检测分子标记的KASP引物组及其在鉴定小麦胚芽鞘长度中的应用

本发明涉及分子生物学及遗传育种领域，特别是涉及检测分子标记的kasp引物组及其在鉴定小麦胚芽鞘长度中的应用。

背景技术：

1、小麦（triticum aestivum l.）是最重要的粮食作物之一。干旱胁迫是限制小麦产量和品质的主要非生物胁迫因素之一，尤其在干旱和半干旱地区，小麦生产受到严重影响。随着全球气候变化加剧，干旱发生的频率和强度不断增加，培育耐旱小麦品种已成为保障粮食安全的迫切需求。

2、胚芽鞘长度（coleoptile length）是小麦耐旱性的重要指示性状。较长的胚芽鞘使小麦种子可以播种到更深的土层（3-5英寸深度），在土壤深层水分更充足的条件下顺利出苗，而表土在干旱条件下容易干燥，不利于浅播种子萌发。因此，长胚芽鞘性状与小麦的旱地适应性密切相关，是耐旱育种中重要的筛选指标。

3、近年来，随着分子标记技术和基因组学的发展，全基因组关联分析（gwas）已被广泛应用于小麦重要农艺性状的遗传解析。竞争性等位基因特异性pcr（kasp）标记技术作为一种高通量、低成本、高准确性的基因分型平台，已被广泛应用于分子标记辅助选择育种。然而，目前关于小麦胚芽鞘长度相关基因的紧密连锁分子标记报道较少，亟需开发与小麦耐旱相关胚芽鞘长度基因紧密连锁的分子标记，以加速小麦耐旱品种的选育进程。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供检测分子标记的kasp引物组及其在鉴定小麦胚芽鞘长度中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的kasp引物组能直接对snp变异位点的a或g碱基进行特异区分和检测。经验证，基因型为aa的小麦品系胚芽鞘长度显著大于基因型为gg的小麦品系。且长胚芽鞘单倍型（aa）对应耐旱表型，短胚芽鞘单倍型（gg）对应敏旱表型。因此，本发明提供的kasp引物组的应用方法准确可靠，操作简便，适用于小麦胚芽鞘长度鉴定及耐旱品系育种。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供检测分子标记的kasp引物组，所述分子标记的核苷酸序列如seq idno.4所示，在第20位碱基处存在g/a突变，该位点的基因型包括gg和aa；

4、所述kasp引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物1、核苷酸序列如seq id no.2所示的正向引物2和核苷酸序列如seq id no.3所示的反向引物。

5、本发明还提供所述的kasp引物组在制备鉴定小麦胚芽鞘长度的试剂盒中的应用。

6、本发明还提供一种鉴定小麦胚芽鞘长度的试剂盒，包含所述的kasp引物组。

7、本发明还提供所述的kasp引物组或所述的试剂盒在以下任一项中的应用：

8、（1）鉴定小麦胚芽鞘长度；

9、（2）筛选长胚芽鞘的小麦品种或品系；

10、（3）鉴别小麦耐旱性；

11、（4）筛选耐旱的小麦品种或品系；

12、（5）小麦耐旱分子标记辅助育种；

13、（6）改良小麦耐旱种质资源。

14、本发明还提供一种鉴定小麦胚芽鞘长度的方法，包括以下步骤：

15、以待测小麦的基因组dna作为模板，利用所述的kasp引物组进行荧光定量pcr扩增，读取荧光信号获得待测小麦的基因型；

16、若基因型为gg，则判断待测小麦的胚芽鞘短；若基因型为aa，则判断待测小麦的胚芽鞘长。

17、本发明还提供一种鉴别小麦耐旱性的方法，包括以下步骤：

18、以待测小麦的基因组dna作为模板，利用所述的kasp引物组进行荧光定量pcr扩增，读取荧光信号获得待测小麦的基因型；

19、若基因型为gg，则判断待测小麦对干旱敏感；若基因型为aa，则判断待测小麦耐旱。

20、可选的是，所述荧光定量pcr扩增的反应体系为：2×kasp mastermix 5μl、kasp混合引物1.4μl、dna模板1μl和无核酶水2.6μl；

21、所述kasp混合引物中正向引物f1、正向引物2和反向引物的体积比为2:2:5。

22、可选的是，所述荧光定量pcr扩增的程序为：95℃预变性10min；95℃变性20s，61℃退火延伸40s，循环10次，每次退火延伸温度降低0.6℃；95℃变性20s，55℃退火延伸40s，循环40次；35℃ 60s。

23、本发明公开了以下技术效果：

24、本发明首次通过全基因组关联分析（gwas）鉴定了位于小麦4a染色体上与胚芽鞘长度显著关联的基因位点ta4a-hx1，该位点与小麦耐旱性密切相关，在小麦耐旱育种中具有较高的利用价值。同时开发了可以用于检测基因位点ta4a-hx1的快速、高效kasp引物组，该kasp引物组在鉴定小麦胚芽鞘长度中具有重要价值。本发明提供的kasp引物组能直接对snp变异位点的a或g碱基进行特异区分和检测。经验证，基因型为aa的小麦品系胚芽鞘长度显著大于基因型为gg的小麦品系。且长胚芽鞘单倍型（aa）对应耐旱表型，短胚芽鞘单倍型（gg）对应敏旱表型。因此，本发明提供的kasp引物组的应用方法准确可靠，操作简便，适用于小麦胚芽鞘长度鉴定及耐旱品系育种。

1.检测分子标记的kasp引物组，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如seq idno.4所示，在第20位碱基处存在g/a突变，该位点的基因型包括gg和aa；

2.如权利要求1所述的kasp引物组在制备鉴定小麦胚芽鞘长度的试剂盒中的应用。

3.一种鉴定小麦胚芽鞘长度的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的kasp引物组。

4.如权利要求1所述的kasp引物组或权利要求3所述的试剂盒在以下任一项中的应用：

5.一种鉴定小麦胚芽鞘长度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.一种鉴别小麦耐旱性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述荧光定量pcr扩增的反应体系为：2×kasp mastermix 5μl、kasp混合引物1.4μl、dna模板1μl和无核酶水2.6μl；

8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述荧光定量pcr扩增的程序为：95℃预变性10min；95℃变性20s，61℃退火延伸40s，循环10次，每次退火延伸温度降低0.6℃；95℃变性20s，55℃退火延伸40s，循环40次；35℃ 60s。