水 1.04 0.84 1.03 8.56 11.19明矾 1.59 5.54 3.16 86.6 82.1100μg 0.87 1.65 2.04 155.3 138.050μg 1.18 0.75 2.99 54.2 86.210μg 1.61 3.15 1.49 85.9 131.9＊抗肽抗体浓度，μg/ml表3所示结果表明，长链烷基酯，即酪氨酸十八醇酯，与另一种免疫原性多肽，即衍生于HlV蛋白质gp41之氨基酸503至535的多肽合用表现出浓度依赖性佐剂效果。另外，当达到最佳抗体滴度后，该滴度便不再增加。
3)狒狒实验用300μg已与钥孔、
血兰蛋白偶联的、相当于HlV-1残基503-535之氨基酸序列的化学合成多肽免疫两只狒狒。按实施例2中所述方法将500μg酪氨酸十八醇酯盐酸化物与该多肽复合。于第一天注射总体积1.0ml的该混合物，并于第35天作加强免疫。于第一次免疫前3天、免疫后14、32和49天采血。用另外两只狒狒作同样实验，但使用的免疫原是相当于HIV-1之氨基酸序列526-535的多肽。
用放射免疫法间接检测血清中的抗体浓度。通过在用肽-白蛋白结合物包被的平板上保温样品，并与I125标记的免抗猴免疫球蛋白反应进行滴定。结果示于表4中。
表4所示结果表明，可在高等动物，如狒狒身上观察到长链烷基酯(酪氨酸十八醇酯)和免疫原性HIV多肽间的佐剂效果。
实施例6本实施例证明从铝佐剂化候选肝炎疫苗改为酪氨酸十八醇酯佐剂化候选肝炎疫苗时发生的抗体型改变。
方法如实施例5第2部分(小鼠)所述，不同的是使用50μg酪氨酸十八醇酯进行第一次和第二次(21天)免疫。用放射免疫法检测抗体反应的异型，其中使用了氚标记的抗小鼠异型抗体。在用免疫亲和纯化之乙型肝炎表面抗原包被的平板上保温样品，以进行滴定。结果以结合了异型抗体的放射活性(cpm)表示，并示于下列表5中。
表5中所示结果表明，用免疫原性多肽(乙型肝炎表面抗原)进行免疫时，将佐剂由铝改为长链烷基酯(酪氨酸十八醇酯-OT)可引起抗体反应之异型的改变。具体地说，与对照组所得数据相比，当使用铝时IgE抗体的水平升高，而当使用酪氨酸十八醇酯时则IgE水平没有明显升高。
权利要求
1.一种疫苗组合物，含有同源免疫原性多肽及有效量的下列通式的至少一种佐剂
其中C选自氢、氨基酸残基，和肽残基；D选自氢和医药上可接受的酸；E选自4-羟苄基、苄基、4-羟苯基、苯基、4-氨丁基、异丙基、甲基、氢和天然存在的氨基酸残基；A是(CH2)n、氧或CH2O，且B是(CH2)n或氧、这里n是0至4，条件是A和B的(CH2)n和氧不是一样的；且R是有12至20个碳原子的烷基。
2.根据权利要求1的组合物，其中所说的佐剂包含有L-构型的氨基酸。
3.根据权利要求1的组合物，其中所说的佐剂包含有D-构型的氨基酸。
4.根据权利要求1的组合物，其中所说的佐剂包含D和L-构型氨基酸的混合物。
5.根据权利要求1的组合物，其中E选自4-羟苄基、苄基、4-羟苯基、苯基和氢。
6.根据权利要求5的组合物，其中E是4-羟苄基。
7.根据权利要求1的组合物，其中C选自氢、氨基酸，和包括多达10个氨基酸残基的肽残基。
8.根据权利要求7的组合物，其中所说的肽残基选自二肽和三肽。
9.根据权利要求7的组合物，其中C氨基酸并选自于酪氨酰甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰酪氨酸和苯丙氨酰甘氨酸。
10.根据权利要求8的组合物，其中C是二肽并选自于酪氨酰甘氨酰甘氨酸和酪氨酰丙氨酰甘氨酸。
11.根据权利要求1的组合物，其中医药上可接受的酸选自盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸，乳酸和乙酸。
12.根据权利要求1的组合物，其中所说的佐剂包含α-氨基酸。
13.根据权利要求1的组合物，其中所说的同源多肽选自于线性和成环多肽。
14.根据权利要求1的组合物，其中所说的同源多肽是与生物学载体偶联的。
15.根据权利要求14的组合物，其中所说的载体选自破伤风类毒素、白喉类毒素、无细胞百日咳疫苗(LPS)、交联反应材料(CRM)和细菌蛋白质载体。
16.根据权利要求15的组合物，其中所说的CRM是CRM197。
17.根据权利要求1的组合物，其中所说的同源多肽基本上是选自爱滋病、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、破伤风、脊髓灰质炎、百日咳(淋巴细胞增多促进因子毒素)、单纯性疱疹、呼吸道合胞病毒、麻疹、流感病毒、狂犬病、雷萨热(lassa fever)、轮状病毒、腺病毒、鼻病毒、口蹄疫、牛和猫白血病病毒、牛疫病毒、革登热病毒、蜱传播的脑炎、疟疾和付流感病毒的致病因子衍生的一个或多个抗原决定基组成的。
18.根据权利要求1的组合物，其中所说的同源多肽基本上与肝炎病毒的表面抗原有同样的氨基酸序列。
19.根据权利要求1的组合物，其中所说的同源多肽包含肝炎病毒表面抗原的一个或多个抗原决定基。
20.根据权利要求1的组合物，其中所说的同源多肽包含基本上与乙型肝炎表面抗原相同的氨基酸序列。
21.根据权利要求1的组合物，其中所说的同源多肽具有基本上与单纯疱疹病毒的gD亚单位之表面抗原相同的氨基酸序列。
22.根据权利要求1的组合物，其中所说的同源多肽包含人类免疫缺陷病毒之gp120的一个或多个抗原决定基。
23.根据权利要求1的组合物，其中所说的同源多肽包含人类免疫缺陷病毒之gp41的一个或多个抗原决定基。
24.根据权利要求1的组合物，其中所说的同源多肽具有基本上与淋巴细胞增多促进因子相同的氨基酸序列。
25.根据权利要求1的组合物，其中所说的佐剂是含14至20个碳原子之烷基醇以及氨基酸、二肽或三肽的酯。
26.根据权利要求25的组合物，其中所说的佐剂是酪氨酸十八醇酯。
27.一种引发病人体内免疫反应的方法，该方法包括给所说的病人使用治疗有效量的权利要求1的疫苗组合物。
28.根据权利要求27的方法，其中所说的组合物是经肌肉内、皮内、皮下途径，或以滴鼻方式给药的。
29.根据权利要求27的方法，其中给予所说的疫苗组合物基本上不增高IgE抗体水平，并且不增加IgG2a对IgG1抗体的比例。
全文摘要
提供了包含长链烷基化合物作为结合同源免疫原性多肽免疫佐剂的改良的疫苗组合物。本发明的组合物可用于激活免疫系统，以一种预防方式赋予宿主以抗该免疫原的免疫力。
文档编号C07K14/16GK1056816SQ91102899
公开日1991年12月11日 申请日期1991年5月7日 优先权日1990年5月7日
发明者查里斯托夫·L·佩尼 申请人:北美疫苗公司
再多了解一些
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