一种具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的制备方法与流程

1.本发明涉及一种碳点/多孔二氧化硅纳米酶的制备方法。


背景技术：

2.纳米酶，具有高结构稳定性、可调节催化活性、功能多样性、可回收性和大规模制备可行性类酶活性纳米材料的特点，表现出类似天然酶的酶促反应动力学和催化机理。近年来已成为人工酶领域的研究热点，并有望在实际应用中成为天然酶的潜在替代品。此外，很多纳米酶具有过氧化物酶(pod)、氧化物酶(oxd)、过氧化氢酶(cat)和超氧化物歧化酶(sod)活性，可对生命活动中产生的活性氧(ros)水平进行调解，在生物医学领域具有广阔的应用前景。
3.癌症被认为是威胁人类健康的主要疾病之一，设计和开发新的纳米技术是一种有效的治疗策略。近年来，能够在肿瘤细胞微环境内(弱酸性、高h2o2浓度)产生催化活性物质的“纳米酶”引起了人们的极大兴趣。研究表明，具有pod活性纳米酶可在酸性条件与过氧化氢作用产生高毒性的羟基自由基(
·
oh)，从而引起肿瘤细胞的凋亡甚至坏死。因此，可利用纳米酶这一特性用于肿瘤治疗。但是，目前报道的纳米酶大多为金属基纳米材料，具有潜在的生物毒性。此外，还存在制备方法复杂、成本高和不易操作等缺点。因此，如何采用简单易行策略来构建不含金属元素的纳米酶用于抗肿瘤治疗仍然是一个挑战。
4.碳点(cds)作为一种新兴的小尺寸(<10nm)零维碳材料，自从2004年问世以来受到人们的广泛关注。碳点表面丰富的基团(如羟基、羧基和氨基等)赋予其优异的亲水性并且易于表面修饰。此外，碳点还具有良好的生物相容性和无毒等优点，在生物医学领域具有广阔的应用前景。碳点表面的碳原子具有sp2杂化的类石墨烯结构和非零带隙，具有典型半导体的特性，在催化、传感和疾病治疗方面具有潜在的应用前景。最近，有文献报道碳点还具有良好的pod酶活性，并用抗菌和抗肿瘤的生物材料。但是，碳点由于其超小尺寸和超亲水性，造成产品分离困难。目前，分离碳点的方法主要有透析法和色谱分离法，存在耗时、成本高和产量低等问题，很难规模化得到产品。另外，碳点还存在容易团聚的问题，降低了其催化活性。
5.鉴于此，将碳点与其他纳米材料进行复合被认为是一种可有效解决上述问题的有效策略。多孔二氧化硅具有大的比表面积和有序的孔结构、表面丰富的硅羟基、良好的生物相容性和无毒等优点，是一种优良的生物材料。因此，如果将碳点负载到二氧化硅表面将得到一种具有酶活性的多孔二氧化硅纳米酶。目前，文献报道合成碳点/多孔二氧化硅的方法主要有两种。一是后合成法，即先合成多孔二氧化硅基质材料，然后碳点或碳点前躯体负载多孔二氧化硅孔道内，在通过吸附或水热处理得到碳点/多孔二氧化硅纳米酶；该法的缺点是容易造成碳点从多孔二氧化硅中流失，因为碳点主要依靠与二氧化硅表面间的硅羟基形成分子间氢键作用，二者的相互作用较弱。另一种方法是原位合成法，即在合成多孔二氧化硅过程中将预先制备的碳点引入到二氧化硅骨架中。该法需要多步合成，首先合成碳点，然
后再通过溶胶
‑
凝胶法将碳点引入到二氧化硅表面和骨架中。由于碳点不易分离，造成分离过程(如透析法、色谱柱分离法)耗时、成本高和不易规模化生产。


技术实现要素：

6.本发明要解决现有碳点/多孔二氧化硅纳米酶制备工艺复杂，且碳点易与多孔二氧化硅分离的问题，进而提供一种具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的制备方法。
7.一种具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的制备方法，它是按以下步骤进行的：
8.一、碳点/多孔二氧化硅纳米酶的制备：
9.向模板剂十六烷基三甲基溴化铵中依次加入去离子水和三乙胺，在油浴温度为80℃～95℃及搅拌速度为200rpm～400rpm的条件下，搅拌0.5h～2h，然后加入正硅酸四乙酯及柠檬酸，在油浴温度为80℃～95℃及搅拌速度为200rpm～400rpm的条件下，搅拌1h～2h，最后在温度为150℃～180℃的条件下，反应2h～4h，得到反应液，将反应液冷却到室温，然后离心得白色沉淀，白色沉淀洗涤及干燥，得到未脱除模板剂的碳点/多孔二氧化硅纳米酶；
10.所述的十六烷基三甲基溴化铵的质量与去离子水的体积比为1g:(30～50)ml；所述的十六烷基三甲基溴化铵与三乙胺的质量比为1:(0.1～0.15)；所述的十六烷基三甲基溴化铵的质量与正硅酸四乙酯的体积比为1g:(3～5)ml；所述的十六烷基三甲基溴化铵与柠檬酸的质量比为1:(2～3)；
11.二、脱除模板剂十六烷基三甲基溴化铵：
12.①
、向碳点/多孔二氧化硅纳米酶中加入nacl/乙醇混合液；
13.所述的碳点/多孔二氧化硅纳米酶的质量与nacl/乙醇混合液的体积比为1g:(60～100)ml；
14.②
、在温度为60℃～70℃及频率为30khz～80khz的条件下，超声震荡1.5h～3h；
15.③
、重复步骤二
②
中2次～4次；
16.④
、冷却、离心、洗涤及干燥，得到具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶。
17.本发明的有益效果是：
18.本发明采用一锅法合成碳点/多孔二氧化硅纳米酶，具有以下优点：
19.一、与传统的纳米酶相比，该纳米酶不含金属离子，不会造成生物体内金属离子的中毒，有利于在生物医学领域得到应用。
20.二、与非一步合成法相比，该法制备的碳点/多孔二氧化硅纳米酶碳点不易与载体分离。这是因为在通过溶胶
‑
凝胶形成二氧化硅网络中，碳点前驱体柠檬酸通过化学作用进入到二氧化硅的骨架中(红外表征结果可证实)，再通过水热过程实现碳点在二氧化硅凝胶网络中的原位生成。正是由于碳点与二氧化硅的强相互作用，导致碳点不易从二氧化硅上脱落。
21.三、该纳米酶合成方法简单，不需要多步合成，反应条件温和，易操作，并且产量较高(可达克级)，适合规模化生产。
22.四、该纳米酶不仅具有过氧化物酶(pod)活性，还具有多孔结构、良好的亲水性和分散性、无毒和易于表面修饰等优点。
23.由于该纳米酶具有pod活性，可利用其与肿瘤微环境内过量表达的过氧化氢反应，生成具有较强生物毒性的羟基自由基(
·
oh)来杀死肿瘤细胞，因此可用于抗肿瘤治疗。
24.本发明用于一种具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的制备方法。
附图说明
25.图1为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的xrd图；
26.图2为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的tem图；
27.图3为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的stem图；
28.图4为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶在水溶液中经超声震荡、沸水回流后得到的stem图；
29.图5为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的数码照片；
30.图6为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的dls粒径分布图；
31.图7为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的zeta电位；
32.图8为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的eds能谱；
33.图9为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的低温氮气吸附
‑
脱附图；
34.图10为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的氮气吸附孔径分布图；
35.图11为ft
‑
ir图，1为多孔二氧化硅，2为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶；
36.图12为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的紫外可见漫反射光谱图；
37.图13为在过氧化氢存在下，实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶与tmb孵育不同时间后的紫外可见吸收光谱图；
38.图14为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的电子顺磁共振光谱图；a为具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶在pbs溶液中的esr光谱曲线，b为具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶在含有过氧化氢的pbs溶液中的esr光谱曲线；
39.图15为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶对染料亚甲基蓝的降解行为。
具体实施方式
40.具体实施方式一：本实施方式一种具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的制备方法，它是按以下步骤进行的：
41.一、碳点/多孔二氧化硅纳米酶的制备：
42.向模板剂十六烷基三甲基溴化铵中依次加入去离子水和三乙胺，在油浴温度为80℃～95℃及搅拌速度为200rpm～400rpm的条件下，搅拌0.5h～2h，然后加入正硅酸四乙酯及柠檬酸，在油浴温度为80℃～95℃及搅拌速度为200rpm～400rpm的条件下，搅拌1h～2h，最后在温度为150℃～180℃的条件下，反应2h～4h，得到反应液，将反应液冷却到室温，然后离心得白色沉淀，白色沉淀洗涤及干燥，得到未脱除模板剂的碳点/多孔二氧化硅纳米酶；
43.所述的十六烷基三甲基溴化铵的质量与去离子水的体积比为1g:(30～50)ml；所述的十六烷基三甲基溴化铵与三乙胺的质量比为1:(0.1～0.15)；所述的十六烷基三甲基溴化铵的质量与正硅酸四乙酯的体积比为1g:(3～5)ml；所述的十六烷基三甲基溴化铵与柠檬酸的质量比为1:(2～3)；
44.二、脱除模板剂十六烷基三甲基溴化铵：
45.①
、向碳点/多孔二氧化硅纳米酶中加入nacl/乙醇混合液；
46.所述的碳点/多孔二氧化硅纳米酶的质量与nacl/乙醇混合液的体积比为1g:(60～100)ml；
47.②
、在温度为60℃～70℃及频率为30khz～80khz的条件下，超声震荡1.5h～3h；
48.③
、重复步骤二
②
中2次～4次；
49.④
、冷却、离心、洗涤及干燥，得到具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶。
50.本实施方式采用一锅法制备了不含金属离子和具有pod酶活性的碳点/多孔二氧化硅纳米酶，通过简单的离心过程即可得到克级产品。该法具有合成简单，产品易分离和可大规模生产等优点。另外，所制备的碳点/多孔二氧化硅具有较好的pod活性，在肿瘤微环境中可有效产生高毒性
·
oh，可用于抗肿瘤治疗。
51.本实施方式的有益效果是：
52.本实施方式采用一锅法合成碳点/多孔二氧化硅纳米酶，具有以下优点：
53.一、与传统的纳米酶相比，该纳米酶不含金属离子，不会造成生物体内金属离子的中毒，有利于在生物医学领域得到应用。
54.二、与非一步合成法相比，该法制备的碳点/多孔二氧化硅纳米酶碳点不易与载体分离。这是因为在通过溶胶
‑
凝胶形成二氧化硅网络中，碳点前驱体柠檬酸通过化学作用进入到二氧化硅的骨架中(红外表征结果可证实)，再通过水热过程实现碳点在二氧化硅凝胶网络中的原位生成。正是由于碳点与二氧化硅的强相互作用，导致碳点不易从二氧化硅上脱落。
55.三、该纳米酶合成方法简单，不需要多步合成，反应条件温和，易操作，并且产量较高(可达克级)，适合规模化生产。
56.四、该纳米酶不仅具有过氧化物酶(pod)活性，还具有多孔结构、良好的亲水性和分散性、无毒和易于表面修饰等优点。
57.由于该纳米酶具有pod活性，可利用其与肿瘤微环境内过量表达的过氧化氢反应，生成具有较强生物毒性的羟基自由基(
·
oh)来杀死肿瘤细胞，因此可用于抗肿瘤治疗。
58.具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一及步骤二
④
中所述的离心具体为在4000r/min～6000r/min的条件下，离心5min～15min。其它与具体实施方式一相同。
59.具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二之一不同的是：步骤一及步骤二
④
中所述的洗涤具体为用去离子水和无水乙醇分别洗涤2次～4次。其它与具体实施方式一或二相同。
60.具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一及步骤二
④
中所述的干燥具体为在温度为40℃～70℃的条件下，真空干燥8h～12h。其它与具体实施方式一或二相同。
61.具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二中所述的nacl/乙醇混合液中nacl的浓度为8mg/ml～15mg/ml。其它与具体实施方式一至四相同。
62.具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤一中向十六烷基三甲基溴化铵中依次加入去离子水和三乙胺，在油浴温度为85℃～95℃及搅拌速度为200rpm～300rpm的条件下，搅拌0.5h～1h。其它与具体实施方式一至五相同。
63.具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤一中然后加入正硅酸四乙酯及柠檬酸，在油浴温度为85℃～95℃及搅拌速度为200rpm～300rpm的条件下，搅拌1h～1.5h。其它与具体实施方式一至六相同。
64.具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤一中最后在温度为150℃～160℃的条件下，反应3h～4h，得到反应液。其它与具体实施方式一至七相同。
65.具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤一中所述的十六烷基三甲基溴化铵的质量与去离子水的体积比为1g:(40～50)ml；步骤一中所述的十六烷基三甲基溴化铵与三乙胺的质量比为1:0.1；步骤一中所述的十六烷基三甲基溴化铵的质量与正硅酸四乙酯的体积比为1g:(3～4)ml；步骤一中所述的十六烷基三甲基溴化铵与柠檬酸的质量比为1:(2～2.5)。其它与具体实施方式一至八相同。
66.具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤二
①
中所述的碳点/多孔二氧化硅纳米酶的质量与nacl/乙醇混合液的体积比为1g:(80～100)ml。其它与具体实施方式一至九相同。
67.采用以下实施例验证本发明的有益效果：
68.实施例一：
69.一种具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的制备方法，它是按以下步骤进行的：
70.一、碳点/多孔二氧化硅纳米酶的制备：
71.向模板剂十六烷基三甲基溴化铵中依次加入去离子水和三乙胺，在油浴温度为95℃及搅拌速度为200rpm的条件下，搅拌0.5h，然后加入正硅酸四乙酯及柠檬酸，在油浴温度为95℃及搅拌速度为200rpm的条件下，搅拌1h，最后置于聚四氟乙烯为内衬的高压釜内，在
温度为150℃的条件下，反应4h，得到反应液，将反应液冷却到室温，然后离心得白色沉淀，白色沉淀洗涤及干燥，得到未脱除模板剂的碳点/多孔二氧化硅纳米酶；
72.所述的十六烷基三甲基溴化铵的质量与去离子水的体积比为1g:40ml；所述的十六烷基三甲基溴化铵与三乙胺的质量比为1:0.1；所述的十六烷基三甲基溴化铵的质量与正硅酸四乙酯的体积比为1g:3ml；所述的十六烷基三甲基溴化铵与柠檬酸的质量比为1:2；
73.二、脱除模板剂十六烷基三甲基溴化铵：
74.①
、向碳点/多孔二氧化硅纳米酶中加入nacl/乙醇混合液；
75.所述的碳点/多孔二氧化硅纳米酶的质量与nacl/乙醇混合液的体积比为1g:100ml；
76.②
、在温度为60℃及频率为40khz的条件下，超声震荡2h；
77.③
、重复步骤二
②
中2次；
78.④
、冷却、离心、洗涤及干燥，得到具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶。
79.步骤一及步骤二
④
中所述的离心具体为在4000r/min的条件下，离心10min。
80.步骤一中所述的洗涤具体为用去离子水和无水乙醇分别洗涤3次。
81.步骤二
④
中所述的洗涤具体为用去离子水和无水乙醇分别洗涤2次
82.步骤一及步骤二
④
中所述的干燥具体为在温度为60℃的条件下，真空干燥12h。
83.步骤二中所述的nacl/乙醇混合液中nacl的浓度为15mg/ml。
84.图1为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的xrd图；由图可知，具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶在2θ＝22
°
附近有一馒头状衍射峰，这是无定形二氧化硅的特征衍射峰。这表明碳点/多孔二氧化硅纳米酶成功合成。
85.图2为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的tem图；由图可知，碳点/多孔二氧化硅纳米酶为40nm左右的球形纳米粒子，并且具有明显的多孔结构。
86.图3为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的stem图；由图可知，在球形二氧化硅表面分布着均匀的碳点，碳点的尺寸约为2nm。这表明通过一锅法反应，确实形成了碳点/多孔二氧化硅纳米酶。
87.图4为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶在水溶液中经超声震荡、沸水回流后得到的stem图。在40khz的条件下超声震荡3h，然后沸水中回流12h，由图可见，所合成的碳点/多孔二氧化硅纳米酶经过超声震荡、水煮等过程后，依然可见大量碳点分布在多孔二氧化硅表面，这是因为碳点与多孔二氧化硅表面存在强相互作用所致(红外表征结果已证实)。
88.图5为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的数码照片；由图可知，采用一锅法可一次制备较大量的碳点/多孔二氧化硅纳米酶(1.2g)，可规模化生产。
89.图6为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的dls粒径分布图；由图可知，碳点/多孔二氧化硅纳米酶的dls粒径约为85nm。
90.图7为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的zeta
电位；由图可知，碳点/多孔二氧化硅纳米酶的zete约为
‑
46mv，这是因为碳点/多孔二氧化硅纳米酶表面含有大量亲水性基团所致。
91.图8为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的eds能谱；由图可知，碳点/多孔二氧化硅纳米酶主要含有c、si及o等元素。
92.图9为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的低温氮气吸附
‑
脱附图；由图可知，碳点/多孔二氧化硅纳米酶具有典型的iv滞后环，这是介孔材料的典型特征，表明碳点/多孔二氧化硅纳米酶具有多孔结构。
93.图10为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的氮气吸附孔径分布图；由图可知，碳点/多孔二氧化硅纳米酶的最可几孔径约为2.6nm。
94.图11为ft
‑
ir图，1为多孔二氧化硅，2为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶；由图可知，纯msn(多孔二氧化硅)在1089cm
‑1处的吸收峰为si
‑
o
‑
si的伸缩振动。而碳点/多孔二氧化硅(cds/msn)纳米酶的吸收红移到1101cm
‑1，表明碳点与二氧化硅之间存在较强的相互作用。
95.图12为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的紫外可见漫反射光谱图；由图可知，碳点/多孔二氧化硅纳米酶具有较窄的带隙，约为2.91ev。较窄的带隙有利于发挥其pod活性，生产羟基自由基。
96.以3,5,3',5'
‑
四甲基联苯胺(tmb)为底物，验证实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的过氧化酶(pod)活性。实验方法：将实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶分散到3.0ml ph＝6.0的pbs中，超声分散1min后，得到浓度为0.1mg/ml的均一悬浊液，然后加入过氧化氢，使溶液中过氧化氢浓度为0.2mm，摇匀后加入100μl tmb/dmso溶液(tmb/dmso溶液中tmb浓度为10mg/ml)，反应不同时间后用紫外可见分光光度计测试溶液在652nm处的吸光度。图13为在过氧化氢存在下，实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶与tmb孵育不同时间后的紫外可见吸收光谱图。当有羟基自由基存在时，无色的tmb可被氧化为蓝色的氧化态ox
‑
tmb，并在652nm有强烈吸收。由图可知，随时间的延长，tmb在652nm处的吸收峰逐渐增强(吸光度由0.46增加到1.72)，表明碳点/多孔二氧化硅纳米酶具有过氧化酶活性。
97.图14为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶的电子顺磁共振光谱图；a为具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶在pbs溶液中的esr光谱曲线，b为具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶在含有过氧化氢的pbs溶液中的esr光谱曲线。以捕获剂为dmpo，将具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶分散于ph＝6.0pbs溶液中作为对照曲线，同时将具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶分散于过氧化氢浓度为5mm的pbs溶液中(ph＝6.0)；由图可知，当碳点/多孔二氧化硅纳米酶与h2o2孵育5min后，有较强羟基自由信号的产生。这表明碳点/多孔二氧化硅纳米酶可与肿瘤tme内的h2o2反应，生成毒性较强的羟基自由。因此，碳点/多孔二氧化硅纳米酶可用于抗肿瘤治疗。
98.图15为实施例一制备的具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶对染料亚甲基蓝的降解行为。实验方法：取浓度为10mg/l的mb水溶液3ml，分别加入1mg具有类过氧化物酶活性碳点/多孔二氧化硅纳米酶和5μl过氧化氢，室温避光搅拌不同时间后用紫外可见分光光度计测溶液中残留mb溶液的吸光度。由图可见，碳点/多孔二氧化硅纳米酶在过氧
化氢存在下，可有效降解mb染料，20min内mb的降解率约为20％，这是因为负载到二氧化硅表面的碳点与过氧化氢相互作用生成羟基自由基的所致，这与esr表征的结果相一致。