胰蛋白肽来源的功能小分子肽及其在药物递送中的应用的制作方法

本发明涉及生物医学工程与药物递送，特别涉及胰蛋白肽来源的功能小分子肽及其在药物递送中的应用。

背景技术：

1、药物递送系统（drug delivery system, dds）是指将药物通过特定载体输送至靶器官、靶组织或靶细胞，实现药物的可控释放、提高药物生物利用度、降低药物毒副作用的一类制剂技术。理想的药物递送载体应具备良好的生物相容性、生物可降解性、靶向性及稳定的药物负载与释放能力。

2、目前，常用的药物递送载体包括脂质体、聚合物纳米粒、无机纳米材料、蛋白质/多肽载体等。其中，多肽类载体因具有分子量小、生物相容性好、易被降解、可特异性识别靶细胞等优势，成为药物递送领域的研究热点。胰蛋白肽是由胰蛋白酶水解蛋白质得到的混合物，含有多种生物活性肽段，但现有技术中尚未从胰蛋白肽中筛选出具有明确药物递送功能的小分子肽，也未将其应用于药物递送系统的构建。

3、现有多肽类药物递送载体存在以下不足：部分多肽载体靶向性不强，难以精准富集于靶组织；部分多肽载体生物稳定性较差，在体内易被酶降解，导致药物提前释放；此外，部分人工合成多肽载体存在生物相容性不佳、制备工艺复杂、成本较高等问题，限制了其临床应用。因此，开发一种来源天然、生物相容性好、靶向性强、制备简便的多肽类药物递送载体具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，针对现有药物递送载体存在的靶向性不强、生物稳定性差、生物相容性不佳等问题，本发明提供一种胰蛋白肽来源的功能小分子肽，该小分子肽具有良好的生物相容性、靶向性及生物可降解性，可作为药物递送载体的核心成分，构建高效、安全的药物递送系统，提升药物治疗效果，降低毒副作用。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了胰蛋白肽来源的功能小分子肽，所述功能小分子肽具有：

4、（i）、如seq id no:1所示的氨基酸序列；或

5、（ii）、如（i）所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与（i）的相同或相似；或

6、（iii）、与如（i）或（ii）所示的氨基酸序列至少有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源性的氨基酸序列；

7、作为优选，所述功能小分子肽的分子量为728.85 da，等电点为8.92；

8、作为优选，所述功能小分子肽在25℃下，水中溶解度不低于150 mg/ml。

9、第二方面，本发明还提供了所述功能小分子肽的制备方法，包括以下步骤：

10、步骤1：取胰蛋白肽经预处理，过滤后，收集滤液；

11、步骤2：取所述滤液与胰蛋白酶混合，酶解后终止酶解反应，收集酶解液；

12、步骤3：取所述酶解液离心，收集上清液过滤除沉淀，纯化，干燥后获得所述功能小分子肽。

13、在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述预处理包括将所述胰蛋白肽溶于ph 7.4、浓度为0.05 mol/l的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为5~10 mg/ml的胰蛋白肽溶液；

14、作为优选，步骤1中所述过滤采用0.22 μm有机滤膜真空抽滤；

15、作为优选，步骤2中所述胰蛋白酶的酶活≥25000 u/g，酶添加量为所述胰蛋白肽质量的1~3%；

16、作为优选，步骤2中所述酶解包括在37℃恒温水浴、ph值 7.4的条件下酶解2~4 h；所述ph值采用0.1 mol/l naoh或0.1 mol/l hcl调节；

17、作为优选，步骤2中所述终止酶解反应包括加入质量浓度为10%的三氯乙酸溶液，使体系中三氯乙酸的终浓度为1%，静置15 min终止酶解反应；

18、作为优选，步骤3中所述离心包括于8000 r/min、4℃条件下离心20 min；

19、作为优选，步骤3中所述过滤采用0.22 μm滤膜脱除沉淀；

20、作为优选，步骤3中所述纯化包括第一纯化和第二纯化；

21、作为优选，所述第一纯化采用sephadex g-10层析柱，以ph 7.4、0.05 mol/l磷酸盐缓冲液为洗脱液，洗脱流速0.8~1.2 ml/min，紫外检测器220 nm波长下检测，收集对应分子量700~750 da的组分；

22、作为优选，所述第二纯化将所述第一纯化获得的所述组分通过反相高效液相色谱（rp-hplc）进一步纯化；

23、更优选的，所述第二纯化的色谱柱选用c18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液（体积比15:85），洗脱流速1.0 ml/min，柱温30℃，收集保留时间12~15 min的单一吸收峰组分；

24、作为优选，步骤3中所述干燥包括真空冷冻干燥；

25、更优选的，所述真空冷冻干燥为于-40℃、真空度10-20 pa的条件下，冻干8 h；

26、作为优选，所述制备方法还包括鉴定的步骤；

27、更优选的，所述鉴定采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（maldi-tof-ms）对步骤3所得产物进行分子量鉴定；

28、更优选的，所述鉴定采用埃德曼降解法进行氨基酸序列分析。

29、第三方面，本发明还提供了所述制备方法制得的功能小分子肽。

30、第四方面，本发明还提供了如下任一项在制备药物递送载体和/或药物递送系统中的应用；

31、（i）、如第一方面所述的功能小分子肽；

32、（ii）、如第三方面所述的功能小分子肽。

33、第五方面，本发明还提供了药物递送载体，包括如下任一项和药学上可接受的辅料：

34、（i）、如第一方面所述的功能小分子肽；

35、（ii）、如第三方面所述的功能小分子肽；

36、作为优选，所述药学上可接受的辅料包括但不限于稳定剂、助溶剂、靶向修饰剂或缓释调节剂中的一种或多种；

37、更优选的，所述稳定剂与所述功能小分子肽的质量比为（0.5-2.0）:10；

38、更优选的，所述助溶剂与所述功能小分子肽的质量比为（0.3-1.0）:10；

39、更优选的，所述靶向修饰剂与所述功能小分子肽的质量比为（0.8-1.5）:10；

40、更优选的，所述缓释调节剂与所述功能小分子肽的质量比为（1.0-2.5）:10；

41、作为优选，当所述药学上可接受的辅料包括稳定剂、助溶剂、靶向修饰剂和缓释调节剂时，所述稳定剂、所述助溶剂、所述靶向修饰剂和所述缓释调节剂与所述功能小分子肽的质量比为（0.5-2.0）:（0.3-1.0）:（0.8-1.5）:（1.0-2.5）:10；

42、所述稳定剂包括麦芽糊精或β-环糊精；

43、所述助溶剂包括聚乙二醇400或甘油；

44、所述靶向修饰剂包括叶酸、半乳糖或单克隆抗体中的一种或多种；

45、所述缓释调节剂包括聚乙二醇或透明质酸中的一种或多种。

46、第六方面，本发明还提供了所述的药物递送载体在制备药物递送系统中的应用。

47、第七方面，本发明还提供了药物递送系统，包括所述的药物递送载体；

48、作为优选，所述药物递送系统还包括药物；

49、作为优选，所述药物包括化疗药物、靶向治疗药物、免疫治疗药物或核酸药物中的一种或多种；

50、更优选的，所述化疗药物包括阿霉素、紫杉醇或顺铂中的一种或多种；

51、所述核酸药物包括sirna、mirna或质粒dna中的一种或多种；

52、作为优选，所述药物递送系统的粒径分布包括50~200 nm。

53、第八方面，本发明还提供了所述的药物递送系统在制备预防、辅助治疗和/或治疗肿瘤或炎症性疾病的药物中的应用。

54、在本发明的一些具体实施方案中，所述肿瘤包括乳腺癌、肺癌或肝癌中的一种或多种；

55、所述炎症性疾病包括类风湿关节炎或溃疡性结肠炎中的一种或多种。

56、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

57、1.本发明的功能小分子肽来源于天然胰蛋白肽，生物相容性好、生物可降解性优异，在体内不会产生有毒有害物质，安全性高；同时，其制备工艺简便、成本较低，易于工业化生产。

58、2.该功能小分子肽具有明确的靶向性，可特异性识别肿瘤细胞、炎症细胞表面高表达的受体（如整合素αvβ3），能够将药物精准递送至靶组织，显著提高药物在靶部位的富集度，降低药物对正常组织的毒副作用。

59、3.以该功能小分子肽为核心构建的药物递送系统，可实现药物的可控释放，延长药物在体内的作用时间，提高药物的生物利用度和治疗效果；同时，载体可保护药物免受体内酶的降解，提高药物的稳定性。

60、4.本发明的药物递送系统适用范围广，可负载多种类型的药物（化疗药物、靶向药物、核酸药物等），可用于治疗多种疾病（肿瘤、炎症性疾病等），具有广阔的应用前景。